Seit der Einführung des Konzepts der Bioadhäsion in der pharmazeutischen Literatur wurden viele Versuche im universitä- ren als auch im industriellen Bereich unternommen, um die bioad- häsiven Eigenschaften von verschiedenen Polymeren zu verbessern.

Diese Versuche umfassten die Neutralisierung von ionogenen Poly- meren (Tobyn et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 42 (1996) 56-61), die Fällung von Polymeren in organischen Lösungsmitteln und deren Lufttrocknung anstelle von Lyophilisierung (Bernkop-Schnürch et al., Int. J. Pharm. 165 (1998) 217-225), Entwicklung von Polymer- Lektin Konjugaten (Naisbett et al., Int. J. Pharm. 107 (1994) 223- 230) sowie Konjugate aus Polymeren und bakteriellem Adhesin (Bernkop-Schnürch et al., J. Pharm. Sci. 3 (1995) 293-299).

Diese beschriebenen Systeme basieren alle auf der Bildung von nicht-kovalenten Bindungen, wie z. B. Wasserstoffbrücken oder ionische Wechselwirkungen, mit welchen nur eine schwache Bindung ermöglicht wird, die in vielen Fällen für eine zufriedenstellen- de Lokalisierung des Wirkstoff-Abgabe-Systems an einem bestimm- ten Zielort nicht ausreicht.

Jene Mucus-Schicht, die GI-Epithelien überzieht, besteht hauptsächlich aus Mucus-Glycoproteinen, die einen zentralen Be- reich mit vielen O-verknüpften Oligosaccharidketten und zwei flankierende cysteinreiche Subdomänen auf jeder Seite aufweisen.

Diese cysteinreichen Subdomänen enthalten über 10% Cys in deren Primärstruktur, welche bei der Verknüpfung von Mucinmonomeren zu Oligomeren über Disulfidbrücken eingebunden sind. Damit wird ein dreidimensionales Netzwerk der Mucusgelschicht aufgebaut.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht im Zur- Verfügung-Stellen von verbesserten mucoadhäsiven Polymeren, mit welchen eine zielgerichtete Einbringung von Wirkstoff in Mucus- Schichten ermöglicht wird, wobei eine stabile Präsenz am Zielort ermöglicht werden soll. Mit der Erfindung soll ein wirksames und effizientes Wirkstoff-Abgabe-System ermöglicht werden, mit wel- chem eine verbesserte und damit auch verlängerte Anhaftung von Arzneimittel an Schleimhäuten erzielt werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein mucoadhäsives Polymer gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus nicht mehr als 10 verschiedenen Monomeren aufgebaut ist und mindestens eine nicht endständige Thiol-Gruppe aufweist. Mit der gezielten Einführung von Thiol-Gruppen in Polymeren mit be- kannter mucoadhäsiver Eigenschaft oder mit der Schaffung völlig neuer Thiol-hältiger Polymere wird die spezifische Struktur von Mucus-Schichten in spezifischer Weise ausgenutzt : Es war be- kannt, dass die mucolytische Aktivität von Thiolen, wie bei- spielsweise N-Acetylcystein, auf Disulfidaustauschreaktionen zwischen Glycoproteinen im Mucus und dem mucolytischen Wirkstoff basiert. Aufgrund derartiger Austauschreaktionen werden sowohl intra-als auch intermolekulare Disulfidbrücken in der Glycopro- teinstruktur des Mucus gespalten, wodurch die Mucus-Schicht auf- gelöst wird. Basierend auf dieser Beobachtung, wonach ein muco- lytisches Mittel kovalent an Glycoproteine im Mucus gebunden wird, wurde erfindungsgemäß die Hypothese aufgestellt, dass an- dere Thiol-hältige Verbindungen, insbesondere Polymere mit Thiol-Gruppen, ebenfalls kovalent an eine Mucus-Schicht gebunden werden könnten. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass diese Hypothese nicht nur voll zutrifft sondern auch so spezifisch wirkt, dass damit ein effizientes Wirkstoff-Abgabe- System zur Verfügung gestellt werden kann. Insbesondere zeigt es sich, dass die erfindungsgemäßen Polymere im Gegensatz zu den mucolytischen Thiolen keine maßgebliche mucolytische Aktivität aufweisen.

Es zeigte sich, dass die erfindungsgemäßen Polymere in der Lage sind mit den cysteinreichen Subdomänen der Mucusglycopro- teine reversible kovalente Bindungen einzugehen (vgl. Fig. 1), mit welchen eine stabile Lokalisierung der Polymere an bestimm- ten Schleimhäuten im Mucus ermöglicht wird.

Bevorzugterweise enthalten die erfindungsgemäßen Polymere mindestens 0,05 pmol, insbesondere mindestens 0,1 J. mol kovalent gebundene Thiol-Gruppen pro g Polymer. Üblicherweise enthalten die erfindungsgemäßen Polymere 1-500 pmol Thiol-Gruppen pro g Polymer, insbesondere 10-100 jumol. Damit wird nicht nur eine ef- fiziente Bindung an die Mucusglycoproteine ermöglicht sondern es werden die mucoadhäsiven Eigenschaften auch noch durch vorteil- hafte Hydrationseffekte und interne Kohäsion verstärkt.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polymere durch Thiolierung von Polymeren hergestellt für die eine mucoadhäsive Eigenschaft bereits bekannt ist. Dabei wird diese mucoadhäsive Eigenschaft entscheidend verstärkt und verbessert. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Polymer daher ausgewählt aus thiolier- tem Polycarbophil (einem Copolymer aus Acrylsäure und Divinyl- glykol), thioliertem Chitosan, thiolierter Natrium- Carboxymethylzellulose, thioliertem Natrium-Alginat, thiolierter Natrium-Hydroxypropylzellulose, thiolierte Hyaluronsäure und thioliertem Pektin. Für die unthiolierten Basispolymere ist die mucoadhäsive Eigenschaft beispielsweise in Smart et al.

(J. Pharm. Pharmacol. 36 (1984) 295-299) beschrieben.

Selbstverständlich sind auch die thiolierten Derivate der oben genannten Polymere bevorzugt. Beispiele für derartige Deri- vate umfassen Derivate, die durch Autocrosslinking, Einführung von funktionellen Gruppen, Anbindung von Komplexbildnern (wie z. B. EDTA), Kopplung von Enzyminhibitoren, etc., erhalten wer- den, insbesondere bei Polymeren mit negativ geladenen Gruppen, z. B. COO--Gruppen.

Die Thiolierung kann erfindungsgemäß durch alle möglichen chemischen Reaktionen vorgenommen werden, mit welchen Thiol- Gruppen an Polymere, insbesondere an wasserlösliche Polymere, gebunden werden. Aus wirtschaftlichen Gründen bietet sich für die Thiolierung die Verwendung von Cystein-Gruppen an, da diese leicht und preisgünsig zu erhalten sind. Cystein-Gruppen können vorzugsweise über eine Amidbindung an das Polymer gebunden wer- den.

Andererseits kann das erfindungsgemäße Polymer auch dadurch hergestellt werden, dass im Zuge der Herstellung des Polymers mindestens ein Monomer mit Thiol-Gruppen (co-) polymerisiert wird, das im Polymer freie Thiol-Gruppen aufweist d. h. die Thiol-Gruppen nicht in der Polymerisierungsreaktion direkt umge- setzt wird. Ein derartiges Polymer, das mindestens ein Monomer enthält, das im Polymer freie Thiol-Gruppen aufweist, ist erfin- dungsgemäß ebenfalls bevorzugt.

Bevorzugte erfindungsgemäße Polymere zeichnen sich auch durch eine Bindungskapazität an Darm-Mucosa aus, die gemessen als Gesamt-Adhäsions-Arbeit (total work of adhesion ; TWA) größer als 120 pJ ist, insbesondere griser als 150 pJ (bei pH-Wert 7).

Ein zur Messung dieser TWA geeignetes System wird in den Bei- spielen beschrieben.

Bevorzugterweise werden erfindungsgemäß Polymere einge- setzt, die eine im Vergleich zur TWA des nicht-thiolierten Poly- mers, erhöhte TWA aufweisen. Vorzugsweise beträgt die Erhöhung der TWA 50k oder mehr, insbesondere 100k oder mehr, gemessen am pH-Optimum der TWA des thiolierten Polymers.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfin- dung ein Arzneimittel, welches ein erfindungsgemäßes Polymer und zumindest einen Wirkstoff, der aber Schleimhäute aufgenommen wird, umfasst. Da mit den erfindungsgemäßen Polymeren gezielt Wirkstoffe an Mucus-Schichten appliziert werden können, ist das erfindungsgemäße Arzneimittel allen bisher bekannten Wirkstoff- Abgabe-Systemen an Mucus-Schichten überlegen, sowohl was seine Spezifität als auch was seine generelle Einsetzbarkeit anbe- langt.

Bevorzugterweise wird der Wirkstoff nicht-kovalent an das Polymer gebunden, wodurch die Verabreichung des Wirkstoffes am Zielort durch Diffusion ermöglicht wird. Die Art und Weise wie der Wirkstoff und das Polymer miteinander gemischt oder ver- knüpft werden ist nicht kritisch, Colyophilisierung ist dabei unter anderem genauso anwendbar wie Lufttrocknen, Gelieren, etc.

Auch die Art der Endkonfektionierung des Arzneimittels ist nicht kritisch, bevorzugterweise wird es aber als Tablette, Zäpfchen, Pellet, Augen-, Nasen-, Ohrentropfen oder-gele, als Darrei- chungsform zur Inhalation oder in Form von Mikro (Nano-) partikel zur Verfügung gestellt.

Als Wirkstoffe kommen bevorzugterweise Wirkstoffe in Be- tracht, von denen bekannt ist, dass sie eine Wirkung aber die Mucus-Schicht zeigen, insbesondere jene Wirkstoffe, die eine vergleichsweise kurze Eliminationshalbwertszeit z. B. unter 3 Stunden im Blut aufweisen. Durch eine verbesserte bzw. verlän- gerte Anhaftung von Wirkstoffabgabesystemen basierend auf erfin- dungsgemäßen thiolierten Polymeren, die zudem eine kontrollierte Wirkstofffreigabe über mehrere Stunden ermöglichen, kann die Einnahmefrequenz für solche Wirkstoffe drastisch reduziert wer- den.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfin- dungsgemäße Arzneimittel Wirkstoffe, die von Thiol-Gruppen ver- stärkt werden, vorzugsweise Thiol-abhängige Enzyme, insbesondere Papain und Subtilisin.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfin- dung das erfindungsgemäße Polymer als Arzneimittel bzw. die Ver- wendung eines erfindungsgemäßen Polymers zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere eines mucoadhäsiven Arzneimittels.

Bevorzugterweise kann dieses Arzneimittel peroral verabreicht werden.

Die erfindungsgemäße Darreichungsform ermöglicht auch eine verzögerte Abgabe des Wirkstoffes, beispielsweise indem der Wirkstoff im Inneren einer Polymertablette zur Verfügung ge- stellt wird und die Verzögerung durch die Notwendigkeit des Durchtrittes des Wirkstoffes durch die Polymer-Hüllschicht ein- tritt. Hierbei spielt insbesondere das aufgrund der Thiol- Gruppen verbesserte Quellverhalten der erfindungsgemäßen Polyme- re eine wichtige Rolle.

Erfindungsgemäß erfolgt die Verabreichung des Arzneimittels in einer effizienten Dosis an Patienten, wobei die Dosis sich nach der im Stand der Technik für den jeweiligen Wirkstoff be- schriebenen Dosierung richten kann. Dabei sind aber zwei Aspekte zu berücksichtigen : einerseits ist die erfindungsgemäße Verab- reichungsform um einiges gezielter und effizienter als die be- kannte Verabreichung (auf demselben Verabreichungsweg), anderer- seits kann durch die erfindungsgemäßen Polymere die Permeation von Wirkstoffen durch die Mucosa verstärkt werden.

Demgemäß betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vor- liegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Poly- mers zur Herstellung eines Mittels zur Verstärkung der Permeati- on von Wirkstoffen, insbesondere von hochmolekularen, hydrophi- len Wirkstoffen, beispielsweise (Poly-) Peptid-Wirkstoffen, durch Mucosa, vorzugsweise durch die Darm-Mucosa.

Es zeigte sich, dass die erfindungsgemäßen Polymere auch in der Lage sind bestimmte Ionen, insbesondere Zink-Ionen zu bin- den. Durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen Polymers wer- den dabei am Ort der Adhäsion Zink-Ionen vom Polymer gebunden, wodurch Enzyme, insbesondere Enzyme, die Zink-Ionen abhängig sind, inhibiert werden. Eine Inhibierung von Enzymen kann auch durch direkte Bindung der Enzyme an das erfindungsgemäße Polymer erfolgen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Ver- wendung des erfindungsgemäßen Polymers zur Herstellung eines Mittels zur Inhibierung von Enzymen, insbesondere von Enzymen, die Zink-Ionen abhängig sind. Beispiele hierfür sind vor allem Zink-abhängige Enzyme im Verdauungstrakt, wie Carboxypeptidase A und B.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfin- dung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Polymere an nicht-mucosen Kontaktschichten, worin ebenfalls die verbesserten Haftungseigenschaften an biologischem (proteinhaltigen) Material ausgenützt wird. Dabei kommen insbesondere Anwendungen in der Viscochirurgie (intraokuläre chirurgische Eingriffe, Katarakt- Behandlung), intradermale Anwendungen (kosmetisch aber auch the- rapeutisch ; z. B. Faltenglätttung oder Gewebeaugmentierung) aber auch intraartikuläre, insbesondere synariale, Anwendungen in Be- tracht.

Wie oben erwähnt ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymere nicht kritisch, ein bevorzugtes Verfahren zur Herstel- lung der erfindungsgemäßen Polymere ist dadurch gekennzeichnet, dass Basispolymere, die aus nicht mehr als 10 verschiedenen Mo- nomeren aufgebaut sind, wobei zumindest eines der nicht endstän- digen Monomere eine im Polymer freie endständige funktionelle Gruppe I aufweist, mit Thiol-hältigen Verbindungen, die zumin- dest eine weitere funktionelle Gruppe II aufweisen, umgesetzt werden, wobei die funktionellen Gruppen I und II bei dieser Um- setzung, gegebenenfalls unter Verwendung von Kopplungsreagenzi- en, eine kovalente Bindung miteinander eingehen.

Bevorzugterweise ist bei diesem Verfahren die funktionelle Gruppe I eine Carboxylgruppe und die funktionelle Gruppe II eine Aminogruppe, bevorzugterweise eine primäre Aminogruppe, wobei eine Amidbindung eingegangen wird. Bei der Umsetzung können vor- zugsweise Kopplungsreagenzien, insbesondere Carbodiimide verwen- det werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird als Thiol- hältige Verbindung eine Mercaptoverbindung mit primärer Amino- gruppe eingesetzt, vorzugsweise Cystein oder ein Cysteinderivat.

Die Umsetzung erfolgt bevorzugterweise bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8, insbesondere bei 5,5 bis 6,5.

Das erfindungsgemäß hergestellte Polymer kann dabei auf ei- nen bestimmten pH-Wert eingestellt werden, vorzugsweise auf ei- nen pH-Wert zwischen 5 und 9, insbesondere von 6,5 bis 8,5.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfin- dung auch ein Verfahren zur Verbesserung der Mucoadhäsion von Polymeren, welches sich dadurch auszeichnet, dass seitenständige Thiol-Strukturen in diese Polymere eingebracht werden, wodurch es zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen dem Polymer und der Mucus-Schicht kommt.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren näher erläutert : Es zeigen : Fig. 1 das Prinzip der kovalenten Bindung der erfindungsgemäßen Polymere an die Mucus-Schicht ; Fig. 2 die Disintegration von thiolierten Polymeren im Ver- gleich mit den unmodifizierten Polymeren ; Fig. 3 die Freisetzungsprofile von Rifampicin aus thiolier- ter und nicht-thiolierter CMC (Fig. 3A) und thioliertem und nicht-thioliertem PCP (Fig. 3B) ; Fig. 4 die Permeationswirkung über Darm-Mucosa ; Fig. 5 die Vorrichtung zur Messung der mucoadhäsiven Eigen- schaften ; Fig. 6 die Bindung von L-Cystein an thioliertem PCP.

Beispiel 1 : Herstellung eines erfindungsgemäßen Polymers 10 g Polycarbophil (Noveon AA1 ; Firma BF Goodrich) werden portionsweise in 100 ml einer 4Wigen (m/m) methanolischen NaOH Lösung unter ständigem Rühren suspendiert. Das dabei entstehende Natriumsalz des Polymers wird abfiltriert und mit Methanol so- lange gewaschen bis das Filtrat einen neutralen pH-Wert auf- weist. Im Anschluss daran wird das Polymer bei Raumtemperatur im Exsiccator getrocknet. Ein Gramm von neutralisiertem Polycarbo- phil wird in 250 ml demineralisiertem Wasser hydratisiert und die Carbonsäuregruppen des Polymers durch 1-Ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid, das in einer End- konzentration von 50 mM zugesetzt wird, bei Raumtemperatur unter Rühren 45 Minuten lang voraktiviert. Um eine Oxidation des in der Folge zugesetzten L-Cysteins zu verhindern, wird der pH-Wert der Lösung mit 5 N HC1 auf pH-Wert 4 eingestellt und mit N2 15 Minuten lang begast. Nach der Zugabe von 0,5 g L-Cystein wird der pH-Wert der Lösung gegebenenfalls auf pH-Wert 4-5 mit HC1 bzw. NaOH nachjustiert und der Reaktionsansatz 3 Stunden bei Raumtemperatur unter N2-Begasung gerührt. Das entstandende Poly- carbophil-Cystein-Konjugat wird gegen eine wässrige 1 mM HC1 und 2 uM EDTA Lösung, zwei Mal gegen das gleiche Dialysemedium je- doch zusätzlich 1% NaCl enthaltend und abschließend erschöpfend gegen 0,5 mM HC1 bei 10°C unter Lichtausschluss dialysiert. Im Anschluss daran wird der pH-Wert des Konjugates mit 1 N NaOH auf pH-Wert 5 eingestellt. Das isolierte Konjugat wird bei-30°C ge- friergetrocknet. Die Aufbewahrung erfolgt bei 4°C.

Es wurden verschiedene Polycarbophil- (PCP) Cystein-Konjugate hergestellt, welche die folgenden Thiol-Gruppenkonzentrationen (in mol/g Polymer) aufwiesen : PCP-Cyst 1 : 4 : pmol/g Polymer ; PCP-Cyst 1 : 2 : ; PCP-Cyst 2 : 1 : ; PCP-Cyst 4 : 1 : ; PCP-Cyst 8 : 1 : ; PCP-Cyst 16 : 1 : ; PCP-Cyst 32 : 1 : ; Kontrolle : (PCP+Cyst ohne Reaktion) : (dadurch zeigte sich die Effizienz der Reinigung).

Speziell die PCP-Cyst Konjugate 1 : 2 und 1 : 4 zeigten eine signifikant (>100k) höhere Wasseraufnahmekapazität im Vergleich mit dem nicht-modifizierten Polymer.

In Mucinbindungsstudien (Bindung von porcinem Mucin an die Polymere) konnte gezeigt werden, dass Mucine effektiv an die ge- testeten Polymer-Cystein-Konjugate gebunden wurden (im Gegensatz zu den nicht-modifizierten Polymeren).

Die Bindungsstärken (TWA) der erfindungsgemäßen Polymere an Mucine der intestinalen Mucosa wurden im Wesentlichen gemäß Ch'ng et al. (J. Pharm. Sci. 74 (1985) 399-405) durchgeführt, wie in Bernkop-Schnürch et al. (Pharm. Res. 16 (6) (1999) 876-881) be- schrieben.

Das hier beschriebene Polymer (Polycarbophil)-Cystein- Konjugat zeigt bei Adhäsionstests sowie bei ex-vivo Studien an exzidierter Schweinedünndarm-Mucosa in künstlichem Darmsaft, be- stehend aus 50 mM Tris-HC1 Puffer pH-Wert 6,8, der 0,9% NaCl enthält, ein deutlich höheres Anhaftungsvermögen als auf diesel- be Weise vorbehandeltes Polycarbophil, an das jedoch kein Cy- stein kovalent gebunden wurde.

Es konnte gezeigt werden, dass mit den erfindungsgemäßen Polymeren die Adhäsionswirkung gegenüber nicht-modifiziertem Po- lymer (PCP) zumindest um 100% gesteigert werden konnte. So konn- te beispielsweise mit dem Polymer-Cystein-Konjugat 16 : 1 eine TWA von 19147 J und mit dem 2 : 1 Konjugat von 28067 pJ erzielt werden, wohingegen das unmodifizierte Polymer eine TWA von 10421 u. J aufwies. Es zeigte sich, dass die Zunahme der TWA bei pH-Wert 6,8 ein Optimum aufwies, jedoch sogar bei pH-Wert 3 po- sitive Effekte der thiolierten Verbindung gegenüber dem Aus- gangspolymer auftreten.

Beispiel 2 : Untersuchungen zur Disintegration der erfin- dungsgemäßen Polymere Erfindungsgemäß hergestelltes Carboxymethylzellulose- Cystein-Konjugat (CMC-Cystein-Konjugat) und PCP-Cystein-Konjugat wurden lyophilisiert und in eine Matrix-Tablettenform gebracht.

Ebenso wurden Tabletten mit den entsprechenden nicht- modifizierten Polymeren hergestellt. Die Stabilität der Polymer- tabletten (30 mg) in 5 ml 50 mM Tris-HCl gepufferter physiologi- scher Kochsalzlösung (TBS), pH-Wert 6,8 bei 37°C wurde mit einem Disintegrationstestapparat gemäß der europäischen Pharmacopöe mit einer Oszillationsfrequenz von 0,5 pro sec. analysiert.

Es zeigte sich, dass die Tabletten aus thiolierten Polyme- ren eine wesentlich höhere Stabilität als die unmodifizierten Polymere aufwiesen. Matrix-Tabletten, die PCP-Cystein-Konjugate enthalten, waren sogar für mehrere Tage im Test stabil. Die Er- gebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, wobei auf der y-Achse die Disintegrationszeit in Stunden angegeben ist.

Diese hohe Stabilität der Tabletten der erfindungsgemäßen Polymere kann durch die Ausbildung von Disulfidbrücken in den Polymeren erklärt werden, womit indirekt auch eine verbesserte Anhaftung des Matrixsystems ermöglicht wird, da die Ablösung der Arzneiform von der Schleimhaut durch ein Abreißen der Bindung innerhalb der Arzneiform stark reduziert werden kann. Diese ver- besserte Stabilität hat auch wesentliche praktische Bedeutung und bietet verschiedene Vorteile im Vergleich zu bekannten Poly- mer-Carrier-Systemen, vor allem was die Reduktion von präsy- stemischen Metabolismen bei Polypeptid-Wirkstoffen im Darm anbe- langt.

Beispiel 3 : Freisetzungsuntersuchungen Erfindungsgemäß hergestellte Konjugate (CMC-Cystein- Konjugat und PCP-Cystein-Konjugat) wurden in demineralisiertem Wasser hydratisiert und in Aceton bzw. 1N NaOH gegeben, wodurch die Viskosität stark erhöht wurde. Nach Waschung mit Aceton bzw.

Methanol wurde luftgetrocknet und pulverisiert.

Es wurden Tabletten gefertigt, die aus 1 mg Rifampicin als Modellwirkstoff und 29 mg des CMC-Cystein-Konjugats bzw. des PCP-Cystein-Konjugats sowie den korrespondierenden nicht- modifizierten Polymeren bestehen. Anschließend wurde die in vi- tro-Freisetzungsrate dieses Wirkstoff-Abgabe-Systems analysiert, indem die Tabletten in 25 ml Behälter, enthaltend 10 ml Freiset- zungsmedium (50 mM TBS pH-Wert 6,8), gegeben wurden. Die Behäl- ter wurden verschlossen und auf einem oszillierenden Wasserbad bei 370,5°C inkubiert. 600 il Aliquote wurden in einstündigen Intervallen entnommen und durch gleiche Volumina an Freiset- zungsmedium ersetzt. Freigesetztes Rifampicin wurde photome- trisch bei 470 nm mittels Eichgerade quantifiziert.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3A (für CMC) und Fig. 3B (far PCP) wiedergegeben, wobei auf der x-Achse die Zeit in Stunden und auf der y-Achse die Prozent freigesetztes Rifampicin aufge- tragen wurden.

Es zeigte sich, dass mit den erfindungsgemäßen Systemen ei- ne wesentlich effizientere Freisetzung erfolgt, die vor allem in Anbetracht der Disintegrationsergebnisse das große Potential der erfindungsgemäßen Polymere demonstriert. Eine kontrollierte Wirkstofffreisetzung für eine verlängerte Zeitdauer wird dabei in effizienter Weise erreicht.

Beispiel 4 : Wirkung der erfindungsgemäßen Polymere als Per- meationsverstärker 2 mg Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden in 1 ml DMSO aufgelöst und in aliquoten Volumina von 25 1 40 mg Bacitracin (gelöst in 20 ml 0,1 M Na2CO3) zugegeben. Um die Kopplungsreakti- on nach 8 Stunden bei 4°C zu stoppen wurde Ammoniumchlorid in einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben. Das entstandene FITC-Konjugat wurde durch Gelfiltration über Sephadex G15 iso- liert und lyophilisiert.

Permeationsuntersuchungen mit diesem modifizierten Peptid wurden bei 37°C unter Verwendung von Ussing-Kammern mit Dünn- darmstücken von Meerschweinchen durchgeführt. Die Donor-und die Akzeptorkammer wurde jeweils mit 1 ml einer Lösung enthaltend 250 mM Natriumchlorid, 2,6 mM Magnesiumsulfat, 10,0 mM Calcium- chlorid, 40,0 mM Glucose und 50 mM Natriumhydrogencarbonat (pH- Wert 7,2) gefüllt. Das Bacitracin-FITC-Konjugat wurde der Donor- kammer in einer Endkonzentration von 0,1'-. (m/v) zugegeben. Ali- quote Volumina von 200 tl wurden aus der Akzeptorkammer zu be- stimmten Zeitpunkten entnommen und durch dasselbe Medium er- setzt. Der Einfluss von PCP und thioliertem PCP (PCP-Cyst), wel- ches erfindungsgemäß hergestellt worden ist, auf das Permeati- onsverhalten des modifizierten Peptides wurde durch Zugabe von 0,5% (m/v) PCP und 0,5% (m/v) PCP-Cyst untersucht. Die Menge an permeiertem Bacitracin-FITC-Konjugat wurde mit einem Fluorimeter bestimmt. Ebenso wurden die Änderungen in transepitelialen elek- trischen Widerstand überwacht.

Es konnte gezeigt werden, dass Bacitracin mit einem Moleku- largewicht von 1422 Da die Darm-Mucosa zu einem bestimmten Grad permeieren kann. Dabei konnte eine Degradation durch Verdauungs- enzyme aufgrund seiner enzymhemmenden Wirkung ausgeschlossen werden. Die Zugabe von 0,5% PCP führte zu einem 1,2fachen An- stieg des Transports des Modellpeptids durch die Membran, wohin- gegen die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Polymere eine signifikant erhöhte Steigerung (etwa das 1,5fache) in der Permeation ermöglichten. Als Gegenversuch konnte gezeigt werden, dass Cystein per se keinen Einfluss auf die Permeation hatte, wodurch der signifikante Effekt der erfindungsgemäßen Polymere belegt wird.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 4 darge- stellt, wobei auf der x-Achse die Zeit in Minuten und auf der y- Achse die Permeation in Prozent der gesamten Dosis angegeben werden (o : PCP : PCP-Cyst + Kontrolle).

Beispiel 5 : In vitro-Mucuadhäsionsuntersuchungen PCP (Molgewicht größer 700 kDa) wurde mit NaOH neutrali- siert. Die Carbonsäuregruppen von hydriertem, neutralisiertem PCP und hydriertem CMC (Molgewicht rund 1000 kDa) wurden für 45 Minuten durch Zugabe von l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)- Carbodiimid-Hydrochlorid (EDAC ; Sigma) in einer End- Konzentration von 50 mM aktiviert. L-Cysteinhydrochlorid wurde zugegeben und der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde auf 4-5 eingestellt. Das molare Verhältnis von EDAC zu L-Cystein war 50 : 3,2 und 50 : 1 für die Kopplungsreaktionen mit PCP bzw. CMC.

Der pH-Wert der Kopplungsreaktion mit CMC wurde durch Zugabe von 1 N HCl konstant gehalten. Die Reaktionsmischungen wurden für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltenen Polymer- Cystein-Konjugate wurden durch Dialyse bei 10°C im Dunkeln gegen 1 mN HCl isoliert. Anschließend wurde der pH-Wert dieser Polyme- re mit 1 N NaOH auf pH 3, pH 5 bzw. pH 7 eingestellt und lyophi- lisiert. Die erhaltenen thiolierten Polymere wiesen 12,3 pmol (PCP-Konjugat) und 22,3 pmol (CMC-Konjugat) Thiol-Gruppen/g Po- lymer auf.

Die Mucuadhäsionsuntersuchungen wurden mit einer Apparatur gemäß US-Pharmacopöe (vgl. Fig. 5) durchgeführt : Dabei wurde ei- ne frisch exzisierte intestinale Mucosa vom Schwein auf einem Stahlzylinder (Durchmesser 4,5 cm, Höhe 5,1 cm, Apparatus 4- Zylinder, USP XXII) aufgespannt. Dieser Zylinder wurde in den Dissolutionsapparat, enthaltend 100 mM TBS pH-Wert 6,8 bei 37°C, eingebracht und mit 250 Umdrehungen/Minute bewegt. Die Polymere wurden zu 30 mg-Tabletten von 5,0 mm Durchmesser gepresst, auf die Mucosa aufgebracht und über einen Zeitraum von 10 Stunden beobachtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle darge- stellt : Polymer pH 3 pH 5 pH 7 PCP Kontrolle dis. los. dis. PCP-Cys7, 551,15 dis. >10 2, 250,87 los. CMC Kontrolle los. dis. los. CMC-Cys 3, 91,02 los. los. los. dis.. Disintegration los..Loslösung Es zeigte sich, dass die erfindungsgemäßen Polymere deut- lich verbesserte Eigenschaften gegenüber den nicht-thiolierten Ausgangspolymeren aufwiesen. Es zeigte sich, dass im erfindungs- gemäßen System das Zusammenwirken der Eigenschaften : Haftungs- fähigkeit an der Mucosa, Bindungsmechanismus der erfindungsgemä- ßen Polymere an die Mucosa, erhöhte Kohäsivität und Quellverhal- ten zu einem optimalen Adhäsionsprozess führen, wodurch eine überlegene Arzneimittelzuführung durch optimierte Anhaftung an die zu Mucus-Schichten ermöglicht wird.

Beispiel 6 : Enzyminhibierungswirkungen Die Inhibierungswirkung von PCP-Cystein-Konjugaten und nicht-modifizierten neutralisierten PCP wurden gegenüber Car- boxypeptidase A und Carboxypeptidase B getestet. Hierbei wurde in für diese Enzyme beschriebenen Enzymaktivitätstests unter- sucht : 0,5 mg der Polymere bzw. von L-Cystein und 0,5 Einheiten Carboxypeptidase A aus Rinderpankreas wurden in 400 pl 25 mM Tris-HC1 pH-Wert 6,8, enthaltend 2,9% NaCl, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation wurden 300 pl Überstand in 300 pl 2 mM Hippuryl-L-phenylalanin gegeben, wobei der Anstieg der Absorption bei 254 nm in 1 Minuten-Intervallen gemessen wurde.

Die Polymere (1 mg) und Carboxypeptidase B (0,62 Einheiten) aus Rinderpankreas wurden in einem Gesamtvolumen von 600 il 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zentrifugation wurden 400 pl Überstand in 400 J. l 2 mM Hippuryl-L-arginin gegeben, wobei der Anstieg der Absorption bei 258 nm in 1 Minuten-Intervallen ge- messen wurde.

Es zeigte sich, dass der bereits gegebene inhibitorische Effekt von PCP gegenüber Carboxypeptidase A und B signifikant durch die Immobilisierung von Cystein am Polymer erhöht werden konnte. Da die Bindungsaffinität von PCP gegenüber Zink durch die Immobilisierung von Cystein auf dem Polymer um das 1,13fache gesteigert werden konnte Zink werden an PCP gebunden, wohingegen an das PCP-Cystein gebunden werden), und diese Exopeptidasen nicht an die Polymere gebunden werden, ist klar, dass die Verstärkung im inhibierenden Effekt auf die höhe- re Zinkaffinität der erfindungsgemäßen Polymere zurückzuführen ist.

Beispiel 7 : Cystein-Bindung an das erfindungsgemäße Polymer In Cystein-Bindungsstudien wurden 0,5% (m/v) des herge- stellten PCP-Cystein-Konjugates und 0,1% (m/v) L-Cystein bei verschiedenen pH-Werten bei 37°C inkubiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt : Auf der x-Achse ist die Zeit in Stunden und auf der y-Achse das gebundene Cystein in k des theoretischen Maximums, das an das Polymer gebunden werden kann, aufgetragen.

Aus diesen Bindungsstudien geht klar hervor, dass die er- findungsgemäßen Polymere an Cystein-Teilstrukturen in biologi- schen Systemen kovalent anhaften können und somit auch für An- wendungen bei welchen eine verbesserte Haftung an nicht-mucosen Kontaktflächen, wie z. B. bei intradermalen, intraartikulären und intraokulären Anwendungen, geeignet sind.