多臂聚乙二醇衍生物及其与药物的结合物和凝 胶 技术领域 本发明涉及一种具有不同类型活性基团的多臂 聚乙二醇衍生物、其制备方法以^:其与 药物分子的结合物和形成的凝胶材料。本发明 还涉及包含所述新型具有不同类型活性基团 的多臂聚乙二醇衍生物及其形成的凝胶在制备 药物制剂和医疗器械材料中的应用。 背景技术 目前， 聚乙二醇衍生物被广泛地用于与蛋白质、 多肽以及其他治疗药物结合以延长所 述药物的生理半衰期， 降低其免疫原性和毒性。在临床使用中， PEG及其衍生物作为制作 药物制剂的载体已经在很多药品中得到了广泛 的应用， 而将 PEG键合到药物分子的尝试 在最近十年里也得到了长足的发展， 在许多批准药品中被广泛使用， 如 PEGasys® , 它是 一种 α-干扰素与聚乙二醇的结合物，表现出了更长 的循环半衰期和更好的治疗效果。 聚乙 二醇在人体内的代谢过程已相当清楚， 是一种安全的、 无副作用的合成高分子材料。 在药物修饰方面， 最新的研究方向是将一种靶向分子用聚乙二醇 连接到药物分子上， 使得药物分子能在病灶附近富集， 从而发挥最好的疗效。 例如， 把抗癌药物连接到单克隆 抗体上。 最近， 本公司的研究认为把两种不同的药用分子用聚 乙二醇结合到一起， 可以在 保持前述的提高药物的生理半衰期， 降低其免疫原性和毒性的同时， 充分发挥两个分子的 协同作用。分子间的协同作用在中医理论中是 相当重要的。 当要把两个或两个以上的不同 分子用聚乙二醇连接时， 需要一种具有异双官能团的聚乙二醇衍生物。 目前， 本公司生产 多种具有异双官能团的聚乙二醇衍生物。 例如， MAL-PEG-NHS , 丙烯酸 -PEG-NHS, HO-PEG-COOH等。但是， 这些具有异双官能团的聚乙二醇衍生物都是直 链的聚乙二醇衍 生物。 直链的异双官能团聚乙二醇衍生物在应有上有 一定的局限性。 用直链的异双官能团聚 乙二醇衍生物连接的两个分子的比例基本上是 1 : 1。如果有一个分子需要比另一个分子多， 例如， 一个分子的体内活性低， 这就要求活性低的分子比活性高的分子连接多 ,这对直链 的异双官能团聚乙二醇衍生物就是挑战。 同时， 在药物承载方面， 多臂聚乙二醇相比直链 聚乙二醇具有优势。直链的异双官能团聚乙二 醇衍生物只能承载两个分子； 而多臂聚乙二 醇具有多个端基， 进而具有多个药物连接点、 可以负载多个药物分子。 目前， 多臂聚乙二 醇广泛应用于多肽和小分子药物的 PEG化修饰。 但是， 目前市场上的多臂聚乙二醇衍生 物都只具有同一种活性基团。 如， 4臂聚乙二醇丁二酸酯 -NHS酯（4arm-SS)。US 6046305 展示了一种通过聚合反应形成的只有一个活性 基团的星型聚乙二醇衍生物。 同是， 这种星 型聚乙二醇衍生物的一个臂与其它臂通过非醚 键， 如酰胺键或酯键连接。 '这种连接方式上 是不同的， 降低了衍生物的稳定性。 本发明的目的在于克服现有技术中多臂聚乙二 醇都只有单一活性基团的现状，提供一 种新型的、结构简单且稳定的具有不同类型活 性基团的多臂聚乙二醇衍生物。这些新型的 具有不同类型活性基团的多臂聚乙二醇衍生物 包括异双官能团多臂聚乙二醇衍生物以及. 异三官能团多臂聚乙二醇衍生物。 同时， 本发明提供这些新型的具有不同类型活性基团 的 多臂聚乙二醇衍生物的制备方法， 以及所述多臂聚乙二醇的活性衍生物与药物分 子的结合 物和形成的凝胶及其凝胶的应用。

^馳 发明提供一种新型多臂聚乙二醇衍生物， 所述的多臂聚乙二醇衍生物具有通式 I的

0 PEG― F,

CH

PEG— O— CH,—— C— CH -O-H PEG

其中：

F ₂ 、 F ₃ 、 F ₄ 为 -X-Y型结构， 并且 Fi、 F ₂ 、 F ₃ 、 F ₄ 中至少有两个是不同的；

X是连接基团，选自由以下基团组成的组： (CH ₂ ),、(C ),NH、(： CH ₂ ),OCOO-、(CH ₂ ),OCONH -、 (CH ₂ NHCOO-、（C¾),NHCONH -、 OC(CH ₂ ),COO-、（C¾)iCOO-和 (CH ₂ ),CONH-; /为 0-10 的整数；

Y是活性端基基团， 选自由以下基团组成的组： 羟基、 氨基、 巯基、 羧基、 酯基、 醛基、 丙烯酸基和马来酰亚胺基；

PEG为相同或不同的 -(C¾CH ₂ 0) _m -， m的平均值为 2- 250的整数；

/为≥1的整数。 在一个优选的实施方案中， 在本发明的多臂聚乙二醇衍生物中的！^为-X-CO OH; F ₂ 、 F ₃ 、 F ₄ 为 -X-Y型结构， 并且 F ₂ 、 F ₃ 、 F ₄ 中至少有一个不是 -X-COOH。 所述的多臂聚乙二 醇活性衍生物具有通式 II的结构：

II 在一个优选的实施方案中， 在本发明的多臂聚乙二醇衍生物中的 和 F ₂ 均为 -X-COOH; F ₃ 、 F ₄ 为 -X-Y型结构， 并且 F ₃ 、 F ₄ 中至少有一个不是 -X-COOH。 所述的多臂 聚乙二醇活性衍生物具有通式 ΠΑ的结构：

0一 PEG-

〇

■PEG― 0— CH,— C— CH,-0- PEG X—— C OH

CH, O

◦一 PEG— X—— C一 OH

IIA 在一个具体实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有通式 III结构的多臂聚乙: 醇羟基-单乙酸：

在一个具体实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 ΠΙΑ结构的多臂聚 乙二醇羟基-多乙酸：

在一个具体实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 IV结构的多臂聚 乙二醇羟基-单 NHS酯：

IV 在一个具体实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 IVA结构的多臂聚 乙二醇羟基-多 NHS酯：

在一个具体实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 V结构的多臂聚乙 二醇氨基-单乙酸： O— PEG—— CH ₂ CH ₂ -NH ₂

CH, O

H ₂ N— CH ₂ CH ₂ —— PEG ~~ 0- -CH ₂ ― C― CH ₂ -O -PEG-CH ₂ — C― OH

I '

CH ₂

O I PEG—— CH ₂ CH ₂ -NH ₂

V 在一个具体实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 VA结构的多臂聚 乙二醇氨基-多乙酸：

在一个具体的实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 VI结构的多臂 聚乙二醇马来酰亚胺-单 NHS酯：

在一个具体的实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 VIA结构的多臂 聚

在一个具体的实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 VII结构的多臂 聚乙二醇丙烯酸-单 NHS酯：

在一个具体的实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物， 具有以下通式 VIIA结构的多 臂聚乙二醇丙烯酸-多 NHS酯：

在优选的实施方案中， 所述多臂聚乙二醇衍生物中的/为≥1且≤10的� �数， 更优选 / 为≥1且≤3的整数。 在优选的实施方案中， 所述多臂聚乙二醇的分子量为 400-80000 道尔顿， 优选为 1000-20000道尔顿。 本发明还提供了所述多臂聚乙二醇活性衍生物 通过其端基 F与药物分子所形成的结合 物。 在一些实施方案中， 所述药物分子选自由以下药物分子组成的组： 氨基酸、 蛋白质、 酶、 核苷、 糖类、 有机酸、 黄酮类、 醌类、 萜类、 苯丙素酚类、 体及其苷类、 生物碱及 其组合。优选地，本发明提供了八臂聚乙二醇 乙酸与依诺替康或多西紫杉醇形成的结合物。 本发明还提供由所述多臂聚乙二醇活性衍生物 形成的凝胶。 本发明进一步提供了上述结合物在制备药物中 的应用。 本发明进一步提供了制备新型的、 结构简单且稳定的具有不同类型活性基团的多 臂聚 乙二醇衍生物的方法。所述的方法包括： 使用由季戊四醇或寡聚季戊四醇作为引发剂聚 合 环氧乙垸所形成的多臂聚乙二醇，将多臂聚乙 二醇的一个或多个端羟基通过化学反应转化 为羧酸或胺， 进而通过离子交换色谱柱分离纯化出所要的单 羧基或多羧基、单氨基或多氨 基产物， 进而通过化学反应将对应的羟基、羧基和氨基 转化成所需的活性基团， 从而制成 本发明所述的具有不同类型活性基团的多臂聚 乙二醇衍生物。 具体实施方式 以下用具体实例， 说明本发明具有不同类型活性基团的多臂聚乙 二醇衍生物的制备方 法' 多臂聚乙二醇 （Multi-ar :

其中：

R为中心分子或引发分子的非羟基部分， 通常为 d. ₁₂ 垸基、 环垸基或芳垸基； n为分支数或臂数；

PEG为相同或不同的 -(CH ₂ C¾0) _m -， m为任何整数， 表征聚乙二醇单臂聚合度。 当 R为季戊四醇的非羟基部分时， 引发分子为季戊四醇， 其化学结构如下式:

OH

其中 n等于 4， 所形成的是四臂聚乙二醇 当 R 其化学结构如下式:

其中 n等于 6， 所形成的是六臂聚乙二醇。 当 R为三聚季戊四醇的非羟基部分时，.引发分子� ��三聚季戊四醇， 其化学结构如下

其中 _n 等于 8， .所形成的是八臂聚乙二醇。 本发明所用多臂聚乙二醇是由上述的季戊四醇 或寡聚季戊四醇作为引发剂聚合环氧 乙烷所形成的多臂聚乙二醇。 对聚乙二醇而言， 一般采用分子量予以表示， 只要使形成的聚乙二醇的单臂分子量为 300〜60,000道尔顿， 这相当于 m为大约 6〜1300。 更优选 m为 28、 112和 450, 这分别 相应于分子量为 1325、 5000和 20,000。 由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定 的 起始 PEG化合物的潜在不均一性， 优选用分子量表征聚乙二醇聚合物， 而不是用整数 m 表示 PEG聚合物中的自重复单元。 活性基团: 在根据本发明的多臂聚乙二醇的活性衍生物的 应用中， 不同的端基功能基团 F决定衍 生物具有不同的用途。 这些功能基团的引入， 将决定该衍生物的应用领域和适用结构。 最 常用的功能基团是 N-羟基丁二酰亚胺酯 (NHS)， 如 IV式所示。 NHS酯结构的活性衍生物 可与具有胺基的基团链接。 同样的， 依据本说明书的描述， 本领域的技术人员能够获得氨基功能基团的多 臂聚乙 二醇的活性衍生物， 如 III式所示。 同样的， 本领域的技术人员能够获得羧基功能基团的多 臂聚乙二醇的活性衍生物， 如

IV式所示。 同样的， 本领域的技术人员能够获得马来酰亚胺功能基 团（MAL)的多臂聚乙二醇的 活性衍生物， 如 VI式所示。 MAL结构的活性衍生物可与具有巯基的基团链接 。 许多药物成分中都含有活性的氨基、 羧基、羟基等官能团， 它们在生物体内通常都与 单糖、多糖、核苷、多聚核苷、憐酰基等成分 结合， 以形成在生物体中有活性的药理结构。 因此官能团修饰后的聚乙二醇衍生物可以通过 相同的方式和这些药物分子结合， 以替 代生物有机分子。 克服生物有机分子在生物体内生理半衰期短、 药效持续时间短的缺点。 本发明的多臂聚乙二醇活性衍生物使用适当的 端基官能团 （F) 可与药物分子结合， 所述的端基官能团使蛋白质、 多肽或者其他天然药物中的游离氨基、 羟基、 硫羟基等与 PEG衍生物连接起来。对小分子药物， 每个多臂聚乙二醇分子可以键合多个药物分子 。此 类 PEG衍生物有着较高的药物负载率， 以保证适当的药物浓度和增强缓释功能， 改善药 物分子在体内的生理作用。 以上各种应用领域只是对该 PEG衍生物的医药应用提供一个可能参考的模式 ， 具体 的使用和选择需要根据药理、 毒理和临床等必须的实验予以确认。 在本发明的结合物中， 药物分子部分优选为氨基酸、 蛋白质、 酶、 核苷、 糖类、 有机 酸、 黄酮类、 醌类、 萜类、 苯丙素酚类、 体及其苷类、 生物碱等。 蛋白质药物分子部 分还优选是干扰素类药物， EPO类药物， 生长素类药物， 抗体类药物， 等等。 本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药 物组合物进行给药，可采用任何可接 受的给药方式或用于类似用途的试剂进行。 因此，采用的给药方式可选择通过口、 鼻内、 直肠、透皮或注射给药方式，其形式为固体、 半固体、冻干粉或液体药剂形式给药， 例如， 片剂、 栓剂、 丸剂、 软和硬明胶胶囊剂、 散剂、 溶液剂、 混悬剂或气雾剂等，优选采用适 用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组 合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活 性成分 （一种或多种） 的本发明的结合物， 此外， 还可包含其它药剂、 载体、 辅剂等。 通常， 根据所需给药方式， 药学上可接受的组合物将包含约 1至约 99重量％的本发 明结合物、 以及 99至 1 重量％的适宜的药用赋形剂。 优选组合物包含约 5至 75 重量％ 的本发明结合物， 其余为适宜的药用赋形剂。 优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量 方案， 该方案可根据疾病的严重程度进 行调整。 本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配 制成注射用剂，例如使用约 0.5至 约 50%的活性成分分散于可采用液体形式给药的药 用辅剂中， 实例为水、盐水、含水葡萄 糖、 甘油、 乙醇等， 从而形成溶液剂或混悬剂。 可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过 溶解、 分散等手段将本发明的结合物 (约 0.5至约 20% )和选择性存在的药用辅剂溶解、 分散于载体中， 载体的实例为水、 盐 水、.含水葡萄糖、 甘油、 乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。 如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含 少量的辅助物质， 如润湿剂或乳化剂、 _P H缓冲剂、 抗氧化剂等， 例如： 柠檬酸、 脱水山梨醇单月桂酸酯、 三乙醇胺油酸酯、 丁 基化羟基甲苯等。 该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员 公知的或者显而易见的，例如可参见 Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 18 版， (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990)。无论如何， 按照本发明的技术， 所使用的组合物将含有治疗有效量的 本发明结合物， 以用于治疗相应的疾病。 实施例: 下面结合实例描述本发明的结合物及其制备方 法， 它不限制本发明， 本发明的范围由 权利要求限定。 除非另有说明， 以下实施例中所使用的试剂购自北京化学试剂 公司或其它类似大众化 学品销售公司。 实施例 1 : 合成四臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (III- 1)和四臂聚乙二醇羟基-二乙酸 (ΙΠΑ-1 )

步骤 _:

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 加入 100g 4ARM-PEG- 10K和 800mlTHF , 加热溶解， 蒸 出约 20%溶剂， 降温， 加入 4.48g叔丁醇钾， 室温下反应 2小时， 滴加 5.17ml溴乙酸叔丁 酯， 室温下过夜反应， 次日过滤， 反应液浓缩至粘稠， 加入 500ml碱解液（500ml水中加 入 8.16g氢氧化钠和 77.52g磷酸钠）， 80 Ό碱解 2小时，用 2N盐酸溶液调节溶液 pH为 2-3， 在溶液中加入 15。/。氯化钠，用二氯甲烷萃取三次，合并有 机相，用无水硫酸钠干燥，过滤， 50'C浓缩至粘稠， 加入乙醚沉淀， 真空干燥。 22g粗品 DEAE阴离子柱分离， 分别收集氯 化钠水溶液洗脱液， 水相分别用 2N盐酸调 pH为 2-3， 用二氯甲垸萃取， 合并有机相， 用 无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓縮， 用乙醚沉淀， 分别得到分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基 -单乙酸 (III-1)和四臂聚乙二醇羟基-二乙酸 (ΙΠΑ-1)。

NMR(DMSO)5: 4.0 l (s, CH ₂ COOH), 4.54(t, CH ₂ OH)。 实施例 2: 合成四臂聚乙二醇羟基-单 NHS酯 (IV-1)

三口圆底烧瓶中，通氮气，称取 0.5克分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (III-1) 和 0.01439gNHS， 加入 5ml二氯甲垸搅拌溶解， 加入 0.01290gDCC， 室温下反应过夜， 次 日， 过滤， 4CTC浓缩， 加入 10ml异丙醇热溶后冰水浴沉淀， 过滤， 用异丙醇洗涤一次， 真空干燥， 得四臂聚乙二醇羟基-单 NHS酯 (IV-1)。

NMR(DMSO)6: 2.89(s, 'Ρ), 4.55(t, C¾C¾OH)。 实施例 3 : 四臂聚乙二醇羟基 -单乙酸甲酯 (IVA-1)

步骤：

单口圆底烧瓶中，加入 3.2克分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (III-1),用 16ml 无水甲醇溶解， 冰水浴， 滴加 0.64ml浓硫酸， 室温下反应 3小时， 用 8%碳酸氢钠水溶液 调节体系 pH为 7.0，用二氯甲垸萃取三次，合并有机相，有机 相用无水硫酸镁干燥，过滤， 40°C浓缩至粘稠， 用乙醚沉淀， 真空干燥， 得四臂聚乙二醇羟基 -单乙酸甲酯 (IVA-1)。

NMR(DMSO)8: 3.32(s, CH ₂ COOCH ₃ ), 4.13(s, CH ₂ COOCH ₃ ), 4.57(t, C¾OH)。 实施例 4 : 四臂聚乙二醇磺酸酯 -单乙酸甲酯 (IVB-1)

步骤：

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 加入分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基 -单乙酸甲酯 3.0g， 用 50ml甲苯溶解， 加热蒸出 38ml甲苯至流馏出液清亮， 降至室温， 加入 5ml二氯甲垸， 搅拌 10分钟， 加入 188μ1三乙胺， 搅拌 5分钟， 滴加入 94μ1甲基磺酰氯， 密闭反应过夜， 次日， 加入 720μ1无水乙醇， 搅拌 15分钟， 过滤， 60Ό浓缩至粘稠， 用 60ml异丙醇热溶 解后冰水浴沉淀， 过滤， 滤饼用异丙醇洗涤一次， 真空干燥， 得四臂聚乙二醇磺酸酯-单 乙酸甲酯 (IVB-1)。

NMR(DMSO)8: 3.17(s, CH ₂ OS0 ₂ CH ₃ ), 4.13(s, CH ₂ COOC )， 4.30(t, CH ₂ OS0 ₂ CH ₃ )。 实施例 5 : 合成四臂聚乙二醇氨基-单乙酸 (V-l)

0— PEG—— CH ₂ CH ₂ — ΝΗ ₂

Η ₂ Ν— CH ₂ CH ₂ —— PEG—— Ο—— CH ₂ —— C—— CH ₂ _0—— PEG—CH ₂ —— C—— OH

I

CH ₂

O PEG—— CH ₂ CH ₂ -NH ₂

V-l

步骤：

单口圆底烧瓶中，加入 2.6克分子量为 10000四臂聚乙二醇磺酸酯 -单乙酸甲酯溶解在 7.8ml脱气水中， 用 2N氢氧化钠水溶液调节溶液 pH为 12.0, 室温下反应 2-2.5小时， 将 26ml溶解有 1.3g氯化铵的氨水溶液加入体系， 室温下搅拌反应 72小时， 反应完毕后， 加 入 7g氯化钠， 溶解后， 用二氯甲垸萃取反应液三次， 合并有机相， 40°C浓缩至干， 加入 30ml脱气水搅拌溶解至清亮， 用 2N盐酸调节溶液 _P H为 2-3 , 加入 5g氯化钠， 再次用二 氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用无水 硫酸钠干燥至澄清，过滤， 40°C浓缩至粘稠， 用 50ml乙醚沉淀， 过滤， 真空干燥， 得四臂聚乙二醇氨基-单乙酸 (V-l)。

NMR(DMSO)5: 2.96(t, CH ₂ CH ₂ NH ₂ ), 4.00(s, CH ₂ COOH)。 实施例 6: 四臂聚乙二醇羟基 -二乙酸甲酯 (IVC-1) HO— CH ₂

起始物为分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基-二乙酸 (IIIA-1)， 合成步骤与实施例 3相 同。

NMR(DMSO)8: 3.32(s， CH ₂ COOCH ₃ )， 4.13(s, CH ₂ COOCH ₃ ), 4.57(t, CH ₂ OH)。

起始物为分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基 -二乙酸甲酯 (IVC-1)， 合成步骤与实施例 4相同。 o=

NMR(DMSO)5: 3.17(s, CH ₂ OS0 ₂ CH ₃ ), 3.32(s, CH ₂ COOCH ₃ ), 4.13(s, CH ₂ COOCH ₃ ), 实施例 8: 合成四臂聚乙二醇氨基-二乙酸 (VA-1)

0—— PEG—— CH ₂ CH ₂ — ΝΗ ₂

CH

H N— CH ₂ CH ₂ —— PEG ~~ O— CH C—— CH ₂ "0—— PEG-CH ₂ — C—— OH CH ₂ O

I II

O PEG— CH ₂ — C—— OH

VA-1

起始物是分子量为 10000四臂聚乙二醇磺酸酯 -二乙酸甲酯 (IVD-1), 合成步骤与实施 例 5相同。

NMR(DMSO)6: 2.96(t, CH ₂ CH ₂ NH ₂ ), 4.00(s, CH ₂ COOH)。 实施例 9: 四臂聚乙二醇-三马来酰亚胺-单乙酸 (VB-1)

三口圆底烧瓶中，加入 1.0克分子量为 10000四臂聚乙二醇氨基-单乙酸 (V-l)，通氮气， 用 10ml二氯甲烷搅拌溶解， 加入 42μ1三乙胺， 搅拌 5分钟， 加入 0.1038gMAL-NHS， 避 光搅拌反应过夜， 次日， 40°C浓缩至干， 用 20ml异丙醇热溶解后冰水浴沉淀， 过滤， 异 丙醇洗涤滤饼 2次， 真空干燥得四臂聚乙二醇-三马来酰亚胺-单乙� �� (VB-1)。

NMR(DMSO)5: 2.32(t, CH ₂ CH ₂ NH ₂ ), 4.01(s, CH ₂ COOH), 7.00(s, ~P) 实施例 10: 四臂聚乙二醇 -三马来酰亚胺-单 NHS酯 (VI-1)

步骤：

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 避光， 称取 1.0克分子量为 10000四臂聚乙二醇-三马来酰 亚胺-单乙酸 (VB-1)和 0.01496gNHS， 用 10ml 二氯甲垸溶解， 固体全部溶解后， 加入 0.02889g DCC, 避光密闭搅拌反应过夜， 次日， 过滤， 40°C浓縮至干， 用 20ml异丙醇热 溶解后冰水浴沉淀， 过滤， 异丙醇洗涤滤饼 2次， 真空干燥得四臂聚乙二醇 -三马来酰亚 胺 -单腦酯 VI-1) _C

NMR(DMS0)5: 2.83(s, 4.60(s, CH ₂ COO)， 7.00(s, 二醇-二马来酰亚胺-二乙酸 （VC-1 )

起始物是分子量为 10000四臂聚乙二醇氨基-二乙酸 (VA-1)，合成步骤与实施例 9相同, NMR(DMSO)5: 2.32(t, CH ₂ CH ₂ NH ₂ )， 4.0 l(s, CH ₂ COOH), 7.00(s, o^) -二马来酰亚胺-二 NHS酯 (VIA-1)

起始物是分子量为 10000四臂聚乙二醇-二马来酰亚胺-二乙酸 （VC-1 ), 合成步骤与 实施例 10相同。

NMR(DMSO)5: 2.96(t, 实施例 13 : 四臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸 （VD-1 )

三口圆底烧瓶中，通氮气，称取 1.0克分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (ΙΠ-1) 和 0.0005g BHT，用 12ml二氯甲烷溶解， 加热蒸除 10%溶剂， 降温， 至室温后， 加入 49μ1 三乙胺， 搅拌 5-10分钟， 加入 25μ1丙烯酰氯， 充氮气， 避光， 体系密闭搅拌反应过夜， 次日， 30°C浓缩至粘稠， 加入 20ml水溶解至清亮， 静置 30分钟， 加入 15%氯化钠， 用稀 盐酸调节体系 pH=2-3， 用二氯甲垸萃取三次， 合并有机相， 有机相用无水硫酸钠干燥至 澄清， 过滤， 滤液 30°C浓缩至粘稠后， 加入 20ml异丙醇， 热溶解后冰水浴沉淀， 过滤， 异丙醇洗涤， 真空干燥， 得四臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸 （VD-1 )。

NMR(DMSO)S ： 4.00(s, CH ₂ COOH) ， 4.2 l(t, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ) ， 5.93(d, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ), 6.20(q, CH ₂ OCOCH=CH ₂ )， 6.36(d, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ) 实施例 14: 四臂聚乙二醇丙烯酸-单 NHS酯 （VII-1 )

步骤：

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 避光， 称取 0.8克分子量为 10000四臂聚乙二醇丙烯酸 -单. 乙酸 （VD-1 ) 和 0.011g NHS， 用 8ml二氯甲垸溶解后， 加入 0.0206g DCC， 体系避光密 闭搅拌反应过夜， 次日， 过滤， 滤液 30Ό浓缩至粘稠， 用 16ml异丙醇热溶解后冰水浴搅 拌 30分钟沉淀，过滤，异丙醇洗涤，真空干燥得� ��臂聚乙二醇丙烯酸-单 NHS酯（VII-1 )。 NMR(DMSO)5: 2.86(s, 。 ）， 4.2 l(t, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ), 4.60(s， CH ₂ COO)， .93(b,

C¾OCOCH=CH ₂ ), 6.20(4, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ), 6.36(b, C¾OCOCH=CH ₂ )。 实施例 15 : 四臂聚乙二醇丙烯酸-二乙酸 （VE-1 )

起始物是分子量为 10000四臂聚乙二醇羟基-二乙酸 (IIIA-1)，合成步骤与实施例 13相 同。

NM (DMSO)6: 4.00(s, CH ₂ COOH), 4.2 l(t, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ), 5.93(b,

CH ₂ OCOCH=CH ₂ ), 6.20(4， CH ₂ OCOCH=CH ₂ )， 6.36(b, CH ₂ OCOCH=CH ₂ )。 实施例 16: 合成四臂聚乙二醇丙烯酸-二 NHS酯 （VIIA-1 )

起始物是分子量为 10000四臂聚乙二醇丙烯酸-二乙酸 （VE-1 ), 合成步骤与实施例 14相 同。

NMR(DMSO)5: 2.86(s, 。 ）， 4.2 l(t, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ) , 4.60(s, CH ₂ COO)， 5.93(d, C¾OCOCH=CH ₂ )， 6.20(q, CH ₂ OCOCH=C¾)， 6.36(d, CH ₂ OCOCH=CH ₂ )。 实施例 17: 合成八臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (ΠΙ-2)和八臂聚乙二醇羟基-二乙酸 (IIIA-2) O― PEG—— CH CH— OH

O

HO― CH ₂ CH ₂ —— PEG—— O寸 CH ₂ C—— CH _? -0-)— PEG-CH ₂ —— C—— OH

3

CH 2

PEG—— CHoCHo— OH

III-2

PEG—— CH ₂ CH ₂ — OH

HO—— CH ₂ CH ₂ —— PEG

步骤：

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 加入 100g 8ARM-PEG-10K和 800mlTHF， 加热溶解， 蒸 出约 20%溶剂， 降温， 加入 8.96g叔丁醇钾， 室温下反应 2小时， 滴加 10.34ml溴乙酸叔 丁酯， 室温下过夜反应， 次日过滤， 反应液浓缩至粘稠， 加入 1000ml碱解液（1000ml 7_K 中加入 16.32g氢氧化钠和 155.04g磷酸钠）， 80°C碱解 2小时， 用 2N盐酸溶液调节溶液 pH为 2-3， 在溶液中加入 15%氯化钠， 用二氯甲垸萃取三次， 合并有机相， 用无水硫酸钠 干燥， 过滤， 50°C浓缩至粘稠， 加入乙醚沉淀， 真空干燥。 40g粗品配成的水溶液， DEAE 阴离子柱分离， 分别收集氯化钠水溶液洗脱液， 水相分别用 2N盐酸调 pH为 2-3， 用二氯 甲垸萃取， 合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩， 用乙醚沉淀， 分别得到分子量 为 10000八臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (ΠΙ-2)和八臂聚乙二醇羟基-二乙酸 (ΠΙΑ-2)。

N R(DMSO)8: 4.0 l(s, CH ₂ COOH), 4.54(t, CH ₂ OH)。 实施例 18: 八臂聚乙二醇羟基 -单乙酸甲酯 (ΠΙΒ-2)

HO― CH ₂

步骤： 单口圆底烧瓶中，加入 4.0克分子量为 10000八臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (111-2)，用 20ml 无水甲醇溶解， 冰水浴， 滴加 0.8ml浓硫酸， 室温下反应 3小时， 用 8%碳酸氢钠水溶液 调节体系 pH为 7.0，用二氯甲垸萃取三次，合并有机相，有机 相用无水硫酸镁干燥，过滤， 40°C浓缩至粘稠， 用乙醚沉淀， 真空干燥， 得八臂聚乙二醇羟基 -单乙酸甲酯 (ΠΙΒ-2)。

NMR(DMSO)5: 3.32(s, CH ₂ COOCH ₃ ), 4.13(s, CH ₂ COOCH ₃ )， 4.57(t, C¾OH)。 实施例 19: 八臂聚乙二醇磺酸酯 -单乙酸甲酯 (IIIC-2)

CH

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 加入分子量为 10000八臂聚乙二醇羟基 -单乙酸甲酯 3.0g， 用 50ml甲苯溶解， 加热蒸出 38ml甲苯至流馏出液清亮， 降至室温， 加入 5ml二氯甲烷， 搅拌 10分钟，加入 439μ1三乙胺，搅拌 5分钟，滴加入 220μ1甲基磺酰氯，密闭反应过夜， 次日， 加入 1.44ml无水乙醇， 搅拌 15分钟， 过滤， 60Ό浓缩至粘稠， 用 60ml异丙醇热 溶解后冰水浴沉淀， 过滤， 滤饼用异丙醇洗涤一次， 真空干燥， 得八臂聚乙二醇磺酸酯- 单乙酸甲酯 (IIIC-2)。

NMR(DMSO)S: 3.17(s, C¾OS0 ₂ CH ₃ )， 4.13(s, CH ₂ COOCH ₃ )， 4J0(t, CH ₂ OS0 ₂ CH ₃ )。 实施例 20: 合成八臂聚乙二醇氨基-单乙酸 (V-2)

V-2 步骤：

单口圆底烧瓶中，加入 2.6克分子量为 10000八臂聚乙二醇磺酸酯 -单乙酸甲酯溶解在 7.8ml脱气水中， 用 2N氢氧化钠水溶液调节溶液 pH为 12.0， 室温下反应 2-2.5小时， 将 26ml溶解有 1.3g氯化铵的氨水溶液加入体系， 室温下搅拌反应 72小时， 反应完毕后， 加 入 7g氯化钠， 溶解后， 用二氯甲垸萃取反应液三次， 合并有机相， 40°C浓缩至干， 加入 30ml水搅拌溶解至清亮， 用 2N盐酸调节溶液 pH为 2-3， 加入 5g氯化钠， 再次用二氯甲 垸萃取三次， 合并有机相， 有机相用无水硫酸钠干燥至澄清， 过滤， 40Ό浓缩至粘稠， 用 50ml乙醚沉淀， 过滤， 真空干燥， 得八臂聚乙二醇氨基-单乙酸 (V-2)。

NMR(DMSO)5: 2.96(t, CH ₂ CH ₂ NH ₂ ), 4.00(s， CH ₂ COOH)。 实施例 21 : 合成八臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸（VI-2 )

-

步骤：

三口圆底烧瓶中，通氮气，称取 1.0克分子量为 10000八臂聚乙二醇羟基-单乙酸 (ΙΠ-2) 和 0.0005g BHT，用 12ml二氯甲垸溶解，加热蒸除 10%溶剂， 降温，至室温后，加入 115μ1 三乙胺， 搅拌 5-10分钟， 加入 59μ1丙烯酰氯， 充氮气， 避光， 体系密闭搅拌反应过夜， 次日， 30 C浓缩至粘稠， 加入 20ml溶解至清亮， 静置 30分钟， 加入 15%氯化钠， 用稀盐 酸调节体系 pH=2-3， 用二氯甲烷萃取三次， 合并有机相， 有机相用无水硫酸钠干燥至澄 清， 过滤， 滤液 30Ό浓缩至粘稠后， 加入 20ml异丙醇， 热溶解后冰水浴沉淀， 过滤， 异 丙醇洗涤， 真空干燥， 得八臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸 （VI-2)。

NMR(DMSO)5 ： 4.00(s, CH ₂ COOH) , 4.2 l(t, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ) ， 5.93(d, CH ₂ OCOCH=CH ₂ )， 6.20(q, C OCOCH=CH ₂ ), 6.36(d, CH ₂ OCOCH=CH ₂ )。 实施例 2 -单 NHS酯 （VII-2)

步骤：

三口圆底烧瓶中， 通氮气， 避光， 称取 0.8克分子量为 10000八臂聚乙二醇丙烯酸-单 乙酸（VI-2)和 O.Ol lg NHS, 用 8ml二氯甲垸溶解后， 加入 0.0206g DCC, 体系避光密闭 搅拌反应过夜， 次日， 过滤， 滤液 30°C浓缩至粘稠， 用 16ml异丙醇热溶解后冰水浴搅拌 30分钟沉淀， 过滤， 异丙醇洗 ， 真空干燥得八臂聚乙二醇丙烯酸-单 NHS酯 （VII-2)。

NMR(DMSO)5: 2.86(s, . ^), 4.21(t, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ), 4.60(s, CH ₂ NHS)， 5.93(d, C¾OCOCH=CH ₂ ), 6.20(q, CH ₂ OCOCH=C¾)， 6.36(d, CH ₂ OCOCH=CH ₂ ) = 实施例 23 : 八臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸 （VI-2) 与依诺替康衍生物的结合物 将 1克分子量为 10000八臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸（VI-2) (实施例 21中制得）溶在 10毫升二氯甲垸中， 再加入 0.12克依诺替康甘氨酸酯 （Glycine-Irrinitecan) ( Irrinitecan 购自成都福润德实业有限公司）、 50毫克的二甲基氨基吡啶和 95毫克的二环己基碳二亚 胺。 此溶液在室温下搅拌 6小时， 减压回收溶剂， 残余物添加 20毫升 1，4-二氧六环溶解。 过滤除去沉淀， 溶液浓缩， 剩余物加入 20毫升乙醚中， 过滤收集沉淀再用乙醚洗涤后真 空干燥。 产率： 0.8克 （80% ), 熔点： 46— 50°C。 实施例 24: 合成稳定八臂聚乙二醇丙烯酸带药凝胶 将 0.5克分子量为 10000的八臂聚乙二醇丙烯酸-单乙酸（VI-2)与依� ��替康衍生物的 结合物 (实施例 23中制得）溶于 10ml磷酸盐缓冲液 （ρΗ 7.4)。 将 0.4克分子量为 5000四 臂聚乙二醇 SH (键凯产品)溶于 10ml磷酸盐缓冲液（pH 7.4) 。 迅速将二溶液混合， 静置， 八臂聚乙二醇凝胶在 2分钟之内形成。将所形成的凝胶放入 100毫升磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中， 在 37°C下保存， 凝胶在 360天内稳定， 不降解不溶化，但依诺替康缓慢释放。