Gebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist Verfahren zur Herstellung von mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoffen umfassend die Verfahrensschritte

A) Umsetzen einer Kohlenstoffquelle umfassend mindestens eine ausgewählt aus C0 ₂ und CO zu Acetat und/oder Ethanol mit einem ersten Mikroorganismus,

B) Abtrennen des Acetats und/oder Ethanols von dem ersten Mikroorganismus,

C) Umsetzen des Acetats und/oder Ethanols zu einem mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoff mit einem zweiten Mikroorganismus und gegebenenfalls

D) Aufreinigung des mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoffs.

Stand der Technik

Die Verwendung von C0 ₂ als Kohlenstoffquelle zur Synthese organischer Verbindungen in mikrobiologischen Verfahren ist in der Literatur oft beschrieben.

In der Regel wird im Stand der Technik versucht, zwei sich ergänzende Stoffwechselwege aus verschiedenen Organismen in einer rekombinanten Zelle abzubilden, mit deren Hilfe sich dann die organische Substanz synthetisieren lässt.

Hier stellt sich das Problem, dass die verschiedenen Organismen, deren Eigenschaften zusammengeführt werden sollen, sehr hoch spezialisierte Organismen aus Nischen darstellen, und man daher schwerlich die Summe aller damit einhergehenden Vorteile in einer Zelle vereinigen kann. Zusätzlich erschwert eine mangelnde genetische Zugänglichkeit dieser Organismen die gewünschte Manipulation.

Alternative Verfahren zur Verwendung von C0 ₂ als Kohlenstoffquelle beeinflussen einen Mikroorganismus, der bekannt dafür ist, C0 ₂ fixieren zu können, durch eine bestimmte Auswahl der Fermentationsparameter, so dass dieser eine gewünschte, einfache organische Substanz, wie beispielsweise Ethanol, n-Butanol oder 2,3-Butandiol, vermehrt synthetisiert. Die WO200068407 beschreibt den Einsatz von acetogenen Bakterien zur Herstellung von Ethanol, die WO2012024522 den Einsatz von acetogenen Bakterien zur Herstellung von Butandiol. Alle beschriebenen Verfahren haben zum Nachteil, dass die Ausbeuten gering sind und das der Einsatz eines einzigen Zelltypus keine Flexibilität bei den Fermentationsbedingungen ermöglicht.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren bereitzustellen, was mindestens einen Nachteil des Standes der Technik zu überwinden vermag.

Beschreibung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene, mehrstufige Verfahren mit einer Trennung von Acetat-Produktion aus C0 ₂ und/oder CO von der Acetat- Weiterverarbeitung auf einfachste Art und Weise Nachteile des Standes der Technik zu lösen vermag.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ein Verfahren wie in Anspruch 1 und den weiteren unabhängigen Ansprüchen beschrieben.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass C0 ₂ /CO Mischungen ein wesentlich günstigerer Rohstoff, der zudem aus verschiedenen Quellen, wie Erd- und Biogas, Kohle, Öl sowie Pflanzenreststoffen hergestellt werden kann, sind.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die hohe Kohlenstoffausbeute.

Diese wird durch die Rückführung von gebildetem C0 ₂ ermöglicht. Das C0 ₂ kann nämlich in der ersten Stufe wieder zu Essigsäure umgesetzt werden.

Ein weiterer Vorteil liegt in der größeren Flexibilität hinsichtlich der angewandten

Fermentationsbedingungen, da für die eigentliche Produktion in dem erfindungsgemäßen Verfahrensschritt C) ein anderer Organismus eingesetzt wird, als bei der Kohlenstofffixierung im Acetat.

Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass durch den Einsatz von Acetat und/oder Ethanol, insbesondere Acetat, als C-Quelle in Verfahrensschritt C) sich andere Produktzusammensetzungen ergeben können, als wenn in Verfahrensschritt C) ein Zucker eingesetzt wird.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten

Kohlenwasserstoffen umfassend die Verfahrensschritte

A) Umsetzen einer Kohlenstoffquelle umfassend mindestens eine ausgewählt aus C0 ₂ und CO zu Acetat und/oder Ethanol, insbesondere Acetat, mit einem ersten

Mikroorganismus,

B) Abtrennen des Acetats und/oder Ethanols, insbesondere Acetats, von dem ersten

Mikroorganismus,

C) Umsetzen des Acetats und/oder Ethanols, insbesondere Acetats, zu einem mit

mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoff mit einem zweiten Mikroorganismus und gegebenenfalls

D) Aufreinigung des mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoffs, bevorzugt mit mindestens 3, insbesondere mindestens 4 Kohlenstoffatomen.

Unter dem Begriff„Acetat" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind sowohl Essigsäure als auch ihre Salze zu verstehen; dies ergibt sich zwangsläufig daher, da die

Mikroorganismen im wässrigen Milieu arbeiten, und somit immer ein Gleichgewicht zwischen Salz und Säure vorliegt.

Unter dem Begriff„zweiter Mikroorganismus" ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein anderer als der„erste Mikroorganismus" aus Verfahrensschritt A) zu verstehen. Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in Verfahrensschritt A) von einem ersten

Mikroorganismus aus einer Kohlenstoffquelle enthaltend Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid Acetat und/oder Ethanol gebildet; dieser Formulierung beinhaltet, dass mindestens teilweise das Acetat und/oder Ethanol aus Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid entsteht.

In Bezug auf die Quelle der Substrate Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid ist offenbar, dass viele mögliche Quellen zur Bereitstellung von CO bzw. C0 ₂ als Kohlenstoffquelle existieren. Es ist ersichtlich, dass in der Praxis als Kohlenstoffquelle der vorliegenden Erfindung jedes Gas bzw. jede Gasmischung eingesetzt werden kann, welche in der Lage ist, die Mikroorganismen mit genügenden Mengen an Kohlenstoff zu versorgen, damit diese Acetat und/oder Ethanol zu bilden vermögen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, dass die Kohlestoffquelle bereitgestellt wird durch Abgase wie beispielsweise Synthesegas, Rauchgas, Erdölraffinerieabgase, durch Hefegärung oder clostridielle Gärung entstandene Gase, Abgase aus der Vergasung zellulosehaltige Materialien oder der Kohlevergasung.

In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass mindestens ein Teil des Kohlendioxids und/oder Kohlenmonoxids ein Nebenprodukt des Verfahrensschrittes C) des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt. Dieses hat den technischen Effekt, dass die

Kohlenstoffausbeute über den gesamten Prozess 100% beträgt.

Diese Abgase müssen nicht notwendigerweise als Nebenerscheinungen anderer Prozesse entstanden sein, sondern können extra für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren produziert werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die

Kohlenstoffquelle Synthesegas.

Synthesegas kann z.B. aus dem Nebenprodukt der Kohlevergasung bereitgestellt werden. Der Mikroorganismus wandelt folglich eine Substanz, die ein Abfallprodukt ist, in einen wertvollen Rohstoff um.

Alternativ kann Synthesegas durch die Vergasung von weit verfügbaren, preiswerten landwirtschaftlichen Rohstoffen für das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt werden.

Es gibt zahlreiche Beispiele an Rohstoffen, die in Synthesegas umgewandelt werden können, da fast alle Vegetationsformen zu diesem Zwecke genutzt werden können. Bevorzugte

Rohstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend perennierende Gräser wie Chinaschilf,

Getreiderückstände, Verarbeitungsabfälle wie Sägemehl.

Im Allgemeinen wird Synthesegas in einer Vergasungsapparatur aus getrockneter Biomasse gewonnen, hauptsächlich durch Pyrolyse, partielle Oxidation und Dampfreformierung, wobei die

Primärprodukte CO, H ₂ und C0 ₂ sind.

Normalerweise wird ein Teil des Produktgases aufbereitet, um Produkterträge zu optimieren und Teerbildung zu vermeiden. Das Cracken des unerwünschten Teers in Synthesegas und CO kann unter Einsatz von Kalk und/oder Dolomit durchgeführt werden. Diese Prozesse werden im Detail in z.B. Reed, 1981 beschrieben (Reed, T.B., 1981 , Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.)

Es können auch Mischungen verschiedener Quellen als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden. Generell ist es im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass die Kohlenstoffquelle in Verfahrensschritt A) mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% C0 ₂ und/oder CO enthält, wobei sich die Gew.-% auf alle Kohlenstoffquellen, die dem Mikroorganismus in Verfahrensschritt A) zur Verfügung stehen, beziehen.

In Verfahrensschritt A) wird bevorzugt ein reduzierendes Agens, bevorzugt Wasserstoff zusammen mit dem Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid der Reaktion zugeführt.

Daher ist ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle in Verfahrensschritt A) Synthesegas umfasst, insbesondere aus Synthesegas besteht.

Mikroorganismen, welche C0 ₂ und/oder CO zu Acetat und/oder Ethanol, insbesondere Acetat, umsetzen, sowie geeignete Verfahren und Verfahrensbedingungen, die in Verfahrensschritt A) zum Einsatz kommen sind seit langem bekannt. Solche Prozesse werden beispielsweise in der WO9800558, WO2000014052, WO2010115054

in Demier et al. Reaction engineering analysis of hydrogenotrophic production of acetic acid by Acetobacterium woodii. Biotechnol Bioeng. 2011 Feb; 108(2):470-4,

in Younesia et al. Ethanol and acetate production from synthesisgas via fermentation processes using anaerobic bacterium, Clostridium ljungdahlii. Biochemical Engineering Journal, Volume 27, Issue 2, Pages 110-119,

in Morinaga et al. The production of acetic acid from carbon dioxide and hydrogen by an anaerobic bacterium. Journal of Biotechnology, Volume 14, Issue 2, Pages 187-194, in Li Production of acetic acid from synthesis gas with mixed acetogenic microorganisms, ISSN

0493644938,

in Schmidt et al. Production of acetic acid from hydrogen and carbon dioxide by Clostridium species ATCC 2979. Chemical Engineering Communications, 45: 1 -6, 61 -73,

in Sim et al. Optimization of acetic acid production from synthesis gas by chemolithotrophic bacterium - Clostridium aceticum using a Statistical approach. Bioresour Technol. 2008 May;99(8):2724-35,

in Vega et al. Study of gaseus Substrate fermentations CO conversion to acetate 1 Batch culture bzw. 2 continous culture. Biotechnology and Bioengineering Volume 34, Issue 6, pages 774, bzw. 785, September 1989, in Cotter et al. Ethanol and acetate production by Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum using resting cells. Bioprocess and Biosystems Engineering (2009), 32(3), 369-380 und

in Andreesen et al. Fermentation ofglucose, fructose, and xylose by Clostridium

thermoaceticum. Effect of metals on growth yield, enzymes, and the synthesis of acetate from carbon dioxide. Journal of Bacteriology (1973), 1 14(2), 743-51 beschrieben.

Dem Fachmann bietet sich hieraus eine große Anzahl von ausführbaren Möglichkeiten zur Auslegung des Verfahrensschrittes A), die allesamt gut funktionieren.

Besonders geeignet sind in diesem Zusammenhang acetogene Bakterien. Die Gruppe der acetogenen Bakterien gehört zu den anaerobe Prokaryoten, die C0 ₂ als terminalen

Elektronenakzeptor nutzen können und dabei Acetat bzw. Ethanol bilden. Gegenwärtig werden 21 verschiedenen Gattungen zu den Acetogenen gezählt (Drake et al., 2006), wozu auch einige Clostridien zählen (Drake & Kusel, 2005). Sie sind in der Lage, Kohlendioxid oder auch

Kohlenmonoxid als Kohlenstoff- und Wasserstoff als Energiequelle zu nutzen (Wood, 1991 ). Daneben können auch Alkohole, Aldehyde, Carbonsäuren sowie zahlreiche Hexosen als

Kohlenstoff-Quelle genutzt werden (Drake et al., 2004). Der reduktive Stoffwechselweg, der zur Bildung von Acetat führt wird als Acetyl-CoA- oder Wood-Ljungdahl-Weg bezeichnet.

Somit ist es bevorzugt , dass in Verfahrensschritt A) des erfindungsgemäßen Verfahrens als erster Mikroorganismus ein acetogenes Bakterium eingesetzt wird. Besonders bevorzugt werden acetogene Bakterien eingesetzt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Clostridium autothenogenum DSMZ 19630, Clostridium ragsdahlei ATCC no. BAA-622, Clostridium autoethanogenum, Moorella sp HUC22-1, Moorella thermoaceticum, Moorella

thermoautotrophica, Rumicoccus productus, Acetoanaerobum, Oxobacter pfennigii,

Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Carboxydothermus, Desulfotomaculum kutznetsovii, Pyrococcus, Peptostreptococcus, Butyribacterium methylotrophicum ATCC 33266, Clostridium formicoaceticum, Clostridium butyricum, Laktobacillus delbrukii, Propionibacterium acidoprprionici, Proprionispera arboris, Anaerobierspirillum succiniproducens, Bacterioides amylophilus, Becterioides ruminicola, Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ATCC 29797 und Clostridium carboxidivorans, insbesondere ATCC BAA-624. Ein besonders geeignetes Bakterium ist Clostridium carboxidivorans, insbesondere solche Stämme wie "P7" und "P11 ". Solche Zellen sind beispielsweise in US 2007/0275447 und US

2008/0057554 beschrieben. Ein weiteres, besonders geeignetes Bakterium ist Clostridium ljungdahlii, insbesondere Stämme ausgewählt aus der Gruppe umfassend Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii C0I und Clostridium ljungdahlii 0-52, diese werden in der WO 98/00558 und WO 00/68407 beschrieben, sowie ATCC 49587, ATCC 55988 und ATCC 55989. In einem besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Verfahrensschritt A) Ethanol gebildet und als Mikroorganismus Alkalibaculum bacchi ATCC BAA-1772, Moorella sp. HUC22-1 , Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdahlei, oder Clostridium autoethanogenum eingesetzt. Entsprechende Anweiseungen zur Durchführung des Verfahrensschrittes A) erhält man aus beispielsweise Saxena et al. Effect of trace metals on ethanol production from synthesis gas by the ethanologenic acetogen Clostridium ragsdalei. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology Volume 38, Number 4 (201 1), 513-521 , Younesi et al. Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacteriumClostridium ljungdahlii. Biochemical Engineering Journal Volume 27, Issue 2, 15 December 2005, Pages 110-119,

Sakai et al. Ethanol production from H2 and C02 by a newly isolated thermophilic bacterium, Moorella sp. HUC22-1. Biotechnology Letters Volume 26, Number 20 (2004), 1607-1612 und Abrini et al. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of Microbiology Volume 161 , Number 4 (1994), 345- 351.

Verfahrensschritt A) wird bevorzugt unter anaeroben Bedingungen ausgeführt.

In Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in Verfahrensschritt A) gebildete Acetat und/oder Ethanol, insbesondere Acetat, von dem ersten Mikroorganismus abgetrennt.

Im einfachsten Fall werden die Mikroorganismen beispielsweise durch bekannte Verfahren wie Sedimentation, Zentrifugation oder Filtration als Feststoff von dem Medium enthaltend das Acetat und/oder Ethanol, insbesondere Acetat, entfernt und gegebenenfalls die verbleibende flüssige Phase dem Verfahrensschritt C) direkt zugeführt wird. Das direkte Zuführen hat den Vorteil, dass gegebenenfalls aus Verfahrensschritt A) noch zusätzlich enthaltene

Medienbestandteile wie zum Beispiel Vitamine, Spurenelemente oder Induktoren ebenfalls in Verfahrensschritt C) dem zweiten Mikroorganismus zur Verfügung stehen und ist somit bevorzugt. Es kann in diesem Zusammenhang vorteilhaft und somit bevorzugt sein, die

Konzentration des Acetats und/oder Ethanols, insbesondere Acetats, vor Zuführung in Verfahrensschritt C) zu erhöhen, beispielsweise durch Entfernung von mindestens Teilen von anwesendem Wasser.

Ebenso kann das Acetat selber von den Mikroorganismen in Verfahrensschritt A) mittels Extraktion, insbesondere mittels in situ Extraktion, entfernt werden. Geeignete

Extraktionsverfahren sind dem Fachmann bekannt, so zum Beispiel aus der EP2294206, der WO2000014052, der US 4405717, aus Katikaneni et al. Purification of Fermentation-Derived Acetic Acid By Liquid-Liquid Extraction and Esterification. Ind. Eng. Chem. Res. 2002, 41 , 2745- 2752, und aus Huh et al. Selective extraction of acetic acid from the fermentation broth produced by Mannheimia succiniciproducens. Biotechnol Lett. 2004 Oct;26(20):1581 -4.

Geeignete Extraktionsmittel werden beispielsweise unter Punkt A The modified solvent and solvent/co-solvent mixture auf den Seiten 8 bis 17 der WO2000014052 beschrieben.

Bei einer Abtrennung des Acetats durch Extraktion sind als Extraktionsmittel insbesondere Alkylamine oder leichtsiedende Lösungsmittel wie MTBE oder Ethylacetat bevorzugt enthalten, wobei es sich bei den Alkylaminen bevorzugt um solche mit mindestens 16 C-Atomen, bevorzugt um Trialkylamine und besonders bevorzugt um Trialkylamine ausgewählt aus der Gruppe umfassend Trihexylamin, Trioctylamin, Tridecylamin, Tricaprylamin, Tridodecylamin handelt. Diese Trialkylamine umfassenden Extraktionsmittel werden bevorzugt in Verbindung mit einer in situ Extraktion in Verfahrensschritt B) eingesetzt. Dies hat den technischen Effekt, dass der erste Mikroorganismus nicht geschädigt wird und den zusätzlichen Vorteil, dass Verfahrensschritt B) im Gegenstromverfahren durchgeführt werden kann, was zusätzlich bevorzugt ist.

Insbesondere wird als Extraktionsmittel in Verfahrensschritt B) eine Mischung aus Trioctylamin und 2-Ethyl-1-Hexanol eingesetzt, wobei diese bevorzugt in gleichen Mengen eingesetzt werden.

Für detaillierte Verfahrensanweisungen sei auf die EP2294206 und die dort beschrieben Verfahrensschritte A) und B) verwiesen.

In Verfahrensschritt C) wird das Acetat und/oder Ethanol, insbesondere Acetat, mit einem zweiten Mikroorganismus zu einem mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoff umgesetzt.

Bei dem mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe

substituierten Kohlenwasserstoff handelt es sich bevorzugt um Carbonsäuren, Dicarbonsäuren, Hydroxycarbonsäuren, Carbonsäureester, Hydroxycarbonsäureester, Alkohole, Aldehyde, Ketone, welche insbesondere 4 bis 32, bevorzugt 6 bis 20, besonders bevorzugt 8 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen. Besonders bevorzugt sind Carbonsäuren, Hydroxycarbonsäuren und Carbonsäureester.

Bei dem zweiten Mikroorganismus handelt es sich bevorzugt um Hefen oder Bakterien

Bei dem zweiten Mikroorganismus handelt es sich bevorzugt um einen gentechnisch veränderten Stamm, welcher insbesondere bezüglich der Ausbeute an dem mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoff gentechnisch optimiert wurde.

Der Fachmann kennt aus dem Stand der Technik für das jeweilige Zielmolekül geeignete zweite Mikroorganismen und die anzuwendenden Verfahrensbedingungen.

So beschreibt die

WO2011 127409, WO200911 1672 und WO2010062480 geeignete zweite Mikroorganismen und Verfahren für die Herstellung von Fettalkoholen,

die WO2012017083 für die Herstellung von Fettsäureethylestern,

die WO201 1157848, WO201 1059745, WO 2009140695, WO2007106903 und WO2009124694 für die Herstellung von Fettsäuren,

die WO2010126891 für die Herstellung von Alkoholen, Fettsäuren und Fettsäureestern, die WO20101 18410, WO201002171 1 und WO2010022090 für die Herstellung von

Fettsäureestern,

die WO2010042664 und WO 2009140695 für die Herstellung von Fettsäurealdehyden, die WO2012038390, WO2007077568 und WO201 1153317 für die Herstellung von

Dicarbonsäuren und

die WO201 1008232, WO 2009156214, WO2007141208, WO2004003213, GB2473755 und EP11 191923.9 für die Herstellung von Hydroxycarbonsäuren.

Es handelt sich in einer bevorzugten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens bei dem mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoff um Fettsäuren, insbesondere um lineare, gesättigte, Fettsäuren mit 4 bis 32, bevorzugt 6 bis 20, besonders bevorzugt 8 bis 12 Kohlenstoffatomen. In diesem

Zusammenhang handelt es sich bei dem zweiten Mikroorganismus insbesondere um einen Mikroorganismus, der im Vergleich zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens einer Thioesterase aufweist. Unter dem Begriff„im Vergleich zu seinem Wildtyp eine

gesteigerte Aktivität" ist zu verstehen, dass der Mikroorganismus gentechnisch verändert wurde, so dass er diese gesteigerte Aktivität aufweist. Bevorzugt wird hierunter eine Überexpression einer Thioesterase bzw. eine Expression einer exogenen Thioesterase verstanden. In diesem Zusammenhang bevorzugte Thioesterasen sind ausgewählt aus Acyl- ACP-Thioesterasen, bevorzugt der EC 3.1.2.14 oder EC 3.1.2.22 und Acyl-CoA-Thioesterasen, bevorzugt der EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 oder EC 3.1.2.22. Bevorzugte zweite Mikroorganismen, die in der erfindungsgemäßen Alternative eingesetzt werden, sind in der WO20101 18410, WO2010075483, WO2008119082 und WO2007136762 offenbart, auf den Offenbarungsgehalt dieser Schriften wird hinsichtlich dieser Mikroorganismen und hinsichtlich dieser Thioesterasen ausdrücklich verwiesen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der Fettsäure um Oktan- und/oder Dekansäure und bei der Thioesterase um das Genprodukt von fatB2 aus Cuphea hookeriana.

Es handelt sich in einer bevorzugten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens bei dem mit mindestens einer, mindestens ein Sauerstoffatom enthaltenden Gruppe substituierten Kohlenwasserstoff um Hydroxycarbonsäuren, insbesondere um omega-Hydroxycarbonsäuren oder Hydroxyisobuttersäuren, insbesondere um 3-Hydroxyisobuttersäure. In diesem

Zusammenhang betreffend Hydroxyisobuttersäuren handelt es sich bei dem zweiten

Mikroorganismus insbesondere um Mikroorganismen, welche in der WO2009156214,

WO2007141208, WO2009135074 und EP11 191923.9 offenbart sind, auf den

Offenbarungsgehalt dieser Schriften wird hinsichtlich dieser ausdrücklich verwiesen. In diesem Zusammenhang betreffend omega-Hydroxycarbonsäure handelt es sich bei dem zweiten Mikroorganismus insbesondere um Mikroorganismen, welche in der WO2011008232 offenbart sind, auf den Offenbarungsgehalt dieser Schrift wird hinsichtlich dieser ausdrücklich verwiesen. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass in Verfahrensschritt C) entstandene Kohlendioxid dem Verfahren in Verfahrensschritt A) wieder zugeführt wird und somit als C-Quelle zur Verfügung steht. Dies hat den technischen Effekt, dass die Kohlenstoffausbeute bei 100% liegt.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten

Ausführungsformen beschränkt sein soll.

Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele: Abbildung 1 : Fettsäureproduktion in E. coli von aus Synthesegas mikrobiell hergestelltem Acetat

Beispiele

Beispiel 1: Verfahrensschritt A) Acetat- und Ethanolbildung

Eine Lebendkultur von Clostridium carboxidivorans DSMZ 15243 wurde in 1 I

Anaerobierflaschen in 200 ml modifiziertem PETC Medium nach Hurst bestehend aus 1 g Hefeextrakt, 19 g MES, 30 ml Mineralsalzlösung, 10 ml Spurenelementelösung, 10 ml

Vitaminlösung in 1 I dd Wasser befüllt. Der pH wurde mit 0,5 M NaOH auf einen pH von 5,9 eingestellt. Die Mineralsalzlösung besteht aus 80 g Natriumchlorid, 100 g Ammoniumchlorid, 10 g Kaliumchlorid, 10 g Kaliummonophosphat, 20 g Magnesiumsulfat, 4 g Calciumchlorid per Liter. Die Vitaminlösung besteht aus 0,01 g Pyridoxin, 0,005 g Thiamin, 0,005 g Riboflavin, 0,005 g Calciumpantothenat, 0,005 g Thioctsäure, 0,005 g (para)-Aminobenzoesäure, 0,005 g Nicotinsäure, 0,005 g Vitamin B12, 0,002 g Biotin, 0,002 g Folsäure, 0,01 g MESNA per Liter. Die Spurenelementelösung besteht aus besteht aus 2 g Nitriloessigsäure, 1 g Mangansulfat, 0,8 g Eisenammoniumsulfat, 0,2 g Cobaltchlorid, 0,2 g Zinksulfat, 0,02 g Kupfer(ll)-chlorid, 0,02 g Nickelchlorid, 0,02 g Natriummolybdat, 0,02 g Natriumselenat, 0,02 g Natriumwolframat per Liter.

Das Medium wurde 20min gekocht und anschließend 20 Minuten mit reinem Stickstoff begast. Danach wurde es für 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium 3x mit einer Gasmischung von 50% CO, 45% H2 und 5% C0 ₂ bis zu 1 bar Überdruck beschickt. Danach wurde der Druck auf 0,8 bar Überdruck eingestellt. Direkt vor dem Animpfen erfolgte unter sterilen, anaeroben Bedingungen die Zugabe von 1 ,5 ml einer jeweils 4%igen Lösung von Natriumsulfit/Cysteinhydrochlorid als Reduktionsmittel.

Die Kultur wurde bei 37°C mit 100 upm (5 cm Exzentrizität) kultiviert. Die Kultur wurde jeweils nach 72 Stunden in ein neues Medium überimpft.

Aus einer solchen 48h alten Kultur wurde das Inokulum für die Produktherstellung entnommen. Dazu wurde ein 21 Rührkessel , Labfos 2 der Firma Infors HT mit 900 ml des oben

beschriebenen modifizierten PETC Mediums -exklusive MESNA- ohne die Vitaminlösung befüllt und für 20 Minuten mit Stickstoff begast. Danach wurde der Kessel für 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Anschließend wurde die Vitaminlösung unter sterilen anaeroben Bedingungen zugegeben.

Der pH wurde während der gesamten Fermentation mit 0,5 M NaOH und 0,5 M HCl auf 5,9 geregelt.

Die Gasmischung wurde mit einer Gasmischstation WMR 4000 von Westphal Mess- und Regeltechnik auf 80 %CO und 20 % C0 ₂ eingestellt. Die Begasung erfolgte konstant mit 5 l/h. Die Rührergeschwindigkeit wurde auf konstant 400rpm eingestellt, was einem Leistungseintrag von 0,2 W/l entspricht.

Direkt vor dem Animpfen erfolgte unter sterilen, anaeroben Bedingungen die Zugabe von 7,5 ml einer jeweils 4 %igen Lösung von Natriumsulfit/Cysteinhydrochlorid als Reduktionsmittel.

Das Inokulum betrug 10% und wurde ebenfalls unter sterilen, anaeroben Bedingungen 30 Minuten nach Beginn der Begasung zugegeben. Die Start-OD ₆ oo betrug 0,055.

Über ein Steigrohr wurden mittels einer Spritze nach 0 / 14,4 / 16,8 / 20,8 / 24,2 / 38,7h 3 ml Probe gezogen.

Die Konzentration an Essigsäure, Ethanol, Buttersäure und Butanol wurde über

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Die Säule Aminex HPX-87H wurde als stationäre Phase verwendet. Als Laufmittel kam 5 mM Schwefelsäure bei einer konstanten Flussrate von 0,6 ml/min zum Einsatz. Die Temperatur der Säule betrug 40°C. Der Nachweis von Ethanol und Butanol erfolgte mittels Brechungsindex-Detektor, für den Nachweis von Essigsäure und Buttersäure wurde ein Diodenarray-Detektor bei einer Wellenlänge von 210 nm verwendet. Die Stoffkonzentrationen wurden über die Peakfläche anhand von

Kalibriergeraden definierter Konzentrationen bestimmt.

Nach 38,7 Stunden wurden 0 mM Butanol, 1 ,42 mM Butyrat, 3,33 mM Ethanol und 54,26 mM Acetat gemessen. Das entspricht einem Acetatanteil von 91 ,95%.

Beispiel 2: Verfahrensschritt B) Acetatabtrennung

Der pH der Fermentationsbrühe wurde nach Abtrennung der Zellen durch Zugabe von Essigsäure auf einen pH von unter 3,0 gesenkt. Danach wurde der Fermentationsbrühe eine Tri-n-Oktylaminlösung in 1-Octanol im Verhältnis 1 : 1 zugegeben und bei einer Rührergeschwindigkeit von mindestens 1000 rpm bei 25°C bis zu 2 Stunden mit der Fermentationsbrühe vermischt. Die anschließende Phasentrennung erfolgte durch Zentrifugation. Aus der organischen Phase wurde danach bei 120 °C und 500 mbar Überdrück die Essigsäure destilliert. Der Essigsäuregehalt des Destillats wurde durch HPLC bestimmt und die Lösung in der entsprechenden Konzentration in der weiteren Fermentation (vgl. Beispiel 3 und 4 und 6) eingesetzt.

Beispiel 3: Umsetzung von Acetat zu C8 und C10 Fettsäuren in rekombinanten E.coli

Der Stamm E. coli JW5020-1 (AfadE), erhältlich bei Yale CGSC, The Coli Genetic Stock Center, wurde mit einer Impföse von einer Kryokultur auf eine LB Agarplatte bestehend aus 5 g

Hefeextrakt, 10 g Pepton, 0,5g Natriumchlorid und 15 g Agar-Agar pH 7 ausgestrichen. Der Stamm E.coli JW5020-1 (AfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] wurde mit einer Impföse aus einer Kryokultur auf einer LB-Platte, die zusätzlich 100 mg/ml Ampicillin enthält ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.

Der Stamm E.coli JW5020-1 (AfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] ist transformiert mit einem Expressionsvektoren für das Gen fatB2 aus Cuphea hookeriana. Zur Herstellung des vorgenannten Vektors wurde dieses Gen für die Expression in Escherichia coli codonoptimiert. Das Gen wurde zusammen mit einem fac-Promotor synthetisiert und gleichzeitig eine

Schnittstelle stromaufwärts des Promotors und eine Schnittstelle stromabwärts des Terminators eingeführt. Das synthetisierte DNA-Fragment P _tac -ChFatB2 (SEQ ID NO. 1 ). wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamH\ und Noü verdaut und in den entsprechend geschnittenen Vektor pJ294 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USA) ligiert. Der fertig gestellte E.coli- Expressionsvektor wurde als pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] (SEQ ID NO. 2) bezeichnet.

Vorkultur 1 : Beide Kulturen wurden jeweils in 10 ml M9, mod-G Flüssigmedium in 100 ml Schüttelkolben mit Schikanen überimpft. Das M9 mod-G Medium setzt sich zusammen aus 2,6 g/l (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0,49 g/l MgS0 +7H ₂ 0, 20 g/l Glucose, 1 ml/l Spurenelemente US3 gelöst in 800 ml M9 Puffer und 150 ml ddH ₂ 0. Der M9 Puffer besteht aus 6,79 g/l Na ₂ HP0 ₂ +2H ₂ 0, 3 g/l KH ₂ P0 , 0,5 g/l NaCI, 2 g/l NH CI gelöst in 800 ml ddH ₂ 0. Für den plasmidtragenden Stamm wurden dem Medium 100μg/ml Ampicillin zugesetzt.

Mit einer Impföse wurde jeweils ein voller Loop Zellmaterial von den Platten in die

entsprechenden Flüssigmedien überimpft.

Die Kulturen wurden bei 37°C und 200rpm über Nacht inkubiert.

Nach 20 Stunden betrug die OD:

E.co// ^' JW5020-1 (AfadE) 10,6

E.coli JW5020-1 (AfadE) pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc] 12,8. Vorkultur 2

0,5 ml aus der Vorkultur 1 wurden in 20 ml M9, mod-G in 100 ml Schüttelkolben mit Schikanen überimpft. Das M9, mod-G Medium setzt sich zusammen aus 2,6 g/l (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0,49 g/l MgS0 +7H ₂ 0, 60 mM Natriumacetat (aus Beispiel 2), 1 ml/l Spurenelemente US3 gelöst in 800 ml M9 Puffer und 170 ml ddH ₂ 0. Für die Kultur des plasmidtragenden Stammes wurde 100 μg/ml Ampicillin zugegeben.

Die Kulturen wurden bei 37°C und 200 rpm über Nacht inkubiert.

Die OD der Vorkultur 2 betrug

E. coli J W5020- 1 (Af ad E)/Acetat 2 , 5

E.coli JW5020-1 (AfadE) pJ294[Ptac-ChFATB2_optEc]/Acetat 1 ,75

100 ml modifiziertes M9 Flüssigmedium mit 60 mM Acetat pro Stamm in 1000 ml Schüttelkolben mit Schikanen wurden mit der Vorkultur inokuliert, so das eine OD von 0,2 erhalten wurde. Die Kultur wurde bei 37°C und 225rpm inkubiert

Bei einer OD ₆ oo von ca. 0,5 wurde mit 1 mM IPTG aus einer Stammlösung von 1 M IPTG induziert.

Zur Probennahme wurden jeweils 4 ml Zellsuspension steril entnommen, die OD bestimmt und die restliche Suspension in 15 ml Falconröhrchen bis zur Aufarbeitung der Proben bei -80°C gelagert.

Die Quantifizierung von Fettsäuren erfolgte nach Derivatisierung als Fettsäuremethylester mittels Gaschromatografie. Zu den Proben, bestehend aus 2 ml Kulturbrühe, wurden nach Zugabe von 1 ml Aceton und 2 ml Wasser 50 μΙ Heptadecansäure (10 g/l gelöst in Ethanol) als interne Referenzsubstanz zugesetzt. Die Proben wurden mit 200 μΙ Essigsäure angesäuert und mit 10 ml einer 1 : 1 (v/v) Chloroform/Methanol-Mischung versetzt. Die Proben wurden mindestens 1 min kräftig durchmischt. Anschließend wurde die Chloroformphase entnommen und eingedampft. Der trockene Rückstand wurde in 1 ml 1 ,25 M methanolischer Salzsäure aufgenommen und zur Veresterung der enthaltenen Fettsäuren bei 50°C über Nacht inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ml gesättigter Natnumcarbonatlösung abgestoppt (alle Substanzen Sigma-Aldrich, Steinheim). Die Extraktion der Fettsäuremethylester erfolgte durch Zugabe von 1 ml n-Heptan und 15sekündiges kräftiges Durchmischen. Die Heptanphase wird mittels Gaschromatografie vermessen. Für die Trennung von Fettsäuremethylestern wurde die Kapillarsäule SP™-2560 mit den Maßen 100 m x 0,25 mm und einer Filmdicke von 0,2 μηι (Supelco, Sigma-Aldrich, Steinheim) als stationäre Phase eingesetzt. Als Trägergas wurde Helium verwendet. Die Trennung erfolgte innerhalb von 45 min mit einer Injektortemperatur von 260°C, Detektortemperatur von 260°C und Säulentemperatur von 140°C zu Beginn, gehalten für 5 min und erhöht auf 240°C mit einer Rate von 4°C/min und gehalten für 15 min. Das Injektionsvolumen beträgt 1 μΙ, die Splitrate 1 :20 und der Durchfluss des Trägergases 1 ml/min. Die Detektion erfolgte mittels Flammenionisationsdetektor (GC Perkin Elmer Clarus 500, Perkin Elmer, Rodgau). Heptadecansäure (Sigma-Aldrich, Steinheim) wurde als interne

Referenzsubstanz zur Quantifizierung der Fettsäuremethylester verwendet. Die

Referenzsubstanzen C8:0-Me Caprylsäuremethylester, C10:0-Me Caprinsäuremethylester, C12:0-Me Laurinsäuremethylester, C14:0-Me Myristinsäuremethylester, C16:0-Me

Palmitinsäuremethylester, C16: 1 -Me Palmitoleinsäuremethylester, C18:0-Me

Stearinsäuremethylester, C18: 1-Me Ölsäuremethylester (GLC Standard Mix GLC-20 1892- 1AMP, GLC-30 1893-1AMP, GLC-50 1894-1AMP, Sigma-Aldrich, Steinheim) wurden zur Kalibrierung verwendet. Die Bestimmungsgrenzen liegen für alle Fettsäuremethylester bei einer Konzentration von 10 mg/l. Die Verteilung der Fettsäurekonzentrationen für E. coli JW5020-1 (AfadE) pJ294[Ptac-

ChFATB2_optEc] nach 96 Stunden stellt sich normiert auf eine OD von 1 wie in Abbildung 1 gezeigt dar.

Beispiel 4: Umsetzung von Acetat zu 3-Hydroxyisobuttersäure (3-HIB) mit Yarrowia lipolytica H222-41 A3HIBDH (ura)-8

Gemäß Beispiel 1 , Punkt 1 bis 3 der EP 11 191923.9 wurde eine Y. lipolytica-Ze\\e H222-41 mit abgeschwächter Aktivität der 3-Hydroxyiosbuttersäure-Dehydrogenase dargestellt; diese Zelle wird im Folgenden H222-41 Ä3HIBDH (ura)-8 genannt.

H222-41 Ä3HIBDH (ura)-8 wurde im Vergleich mit dem korrespondierenden Wildtyp H222-41 (ura)-8 kultiviert. Anzucht

Beide Stämmen wurden mit einer Impföse steril aus Kryokulturen auf YEPD Agarplatten ausgestrichen. Die YEPD-Agarplatten bestehen aus 10 g Glucose, 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 15 g Agar-Agar. Der pH beträgt 5,4. Die Inkubation erfolgte 80 Stunden bei 25°C. Vorkultur (Biomasseproduktion)

Sechs 1000 ml Schüttelkolben ohne Schikanen wurden mit 100 ml YEPD Flüssigmedium, bestehend aus Glucose, 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton pH 5,4 befüllt. In jedem Schüttelkolben wurden drei Tropfen Antischaummittel Delmex zugegeben.

Pro Stamm wurden je drei Schüttelkolben jeweils zwei volle Loops Zellmaterial von den entsprechenden YEPD Agarplatten mit einer Impföse steril überimpft. Die Inkubation der Schüttelkolben erfolgte für 20 Stunden bei 28°C und 180 rpm (Amplitude 2,5 cm).

Herstellung des Inokulum für die Acetatkultur

Nach 20 Stunden wurden die 3 Schüttelkolben mit Y. lipolytica H222-41 Ä3HIBDH (ura)-8 und Y. lipolytica H222-41 (ura)-8 vereinigt. Der Glucosegehalt wurde mit dem Multiparameter Bioanalytical System YSI 7100 der Firma KREIENBAUM Wissenschafliche Meßsysteme e.K. mit 0 g/l bestimmt. Die Brühen wurden in 50 ml Falcontubes ausgeteilt und 10 Minuten bei 5600 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets in 0,9 %ige NaCI-Lösung resuspendiert und wieder 10 Minuten bei 5600 rpm abzentrifugiert. Dieser Vorgang wurde noch 2x wiederholt, um möglichern Restzucker zu entfernen. Danach wurden die Pellets in jeweils 15 ml Acetatmedium resuspendiert, die Kulturen wurden nach Stämmen vereinigt und mit

Acetatmedium auf jeweils 50 ml aufgefüllt. Das Acetatmedium nach van Uden setzt sich wie folgt zusammen:

Grundmedium

5 g/l (NH4)2S04, 5 g/l KH2P04, 0,5 g/l MgS0 ₄ x 7 H20, 0,15 g/l CaCI ₂ x 2 H ₂ 0, 4 g/l Na-Acetat (aus Beispiel 2), 5 ml/l Vitaminlösung, 5 ml/l Biotinlösung, 5 ml/l Spurenelementlösung A, 5 ml/l Spurenelementlösung B.

Vitaminlösung

80 mg/100 ml Ca-Pantothenat, 200 mg/100 ml Myoinositol, 160 mg/100 ml Nicotinsäure, 160 mg/100 ml Pyridoxin HCl, 16 mg/100 ml Thiamin HCl.

Biotinlösung

Biotin 8mg/l

Spurenelementlösung A

100 mg/100 ml H ₃ B0 ₃ , 20 mg/100 ml Kl, 40 mg/100 ml NaMo0 ₄ x 2 H ₂ 0

Spurenelementlösung B

8 mg/100 ml CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0, 40 mg/100 ml FeCI ₈ x 6 H ₂ 0, 80 mg/100 ml MnS0 ₄ x 4 H ₂ 0, ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0 0,001 N HCl. Die Festbestandteile des Grundmediums wurden in 700 ml ddH ₂ 0 gelöst der pH auf 5,4 eingestellt und das Medium wurde autoklaviert. Die Lösungen wurden sterilfiltriert und dem Grundmedium nach dem Abkühlen zugegeben, das Gesamtmedium wurde dann mit sterilem ddH ₂ 0 auf 1000 ml aufgefüllt.

Konditionierung der Fermenter

Vier 800 ml sterile Fermenter eines Parallelfermentationssystems der Firma DASGIP wurden mit 175 ml Acetatmedium befüllt. Die Prozessbedingungen wurden auf 30 p0 ₂ [%], 14 sl/h Airflow, 400 - 1500 rpm Rührergeschwindigkeit, 28 °C Temperatur, und pH 5,4 eingestellt. Der pH wurde mit 0,5% H ₂ S0 ₄ bzw 25% Essigsäure und 12,5 % NH ₄ OH geregelt. Als Feed wurde eine 14 %ige Na-Acetatlösung pH 5,4 verwendet.

Produktion 3-HIB

Je zwei Fermenter wurden mit 25 ml Inokulum Y. lipolytica H222-41 Ä3HIBDH (ura)-8 und Y. lipolytica H222-41 (ura)-8 angeimpft.

Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 21 , 30 und 46 Stunden nach dem Animpfen. Von allen Proben wurde die OD600 und der Acetatgehalt mit einem Analytical Test Kit der Firma R-Biopharm bestimmt. Der Feed wurde dem Acetatverbrauch angepasst.

Von den Proben 0 und 46 Stunden wurde zusätzlich eine NMR Bestimmung mit D20 als Solvent und einer Wasserunterdrückung von Acetat und 3HIB durchgeführt.

Ergebnis

Die OD steigt im Versuchzeitraum von durchschnittlich 10 auf durchschnittlich 45.

Der Acetatgehalt betrug zu Beginn im Durchschnitt 2250 mg/kg, am Ende der Fermentation 32 mg/l.

Der 3HIB - Gehalt zu Beginn der Fermentation ist sowohl bei Y. lipolytica H222-41 Ä3HIBDH (ura)-8 und Y. lipolytica H222-41 (ura)-8 0 mg/l.

Nach 46 Stunden werden beim Wildtyp Y. lipolytica H222-41 (ura)-8 0mg/kg gemessen.

Der Stamm Y. lipolytica H222-41 Ä3HIBDH (ura)-8 mit dem knock-out der 3-HIB

Dehydrogenase hat im Durchschnitt 18 mg/kg 3HIB produziert.

Beispiel 5: Verfahrensschritt B) Ethanolabtrennung Die Abtrennung von Ethanol in Form eines wässrigen Konzentrates erfolgte durch direkte Destillation der der Fermentationsbrühe aus Beispiel 1.

Beispiel 6: Umsetzung von Acetat und Ethanol zu Hexansäure und Hexansäureethylester mit dem anaeroben Bakterium Clostridium kluyveri

Für die Kultivierung wurden druckfeste Glasflaschen, die mit einem Butylgummistopfen luftdicht verschlossen werden können, benutzt. Alle Kultivierungsschritte wurden unter anaeroben Bedingungen ausgeführt. Die Flaschen wurden 20 min bei 121 °C autoklaviert um Sterilität zu gewährleisten.

Für die Kulturen wurde in vier druckfeste Glasflaschen (Volumen 500 ml_) mit 200 ml_ anaeroben Medium, welches von der DSMZ als Medium 52 für C. kluyveri empfohlen wird, gefüllt. Das benötigte Acetat und Ethanol wurde aus Beispiel 2 und 5 verwendet. Anschließend wurden die Kulturen mit je 10 mL einer Kultur von C. kluyveri beimpft. Die Kulturen wurden je mit einem Butylgummistopfen verschlossen und für 116,25 h bei 35° inkubiert. Zum Start und Ende der Kultivierung wurden Proben genommen. Diese wurden auf optische Dichte und verschiedene Analyten mittels NMR untersucht. Da Hexansäure und Hexansäureethylester mittels NMR nur als Summenparameter erfasst werden kann, erfolgte die Bestätigung des Vorhandenseins beider Einzelsubstanzen in den Endproben mittels GC/MS-Analytik.

Über die Kultivierungsdauer zeigte sich im Mittel über vier Replikate eine Abnahme bei Acetat von 5,4 g/L auf 1 ,4 g/L und bei Ethanol von 14,2 g/L auf 5,8 g/L. Gleichzeitig konnte eine Bildung von Buttersäure, hier stieg der Wert von 0, 13 g/L auf 2,5 g/L, und

Hexansäure/Hexansäureethylester, hier stieg der Wert in Summe von 0,05 g/L auf 7,6 g/L, gezeigt werden.