VIP recombinant"

La présente invention concerne la production d'un neuropeptide VIP (Vasoactif Intestinal Peptide) recombinant, en particulier un VIP dont iι l'acide aminé en position C-terminale n'est pas amidé.

Sx Le VIP est un neuropeptide de 28 acides aminés et de masse molaire 3326, généralement extrait des cellules intestinales, des tissus nerveux et des cellules endocrines.

Le VIP est un médiateur connu de la vasodilation des vaisseaux sanguins du cerveau, de la stimulation de la production de prolactine ou encore de la sécrétion endocrine, pancréatique.

10 Le VIP est principalement obtenu par extraction tissulaire ou encore par voie de synthèse chimique.

Compte-tenu de la taille du peptide et des rendements de la synthèse chimique, l'intérêt d'employer les techniques du génie génétique s'est rapidement fait sentir.

Le gène précurseur du VIP humain a été isolé et caractérisé, notamment par Bodener et al. (Proc. Nat. Acad Sci., USA, 1985, 252, 3548-3551 ), ainsi que sa transformation, son intégration dans un plasmide et son expression dans un microorganisme hôte (WO-A-89/05857).

Toutefois, si le VIP a une taille trop importante pour que sa

20 synthèse chimique soit rentable, le fait qu'il ne contienne que 28 acides aminés est également un inconvénient pour sa production par les techniques de génie génétique.

Il a été trouvé que , l'utilisation de la technique dite des protéines fusionnées permettait d'obtenir le VIP dans de bonnes conditions.

25

La présente invention concerne donc un polypeptide fusionné de formule χ_T-(A-VIP-B-C) n -A-VIP-B-Y dans laquelle

30 VIP représente substantiellement la séquence peptidique His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys- Gin-Met- Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn,

X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Met-His- -Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser,

35

T représente la séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser dans le cas où X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Arg-Gly-Ser dans l'autre cas. A représente la séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg, 5 B représente la séquence peptidique Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente l'acide aminé Ser,

Y représente la séquence peptidique Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n représente un entier compris entre 0 et 31.

De préférence, n est compris entre 1 et 31. i O La présence d'une protéine marqueur peut présenter un intérêt lors de la purification du polypeptide fusionné selon l'invention.

D'une manière préférentielle, X est choisi parmi la glutathion S-transférase (GST) (Smith & al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83 (1986) S703-&707, et 8 (1987), 6541 ). 1 -5 De même, compte tenu du mode de préparation du polypeptide selon l'invention par les techniques de génie génétique, n est de préférence choisi parmi les entiers 0, 1, 3, 7, 15 ou 31.

La présente invention concerne également le gène codant pour le polypeptide fusionné ci-dessus. 20 Elle concerne également un plasmide d'expression comprenant le gène selon l'invention, sous la dépendance de séquence d'ADN assurant son expression dans un microorganisme hôte, et le microorganisme transformé comprenant au moins un de ces plasmides.

D'une manière avantageuse, ce microorganisme est E. coli JM 25 105 (ATCC n° 47016).

Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation de VIP recombinant comprenant les étapes suivantes :

- de culture du microorganisme selon l'invention dans des conditions d'expression du polypeptide fusionné,

30 _ d'extraction et de purification du polypeptide fusionné,

- de clivage, séquentiel ou combiné des sites A-VIP et VIP-B par un agent de clivage approprié, et

- de purification du VIP.

35

Le polypeptide fusionné est de préférence extrait par sonication et centrifugation des bactéries soniquées.

L'agent de clivage du site A-VIP est de préférence la facteur Xa ou la thrombine, alors que l'on emploie l'hydroxylamine comme agent de clivage du site VIP-B.

La présente invention concerne également un neuropeptide VIP recombinant obtenu par le procédé ci-dessus.

Compte tenu de son procédé de préparation, la présente invention concerne enfin un polypeptide intermédiaire pour la préparation de VIP recombinant, répondant à l'une des formules suivantes :

(VIP-B-C-A) (B-C-A-VIP) ou VIP-B

avec A, B, C et n tels que définis précédemment.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention appa¬ raîtront à la lecture de l'exemple et des figures ci-après.

La figure 1 (la et lb) représente le schéma de construction des plasmides.

La figure 2 représente une autoradiographie du gel de séquence du plasmide pUC18 dans lequel a été inséré l'oligonucleotide VIP de séquence (brin anti-sens) :

3'

CTTGTGAGGC TGCGACAAAA GTGGCTGTTG 30

ATGTGGGCTG ACGCATTTGT CTACCGACAA 60

TTTTTTATGG ACTTGAGGTA GGACTTGCCA 90

CTT 5*

La figure 3 représente un gel d'agarose à 2% montrant l'insertion séquentielle des unités VIP dans le plasmide pUC deltaS-FXa. Tous les plasmides ont été digérés par Pvull.

a) et h) marqueur de poids moléculaire b) pUC deltaS-FXa c) pUC deltaS-FXal VIP d) pUC deltaS-FXa2VIP e) pUC deltaS-FXa4VIP f) pUC deltaS-FXaδVIP g) pUC delatS-FXa!6VIP

La figure 4, relative à l'expression et la purification de la protéine hybride GIV représente un gel de polyacrylamide SDS 12,5% coloré au bleu de Coomassie montrant :

a) les protéines totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) la protéine hybride purifiée après passage sur colonne sépharose glutathion.

La figure 5, relative à l'expression et la purification de la protéine hybride G16V, représente un gel de polyacrylamide SDS 12,5% coloré au bleu de Coomassie montrant :

a) les protéine totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) le surnageant de sonication d) le culot de sonication e) la protéine après lavage.

La figure 6, relative au clivage de la protéine hybride G I V par le facteur Xa, représente un gel de polyacrylamide-SDS 16,5% glycerol coloré au bleu de Coomassie montrant :

piste a) la protéine hybride purifiée par chromatographie d'affinité, piste b), c), d) et e) l'incubation avec le facteur Xa pendant 1, 2, 3 et 5 heures respectivement, à 25°C, dans un rapport enzyme/substrat de

1/50. ⁵ piste V), VIP témoin piste M), marqueurs de poids moléculaire

La figure 7, relative au clivage de la protéine hybride G16V par le facteur Xa représente un gel dénaturant en gradient de polyacrylamide 10 12% à 20% coloré au bleu de Coomassie montrant :

piste a) la protéine hybride soluble pistes b), c), d) et e) l'incubation avec le facteur Xa pendant 15, 30, 45 minutes et 3 heures respectivement à 25°C, dans un rapport l - ⁵ enzyme/substrat de 1/50. piste f) monomère VIP (4,4 Da) purifié sur colonne HPLC (caractéristiques: légende Fig.8). piste h) dimère VIP purifié sur colonne HPLC.

20 La figure 8 représente le diagramme de purification du monomère et du dimère VIP sur colonne analytique HPLC de type Vydac, C l 8, 5μm, 300A end capped :

1. monomère VIP (Fig.7 piste f)

2. dimère VIP (Fig.7 piste h)

25

La figure 9 représente le diagramme d'analyse par électro- phorèse capillaire de la fraction purifiée du monomère VIP.

a) VIP témoin

30 b) monomère VIP rallongé de 10 acides aminés après clivage de la protéine de fusion par le facteur Xa et séparation par HPLC.

La figure 10 représente l'analyse par Western blot de la purification de la protéine G16V et sa digestion par le facteur Xa :

a) les protéines totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) le surnageant de sonication d) le culot de sonication e) la protéine G16V purifiée f) la protéine G16V clivée par le facteur Xa dans les conditions décrites précédemment g) monomère VIP purifié h) VIP témoin

La figure 1 1 représente les courbes de déplacement de la liaison du VIP radioiode par la protéine GIV aux récepteurs des cellules d'adénocarcinome de côlon humain (lignée HT29) :

l ia) VIP témoin ( • ) protéine GIV ( A. ) et GIV digéré par le facteur Xa ( • ) 3 heures à 25°C dans un rapport enzyme/substrat : 1/50.

1 1 b) Témoin Facteur Xa dans le tampon d'incubation.

La figure 12 représente les courbes de déplacement de la liaison du VIP radioiode par le VIP monomère (4,4 kDa) purifié (Fig. 7 piste f) aux récepteurs des cellules d'adénocarcinome de côlon humain (lignée HT29) : VIP témoin (1 ) et monomère VIP (2).

La figure 13 représente la courbe de déplacement de la liaison du VIP radioiode par le VIP recombinant, obtenu après traitement par l'hydroxylamine : VIP témoin ( 1 ) et VIP recombinant (2).

La figure 14 représente les courbes de stimulation de la production d'AMPc par le VIP recombinant et un mélange de poly(VIP) comprenant de 2 à 9 séquences de VIP : VIP témoin (*), VIP recombinant ( * ), et polyVIP ( A ).

EXEMPLE : FUSION GSTVIP et GSTpolyVIP

I. Généralités

A) Synthèse du gène

Un oligonucléotide de synthèse codant pour le site de coupure du facteur Xa (séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg) est inséré dans le plasmide pGEX-2T disponible dans le commerce, en 3' et en phase avec le gène de la Glutathion S-transférase dans les sites BamHI et EcoRI.

Ile Glu Gly Arg

5' GA TCC ATC GAA GGT CGA CAC CCC GGG G 3'

3' G TAG CTT CCA GCT GTG GGG CCC CTT AA 5' BamHI Sali Smal EcoRI

Entre l'extrémité 3' du gène de la glutathion S-transférase (GST) et l'extrémité 5' du gène de l'oligonucleotide codant pour site de coupure du facteur Xa, se trouve porté par le plasmide pGEX 2T un enchaînement de nucleotides codant pour le site de coupure de la thrombine (séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser). Ce site permet d'envisager à l'aide de la thrombine la séparation ultérieure de la GST et d'un VIP ou polyVIP contenant des acides aminés surnuméraires.

Le gène VIP (cf séquence, fig. 2) ou polyVIP est inséré dans le site Sali rempli, en 3' de la séquence nucleotidique codant pour le facteur Xa et en phase avec ce dernier.

L'insertion séquentielle de gènes VIP peut permettre de mieux maîtriser l'addition d'unités VIP et d'obtenir un concatémère plus grand.

B) Caractéristiques de la protéine

- Elle est puπfiable par chromatographie d'affinité sur colonne CH Sépharose 4B-Glutathιon (un seul VIP) ou à partir de corps d'inclusion (polyVIP).

- Les différentes unités VIP rajoutées seront séparées par un peptide de 10 acides aminés contenant à l'extrémité N-terminale le site de coupure de l'hydroxylamine et à l'extrémité C-terminale le site de coupure du facteur Xa soit:

VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-VIP f T

NH ₂ OH Facteur Xa

10 - L'action du facteur Xa libère le poly(VIP) sans acide aminé résiduel à l'extrémité N terminale.

- le facteur Xa clive également un site secondaire de clivage du facteur Xa dans le peptide de liaison B-C-A (clivage après le 5e acide aminé de la séquence). La séquence (Ser-Thr-Pro-Arg^Ser) ne présente pas

- ^• -> d'homologie, à l'exception de l'arginine, avec des sites potentiels connus du Facteur Xa.

- A l'extrémité C terminale de chaque VIP, une glycine permet lors de la coupure par l'hydroxylamine l'élimination des acides aminés surnuméraires. 20

H _* Construction de la fusion (fig. 1)

a) Le plasmide pUC18 est digéré par Sali, rempli par le ^ fragment de Klenow et refermé sur lui-même par la T4 DNA ligase, ce qui permet l'élimination du site Sali. Le plasmide obtenu est dénommé pUClδdeltaS. b) L'oligonucleotide de synthèse, codant pour le site de coupure du facteur Xa, est inséré dans les sites BamHI/EcoRI du plasmide

³⁰ pUC18deltaS. c) Ce plasmide, appelé pUC18deltaS-FXa, est digéré par Sali et le site est rempli par le fragment de Klenow puis ligaturé avec l'oligonucleotide VIP (cf fig. 1 ).

35

d) Un clone recombinant comportant l'oligonucleotide VIP dans le sens correct (le sens d'insertion est véπfiable par analyse des fragments de restriction) est séquence afin de vérifier de manière précise les séquences des oligonucléotides codant pour le VIP et le site de clivage par le facteur Xa, le maintien de la phase et des sites de restriction (cf fig. 2). e) A partir de ce plasmide, on peut récupérer le fragment BamHI rempli/EcoRI et le réinsérer dans ce même plasmide ouvert par Smal/EcoRI (cf fig. 1).

On obtient alors 2 unités VIP fusionnées avec maintien de la phase de lecture. Cette opération peut être répétée de façon à réaliser des fusions comportant 2, 4, 8, 16 et 32 gènes VIP. L'insertion de ces derniers peut être visualisée par l'augmentation de la taille du plasmide ou de celle d'un fragment issu de la digestion du plasmide par PvuII. Deux sites PvuII sont présents dans le pUC18 de part et d'autre de la fusion de gènes. En conséquence, le pUC lδdelta S-FXa digéré par PvuII donne une bande à 2360 bp environ et une bande à 350 bp (fig. 3, piste b).

L'insertion d'une unité du gène VIP dans ce plasmide entraîne un accroissement de taille de 87 bp et l'apparition d'une bande vers 440 bp après digestion (piste c) ; la présence de deux unités VIP l'augmente d'environ 200 bp soit 540 bp (piste d) et ainsi de suite jusqu'à 16 VIP (respectivement, piste e, f et g). f) Après insertion d'un nombre donné de gènes VIP, on peut récupérer le concatémère, par digestion EcoRI/BamHI, et le fusionner au gène de la GST dans le plasmide pGEX-2T ouvert par BamHI/EcoRI.

III. Synthèse et purification des protéines de fusion

Après transformation de bactéries compétentes (souche JM 105 d'E. coli) par le plasmide pGEX-FXaVIP (ne comportant qu'un seul gène VIP) les clones recombinants produisent une protéine de fusion après induction de la synthèse par l'IPTG en phase exponentielle de croissance (D0 _{5 5} = 0,65). La figure 4 montre la migration des protéines totales d'E. coli après électrophorèse dans des conditions dénaturantes.

On observe bien, après induction, l'apparition d'une bande vers 30 kDa correspondant à la masse théorique de la protéine hybride avec un seul VIP (GI V) (fig. 4, piste b). Les résultats sont confirmés par dosage de l'activité glutathion S-transferase à partir de la culture. Dans ce cas précis, la protéine hybride est soluble et peut être purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne glutathion agarose à partir d'un extrait cytoplasmique bactérien (figure 5, piste c). Cette purification, basée sur l'aptitude de la protéine marqueur (la GST) à se lier de manière réversible au glutathion réduit, donne un rendement en protéine hybride de l'ordre de 90%.

Le même protocole a été suivi pour la fusion de la GST avec 8 VIP (G8V) ou 16 VIP (G16V) (fig. 5). Dans ce dernier cas, il y a apparition d'une bande vers 100 kDa qui correspond à la protéine hybride (fig. 5, piste b) (masse moléculaire théorique 96,5 KDa). Cependant des corps d'inclusion se forment, agrégats insolubles composés pour une grande part de la protéine de fusion. Dans ce cas la protéine d'intérêt se retrouve dans le culot de sonication (figure 5, piste d). Sous cette forme agrégée, la protéine marqueur est dénaturée. Elle perd son activité et ne peut plus servir à la purification de la protéine de fusion par chromatographie d'affinité.

Ainsi, des lavages successifs ont été réalisés dans des conditions dénaturantes faibles (Triton X100 0,5%, EDTA I mM) afin d'éliminer spécifiquement les débris cellulaires de manière à enrichir le culot en protéine hybride insoluble. Celle-ci est ensuite solubilisée dans de l'urée 10 M, DTT 10 mM, SDS 0,5% et dialysée contre une solution Tris HC1 10 mM pH 8,0, EDTA ImM, puis contre de l'eau en vue de la digestion par le facteur Xa (fig. 5, piste e). Cependant, dans ces conditions, la protéine de fusion redevient parfois insoluble, avec apparition de micro-agrégats, qui n'affecteront pas toutefois l'action ultérieure du facteur Xa.

IV. Clivage des protéines hybrides

a) Clivage de la protéine GIV

La protéine hybride se compose des séquences suivantes :

GST -Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser-Thr-Pro -Arg- a b

Gly-Ile-His-Arg-Asp

GST : séquence de la GST a : site de clivage du facteur Xa

VIP : séquence du VIP b : site de clivage de l'hydroxylamine

L'étape suivante consiste donc à cliver cette protéine par le facteur Xa (afin de séparer le VIP de la protéine marqueur). L'action de l'hydroxylamine, libère ultérieurement le VIP des acides aminés surnumé¬ raires, résultant de la constrution choisie. La figure 6 montre l'analyse électrophorétique de la digestion opérée avec le facteur Xa.

On remarque une diminution de l'intensité de la bande vers 30 kDa au profit de celle correspondant à la GST (26 kDa) ce qui indique une coupure effective par le facteur Xa au niveau du site attendu.

b) Clivage de la protéine G(n+l)V

La protéine hybride se compose des séquences suivantes :

GST-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-(Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser- Thr-Pro-Arg- a D a

Ser) -Ile-Glu-Gly-ArgrVIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg-Gly-Ile-His-Arg-Asp

avec n = 7, 15 ou 31.

La même digestion que précédemment est réalisée et analysée par électrophorèse pour n = 15 (fig. 7).

On remarque l'apparition d'une bande qui migre au bas du gel dans la zone correspondant au VIP et dont l'intensité augmente rapidement avec le temps de digestion.

Selon les conditions expérimentales, une série de bandes intermédiaires sont obtenues. Elles correspondent à des intermédiaires de la digestion de la protéine de fusion par le facteur Xa, notamment des peptides comprenant 2, 3, 4 ... VIP. Les bandes correspondant au monomère et dimère de VIP sont purifiées sur colonne HPLC (fig. 8). La fraction monomère est analysée par électrophorèse capillaire afin de confirmer la pureté de l'échantillon (fig. 9). L'analyse de la séquence des 10 premiers acides aminés du côté N-terminal est en tous points conforme à celle du VIP naturel. L'utilisation d'anticorps polyclonaux anti-VIP a révélé que ces intermédiaires cités ci-dessus comportaient bien du VIP (fig. 10).

Par contre, la séparation des différents poIy(VIP) intermédiaires de dégradation par le facteur Xa s'est révélée plus délicate, les peptides comprenant plus de deux motifs VIP étant co-élués par HPLC.

V. Analyse du peptide monoVIP

Afin de vérifier précisément la masse du peptide monoVIP recombinant obtenu après clivage par le facteur Xa, ce dernier a été analysé au spectromètre de masse et soumis parallèlement à un séquençage de l'extrémité NH-.

La détermination de la masse du peptide a été effectuée par spectroscopie de masse LSIMS. La masse théorique du VIP recombinant additionné du peptide de liaison de 10 acides aminés (VIP-B-C-A) est de 4367 Da.

On observe bien un pic à cette valeur, mais également un second à 3825,8. Cette masse correspond exactement à celle du VIP rallongé des 5 premiers acides aminés du peptide de liaison (VIP-B). Un second clivage s'effectuerait par conséquent au niveau de la liaison Arg Ser. Ce double clivage du peptide de liaison générerait trois peptides :

VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg^ Ser-Ile-Glu-Gly-Argi VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg4

4824,8

Deux formes de VIP avec une masse 4367,2 pourraient coexister. Cependant l'analyse de la séquence N-terminale établit bien que la nature des dix premiers acides aminés est bien celle du VIP : His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr.

Ce résultat lève la possible ambiguité résultant de l'hétéro¬ généité des peptides obtenus. Le facteur Xa effectue bien en priorité le clivage au niveau de son site principal. Il a par ailleurs été possible en conditions analytiques de séparer les deux formes de VIP rallongées de 5 acides aminés (VIP-B) et de 10 acides aminés (VIP-B-C-A) par HPLC.

Une détermination de la masse des deux fractions confirme ce résultat.

VI. Clivage de la protéine G16V par la thrombine

Lors de la fusion du polyVIP à la GST, le gène polyVIP est inséré en aval d'une séquence nucleotidique codant pour le site de reconnaissance de la thrombine Leu-Val-Pro-Arg Gly-Ser, déjà présent dans le vecteur d'expression pGEX 2T en aval du gène de la GST. Ce site est ici utilisé afin de tenter de libérer le polyVIP de la protéine marqueur.

La thrombine est un des facteurs de coagulation (le facteur Ha) qui active le fibrinogene en fibrine par une coupure unique en C-terminal de la séquence Arg-Gly-Pro-Arg (Knott et al. 1988).

De manière surprenante, un profil analogue à celui de l'incubation avec le facteur Xa est observé. Sachant que la spécificité de substrat de la thrombine chevauche en partie celle du facteur Xa (Reinach et al. 1986) il est possible qu'un clivage ait lieu au site Ile-Glu-Gly-Arg. On

peut cependant remarquer par la présence d'une bande vers 70 KDa que la digestion a eu prioritairement au niveau du site spécifique présent en amont du polyVIP et que comparé au facteur Xa le clivage est en apparence plus lent. Parallèlement, le site secondaire de coupure du facteur Xa dans le décapeptide, présent entre chaque VIP, peut potentiellement être reconnu par la thrombine. Afin de vérifier cette hypothèse, le monoVIP issu d'un clivage prolongé de la protéine G16V par la thrombine est purifié par HPLC et analysé au spectromètre de masse.

La fraction possède un pic majoritaire à 3825,5 Da avec deux satellites à 3809,5 et 3841,5. Pour générer un peptide de cette taille, qui est précisément celle du VIP-B, la thrombine doit systématiquement cliver au niveau des deux sites reconnus par le facteur Xa. De plus, aucun peptide de masse 4367 n'est détecté ce qui indique que la thrombine reconnaît les deux sites avec la même efficacité. H semble donc que cette enzyme puisse a priori être employée pour générer des peptides de 3825 (VIP-B) de manière prépondérante. Il faut toutefois savoir qu'une digestion par la thrombine peut poser un problème de stabilité de la protéine hybride puisque pour être active, l'enzyme a besoin de chlorure de calcium à une concentration supérieure à celle exigée par le facteur Xa, favorisant la reprécipitation de la protéine de fusion G16V.

VII. Clivage de l'analogue du VIP par l'hydroxylamine

L'ultime étape de la production du VIP consiste en l'élimination du peptide de liaison par coupure de la liaison Asn-Gly en présence d'hydroxylamine.

Une hydrolyse du peptide a été réalisée pendant 20 min et 1 h.

On a remarqué un dédoublement du pic correspondant au VIP et un affaissement de chaque pic en fonction du temps d'hydrolyse. Une incubation prolongée accentue le phénomène qui résulterait peut-être d'une dégradation du peptide. Parallèlement un échantillon de VIP a été incubé

1 h. en présence d'hydroxylamine, afin de vérifier dans les mêmes conditions, l'inactivité de l'agent chimique sur le VIP.

D'après le schéma réactionnel théorique, les peptiHes VIP-B et VIP-B-C-A libérés de leur peptide de liaison doivent avoir une masse de 3343 Da. Or à 20 min le peptide n'a pas subi de clivage, alors qu'après lh, on observe un pic majoritaire à 3328, le pic à 3343 n'étant que moyennement représenté.

Ces pics sont collectés et la masse de la ou des formes présentes est estimée par spectrométπe de masse.

De la même manière que sur l'analyse des pics du clivage par le facteur Xa, plusieurs pics sont observés. Seuls les pics 3826, 3843 et 3326 peuvent être assignés à des formes de VIP connues. Le VIP témoin incubé avec l'hydroxylamine, analysé en parallèle, subit aussi des modifications comme en témoigne la présence de pics à 3310,8 et 3341,5.

VIII. Dosage de l'activité du VIP

VIII.1 Déplacement de la liaison du VIP radioiode

Dans le but de vérifier si le VIP produit sous la forme fusionnée ou libérée après le clivage garde son activité, des tests de déplacement de la liaison du VIP radioiode à son récepteur sont réalisés (lignée cellulaire

HT 29).

La protéine GI V ne déplace pas la liaison du VIP radioiode

(figure 9a). Cependant après une incubation de cette protéine pendant 3 heures en présence de facteur Xa, on observe un déplacement mais avec une constante de dissociation (K _n ) 500 fois plus forte qu'avec du VIP froid.

Un témoin réalisé en présence de facteur Xa seul montre que le déplacement est bien dû à la protéine hybride digérée (figure 1 1 b) et montre qu'il y a bien libération d'un peptide actif.

Une expérience de déplacement de la liaison du VIP radioiode par le monomère VIP purifié (fig. 12) montre que ce dernier se lie au récepteur des cellules HT 29 avec une constante de dissociation similaire à celle du VIP témoin.

La même expérience que ci-dessus effectuée avec une forme diVIP purifiée montre que cette dernière possède une activité de liaison au

récepteur du VIP avec une constante de dissociation 1000 fois plus importante. Dans ce cas, l'inaptitude de l'analogue à retrouver la conformation naturelle du VIP peut expliquer la faible activité de cette forme.

Enfin, un mélange de formes multimétπques de 2 à 16 VIP provoque un déplacement de la liaison avec une constante de dissociation analogue à celle du VIP témoin. Ce résultat est surprenant dans la mesure où, seule, la forme diméπque est peu active.

On pourrait interpréter cette observation comme étant le résultat de la liaison d'une forme multiVIP à plusieurs récepteurs simultanément, alors qu'un oligomère plus court ne pourrait y parvenir.

VIII.2 Dosage de la production d'AMPc

Tout comme dans l'expérience précédente, ce dosage est effectué à partir d'un mélange de formes VIP-B et VIP-B-C-A (appelé VIP recombinant). Certains analogues de VIP décrits dans la littérature, bien que possédant une affinité pour le récepteur, se comportent comme des antagonistes du VIP (Pandol et al. 1986). Le but de cette manipulation réside par conséquent dans la vérification de l'effet agoniste du VIP.

Ainsi, une stimulation de la production d'AMPc par des cellules en culture est réalisée comparativement avec le VIP naturel et le VIP recombinant. Cette stimulation s'effectue en présence d'IBMX (3-IsoButyl- l- Méthyl-Xanthine), un inhibiteur de phosphodiestérase, enzyme qui dégrade l'AMPc. L'AMPC produit est estimé par dosage radioimmunologique.

Les résultats obtenus avec le mélange des formes VIP-B et VIP-B-C-A montrent une stimulation de la production d'AMPc par le VIP recombinant par rapport au VIP témoin. L'EC _5Q étant défini comme la concentration en peptide nécessaire pour produire 50% de la quantité maximale d'AMPc, le VIP recombinant stimule la production d'AMPc avec un EC - ₀ 500 fois plus important que le VIP témoin.

On observe surtout une production d'AMPc accrue de 1,6 fois qui résulterait de la conjonction de deux phénomènes. D'une part, le peptide recombinant serait plus stable dans le milieu d'incubation et/ou les

complexes VIP recombinant-récepteur pourraient être plus stables, ce qui conduirait dans les deux cas à une stimulation pendant un temps plus long de l'activité adénylate cyclase.

VIII.3 Activité biologique sur un organe isolé

Le dernier type d'analyse utilisé pour tester l'activité biologique a consisté à observer l'effet du VIP recombinant (mélange VIP-B et VIP-B-C-A), issu du même stock que précédemment, sur un organe isolé.

Le modèle employé pour tester l'activité du VIP est constitué de disques trachéaux de cobayes.

L'attachement de plusieurs disques en chaîne assure un cumul du signal de chaque disque et conduit à une amplification de la réponse. Le capteur isotonique enregistre alors les variations de la longueur de la chaîne d'anneaux.

Le VIP n'a en fait, dans le système utilisé, pas d'effet sur l'organe en conditions normales. Le phénomène de relaxation des disques trachéaux n'est mis en évidence qu'après une précontraction des muscles lisses en milieu Krebs hyperpotassiques (40 mM). On a observé une relaxation des disques en présence de VIP naturel avec un EC _5n de 16 nM tout comme en présence de VIP recombinant où i'EC _5n est de 800 nM soit seulement 50 fois plus. Le VIP recombinant rallongé de 5 ou 10 acides aminés (B ou B-C-A) présente ainsi une activité de relaxation sur les disques trachéaux.

18

LISTE DE SEQUENCES

( 1 ) NOMBRE DE SEQUENCES: 8

(2) INFORMATION POUR LA SEO D NO: 1:

( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 44 acides aminés (B) SEQUENCE: X-T-(A-VIP-B-C) _n -A-VIP-B-Y

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE EMPLACEMENT: l,Xaa

SEQUENCE ID:2 OU ID:3

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: EMPLACEMENT: 2,Xaa LIAISON COVALENTE OU SEQUENCE ID:4 REPETEE DE 1 A 31 FOIS

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 1:

Xaa Xaa Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr 1 5 10 15

Thr Arg Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile 20 25 30

Leu Asn Gly Ser Thr Pro Arg Gly Ile His Arg Asp

35 40

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE

(A) LONGUEUR: 12 acides aminés

(B) SEQUENCE X-T

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

( xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 2:

Met His Gly Cys Arg Ser Ile Asp Ser Arg Gly Ser

1 5 10

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE

(A)LONGUEUR: 7 acides aminés (B) SEQUENCE X-T

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE EMPLACEMENT: l,Xaa CORRESPOND A UNE PROTEINE MARQUEUR

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 3:

Xaa Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 acides aminés

( ϋ ) TYPE DE MOLECULE protéine

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE Peptide A-VIP-B-C

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 4:

Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg 1 5 10 15

Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 30

Gly Ser Thr Pro Arg Ser 35

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 acides aminés

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE Peptide VIP-B-C-A

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 5:

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin 1 5 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Ser Thr Pro

20 25 . 30

Arg Ser Ile Glu Gly Arg 35

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 acides aminés

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE

Peptide B-C-A-VIP (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 6:

Gly Ser Thr Pro Arg Ser Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala Val Phe 1 5 10 15

Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Ser Ile Leu Asn 35

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 7:

( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 acides aminés

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE Peptide VIP-B

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 7:

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin 1 5 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Ser Thr Pro Arg 20 25 30

(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A)LONGUEUR: 50 acides aminés

(B) SEQUENCE G (n+l)V

(ii) TYPE DE MOLECULE peptide

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: EMPLACEMENT: l,Xaa SEQUENCE PEPTIDIQUE DE LA GST PROTEINE MARQUEUR

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE EMPLACEMENT: 8,Xaa LIAISON COVALENTE OU SEQUENCE ID:4 REPETEE DE 1 A 31 FOIS

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 8:

Xaa Leu Val Pro Arg Gly Ser Xaa Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala 5 10 15

Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys 20 25 30

Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Ser Thr Pro Arg Gly Ile His Arg Asp 35 40 45 50