ARREGLO MÚLTIPLE DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA EL PRONÓSTICO, DETECCIÓN Y VIGILANCIA DEL PROCESO FIBROGÉNICO

Campo de la Invención

La presente invención se ubica en el campo de los medios para pronosticar, detectar y vigilar los procesos celulares anormales derivados de padecimientos crónico-degenerativos. Específicamente, , la presente invención se refiere al uso de un arreglo múltiple de anticuerpos específicos para pronosticar, detectar y vigilar el proceso fibrogénico.

Antecedentes de la Invención La fibrosis es un hallazgo en múltiples enfermedades progresivas, que puede afectar a distintos órganos, como el hígado, el páncreas, el pulmón, el corazón y el riñon, por lo que constituye un importante problema de morbilidad y mortalidad a nivel mundial ya que es una respuesta cicatrizal a distintos agentes etiológicos como alcoholismo, hepatitis viral crónica y la enfermedad hepática no alcohólica.

La fibrosis se caracteriza por un desequilibrio entre la producción de fibras de matriz extracelular y la degradación de las mismas. Este desequilibrio tiene lugar debido a la activación de las células estelares hepáticas, ya que son los principales componentes celulares productores de fibras de matriz extracelular principalmente colágenas. La degradación de estas moléculas se encuentra regulada por las metaloproteinasas (MMPs) y sus inhibidores tisulares (TI Ps) . Dicha activación se debe a la secreción de moléculas como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , el factor de crecimiento insulinoide 1 (IGF-1) y el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-βΙ). Éste último se considera el principal componente fibrogénico.

Recientemente se ha propuesto que el proceso fibrogénico puede ser reversible, cuando éste se encuentra en una etapa temprana, una vez que se ha logrado eliminar la fuente de daño tisular. Por lo que la detección temprana de la fibrosis hepática es crucial para definir un tratamiento adecuado asi como evitar la progresión de la misma lo cual representaría una mejora en la calidad de vida del paciente que la padece.

Existen varias escalas para establecer el grado de progresión de la fibrosis, todas ellas con la finalidad de establecer la gravedad de la patología, así como obtener información útil para el tratamiento y seguimiento de cada uno de los pacientes. Las escalas más utilizadas son la escala Metavir, el índice de actividad histológica, también llamado Knodell y el sistema Ishak. Siendo la primera de ellas la más validada clínicamente respecto a las otras dos.

Según la escala Metavir, la fibrosis se puede dividir en cinco grados que son: 0= sin fibrosis, 1= presencia de fibrosis portal sin septos, 2= presencia de fibrosis portal con escasos septos, 3= presencia de fibrosis portal con numerosos septos y 4= cirrosis, mientras que el grado de inflamación se divide en cuatro que son: A0= ninguna, Al= leve, A2= moderada y A3= severa.

Actualmente se cuenta gran número de métodos para el diagnóstico de la fibrosis hepática, todos ellos pueden clasificarse en dos grandes grupos: métodos no invasivos y métodos invasivos.

Métodos Invasivos

Dentro de éste grupo sólo se encuentra la biopsia hepática, la cual constituye el estándar de oro para el diagnóstico de fibrosis, la cual consiste en tomar un fragmento del tejido hepático, que representa aproximadamente 1/50,000 de la totalidad del hígado. Éste procedimiento puede realizarse mediante dos técnicas diferentes: transyugular que se realiza introduciendo una aguja mediante un catéter en la vena yugular para así llegar hasta el hígado a través de dicho vaso sanguíneo, la técnica se apoya en el uso de fluoroscopía y se emplea en los casos en que los pacientes tienen problemas de coagulación, ya que disminuye el riesgo de hemorragia; y percutánea que consiste en tomar un fragmento de tejido al introducir una aguja a través de los espacios intercostales del paciente, ésta técnica se apoya con ultrasonido o tomografía axial computada (TAC) para facilitar la localización de la zona que se desea biopsiar.

A pesar de su alta sensibilidad y especificidad, la biopsia presenta desventajas. La primera de ellas es que se trata de un procedimiento invasivo que representa un riesgo potencial, debido a que los pacientes con cirrosis no producen los factores de coagulación de manera normal, lo que incrementa la probabilidad de sufrir una hemorragia, además, es difícil tomar muestras suficientes de tejido para realizar el seguimiento adecuado de la enfermedad.

Por otra parte, los resultados de la biopsia dependen del tamaño de la misma y debe considerarse la variabilidad inter-observador, ya que el correcto análisis de la misma depende en gran medida de la experiencia del patólogo.

Métodos no invasivos

Los cuales consisten en la medición de los niveles séricos de diferentes clases de biomarcadores , o bien, en obtener información acerca del estado del tejido hepático por medio de técnicas de imagen, lo cual implica un riesgo menor para el paciente. Dentro de éste grupo, se presentan a su vez categorías :

1. Marcadores séricos

Que son moléculas cuyo nivel medido en suero puede correlacionarse con el grado de fibrosis presente en el paciente, de manera ideal, deben ser: específicos de la patología, estables, con medición altamente reproducible y fácilmente cuantificables .

A su vez, podemos considerar tres tipos de marcadores séricos:

- Directos o tipo I, están directamente relacionados con el recambio de matriz _ extracelular , la acumulación de la misma así como el balance entre fibrogénesis y fibrinólisis .

- Indirectos ó tipo II, se basan en la modificación de la función o estructura hepática a causa de la fibrosis.

- Compuestos, son paneles que conjuntan tanto marcadores directos como indirectos.

Existen diferentes paneles que agrupan biomarcadores séricos útiles en el diagnóstico de la enfermedad, sin embargo, ninguno de ellos posee la sensibilidad y especificidad para discriminar entre las etapas intermedias • de la fibrosis, es decir, sólo identifican la ausencia de fibrosis y la presencia de cirrosis. 2. Técnicas de imagenologia

Éstas pueden detectar cambios en el parénquima y modificaciones en la circulación portal, 1ο cual las hace capaces de distinguir entre la fibrosis leve y la cirrosis.

Cabe señalar que, aunque los biomarcadores genéticos han brindado importante información sobre los mecanismos patogénicos de la fibrosis, en la práctica clínica no son utilizados ya que resulta difícil su determinación de manera rutinaria en pacientes con fibrosis hepática.

3. Otros

Uno de los métodos recientemente desarrollados para diagnosticar la fibrosis hepática es la prueba de aliento cuyo principio es el metabolismo medible de un sustrato ingerido es expulsado por el sistema respiratorio, los sustratos más utilizados son la metionina, metacetina o cafeína marcadas con el isótopo Carbonol3. Ésta prueba se fundamenta en la pérdida de función hepática lo cual está directamente relacionado con el metabolismo y depuración de los sustratos, cuyos niveles pueden ser medidos en el aliento y relacionados con el grado de daño en el hígado. Ésta técnica novedosa ha probado su sensibilidad y especificidad únicamente al discriminar entre pacientes con cirrosis y personas sanas.

Por último, se encuentran los métodos proteómicos, que consisten en buscar las proteínas diferencialmente expresadas en las muestras de los pacientes. Las ventajas de la utilización de dichos métodos radican en su alta sensibilidad y capacidad para detectar incluso modificaciones postraduccionales de las proteínas de interés, así como su contribución a la comprensión de la fisiopatología de la fibrosis .

Es importante resaltar que, los métodos proteómicos no son utilizados como método diagnóstico, en cambio, se emplean en la identificación de potenciales biomarcadores que puedan ser validados y cuantificados de manera accesible para constituir nuevos métodos de diagnóstico no invasivo.

Los árboles de decisión esquematizan de manera diagramática un proceso de decisión en donde los nodos representan preguntas acerca de valores atribuidos o rangos de valores y ramas de las posibles respuestas ligadas a un nodo de pregunta con todo nodo más bajo en el árbol, el cual, representa más preguntas. La elaboración de estos árboles de decisión se realiza empleando el algoritmo C4.5, el cual es frecuentemente referido como clasificador estadístico que se basa en los conceptos de entropía y ganancia de información. En este sentido, se emplea un pseudocódigo, mismo que se basa en encontrar el atributo que aporta mayor información, es decir, aquel con menor entropía o mayor ganancia de información, con relación al grupo de muestras aportadas. Asimismo, crea un nodo de decisión que se separe en atributo seleccionado, el cual tiene una pregunta de decisión en un valor de atributo o intervalo de valores, para dividir las muestras en relación a este valor o intervalo de valores, por ejemplo, aquellos con un valor debajo, dentro y por encima del intervalo. En caso de que las muestras correspondan a la misma vertiente, se trata de un nodo de clase. Finalmente, crea un nodo (hijo) para cada caso residual y aplicar el procedimiento para todas las muestras que quedan en la división correspondiente.

Por otro lado, el algoritmo también selecciona las mejores reglas de los árboles y hace un conjunto de reglas compuestas, que son probadas contra todas las muestras del estudio y proveen un factor de confianza. Se realiza la división de todos los datos empíricos disponibles en 10 subgrupos generados aleatoriamente, se usa el 90% de los datos como datos de ensayo y el 10% restante se usa como datos de prueba, para después, computar el desempeño del clasificador como el promedio del total de las pruebas.

La solicitud de patente WO/2008 /133967 revela un panel de biomarcadores útiles en el diagnóstico clínico de fibrosis hepática, el cual se realiza mediante un inmunoensayo empleando plasma como material biológico que permite determinar el grado de desarrollo de la enfermedad, sin embargo, el panel propuesto incluye varias moléculas que aún cuando son sintetizadas en el hígado, no participan en el proceso fibrogénico y se encuentran en bajas concentraciones en el plasma, por lo que este panel es poco específico y poco sensible.

La solicitud de patente US/2009/0275061 protege el uso de la tecnología de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) como un método de cuantificación de biomarcadores séricos asociados al desarrollo de fibrosis hepática, sin embargo, esta tecnología es limitada pues emplea materiales no disponibles como el oro.

Valva, et. al. reportaron la identificación de marcadores séricos relacionados con la progresión de la fibrosis hepática, sin embargo, la identificación de los mismos se realiza de manera separada, para lo cual se requiere de una mayor cantidad de muestra y tiempo para diagnosticar la enfermedad, además que técnicamente existe mayor error intra e interensayo.

Sumario de la Invención

Por lo tanto es un objetivo de la presente invención identificar los biomarcadores no invasivos y específicos que son altamente expresados, para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico. Otro objetivo de la presente invención es el uso de un arreglo múltiple de anticuerpos de captura específicos dirigidos contra los biomarcadores no invasivos para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico.

Asimismo, otro objetivo de la presente invención es brindar un método para acoplar los anticuerpos de captura específicos dirigidos contra biomarcadores no invasivos para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico a soportes sólidos tales como esferas.

Un objetivo más de la presente invención es el uso de un algoritmo matemático para el análisis de los biomarcadores no invasivos para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico.

Este y otros objetivos serán alcanzados mediante la invención que se describe a detalle a continuación.

Breve Descripción de las Figuras de la Invención

Las Figuras 1A y IB se refieren a gráficas que muestran el establecimiento del rango dinámico de las quimiocinas CXCL-7 y CXCL-9 respectivamente, en pacientes con hepatitis C y controles. El análisis se realizó mediante t-no pareada, de los cuales no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas . La Figura 2 se refiere a la gráfica del establecimiento del rango dinámico de IGFBP-1 en pacientes con hepatitis C y controles. El análisis se realizó mediante t-no pareada (encontrando diferencia estadísticamente significativa entre controles y pacientes con hepatitis C crónica.

Las Figuras 3A y 3B, se refieren a las gráficas que muestran la determinación del rango dinámico para ácido hialurónico, para lo cual se emplearon muestras de suero y plasma de pacientes respectivamente. Para ambos grupos se realizó análisis mediante t-no pareada sin obtener diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

Las Figuras 4A y 4B, se refieren a las gráficas de la determinación del rango dinámico para la interleucina IL-29 en muestras de suero y plasma respectivamente, de acuerdo a los resultados, los grupos no mostraron diferencias significativas.

Las Figuras 5A y 5B, se refieren a las gráficas que muestran la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de la quimiocina CXCL-7. Las Figuras 6A y 6B, se refieren a las gráficas que muestran la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de la quimiocina CXCL-9.

Las Figuras 7A y 7B, se refieren a las gráficas que muestran la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de la proteina de unión al factor de crecimiento insulinoide 1 (IGFBP-1) . Las Figuras 8A y 8B, se refieren a las gráficas que muestran la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de ácido hialurónico.

Las Figuras 9A y 9B, se refieren a las gráficas que muestran la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de la interleucina IL ligando 29.

Las Figuras 10A, 10B y 10C, se refieren a las gráficas que muestran el ensayo de linealidad con esferas magnéticas para CXCL-7, CXCL-9 e IGFBP-1, respectivamente.

Las Figuras 11A, 11B y 11C se refieren a la gráfica de la linealidad para el ensayo del arreglo múltiple con las esferas para CXCL-7, CXCL-9 e IGFBP-1.

Las Figuras 12A, 12B y 12C, se refieren a las gráficas que muestran la determinación de las metaloproteinasas 2, 7 y 9 respectivamente, mediante la tecnología en arreglo múltiple.

La Figura 13, se refiere a la gráfica de la determinación de CXCL-10 en suero mediante el arreglo en suspensión . Las Figuras 14A a 14G muestran las gráficas de la determinación de IGFBP 1-7 en suero. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t-no pareada.

La Figura 15 se refiere a una tabla que muestra los resultados de las técnicas de aprendizaje automático: clasificadores logísticos, regresión logística y máquinas de soporte vectorial, aplicados a resultados de niveles de proteínas en muestras de pacientes con hepatitis y controles.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención se refiere al uso de un arreglo múltiple de anticuerpos específicos para la detección, pronóstico y vigilancia del proceso fibrogénico.

El arreglo múltiple de anticuerpos específicos para la detección, pronóstico y vigilancia del proceso fibrogénico según la presente invención, está formado por pares de anticuerpos específicos dirigidos contra biomarcadores altamente expresados durante el proceso fibrogénico acoplados a soportes sólidos.

Los pares de anticuerpos específicos que forman parte del arreglo múltiple según la presente invención, están dirigidos contra proteínas expresadas en el suero o plasma de pacientes que se sospeche que tienen daño fibrogénico, las cuales son identificadas y seleccionadas de una base de datos de alta calidad de expresión génica del cuerpo humano (Affymetrix U133 2.0), que comúnmente contiene >100 diferentes tejidos humanos. Después de un estudio realizado en un grupo de pacientes con enfermedad hepática, tomando como control un grupo de sujetos sanos, se eligieron las siguientes proteínas: las quimiocinas con motivo CXC ligandos 7, 9 y 10 (CXCL-7, CXCL-9 y CXCL-10), la proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide 1 (IGFBP-1), ácido hialurónico (AH) , la interleucina 29 (IL-29), metaloproteinasas de matriz 2, 7 y 9 (MMP-2, MMP-7 y M P-9), las cuales son las más específicas y de mayor expresión durante el proceso fibrogénico.

La quimiocina CXCL-7 es parte del panel propuesto debido a que presenta actividad quimioatrayente y de activador de neutrófilos los cuales expresan en su membrana el receptor de esta quimiocina. Asimismo, interviene en el proceso fibrogénico como reclutador de células de la respuesta inmune en el sitio de inflamación.

La quimiocina CXCL-9 se encuentra incrementada en el hígado y en la sangre periférica durante la infección crónica por virus de hepatitis C, recluta linfocitos T con fenotipos cooperadores y citotóxico. Además, los valores intrahepáticos de esta quimiocina están asociados con la inflamación intralobular, por lo que representa un buen marcador de la etapa del proceso fibrogénico.

La quimiocina CXCL-10 se encuentra sobre expresado en pacientes con hepatopatía crónica, por lo que es considerado como un marcador de la progresión del proceso fibrogénico.

La proteína 1 de unión al factor de crecimiento insulinoide (IGFBP-1), es una molécula que se produce principalmente en el hígado cuya síntesis es inducida por moléculas como catecolaminas, glucagon, cortisol y especies reactivas de oxígeno.

La degradación de la molécula de ácido hialurónico (AH) disminuye en la enfermedad hepática crónica debido a que el hígado es uno de los principales órganos que metabolizan AH, mientras que su síntesis se incrementa durante el proceso inflamatorio. Asimismo, el AH forma parte de la MEC que forma la cicatriz presente en el proceso fibrogénico y muestra una correlación entre sus niveles y el grado de fibrosis.

Las interleucinas 28 y 29 están relacionadas con el virus de hepatitis C. La concentración de la IL-28 muestra un incremento en pacientes con enfermedad hepática crónica.

Las metaloproteinasas de matriz 2,7 y 9 intervienen en la degradación de MEC hepática, específicamente MMP-2 y MMP-9 degradan la colágena tipo IV. En este sentido, las concentraciones de las metaloproteinasas de matriz 2 y 7 muestran un incremento en pacientes con enfermedad hepática crónica.

El desarrollo del arreglo múltiple de anticuerpos específicos para la detección, pronóstico y vigilancia del proceso fibrogénico motivo de la presente invención se realiza con un sistema compacto de plataforma simple basado en esferas como soporte sólido para acoplar los pares de anticuerpos de captura específicos contra los biomarcadores seleccionados .

El método para la obtención del arreglo múltiple de biomarcadores no invasivos consiste de tres fases:

Fase 1: Determinar la concentración de los biomarcadores no invasivos de alta expresión durante el proceso fibrogénico en personas con y personas sin enfermedad hepática, para generar el rango dinámico de estas proteínas por el método de inmunoensayo en humanos, siendo este indispensable para realizar el acoplamiento de las proteínas a las esferas.

La determinación de las concentraciones de los biomarcadores no invasivos durante el proceso fibrogénico, comienza con el establecimiento del rango dinámico para establecer los límites de las concentraciones séricas de los biomarcadores, lo cual se realiza empleando las concentraciones séricas de las quimiocinas con motivo CXC ligandos 7 y 9 (CXCL-7 y CXCL-9) . La Figura 1A muestra la gráfica del establecimiento del rango dinámico de CXCL-7 y la Figura IB muestra la gráfica del establecimiento de CXCL-9, de acuerdo a los resultados obtenidos, los grupos de estudio no presentaron diferencias estadísticamente significativas, sin embargo, estas quimiocinas tienen un papel importante en el inicio de la enfermedad hepática. La expresión de la quimiocina CXCL-9 se incrementa tanto en hígado como en sangre periférica durante la infección crónica por el virus de la hepatitis C, su expresión intrahepática está asociada con la inflamación intralobular por lo que es un marcador de esta etapa del proceso fibrogénico.

El establecimiento del rango dinámico para las concentraciones séricas de las proteínas de unión al factor de crecimiento insulinoide 1 (IGFBP-1) se muestra en la Figura 2, en la que se observa que las concentraciones de esta proteína son estadísticamente significativas entre los grupos. Por lo que esta molécula participa en los diferentes niveles del progreso de la fibrosis, tanto en procesos celulares como en la acumulación de MEC.

La gráfica de determinación del rango dinámico para el ácido hialurónico en suero y plasma se muestra en las Figuras 3A y 3B respectivamente. De acuerdo a los resultados obtenidos, los grupos no muestran diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Sin embargo, el AH forma parte de la cicatriz de MEC observada durante el proceso fibrogénico, y muestra una correlación positiva entre sus niveles y el grado de fibrosis observado en la biopsia hepática en pacientes con Hepatitis C. Las concentraciones en suero de AH mostraron un incremento en las muestras de pacientes respecto a los controles a pesar de no ser estadísticamente significativo.

Las Figuras 4A y 4B, muestran las gráficas de la determinación del rango dinámico para la interleucina IL-29 en muestras de suero y plasma respectivamente, de acuerdo a los resultados, los grupos no mostraron diferencias significativas. Si bien, el papel de estas moléculas ha sido directamente asociado con la infección con el virus de hepatitis C, es importante incluirla en el panel de biomarcadores pues una parte de los pacientes a quienes está dirigida son pacientes con esta infección.

La Tabla 1 muestra la concentración de los diferentes biomarcadores no invasivos de fibrosis en sujetos con y sin enfermedad hepática.

TABLA 1. CONCENTRACION BIOMARCADORES NO INVASIVOS DE

FIBROSIS

Pacientes

Método de

Biomarcador Hepatitis Controles P determinación

C

Ácido

715.2 28.9

Hialurónico ELISA

ns

( 5 . 6- ( inmunoensayo) ng/mL (2-41)

13164)

IL-28 123.5 69.8

ELISA

(0- ns

pg/mL (0-684.5) ( inmunoensayo)

1662.4)

IL-29 40.7 42.8

ELISA

(0.2- ns

pg/mL (7.8-143) (inmunoensayo)

343.6)

MMP-2 225900 196600

(161089- (133542- <0.05 Multiplex pg/mL

300543) 250460)

MMP-7 63970 31170

(20358- (22419- <0.05 Multiplex pg/mL

185486) 42640)

MMP-9 148900 183800

ns Multiplex pg/mL (37682- (66475- 370205) 415128)

CXCL-10 97.4 17.5

(10.5- <0.05 Multiplex pg/mL (10-53)

651)

IGFBP-1 9.5 1.9 Inmunoensayo

(0.40 - <0.05

ng/mL (0.4-29) Multiplex

6.6)

ns= no significativa

Fase 2: El siguiente paso para el arreglo múltiple de anticuerpos específicos para la detección, pronóstico y vigilancia del proceso fibrogénico según la presente invención es el acoplamiento de dichos anticuerpos de captura específicos a esferas magnéticas, para ello, se emplea una esfera específica para cada anticuerpo de captura y la cantidad de anticuerpo a acoplar es óptima para realizar el ensayo de acuerdo a la Tabla 2, lo cual, se realiza de la siguiente manera:

TABLA 2 CANTIDADES VALIDADAS DE ANTICUERPO DE CAPTURA PARA

ACOPLAR EN ESFERAS MAGNÉTICAS

Región

Biomarcador Anticuerpo

(esfera)

de captura

CXCL-7 35 5

CXCL-9 44 10

IGFBP-1 37 5

1. Colocar esferas previamente homogenizadas en un tubo protegido de la luz.

2. Lavar y centrifugar a 8000 rpm por 5 min.

3. Descartar sobrenadante y resuspender en solución de activación. (Incluida en el Kit Amine Coupling Kit, Bio-Rad Catálogo 171-406001) . 4. Agregar 10 μΐ- de una solución de N- hidroxisulfosuccinimida (NHS) a 50 mg/mL, agitar e incubar 2 hrs .

5. Lavar y resuspender en 100 μΐι de solución amortiguadora de fosfatos.

6. Incorporar el anticuerpo de detección e incubar durante 2 horas en agitación a temperatura ambiente.

7. Lavar y resuspender en solución de bloqueo, (incluida en el Kit Amine Coupling Kit, Bio-Rad Catálogo 171- 406001) .

8. Incubar y volver a lavar.

9. Resuspender en solución de almacenamiento, (incluida en el Kit Amine Coupling Kit, Bio-Rad Catálogo 171- 406001) , almacenar en refrigeración y protegido de la luz.

Posteriormente, se realiza la validación del acoplamiento de los anticuerpos de captura específicos dirigidos contra los biomarcadores no invasivos para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico a esferas, empleando un anticuerpo secundario de ratón específico marcado con ficoeritrina (PE) para identificar IgG, el cual, se agrega en concentraciones de acuerdo a la Tabla 3. Posteriormente, se incuban protegiéndolos contra la luz y con agitación. Finalmente, las muestras se lavan con amortiguador de fosfatos y se resuspenden para ser analizadas en el equipo BIOPLEX. La importancia del uso de esferas marcadas con los dos fluoróforos radica en que el primero permite la identificación de la esfera correspondiente y por lo tanto del biomarcador contra el cual está dirigido el anticuerpo de captura acoplado. El segundo fluoróforo permite la cuantificación del biomarcador que se ha unido al anticuerpo de captura. Tabla 3. CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPO SECUNDARIO

Anticuerpo

Biomarcador Concentraciones [ g/mL]

secundario

4 • 0, 2 .0, 1 .0, 0.5, 0 .25, 0. 125,

CXCL-7 Anti-IgG

0.0625

4 .0, 2 • 0, 1 • 0, 0.5, 0 .25, 0. 125,

CXCL-9 Anti-IgG

0 .0625

4 • 0, 2 • 0, 1 • o, 0.5, 0 .25, 0. 125,

IGFBP-1 Anti-IgG

0.0625

A. Hialuronico Anti-IgG 4 .0, 2 .0, 1 • 0, 0.5, 0 .25, 0. 125,

0.0625

IL-29 Anti-IgG 4 • 0, 2 • 0, 1 • o, 0.5, 0 .25, 0. 125,

0.0625

Con base a los datos anteriores, las Figuras 5A y 5B, muestran las gráficas representativas de la validación del acoplamiento del anticuerpo de captura de CXCL-7 en diferentes concentraciones. de CXCL-7 a las esferas magnéticas. La gráfica representativa de la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de CXCL-9 a diferentes concentraciones se muestra en las Figuras 6A y 6B. La validación del acoplamiento del anticuerpo especifico de detección de la proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide 1 con las esferas magnéticas se muestra en las gráficas de las Figuras 7A y 7B. Las Figuras 8A y 8B, se refieren a las gráficas de la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de ácido hialuronico con las esferas magnéticas. En las Figuras 9A y 9B, se muestran las gráficas de la validación del acoplamiento del anticuerpo de detección de IL-29 a las esferas magnéticas.

Asimismo, se realiza la validación de la linealidad de cada anticuerpo de captura específico dirigido contra los biomarcadores no invasivos para la detección de fibrosis hepática a esferas, motivo de la presente invención. Dicha validación se realiza como se muestra a continuación, tomar alícuotas de una suspensión de esferas marcadas y agregar el estándar correspondiente de acuerdo a la Tabla 4, posteriormente, incubar con agitación durante 1.5 hrs . , transcurrido el tiempo lavarlas y agregar el anticuerpo de detección biotinilado, incubar 1.5 hrs, lavar nuevamente y agregar una solución de estreptavidina-PE, incubar con agitación, para después lavar y resuspender en solución amortiguadora de fosfatos, agitar y leer en el equipo BIOPLEX.

De acuerdo a los datos anteriores, en las Figuras 10A, 10B y 10C, se muestran las gráficas de linealidad del ensayo con esferas de CXCL-7, CXCL-9 e IGFBP-1 respectivamente.

Una vez realizadas la validación del acoplamiento de los anticuerpos y la validación de la linealidad de cada anticuerpo específicos dirigidos contra los biomarcadores no invasivos para la detección, pronóstico y vigilancia del proceso fibrogénico según la presente invención, se desarrolla el ensayo multiplex empleando curvas estándar de ocho concentraciones obtenidas mediante diluciones seriales, en las que se colocan las esferas marcadas más el estándar correspondiente y se incuban con agitación, lavar y agregar el anticuerpo de detección biotinilado, posteriormente incubar, lavar y agregar una solución de estreptavidina-PE, las muestras son incubadas con agitación y se lavan para después ser resuspendidas en solución amortiguadora de fosfatos, agitar y leer en el equipo BIOPLEX. Las Figuras 11A, 11B y 11C muestran la gráfica de la linealidad para el ensayo múltiple con las esferas para CXCL-7, CXCL-9 e IGFBP- 1.

Fase 3: Teñir las esferas que se encuentran acopladas a anticuerpos específicos. En este sentido, cada esfera es teñida internamente con diferentes cocientes de 2 fluoróforos distintos espectralmente para asignarle una dirección espectral única. Las esferas vienen teñidas de fábrica con el primer fluorocromo y el segundo corresponde a la ficoeritrina que se une por la reacción realizada a diferentes moléculas de captura como es el caso de Metaloproteinasas 2, 7 y 9, CXCL-10, IGFBP 1-7.

Durante la progresión de la fibrosis se presenta un proceso de remodelación de la MEC que da como resultado su degradación, así como la formación y deposición de colágena nueva. Estos cambios son regulados por un grupo de proteasas, inhibidores y factores de transcripción. La degradación de MEC es principalmente realizada por una familia de enzimas dependientes de calcio y zinc denominadas metaloproteasas (MMP) que degradan sustratos de colágena y no colágena. La degradación de la MEC hepática se lleva a cabo a través de la acción de MMP-2 y MMP-9 que degradan colágena tipo IV, MMP de membrana tipo 1 o 2, las cuales activan a la MMP-2 latente y estromelisina que degrada proteoglicanos y glicoproteínas, y además activa colagenasas latentes. En las Figuras 12A, 12B y 12C, se muestra la determinación de las metaolproteinasas 2, 7 y 9 respectivamente, mediante la tecnología en múltiple. En el caso de este grupo de proteínas, las MMP-2 y 7 mostraron un incremento significativo en las muestras de los pacientes con enfermedad hepática crónica, mientras que la MMP-9 fue más baja a pesar de no ser significativo.

La quimiocina CXCL-10, tiene un papel en el proceso fibrogénico hepático, se sugiere como marcador de cáncer hepático y predictor del éxito de un trasplante hepático. La Figura 13 muestra la gráfica de la determinación de CXCL-10 mediante el análisis en suspensión, de acuerdo con los resultados obtenidos, la concentración de la quimiocina de las muestras analizadas, fue significativamente más alta en pacientes con hepatopatía crónica respecto a los controles, por lo que puede considerarse como un marcador de la progresión del proceso fibrogénico.

Resultados previos del grupo, revelaron que el inmuno- ensayo de la proteína de unión al factor de crecimiento insulinoide tipo 1 (IGFBP-1) presenta niveles en suero significativamente más altos en pacientes respecto del grupo control. Se evaluó este resultado mediante el sistema de detección múltiple, confirmándose los niveles incrementados de IGFBP-1 en pacientes con hepatitis C crónica. La familia de proteínas de unión al factor de crecimiento insulinoide (IGFBP) son moléculas que tienen participación en el proceso fibrogénico pulmonar, la sobre expresión de IGFBP-5 favorece la producción de la matriz éxtracelular (MEC) , y la respuesta fibrogénica por parte de los fibroblastos. Efectos similares se han observado en la piel. IGFBP-4 ha mostrado asociación con los niveles de expresión de las principales moléculas involucradas en la remodelación de MEC. Las MMPs 1, 3 y 13 muestran una correlación con IGFBP-4 en la remodelación tisular del endometrio en el periodo post-parto. El análisis realizado en muestras de controles y pacientes demuestra alteraciones en las concentraciones circulantes de algunas de las IGFBPs, sin embrago, su participación en el progreso de la fibrosis hepática no es clara. Por un lado las figuras 14A, 14B y 14C muestran que las proteínas IGFBP-1, 6 y 7 respectivamente, son significativamente más altas en pacientes con hepatopatía crónica respecto a los controles, mientras la Figura 14D muestra que la proteína IGFBP-2 es significativamente más baja, por su parte las Figuras 14E y 14F, muestran que las proteínas IGFBP-4 y 5 respectivamente, presentan una tendencia ser más bajas. Finalmente, la Figura 14G muestra que la proteína IGFBP-3 no presenta diferencias estadísticas. Este grupo de moléculas puede participar a diferentes niveles durante el progreso de la fibrosis, tanto en procesos celulares como en procesos de acumulación de MEC.

Una vez teniendo los resultados de las diferentes proteínas analizadas por arreglo múltiple, para los datos se emplearon algoritmos de aprendizaje automático para evaluar los resultados de las proteínas que conforman la intención de la patente como se muestra a continuación: 1. Clasificadores Logísticos.

Regresión Logística que es un método logístico para diferenciar dos o más clases de eventos categóricos. Esta técnica no presupone que las variables independientes posean una distribución normal. En este sentido, el clasificador logístico se utiliza para identificar a los parámetros de las funciones logísticas que separan a las dos clases como pacientes y controles y luego los utiliza para decidir a qué clase pertenecen dicho objeto o evento. 2. Máquinas de soporte vectorial (Poly y Puk en tablas).

Es una técnica de clasificación que para separar las clases de objetos y eventos transforma el espacio de las variables independientes a un nuevo espacio donde la separación sea más evidente. El modelo que se escoge para transformar el espacio define se le denomina kernel y define el tipo de máquinas de soporte vectorial. En el caso de transformar las variables usando un polinomio como base a la transformación se trata de un kernel de polinomio (Poly) . Los polinomios ofrecen un rango básico de transformaciones .

Al aplicar estas técnicas de aprendizaje automático a los resultados de los biomarcadores en muestras de pacientes con hepatitis y sujetos control se evidenció que las herramientas son adecuadas para diferenciar a los 2 grupos. La Figura 15 muestra las técnicas arriba descritas en las filas, mientras que las columnas representan cada uno de los pares de anticuerpos específicos dirigidos contra biomarcadores no invasivos del arreglo múltiple para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico según la presente invención. En este sentido, se realizaron combinaciones de los diferentes pares de anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas, las cuales están enumeradas como se muestra a continuación:

1. CXCL7

2. CXCL9

3. IGFBP1

4. MMP2

5. MMP7

6. MMP9

7. IGFBP2

8. IGFBP3

9. IGFBP4

10. IGFBP5

11. IGFBP6

12. IGFBP7 De acuerdo a lo que se muestra en la Figura 15, la última columna, muestra la combinación de todas las proteínas incluidas en el arreglo múltiple. Con base en los resultados obtenidos, las columnas 3, 15 y 16 separan perfectamente 2 grupos: control y pacientes con hepatitis C con lo que se demuestra la aplicabilidad en el caso de enfermedad hepática.

Una vez que se detectan los biomarcadores que incluye el arreglo múltiple, la interpretación que se realiza con el algoritmo matemático, se encuentra una relación entre la concentración de biomarcadores y el grado de fibrosis, por lo que se realiza la detección de dicho padecimiento, al mismo tiempo, se identifica el grado de fibrosis, por ejemplo Fl se considera que el paciente tiene buen pronóstico, si el paciente está en estadio F3 o F4 el paciente tiene mal pronóstico.

De esta manera, la vigilancia se deberá realizar una vez que se identifique el grado de fibrosis, por lo que se deberá determinar la concentración de los biomarcadores no invasivos con cierta periodicidad para vigilar el avance o regresión de la fibrosis como parte de la historia natural de la enfermedad, o bien, cuando reciba intervención terapéutica .

La presente invención, ha sido ejemplificada a lo largo de la descripción con experimentos que muestran la aplicación del uso de un arreglo múltiple de anticuerpos específicos para el pronóstico, detección y vigilancia del proceso fibrogénico de acuerdo con la invención. En este sentido, los ejemplos fueron desarrollados con fines de ilustración y no de limitación, por lo que pueden existir variaciones y modificaciones de los mismos, en vista de lo anteriormente explicado. Asimismo, el alcance de la presente invención abarca también el hecho de que ésta puede ser practicada de otro modo y en una gran variedad de formas diferentes a las aquí descritas.

Dado lo anterior, resulta evidente para una persona con conocimientos medios en la materia que dichas modificaciones y adaptaciones a la presente invención, tal como se describe e ilustra en este documento y sin apartarse del alcance descrito, es factible y cae dentro del ámbito de la misma.

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