【발명의 명칭】

미백, 피부 탄력， 주름 개선 및 상처치유 활성을 갖는 다기능성 피부투과 펩타이드

【기술분야】

본 발명은 피부투과 기능 기반의 미백， 탄력， 주름 개선 효과를 갖는 다기능성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서 , 더욱 상세하게는 피부투과 기능, 멜라닌 생성 억제, 콜라겐 생성 촉진, 피부 각질 줄기세포 증식의 기능을 갖는 다기능성 펩타이드를 기능성 화장품 및 의약품의 원료로 활용하고자 하는 방법에 관한 것이다.

【배경기술】

피부는 인간 신체에서 표면적이 가장 큰 기관으로， 적절한 방법을 사용할 경우 효과적으로 약물을 전달할 수 있는 경로가 된다. 하지만 피부의 제일 바깥쪽에 죽은 세포들로 구성되어 있는 각질층 때문에 외부물질의 피부투과도는 극단적으로 낮아 분자량이 크고 친수성이 있는 물질의 전달에 어려움이 있다. 이러한 피부로의 약물 전달 시 피부 장벽의 외부물질에 대한 방어기전을 극복하고자 여러 피부투과 방법에 관한 연구가 시도되었으나， 물리적으로 피부를 손상 또는 자극하지 않고 화학물질의 특성을 통해 약물을 전달하는 것은 거의 불가능하다고 여겨지고 있으며， 이를 극복한 소재에 기대할 수 있는 다양한 장점 때문에 지속적으로 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이러한 요구에 따라, 큰 분자량의 약물올 효과적으로 전달하기 위한 리포좀 또는 나노 파티클, 펩타이드 리간드 등의 피부투과 전달소재에 관련된 연구가 다수 보고되고 있으며 [Lademarm et al., 2007(Eur J Pharm Biopharm. 2007 May;66(2): 159-64.), Chen et al., 2006a(J Pharmacol Exp Ther. 2006 Nov;319(2):765-75.), Chen et al., 2006b(Nat Biotechnol. 2006 Apr;24(4):455-60.)], 이를 통한 실용화 단계의 개발 비용이 증가함에도 불구하고 전달하고자 하는 약물의 효율과 안정성을 보장할 수 없어, 피부투과 기능과 체내 유효성을 동시에 갖는 소재 개발이 요구되고 있다.

한편, 피부는 외부 환경으로부터 몸을 보호하여 체내 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 끊임없는 외부의 여러 자극과 자체 대사과정 등에서 생기는 불필요한 대사산물 (metabolite)에 의해 피부 기능은 저하되고 노화 현상이 촉진된다.

피부 내 콜라겐은 피부 섬유아세포에서 생성되는 구조 단백질로 노화에 의한 생성 감소 및 해당 구조의 변화는 피부의 주름 형성과 관련이 있다고 알려져 있다. 피부 내에 존재하는 멜라닌 색소는 자외선이나 체내 활성산소로부터 피부를 보호하는 역할을 하나 비정상적인 멜라닌 세포의 활성화는 기미나 주근깨, 검버섯 등의 과색소 침착증을 유발하여 미관상의 문제를 유발한다. 그리고 피부 표피 기저층에 존재하는 피부 각질 줄기세포는 각질형성세포의 성장과 분화는 물론 진피층의 섬유아세포까지 관장하여 피부 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 피부 내 콜라겐 생성, 멜라닌 색소 억제， 각질 줄기세포 생장에 관련된 체내 항상성은 피부의 건강 및 미용에 영향을 주는 밀접한 인자로써 이에 대한 기능과 유효 소재 발굴을 위한 연구는 여전히 활발히 진행되고 있으나, 표면에 도포하는 외용적 처치 소재의 유효성은 표피 및 진피를 통과해야 하는 기술적 어려움으로 인해 많은 노력이 요구된다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기와 같은 효능 물질의 변형으로 인한 유효성 및 안전성 감소, 또는 비용 증가 둥의 문제로 활용에 제약이 있는

펩타이드의 종래 문제점을 해소하기 위하여 예의 노력한 결과, 피부투과 기능을 가질 뿐 아니라, 멜라닌 합성을 억제하며 콜라겐 합성과 피부 각질 줄기세포의 증식올 촉진시키는 다기능성 펩타이드 소재를 발굴하여 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 따라서, 본 발명의 하나의 목적은, 피부투과 기능과 더불어 멜라닌 합성 억제능 및 콜라겐 합성, 피부 각질 줄기세포 및 피부 진피 섬유아세포의 증식 촉진기능을 갖는 피부투과 다기능성 펩타이드를 제공하는 것이다.

나아가, 또 하나의 목적은, 상기 피부투과 다기능성 펩타이드를 포함하는 피부 미백, 피부 탄력 증진 또는.주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다ᅳ 또 다른 하나의 목적은， 상기 피부투과 다기능성 템타이드를 포함하는 피부 미백, 피부 탄력 증진 또는 주름 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 하나의 목적은, 상기 피부투과 다기능성 펩타이드를 포함하는 상처치유용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 피부투과 다기능성 펩타이드 또는 이의 유도체 및 상기 펩타이드와 생리활성물질이 포함된 생리활성물질 경피 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 피부투과 다기능성 템타이드 또는 이의 유도체를 사용하는 것을 특징으로 하는， 피부미백, 피부 탄력 증진， 주름 개선 또는 상처 치유 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 피부투과 다기능성 펩타이드 또는 이의 유도체를 사용하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질의 경피 전달 방법을 제공하는 것이다.

【발명의 효과】

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기와 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 피부투과 다기능성 펩타이드 또는 이들의 유도체에 관한 것이다.

[서열번호 1] KLTTQMM

【발명의 효과】

본 발명에 따른 피부투과 다기능성 펩타이드는, 피부를 효과적으로 투과하는 성질을 가지고 있어 외래 물질이 결합되는 경우, 이를 피부 내로 효과적으로 이동시킬 수 있어 물질 전달을 위한 도구로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 탁월한 멜라닌 합성 억제능， 콜라겐 합성, 피부 각질 줄기세포 및 피부 진피 섬유아세포의 증식 촉진 효과를 나타내어, 펩타이드 단독으로도 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 개선 또는 상처 치유용 화장품, 의약품으로서 유용하게 활용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명에 따른 피부투과 다기능성 펩타이드 단독 사용시의 상처치유효과를 정량적으로 확인한 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 피부투과 다기능성 펩타이드와 투과 목적 20mer 펩타이드를 단순 흔합한 경우의 피부투과효과를 확인한 그래프이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기와 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 피부투과 다기능성 펩타이드 또는 이들의 유도체에 관한 것이다.

[서열번호 1] KLTTQMM

상기 유도체는 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산이 알라닌 (Ala)으로 치환된 서열을 갖는 펩타이드를 의미한다.

바람직하게는 서열번호 2 내지 8에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 펩타이드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 기기를 이용하여 합성하는 경우， 자동 펩타이드

합성기 (PeptrEX-R48, Peptron, Daejeon, Korea)에서 원하는 펩타이드를 Fmoc

고체상 (Fmoc solid-phase) 방법으로 합성한다. 수지 (resin)에서 합성 펩타이드를 분리한 후, 시세이도 캡셀 팩 C18 분석 RP 칼럼 (Shiseido capcell pak Cl 8 analytical RP column)을 이용한 역상 HPLC(reverse-phase HPLC, Prominence LC-20AB, Shimadzu,

Japan)에 의해 펩타이드를 순수분리 및 분석한다. 최종 펩타이드는 질량분광계 (mass spectrometer, HP 1 100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA)를 사용하여 동정한다. 유전공학적 기법을 이용하는 경우， 원하는 펩타이드의 해당 염기 서열을 단백질 발현 백터 (vector)에 도입한 후， BL21(^DE3)와 BL21( DE3)pLys와 같은 단백질 분해효소 (protease)가 결핍된 박테리아 (bacteria)에서 IPTG를 이용하여 발현을

유도하고 순수 분리한다.

구체적인 일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 피부투과 다기능성 펩타이드는 파지디스플레이 기법을 이용하여 동정하였고， 동정된 펩타이드의 효능을 검증하는 것에 의해 선별되었다. 피부를 투과하는 펩타이드를 동정하는 단계에서는 무작위 파지디스플레이 라이브러리를 돼지 피부에 도포한 후 일정시간 경과 후에 피부 표피를 제거하고 표피를 제외한 피부 내부에 잔존하는 파지를 증폭시켜 펩타이드 서열 및 출연 빈도에 대한 정보를 확보할 수 있다.

나아가, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하기 위해, 1) 피부투과 기능을 갖는 펩타이드를 2) 마우스 멜라닌 세포에서 멜라닌 합성 억제 효과, 3) 인간 섬유아세포에서 콜라겐 합성 효과, 4) 인간 피부 각질 줄기세포에서 증식 효과 5) 인간 피부 진피 섬유아세포의 증식으로 인한 상처치유효과 및 6) 목적 물질과 흔합한 경우 해당 목적 물질의 피부투과 효과에 대한 유효성 검증을 통해 다기능성 펩타이드를 선별하였다.

본 발명에 따른 펩타이드는 피부투과능을 가지고 이에 의해 저분자 물질과 같은 다양한 활성물질을 수송 또는 전달할 수 있는 것과 동시에, 그 자체만으로도 다기능， 구체적으로 탁월한 피부 미백, 피부 탄력 증가, 상처치유 및 주름개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하여, 약물 또는 화장료에 관한 유용성이 크다. 나아가, 다양한 활성물질을 수송 또는 전달하는 경우, 해당 활성물질과 본 발명에 따른 템타이드를 공유 결합 등에 의해 결합시켜 수송 또는 전달할 수도 있으며， 활성물질과 본 발명에 따른 펩타이드를 단순히 흔합하는 것에 의하여도 목적하는 활성물질을 용이하게 전달할 수 있어, 특히 펩타이드와 같이 공유결합 등을 시키는 경우 발생할 수 있는 변성과 합성 및 정제의 어려움 등의 문제를 효과적으로 피할 수 있다는 장점을 갖는다. 이때, 해당 활성물질과 본 발명에 따른 피부투과 다기능성 펩타이드를 공유결합시키는 방법은 공지의 기술을 이용하여 적절하게 제조할 수 있다.

구체적으로, 상기 생리활성물질은 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 흑은 억제시키는 물질로서, 생체 내에서 소망하는 효과를 발휘할 수 있는 약물을 비롯한 모든 물질을 의미한다. 상기 생리활성물질은 예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 나노입자, DNA, RNA, 저분자 화합물등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자들은 20mer의 랜덤 펩타이드를 전달하는 생리활성물질로 사용하여 본 발명에 따른 피부투과 다기능성 펩타이드에 의해 경피 전달을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면， 본 발명의 피부투과 다기능성 펩타이드는 종래 PTD(Protein transduction domain)로 알려진 TAT 단백질의 투과율과 비교하여 탁월한 피부 투과도를 나타낼 뿐만 아니라, 그 자체만을 사용하여도 탁월한 멜라닌 생합성 억제 효과, 콜라겐 합성 효과, 각질 줄기세포 증식 효과 및 진피 섬유아세포 증식 효과를 나타낸다.

나아가， 또 다른 양태로서， 본 발명은 상기 피부 투과 다기능성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 피부 탄력 증진 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "주름"이란， 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재 하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에서 "주름개선"이란， 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.

본 발명에서 용어， "피부 탄력 "이란, 진피층에 존재하는 엘라스틴 (elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는 것으로, ' '피부 탄력 증진"이란 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유와 교원섬유인 콜라겐이 층분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지되는 것을 말한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 품, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수， 유액, 메이크업베이스， 에센스， 비누， 액체 세정료， 입욕제， 선 스크린크림, 선오일 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누， 계면활성제 -함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스

파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며， 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코을, 증점게, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 다기능성 피부 투과 펩타이드를 포함하는, 피부 미백, 주름개선, 피부 탄력 증진 또는 상처치유용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립게, 정제, 캡술제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제， 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며， 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 회석제로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로스, 솔비를, 만니를, 자일리를, 에리스리를, 말티를, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀를로즈, 메틸 셀를로즈, 미정질 셀를로스, 폴리비닐피를리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트,

프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슴 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 본 발명에 따른 조성물의 경우 유효 성분인 다기능성 피부 투과 펩타이드는 경피투여 제제 형태인 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도， 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 또는 약학적 조성물은 피부 미백， 피부 주름개선, 피부 탄력 증진 또는 상처치유 기능을 갖는 물질을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부투과 다기능성 펩타이드 또는 이의 유도체 및 상기 펩타이드와 생리활성물질이 포함된 생리활성물질 경피 전달용 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게, 상기 경피 전달용 조성물 중의 피부투과 다기능성 펩타이드 또는 이의 유도체와 생리활성물질은 흔합된 형태일 수도 있고, 서로 공유 결합에 의해 연결된 복합체 형태일 수도 있다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 피부 투과 다기능성 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 또는 약학적 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 개선 또는 상처 치유 방법, 및 상기 피부 투과 다기능성 램타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 또는 약학적 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 활성물질의 경피 전달 방법에 관한 것으로, 이때 사용되는 피부 투과 다기능성 펩타이드의 사용량은 환자의 상태, 체중, 피부 상태의 정도, 화장료나 약학적 조성물의 형태, 투여 및 적용 경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으나 이는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명올 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

<실시예 1> 펩타이드 유도체의 합성

본 실시 예에서는 다양한 펩타이드 유도체를 합성하기 위하여, 일반적인 펩타이드 고상 ¾ ¾ (Wang C. Chan, Perter D. White, "Fmoc Solid phase peptide synthesis" Oxford)에 따라서 진행하였다. 보다 구체적으로, 자동합성기 (ASP48S, Peptron,Inc.)를 사용하여 Fmoc-SPPS(9-Fluorenyl methyl oxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 C-말단부터 하나씩 커폴링 (coupling)하였다. 펩타이드 유도체 합성에 사용한 모든 단량체 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고， 잔기는 트리틸 (Trt), t- 부틸옥시카보닐 (Boc), t-부틸 (t-Bu) 등으로 보호된 아미노산을 사용하였다.

커플링제 (Coupling reagent)로는 HBTU(2-(lH-Benzotimzloe- 1 -yl)- 1 , 1 ,3,3- tetramethyluronium hexafluorophophate I HOBt(Hydroxybenzo triazloe) I NMM(N- methylmorpholine)을 사용하였다.

(1) 보호된 아미노산 (8당량)과 커플링제 HBTU(8당량 )/ΝΜΜ(16당량)을

DMF(Dimethyl formamide)에 녹여서 첨가한 후， 상온에서 2시간 반응시켰다.

(2) Fmoc 제거는 20%(v/v) piperidine/DMF를 가하여 상온에서 5분간 2회 반응하였다.

상기 (1)과 (2)의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 유도체를 만든 후, 피부투과성을 확인하기 위한 형광펩타이드들은 펩타이드의 N-말단 부분에 링커로서 6-아미노 핵사노익산 (6-Amino hexanoic acid)과 플루오르세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate: FITC)를 결합시켰다.

Resin에서의 펩타이드 분리는 TFA(Trifluoroacetic acid) / EDT(l,2-ethanedithiol) / Thioanisole I TIS (Triisopropylsilane) I H ₂ 0 (흔합비 (중량기준) = 90 1 2.5 1 2.5 1 2.5 1 2.5)을 사용하여 분리하였다.

이렇게 얻어진 흔합 용액은 넁장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량

처리함으로써 침전물을 생성시킨다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전 시키고， 과량의 트리플루오로아세트산, 티아니졸 및 에탄디티올 등을 일차로 제거한 후, 동일한 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.

얻은 침전물을 C18 column(250mm ^χ 22 mm, ΙΟμηι, Vydac Everest, USA)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 기기 (Shimadzu Prominence HPLC, Japan)를 이용하여 0.1 ^o /o(v/v) Trifluoroacetic acid를 포함하는 water - acetonitrile liner

gradient(Acetonitrile 농도: 10~75%(v/v)) 방법으로 분리하였다. 정제된 펩타이드 유도체의 분자량은 LC/MS(Agilient HP 1 100 series)를 사용하여 확인하였고, 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형태의 TFA(Trifluoroacetic acid)염으로서 하기의 펩타이드를 얻었다.

구체적으로, 합성된 펩타이드 유도체들의 서열과 분자량을 하기에 나타냈다. 하기에서 헵타펩타이드 2 내지 9는 본 발명에 따른 헵타펩타이드 1(서열번호 1)의 유도체이다.

헵타펩타이드 1(서열번호 1): KLTTQMM : Rt= 6.317 분 (0·01%(ν/ν) TFA를 함유하는 5%(ν/ν) 내지 100%(ν/ν)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 851 m/e, [M+H] ⁺ = 851

헵타펩타이드 2 (서열번호 2): ALTTQMM： Rt= 6.575 분 (0·01%(ν/ν) TFA를 함유하는 5%(ν/ν) 내지 100%(ν/ν)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 794.98 m/e, [M+H] ⁺ = 795

헵타펩타이드 3(서열번호 3): KATTQMM : Rt= 5.352 분 (0·01%(ν/ν) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 809.99 m/e, [M+H] ⁺ = 810

헵타펩타이드 4(서열번호 4): KLATQMM : Rt= 6.210 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 822.05 m/e, [M+H] ⁺ = 823

헵타펩타이드 5(서열번호 5): KLTAQMM： Rt= 6.070 분 (().01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 822.05 m/e, [M+H] ⁺ = 823

헵타펩타이드 6(서열번호 6): KLTTAMM： Rt= 6.252 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 795.03 m/e, [M+H] ⁺ = 796

헵타펩타이드 7(서열번호 7): KLTTQAM : Rt= 5.720 분 (().01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 791.96 m/e, [M+H] ⁺ = 792

헵타펩타이드 8(서열번호 8): KLTTQMA : Rt= 5.694 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 791.86 m/e, [M+H] ⁺ = 792

헵타펩타이드 9(서열번호 9): GLTTQMM： Rt= 6.283 분 (0·01%(ν/ν) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 780.35 m/e, [M+H] ⁺ = 781 형광 헵타펩타이드 1 : FITC-linker-KXTTQMM : Rt= 7.250 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1353.97 m/e, [M+H] ⁺ - 1354

형광 헵타펩타이드 2: FITC-linker-ALTTQMM： Rt= 7.542 분 (0·01%(ν/ν) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1296.92 m/e, [M+H] ⁺ = 1296

형광 헵타펩타이드 3: FITC-linker-KATTQMM : Rt= 6.258 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 131 1.93 m/e, [M+H] ⁺ = 1312

형광 헵타펩타이드 4: FITC-Iinker-KLATQMM： Rt= 7.042 분 (0.01 ^ο / _ο (ν/ν) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1323.96 m/e, [M+H] ⁺ = 1324

형광 헵타펩타이드 5: FITC-Unker-KLTAQMM : Rt= 7.008 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1323.96 m/e, [M+H] ⁺ = 1324

형광 헵타펩타이드 6: FITC-linker-KLTTAMM : Rt= 7.158 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1296.95 m/e, [M+H] ⁺ = 1297

형광 헵타펩타이드 7: FITC-linker-KLTTQAM： Rt= 6.533 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1293.97 m/e, [M+H] ⁺ = 1294 형광 헵타펩타이드 8: FITC-linker-KLTTQMA : Rt= 6.533 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1293.97 m/e, [M+H] ⁺ = 1294

형광 헵타펩타이드 9: FITC-linker-GLTTQMM : Rt= 7.175 분 (().01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 1282.90 m/e, [M+H] ⁺ = 1282

<실시예 2> 피부 투과능 측정

적출된 돼지 피부 (1.77 cm ² )를 프란츠 (Franz) 확산 셀 (FCDV-15, Labfine,

Korea)의 donor chamber와 receiver chamber의 사이에 고정시키고, receiver chamber에 등장인산염 완충액 (pH 7.4)를 13 ^씩 동일하게 제공한다. 그리고 receiver chamber의 온도는 37±0.5 ^° C로 유지시키고， magnetic bar를 이용하여 600 rpm의 속도로 교반 시킨 후 해당 조건은 실험 종료까지 유지시킨다. 형광 (FITC)이 표지된 헵타 펩타이드 및 이들의 유도체와 양성대조군 형광이 표지 된 TAT를 donor chamber와 맞닿은 돼지 피부 표면에 도포하고 20시간 후 receiver chamber로 이동한 펩타이드 및 이 들의 유도체를 측정한다. 펩타이드 정량 분석은 분광광도계 (Nanodrop2000; Thermoscientific _: USA)를 이용하였다. 표 1은 헵타펩타이드의 투과도를 분석한 결과이며, 표 2는 헵타펩타이드의 유효 서열 검증을 위한 방법으로 alanine scanning을 실시하여 이에 대한 투과도를 나타낸 결과이다.

【표 1】

【표 2]

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 형광이 표지된 헵타펩타이드

l(KLTTQMM)의 2.09 g/cm ² /hr의 피부투과도를 나타냄을 확인하였으며, 표 2에서 알 수 있는 바와 같이， 헵타펩타이드 l(KLTTQMM)의 유도체들 간의 피부투과율(%)은 형광 헵타펩타이드 1 (FITC-linker-KLTTQMM)과 비교하여 각각 형광 헵타펩타이드 2는 3.06배, 형광 헵타펩타이드 3은 1.69배， 형광 헵타펩타이드 4는 0.95배, 형광 헵타펩타이드 5는 1.98배, 형광 헵타펩타이드 6은 1.96배， 형광 헵타펩타이드 7은 0.92배, 형광 헵타펩타이드 8은 1.31배 변화가 있었다.

<실시예 3> 멜라닌 생합성 억제 효과 측정

미백용 화장품 소재인 티로시나제 저해 효과 물질과 더불어, 피부 세포 내 멜라닌 합성 저해를 유도하는 물질도 피부 미백에 있어 층분한 가능성을 갖는다. 따라서, 혹색종 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과로 미백 기대할 수 있다.

B16F10 흑색종 세포 (B16F 10 melanoma cell, ATCC)를 10% FBS가 함유된

DMEM(Dulbecco's modified eagle medium, Gibco)배지를 포함하는 6-웰 플레이트에 접종하고 (I X 10 ⁵ 세포 /웰) 5% 농도의 C0 ₂ 배양기에서 37 ^° C로 24시간 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 양성대조군으로서 알부틴 (Arbutin, Sigma Aldrich) 포함 배지， 실험군으로서 20 ppm 헵타펩타이드의 포함 배지,

음성대조군으로서 일반 배지를 처리하고， 48시간 동안 다시 배양하였다 . 48시간 후, 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하고, Trypsin-EDTA 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 13,000 rpm으로 3분간 원심분리한 뒤 상등액을 제거하고 침전물을 확보하였다. 확보된 침전물을 PBS로 1회 세척 하고 상등액 제거 후, 10% DMSO가 포함된 lN NaOH 200 ul를 넣고 60 ^° C에서 1시간 정치하여 세포 내 멜라닌을 녹여내었다. 이 용액올 마이크로 플레이트로 옮겨 405 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 측정하였다. 실험 결과는 표 4에 나타내었다.

그 결과는 표 3에 나타낸 바와 같이 헵타펩타이드는 음성대조군뿐 아니라， 종래 미백에 효과가 있다고 알려진 양성대조군인 알부틴에 비해서도 혹색종 세포내 멜라닌 생합성을 탁월하게 저해시키는 것으로 나타났다.

【표 3】

<실시예 4> 섬유아세포 (human dermal fibroblast)의 콜라겐 합성 측정 섬유아세포의 콜라겐 합성량은 피부에 있어 주름 생성의 지표이다. 주름은 콜라겐의 합성이 감소되고 기존의 콜라겐이 분해되면서 발생하는 것으로 알려져 있다. 결과적으로， 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진은 주름 생성 억제 및 기존 주름의 개선 효과를 가져을 수 있다.

섬유아세포 (human dermal fibroblast, ATCC)를 FBM(fibroblast basal medium; PCS- 201-020; ATCC) 배지가 들어있는 96-웰 플레이트에 접종하고 (3 X 103 세포 /웰) 5% 농도의 C0 ₂ 배양기에서 37 ^° C로 24 시간 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 양성대조군으로서 비타민 C 포함 배지, 실험군으로서 20 ppm

헵타펩타이드 포함 배지， 음성대조군으로서 무혈청 배지로 처리하고， 48시간 동안 다시 배양하였다. 48시간 후, 세포 배양 배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 샘플 내 콜라겐량은 콜라겐 측정 키트 (Procollagen Type I C-peptide EIA kit; MK101; Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide： PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 실험 결과는 표 5에 나타내었다.

표 4의 결과로부터 알 수 있듯이 헵타펩타이드 1은 양성대조군을 사용한 경우와 대등한 정도로 섬유아세포의 콜라겐 합성을 증가시켰다.

【표 4】

<실시여】 5> 피부 각질 줄기세포 (epidermal keratinocyte progenitor cell) 증식 촉진 활성 측정

표피의 기저층에서 존재하는 각질 줄기세포의 지속적인 분열은 나이가 들어감에 따라 증식 능력이 저하되는데 이는 피부재생능력의 감퇴로 인한 탄력 저하 등의 노화현상올 가져온다. 노화에 따른 피부 재생 및 탄력과 연관되어 있는 각질 줄기세포의 생장을 촉진함으로써 지속적인 피부 탄력 개선이 가능 할 수 있다. 인간 피부 각질 줄기세포를 셀앤텍 (CdlnTec; USA)에서 구입하여 셀앤텍 지침서에 따라 배양하였다. 세포 배지는 셀앤텍의 방법에 따라 , 500 의 cnt-BM 배지에 성장인자 cnt-57를 넣어 사용하였다ᅳ 인간 피부 각질 줄기세포를 96-웰 풀레이트에 접종하고 (5 X 10 ³ 세포 /웰) 5% 농도의 C< 배양기에서 37 ^° C로 24시간 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 양성대조군으로서 루틴 (Rutin, Sigma Aldrich) 포함 배지, 실험군으로서 20 ppm 헵타펩타이드 포함 배지,

음성대조군으로서 일반 배지로 처리하고, 72시간 동안 다시 배양하였다. 세포 증식 정도를 CCK-8 키트 (CK04; Dojindo)를 이용하여 확인하였고, 실험방법은 키트 설명서에 따라 수행하였다. 표 5에 상기 실험의 결과를 나타내었다.

표 5의 결과로부터, 20 ppm의 농도에서 헵타펩타이드의 각질 줄기세포 증식 효과를 확인 할 수 있다. 【표 5】

<실시예 6> 세포 생존능 측정

인간의 피부 각질 줄기세포를 셀앤택 (CellnTec; USA)에서 구입하고 지침에 따라 500 m의 Cnt-BM 배지에 성장인자 Cnt-57를 넣어 배양에 사용하였다. 인간 피부 각질 줄기세포를 96-웰 폴레이트에 접종하고 (5 X 10 ³ 세포 /웰) 5% 농도의 C0 ₂ 배양기에서 37 ^° C로 24시간 배양하였다. 24시간 후， 헵타펩타이드의 세포독성을 확인하기 위하여 100, 200， 400 ppm의 농도로 세포에 처리하고, 48시간 후 세포독성 정도를 CCK-8 키트 (CK04; Dojindo)로 확인하였다. 양성대조군으로 20 ppm농도의 독소루비신 (Doxorubicin hydrochloride, sigma)을 동일한 시간 조건으로 처리하였다. 표 6의 결과로 미루어 볼 때 헵타펩타이드는 100 내지 200 ppm에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

【표 6】

<실시예 7> 상처치유능력 측정

본 발명에 따른 헵타 ¾타이드의 상처치유 효과를 확인하기 위하여 본 발명에 따른 헵타펩타이드를 20 ppm의 농도로 인간 진피 섬유아세포에 처리하고 48시간 후에 상처 치유 효과 정도를 세포의 이동거리를 정량화함으로써 확인하였다. 인간의 진피 섬유아세포는 ATCC에서 구입하였고, 섬유아세포 전용 배양배지를 5% 농도의 C0 ₂ 배양기에서 37 ^° C로 24시간 배양하였다. 인간 진피 섬유아세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 24시간동안 배양 후, 헵타펩타이드를 처리하였다.

양성대조군으로 비타민 C를 동일한 20ppm의 농도로, 동일한 시간 조건으로 처리하였고, 그 결과를 표 7 및 도 1에 나타내었다.

【표 7]

상기 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른

헵타펩타이드 l(KLTTQMM)은 그 자체로도 상처치유에 관한 효과를 가지고 있으며 _: 이는 종래 상처치유효과가 있다고 알려져 있는 양성대조군인 비타민 C에

비해서도 훨씬 탁월한 것임을 확인하였다.

<실시예 8> 피부투과도 개선 효과 측정

본 발명에 따른 헵타펩타이드 1(KLTTQMM: 서열번호 1) 및 이의 유도체인 헵타펩타이드 9(GLTTQMM: 서열번호 9)에 의한 약물을 비롯한 물질들의

피부투과도 개선 효과를 확인하기 위하여 , 20mer의 펩타이드를 사용하여 실험하였다. 구체적으로 피부투과를 목적하는 물질로서 20mer의 랜덤 펩타이드를 상기 실시예 1번과 같은 방법에 의해 제조 및 FITC로 형광표지하였다.

20mer 랜덤 펩타이드 (서열번호 10): FITC-linker-DLDLEALAPYIPADDDFQLR: Rt= 5.650 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의

아세토니트릴 /물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); 1\ (£81) 2793.08 1^6, [ +¾ ⁺ = 1397 (M+l)/2

이를 본 발명에 따른 헵타펩타이드 1(서열번호 1) 또는 헵타펩타이드 9(서열번호 9)와 단순 흔합하였고, 이때 흔합비는 중량비로, 헵타펩타이드 1 또는 헵타펩타이드 9 : 랜덤펩타이드 = 1 : 5로 하였으며, 45% EtOH/PBS(v/v) buffer를 사용하였다.

적출된 Balb/c mouse의 제모된 등쪽 피부 (1.77 cm ² )를 프란츠 (Franz) 확산 셀 (FCDV-15, Labfme, Korea)의 donor chamber와 receiver chamber의 사이에 고정시키고， receiver chamber에 등장인산염 완층액 ( H 7.4) 13 mL올 동일하게 제공하였다. 그리고 receiver chamber의 온도는 37±0.5 ^° C로 유지시키고, magnetic bar를 이용하여 600 rpm의 속도로 교반 시킨 후 해당 조건은 실험 종료까지 유지시켰다. 헵타펩타이드 1 또는 헵타펩타이드 9와 형광 (FITC)이 표지 된 20mer 펩타이드 및 이들의 음성대조군인 각각의 랜덤 펩타이드 단독을 donor chamber와 맞닿은 Balb/c mouse의 제모된 등쪽 피부 표면에 도포하고 20시간 후 receiver chamber로 이동한 형광 표지된 랜덤 펩타이드를 측정하였다. 펩타이드 정량 분석은 분광광도계 (Nanodrop2000;

Thermoscientific, USA)를 이용하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이， 본 발명에 따른 헵타펩타이드들에 의해서 목적하는 20mer 펩타이드의 투과율이 각각 190%, 300%씩 현저하게 증가된 것을 확인하였다.