La presente invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial aislada para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro donde preferiblemente dicha célula madre multipotencial es una célula madre mesenquimal o más preferiblemente dicha célula madre mesenquimal es una célula mesenquimal capaz de expresar la proteína Nestina. La presente invención también se refiere a una población celular aislada de células mesenquimales adultas nestina positivas de un mamífero, incluyendo humanas, a su uso para la fabricación de un medicamento para el mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero, para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad asociada con una disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero, y para mantener y expandir células madre adultas hematopoyéticas de dicho mamífero, incluyendo un humano. Asimismo, la presente invención también se refiere a un método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro o a un método para evaluar la capacidad hematopoyética de un mamífero.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Se ha sugerido que las células madre hematopoyéticas (HSCs) están preferentemente localizadas en regiones perivasculares de la médula ósea (Kiel et al., 2005. Cell 121 : 1 109-1 121 ), cerca de células reticulares con expresión elevada de la quemoquina CXCL12/SDF-1 (Sugiyama et al.,

2006. Immunity 25: 977-988). No obstante, no se conoce la identidad y función de estas células. En la médula ósea humana, CD146 se expresa en células perivasculares que tienen capacidad osteoprogenitora y que pueden autorrenovarse y reconstituir la hematopoyesis (Sacchetti et al.,

2007. Cell 131 : 324-336). Sin embargo, no está claro si las células CD45 ^" CD146 ⁺ forman parte del nicho hematopoyético y esta combinación de marcadores está presente también en las células endoteliales vasculares. La migración de las HSCs ofrece un paradigma útil para estudiar los elementos celulares que forman el nicho hemopoyético, ya que la atracción de las HSCs está directamente controlada por el microambiente de la médula ósea. Estudios previos han revelado que la movilización de las HSCs inducida por el factor de crecimiento de colonias de granulocitos (G-CSF) está regulada por el sistema nervioso simpático (SNS) (Katayama et al., 2006. Cell, 124: 407-421 ). En homeostasis, un bajo número de HSCs abandona la médula ósea para pasar al torrente circulatorio (Abkowitz et al., 2003. Blood, 102: 1249-1253; Wright et al., 2001 . Science, 294: 1933-1936). Su liberación en la sangre está regulada por el reloj molecular y dirigida por el SNS, el cual libera cíclicamente noradrenalina en la médula ósea, activando los receptores adrenérgicos β3 e induciendo en consecuencia oscilaciones rítmicas en la expresión de Cxcl12 (Mendez- Ferrer et al., 2008. Nature, 452: 442-447).

Por otro lado, estudios previos han demostrado que las células perivasculares CD45 ^" CD146 ⁺ de la médula ósea y de otros tejidos contienen osteoprogenitores (Sacchetti et al., 2007. Cell 131 : 324-336) o MSCs (Crisan et al., 2008. Cell Stem Cell, 3: 301 -313), y datos recientes sugieren que células capaces de osificación endocondral son necesarias para la formación del nicho hemopoyético en la médula ósea fetal (Chan et al., 2008. Nature, 457[7228]: 490-4).

La nestina es una proteína del filamento intermedio. Constituye un marcador de células progenitoras multilinaje y su presencia en estas células indica la multipotencialidad de las células y su capacidad regenerativa (Wiese et al., 2004. CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 61 : 2510- 2522). En este sentido, es conocido que las células Nestina+ de la región del bulbo del folículo capilar, tienen propiedades de células madre, son multipotentes (células madre mesenquimales) y pueden generar células del linaje neural in vitro e in vivo (Mignone et al., 2007. Cell Cycle, 6 (17): 2161 -2170). En la discusión de Mignore et al., 2007, se mencionan los tipos celulares a los que pueden diferenciarse las células Nestina+, por ejemplo, células madre neuronales y células neuronales, células ovales del hígado, células satélite del músculo, células madre del páncreas, células Leydig progenitoras, células de músculo liso, células de la glándula sebácea, melanocitos o keratinocitos. El traspalnte de células progenitoras hematopoyéticas, consiste en la infusión de estas células obtenidas de la médula ósea, la sangre periférica (Korbling et al., 1981 . Exp Hematol 9:684-690), el cordón umbilical o el hígado fetal, a un paciente que ha sido previamente acondicionado para recibir el injerto. Se ha convertido en una modalidad terapéutica para una gran variedad de enfermedades, como hemopatías malignas, anemia aplástica, inmunodeficiencias y gran número de tumores sólidos. En la actualidad se trasplantan más de 30 000 pacientes al año en todo el mundo. La selección de la fuente y el tipo de trasplante están determinados por diferentes factores. La sangre periférica (SP) fue la fuente de progenitores hematopoyéticos en el 90 % de los trasplantes autólogos y en el 30 % de los alogénicos.

La morbilidad y mortalidad del proceder ha mejorado en los últimos años gracias a un mejor conocimiento del sistema de histocompatibilidad, al desarrollo de la terapia anti-infecciosa, al uso de ambientes con escasa contaminación microbiana, al soporte hemoterapéutico y a la administración de inmunosupresores potentes.

Existe la necesidad de garantizar una función hematopoyética correcta tras un tratamiento quimiorradioterápico en dosis elevadas. Además, existen varias limitaciones del trasplante alogénico, lo que ha sido la causa del desarrollo del autotrasplante en los últimos años. Consiste en obtener células progenitoras hematopoyéticas del propio paciente, conservarlas y reinfundirlas, después de administrar dosis de quimioterapia y/o radioterapia ablativa,

Sin embargo, los transplantes autólogos, pese a presentar una serie de ventajas (no requiere la búsqueda de un donante, menor toxicidad relacionada con el proceder, se puede realizar a pacientes de mayor edad (60 - 65 años), no existen las complicaciones indeseables de enfermedad de injerto contra huésped (EICH), permite la realización de consolidación en los tumores sólidos, en el momento en que la masa tumoral es menor, se necesita un número menor de células para la reconstrucción medular que en el trasplante alogénico, y es una opción en pacientes que por diferentes causas no pueden recibir un trasplante alogénico), presentan una menor frecuencia en la recuperación medular debido a defectos en el microambiente medular, influido por la enfermedad de base y/o los tratamientos previos.

El transplante de precursores hematopoyéticos obtenidos de sangre periférica, requiere la administración de FEC gránulo-monocítico (GM- CSF). La ventaja principal del TCH de SP sobre el trasplante de médula ósea, es que el primero contiene un mayor número de células y se logra un mejor implante. Además, presenta otra serie de ventajas: no hay necesidad de empleo del salón de operaciones y se evitan todos los riesgos que esto conlleva, rápida recuperación hematológica después del implante, menor posibilidad de obtención de células malignas, disminución del riesgo de infección del material recolectado, y se pueden obtener células hematopoyéticas en situaciones en las que se dificulta su extracción de la médula ósea (mielofibrosis, irradiación pélvica, etc.) Sin embargo, a veces no se consigue la celularidad necesaria con un solo proceso de aféresis, y son necesarios varios procesos de donación (o autodonación), con el consiguiente perjuicio para el donante, que sufre diversos síntomas: dolor lumbar, óseo y muscular, cefalea, hipotensión, malestar general, somnolencia, pérdida de apetito, erupción, náuseas, fiebre, retención de líquidos, etc. Se han descrito casos de parada cardíaca e infarto del miocardio durante la aféresis en donantes con antecedentes de enfermedades cardiovasculares. Otras complicaciones incluyen aumento de tamaño del bazo y ruptura esplénica, así como signos de hematopoyesis extramedular. También se puede presentar epiescleritis e iritis.

Es la actualidad, el cordón umbilical es la tercera fuente de células para trasplante en adultos y la segunda en niños. Se ha empleado en enfermedades genéticas y malignas y se ha utilizado en pacientes con compatibilidad total o parcial, familiares y no familiares. Sin embargo, el uso de progenitores hematopoyéticos inmaduros y comprometidos obtenidos a partir del cordón umbilical presenta el inconveniente de que su eficacia en adultos está por probar, ya que el número de células es muy pequeño para proveer un implante duradero (Broxmeyer et al., 1990. Int J Cell Cloning 8:76).

Existe, por tanto, la dificultad de mantener la producción de células sanguíneas derivadas de células madre hematopoyéticas (in vivo y/o in vitro), y de expandirlas, por ejemplo para su aplicación en terapéutica,

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial aislada para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro donde preferiblemente dicha célula madre multipotencial es una célula madre mesenquimal o. más preferiblemente dicha célula madre mesenquimal es una célula mesenquimal capaz de expresar la proteína Nestina. La presente invención también se refiere al uso de cualquiera de las células madre descritas anteriormente para la fabricación de un medicamento para el mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero, o para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad asociada con una disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero. Preferiblemente dicha enfermedad que cursa con una deficiencia en la mielopoyesis o en la linfopoyesis. Asimismo, la presente invención también se refiere a un método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro o a un método para evaluar la capacidad hematopoyética de un mamífero.

En la presente invención se demuestra que las células Nestina positivas son células madre mesenquimales y por tanto, multipotentes, capaces de diferenciarse a linajes celulares como por ejemplo linajes osteoblásticos, chondrocíticos o adipocíticos.

Dichas células Nestina positivas expresan altos niveles de moléculas implicadas en el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas, es decir, en la hematopoyesis. La expresión de Cxcl12, una chemoquina implicada, por ejemplo, en la migración de células hematopoyéticas del hígado del feto hasta la médula ósea, es alrededor de 50 veces mayor en las células Nestina positivas que en el resto de las células del estroma. La expresión de otros genes encargados de regular el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas como por ejemplo Kitl, 117 ó Vcaml es de 140 a 800 veces mayor en las células Nestina positivas que en el resto de las células del estroma.

En este sentido, los ratones en los que se ha eliminado selectivamente el 90% de las células Nestina+ presentan una reducción de 2-4 veces el número de células madre hemopoyéticas en la médula ósea tienen una reducción del 90% en la capacidad de los progenitores hemopoyeticos de anidar en la médula ósea. Asimismo, mientras que la celularidad total y el número de células Lin ^" CD48 ^" de la médula ósea de estos ratones no se afectaron, los progenitores hemopoyéticos y las células madre hemopoyéticas se redujeron en un ~ 50%. Esta reducción estaba asociada con un incremento proporcional y selectivo en el bazo, sin detectarse diferencias en el ciclo celular o la frecuencia de células apoptóticas. Por tanto, estos estudios indican que las células madre hematopoyéticas y los progenitores hemopoyéticos se movilizaban de la médula ósea a sitios extramedulares después de depletar las células nestina ⁺ . Las severas reducciones de HSCs detectadas sugieren un papel central para las células nestina ⁺ en el mantenimiento de las HSCs y en la hematopoyesis. Por tanto, la puesta en contacto de estas células madre nestina+ junto con células madre hematopoyéticas, produce el mantenimiento de la hematopoyesis. Este uso tiene una aplicación industrial clara, por ejemplo, en el campo del tratamiento de enfermedades asociadas con una disfunción en el mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero o en el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro con el objeto de permitir la generación de células derivadas de las células madre hematopoyéticas, como por ejemplo, células sanguíneas.

Así pues, los autores de la presente invención han aislado una población de células mesenquimales nestina positivas, y que promueven la auto- renovación y/o la expansión de las células madre hematopoyéticas, tanto in vitro como in vivo.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una población celular aislada, de ahora en adelante población celular de la invención, que comprende al menos una célula madre multipotencial Nestina positiva. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la célula madre multipotencial Nestina positiva es una célula mesenquimal. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la célula madre multipotencial Nestina positiva es una célula no adherente. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la célula madre multipotencial Nestina positiva se obtiene por un procedimiento que comprende:

a) Obtener un aspirado de la médula ósea de un mamífero, b) Lisar las células de la serie roja,

c) Seleccionar las células CD45 -, y

d) Sembrar las células del paso (c) en un medio adecuado. En otra realización aún más preferida, el mamífero del paso (a) es humano.

En otra realización preferida, la población celular de la invención además comprende, al menos una célula madre hematopoyética. En otra realización más preferida, la célula madre hematopoyética es humana.

Otro aspecto se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende la población celular aislada de la invención. En una realización preferida de este aspecto, la composición es una composición farmacéutica. En otra realización más preferida, la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización más preferida, la composición además comprende otro principio activo. Otro aspecto se refiere al uso de una población celular aislada de la invención o de una composición farmacéutica de la invención, para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro. Otro aspecto se refiere al uso de una población celular aislada de la invención o de una composición farmacéutica de la invención, para el mantenimiento de la hematopoyesis in vivo. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una población celular aislada de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención, para la auto-renovación de las células madre hematopoyéticas. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una población celular aislada de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención, para la la expansión de las células madre hematopoyéticas.

Otro aspecto se refiere al uso de una población celular aislada de la invención o de una composición farmacéutica de la invención, para la elaboración de un medicamento.

Otro aspecto se refiere al uso de una población celular aislada de la invención o de una composición farmacéutica de la invención, para la elaboración de un medicamento para el mantenimiento de la hematopoyesis en un mamífero. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el mamífero es humano.

Otro aspecto se refiere al uso de una población celular aislada de la invención o de una composición farmacéutica de la invención, para la elaboración de un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos. En una realización preferida, el tejido es la sangre.

Otro aspecto se refiere al uso de una población celular aislada de la invención o de una composición farmacéutica de la invención, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de la sangre y de los órganos hematopoyéticos. En una realización preferida la enfermedad cursa con una deficiencia en la mielopoyesis o en la linfopoyesis. Las enfermedades de la sangre y de los órganos hematopoyéticos se recogen, pero sin limitarse, en el tercer capítulo de la lista de códigos CIE- 10 (décima versión de la Clasificación estadística internacional de enfermedades y otros problemas de salud (en inglés ICD, siglas de International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems). Entre otras, en esta memoria se entienden como "enfermedades de la sangre y de los órganos hematopoyéticos" las siguiente: Adquiridas

• Neoplasias malignas

o Hematológicas

■ Leucemias

^■ Leucemia linfoblástica aguda

■ Leucemia no linfoblástica aguda

Leucemia linfocítica crónica

Leucemia mieloide crónica, en fase acelerada o crisis blástica

Linfomas

Enfermedad de Hodgkin

Linfoma no-Hodgkin

Mielomas

Mieloma múltiple (enfermedad de Kahler) o Cánceres de tumor sólido

Neuroblastoma

Tumor desmoplásico de células pequeñas redondas Sarcoma de Ewing

Coriocarcinoma

Enfermedades hematológicas

o Trastornos fagocíticos

■ Mielodisplasia o Anemias

^■ Hemoglobinuria nocturna paroxística (aplasia severa)

^■ Anemia aplásica

^■ Aplasia pura de células rojas

o Trastornos mieloproliferativos

^■ Policitemia vera

^■ Trombocitosis esencial

^■ Mielofibrosis

• Trastornos metabólicos

o amiloidosis

^■ Amiloidosis de cadena ligera amiloide

• Enfermedades ambientalmente inducidas

o Envenenamiento por radiación

• Enfermedades virales

o VIH ^[3]

Congénitas

• Enfermedades de almacenamiento lisosómico

o Lipidosis (trastornos del almacenamiento de lípidos)

^■ Lipofuscinosis neuronal ceroidea

^■ Ceroidolipofuscinosis neuronal infantil (INCL, enfermedad de Santavuori)

■ Enfermedad de Jansky-Bielschowsky (lipofuscinosis neuronal ceroidea infantil tardía )

^■ Esfingolipidosis

■ Enfermedad de Niemann-Pick

^■ Enfermedad de Gaucher

^■ Leucodistrofias

^■ Adrenoleucodistrofia

^■ Leucodistrofia metacromática

^■ Enfermedad de Krabbe (leucodistrofia de células globoides) Mucopolisacaridosis

■

^■ Síndrome de Hurler (MPS IH, deficiencia de a- L-iduronidasa)

^■ Síndrome de Scheie (MPS I S)

^■ Síndrome de Hurler-Scheie (MPS I H-S)

^■ Síndrome de Hunter (MPS II, deficiencia de sulfato de iduronidasa)

^■ Síndrome de Sanfilippo (MPS III)

^■ Síndrome de Morquio (MPS IV)

■ Síndrome de Maroteaux-Lamy (MPS VI)

■ Síndrome de Sly (MPS VII)

Glucoproteinosis

■

^■ Mucolipidosis II (l-enfermedad celular)

^■ Fucosidosis

^■ Aspartilglucosaminuria

^■ Alfa-manosidosis

Otros

^■ Enfermedad de Wolman (deficiencia de ácido lipasa)

nmunodeficiencias

o Deficiencia de células T

^■ Ataxia telangiectasia

^■ Síndrome de DiGeorge

o Deficiencias combinadas de células B y T

^■ Inmunodeficiencia combinada severa (SCID), todos los tipos

o Síndromes bien definidos

■ Síndrome de Wiskott-Aldrich o Trastornos fagocíticos

^■ Síndrome de Kostmann

^■ Síndrome de Shwachman-Diamond

o Enfermedades de desregulación inmune

^■ Síndrome de Griscelli, tipo II

o Deficiencias inmunes innatas

^■ Deficiencia del modulador esencial NF-kappa-B (NEMO) (Potenciador del gen inhibidor del polipéptido ligero kappa en deficiencia de células B Gamma kinasa)

Enfermedades hematológicas

o

^■ Hemoglobinopatías

^■ Enfermedad de células falciformes

^■ β talasemia mayor (anemia de Cooley) o Anemias

^■ Anemia aplásica

■ Anemia de Diamond-Blackfan

^■ Anemia de Fanconi

o Citopenias

^■ Amegakaryocytic trombocitopenia

o Síndromes hemofagocítico

^■ Linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH)

En otra realización preferida la enfermedad se selecciona de la lista que comprende: mieloma, gamapatía monoclonal benigna, hipoplasia y aplasia medular, mielofibrosis, síndrome mielodisplásico, anemia, policitemia, neutropenia, leucemia aguda, leucemia crónica, linfoma, púrpuras, hemofilia, o cualquiera de sus combinaciones. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de células hematopoyéticas in vitro, de ahora en adelante método de obtención de células hematopoyéticas de la invención, que comprende: a) poner en contacto al menos una célula Nestina positiva aislada con al menos una célula madre hematopoyética aislada, e

b) incubar el producto obtenido en el apartado (a) en un medio de cultivo adecuado para la división y/o diferenciación de la célula madre hematopoyética. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la célula Nestina positiva se aisla de la médula ósea. En otra realización preferida la célula Nestina positiva es célula madre multipotencia. En otra realización preferida la célula Nestina positivo es una célula madre mesenquimal. En otra realización preferida la célula Nestina positivo es una célula no adherente. En otra realización preferida la célula Nestina positivo es humana.

Otro aspecto de la invención se refiere a las células hematopoyéticas obtenibles por el método de obtención de células hematopoyéticas de la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial aislada para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro.

Las células madre (o células troncales) son células indiferenciadas que tienen la capacidad de dividirse sin perder sus propiedades y llegar a producir tanto células diferenciadas como células no diferenciadas. Según el origen de las células madre se puede diferenciar entre células madre embrionarias y células madre adultas. En la presente invención se hace referencia a una célula madre adulta o embrionaria. La célula madre multipotencial de la presente invención es capaz de diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de la misma capa embrionaria (Weissman et al., 2001 . Annu Rev Cell Dev Biol. 17: 387-403) y como consecuencia, a cualquier tejido adulto derivado.

El término "aislada" se refiere a que las células madre permanecen fuera del cuerpo humano o animal.

Tal como se entiende en la presente invención, el término "mantenimiento de la hematopoyesis" hace referencia a la preservación del proceso de hematopoyesis, es decir la preservación de la generación, regulación y producción de las células derivadas de las células madre hematopoyéticas así como de la división de dichas células madre hematopoyéticas. En adelante se podrá emplear el término hemopoyesis como sinónimo del término hematopoyesis.

Las células madre hematopoyéticas pueden ser, pero sin limitarse, "células madre hematopoyéticas de largo plazo" (long-term hematopoietic stem cells, LT-HSC) o "células madre hematopoyéticas de corto plazo" (short-term hematopoietic stem cells, ST-HSC).

Las células derivadas de las células madre hematopoyéticas pueden ser, pero sin limitarse, progenitores hematopoyéticos comprometidos capaces de diferenciarse a una línea celular mielocítica o linfopoyética, eritrocitos, plaquetas, granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos), monocitos o linfocitos. Asimismo las células derivadas de las células madre hematopoyéticas pueden cualquiera de los precursores de los eritrocitos, plaquetas, granulocitos, monocitos o linfocitos. En condiciones in vivo, la hematopoyesis se produce en diversos órganos o tejidos dependiendo del estado de desarrollo del individuo o incluso del desarrollo de estados patológicos. Así pues, durante el transcurso de la segunda y tercera semanas aproximadamente de desarrollo embrionario se produce hematopoyesis en el saco vitelino. Aproximadamente a partir de la sexta semana aparece tejido hematopoyético en el hígado. A partir del tercer mes de desarrollo embrionario se empieza a desarrollar el tejido mieloide de la médula ósea, que es donde se produce principalmente el proceso de hematopoyesis. A partir del octavo mes de desarrollo embrionario aparece tejido hematopoyético en el bazo. En el individuo adulto la actividad hematopoyética se mantiene en la médula ósea, sin embargo, en el transcurso de determinados estados patológicos pueden apreciarse focos hematopoyéticos en algunos de los órganos mencionados anteriormente, en este caso la hematopoyesis es extramedular. El mantenimiento de la hematopoyesis in vitro de la presente invención puede llevarse a cabo en las células aisladas procedentes del tejido hematopoyético de cualquiera de los órganos que poseen dicho tejido como por ejemplo, pero sin limitarse, cualquiera de los órganos citados en el párrafo anterior en cualquier estado de desarrollo del individuo.

Una realización preferida de la presente invención se refiere al uso donde la célula madre multipotencial es una célula mesenquimal.

La célula mesenquimal procede de cualquier tejido mesenquimal. El tejido mesenquimal es aquel que procede de la capa embrionaria llamada mesodermo. El tejido mesenquimal del que procede la célula mesenquimal de la presente invención se selecciona de la lista que comprende tejido conectivo laxo, tejido conectivo denso, tejido adiposo, tejido cartilaginoso, tejido óseo, tejido hematopoyético, tejido sanguíneo o tejido muscular. Preferiblemente la célula mesenquimal de la presente invención procede de tejido hematopoyético. Más preferiblemente la célula mesenquimal procede de médula ósea. La médula ósea es un tejido que se encuentra, por ejemplo, pero sin limitarse, en el interior de los huesos largos, vértebras, costillas, esternón, huesos del cráneo, cintura escapular o pelvis. Preferiblemente la médula ósea es médula ósea roja, que ocupa el tejido esponjoso de los huesos planos, como por ejemplo, pero sin limitarse, el esternón, las vértebras, la pelvis o las costillas. Este tipo de médula ósea es la que tiene la función hematopoyética. Además, las células mesenquimales de la presente invención pueden proceder de cordón umbilical.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso donde la célula madre mesenquimal es una célula Nestina positiva.

La proteína Nestina es un tipo de filamento intermedio tipo IV. Esta proteína se expresa en células no diferenciadas durante estadios tempranos del desarrollo del sistema nervioso central, sistema nervioso periférico así como en órganos como el páncreas o en el tejido muscular. La proteína Nestina está considerada como un marcador de células madre. Las células que expresan dicha proteína son células que se comportan como células mesenquimales teniendo en cuenta su capacidad de diferenciación. Por tanto, la célula mesenquimal Nestina positiva de la presente invención se refiere a una célula mesenquimal capaz de expresar la proteína Nestina. Las células mesenquimales Nestina positivas pueden expresar dicha proteína en una cantidad variable dependiendo de condiciones multifactoriales como por ejemplo el tipo de tejido en el que se encuentre la célula mesenquimal así como el estadio de desarrollo del tejido al que pertenece, etc. En los ejemplos de la presente invención se demuestra cómo la reducción drástica de las células mesenquimales Nestina positivas en un ratón, produce una reducción del 75% en el número de células madre hematopoyéticas de la médula ósea, capaces de generar colonias hemopoyéticas después de cultivarlas durante largos períodos de tiempo.

Según otra realización preferida, la célula madre constituye una población celular aislada. La población celular está constituida por, o comprende, cualquiera de las células madre multipotentes, células madre mesenquimales o células mesenquimales Nestina positivas. Dicha población celular puede consistir en cualquier combinación de células madre multipotentes, células madre mesenquimales o células mesenquimales Nestina positivas o puede comprender cualquier combinación de las células anteriores.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial para la fabricación de un medicamento para el mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de al menos una enfermedad asociada con una disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis de un mamífero.

El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de enfermedades que cursen con una disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis. El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención supone combatir los efectos causados como consecuencia de dicha disfunción, para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores.

El término "disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis" tal como se emplea en la presente invención hace referencia a una alteración cuantitativa de la hematopoyesis que produce la pérdida total o parcial en el mantenimiento de la hematopoyesis y como consecuencia de dicha disfunción se produce una bajada en la celularidad (hipocelularidad) en la médula ósea del individuo respecto de una condición normal. La condición normal es aquella en la que dicha celularidad se mantiene por encima de un porcentaje mínimo como por ejemplo, pero sin limitarse, por encima del 20, 25, 30 ó 35%. La condición de hipocelularidad no afecta a la presente invención. Es decir, la enfermedad asociada a dicha disfunción en el mantenimiento de la hematopoyesis está producida como consecuencia de la disminución de la división y/o diferenciación de las células hematopoyéticas, lo que origina una disminución de la producción de cada una de las células derivadas de las células madre hematopoyéticas con respecto a un valor control de producción de dichas células. Dicha comparación puede llevarse a cabo determinando la concentración de cualquier tipo de célula hematopoyética diferenciada y comparándola con los niveles de referencia. Estos niveles de referencia son los niveles control. Por ejemplo, el nivel de referencia de los eritrocitos es de 4,5-10 ⁶ células/mm ³ en el caso de varones o el nivel de referencia de los leucocitos es de 5000 células/ mm ³ . Los niveles de referencia anteriores son niveles mínimos por debajo de los cuales se consideraría que hay una disminución de la producción de cada una de las células derivadas de las células madre hematopoyéticas.

El término "celularidad" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a la relación entre las células hematopoyéticas y el tejido adiposo (células constituyentes mayoritarias de la médula ósea) expresado en el porcentaje de células.

Una realización preferida se refiere al uso donde la enfermedad asociada a la disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis es una enfermedad que cursa con una deficiencia en la mielopoyesis o en la linfopoyesis.

El término "deficiencia" tal como se entiende en la presente invención se refiere a un funcionamiento inferior a lo normal, es decir a una capacidad de división y/o diferenciación de las células madre mielopoyéticas o linfopoyéticas por debajo de los niveles de referencia establecidos para cada tipo de células derivadas de las células madre hematopoyéticas y para cada sexo.

La mielopoyesis es el proceso que da lugar a la generación, desarrollo y maduración de las células mieloides de la sangre, es decir, eritrocitos, plaquetas, granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) o monocitos. Los eritrocitos se generan por un proceso denominado eritropoyesis. Las plaquetas se generan por trombopoyesis. Los granulocitos se generan por granulopoyesis. Los monocitos se generan por monopoyesis. La linfopoyesis es el proceso que permite la generación, desarrollo y maduración de los linfocitos.

La enfermedad que cursa con una deficiencia en la mielopoyesis o en la linfopoyesis se selecciona de la lista que comprende anemia aplástica, pancitopenia, eritroblastopenia, aplasia eritrocítica, anemia de Fanconi, síndrome de Blackfan-Diamond, panmieloptisis, anemia diseritropoyética, anemia dishematopoyética, granulocitopenia (agranulocitosis), neutropenia, o linfopenia.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial para la fabricación de un medicamento donde la célula madre multipotencial es una célula mesenquimal. Otra realización preferida se refiere al uso donde la célula madre mesenquimal es una célula Nestina positiva. Según otra realización preferida, la célula madre constituye una población celular aislada. Dicho medicamento comprende:

- la célula madre multipotencial, mesenquimal o mesenquimal Nestina positiva, y

- un vehículo farmacológicamente aceptable,

- un excipiente farmacológicamente aceptable, u

- otra sustancia activa.

El medicamento puede comprender cualquiera de dichas células con el vehículo, excipiente u otra sustancia activa en cualquiera de sus combinaciones. Además, el vehículo así como el excipiente deben ser farmacéuticamente aceptables.

El término "vehículo" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las secuencias de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de la célula madre multipotencial, mesenquimal o mesenquimal Nestina positiva y/o de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de las secuencias de la presente invención, estabiliza dicha secuencia o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia permita la actividad de la célula madre multipotencial, mesenquimal o mesenquimal Nestina positiva de la presente invención. El término "sustancia activa" hace referencia a una sustancia activa que debe permitir la actividad de cualquiera de las células de la invención, es decir, debe ser compatible con la célula madre multipotencial, mesenquimal o mesenquimal Nestina positiva. Es decir, al menos una célula madre multipotencial, mesenquimal o mesenquimal Nestina positiva, se formula en una composición farmacéutica y farmacológica apropiada (medicamento), en una cantidad terapéuticamente efectiva. El medicamento puede formularse junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente y farmacológicamente aceptables, así como también puede comprender otra sustancia activa.

En cada caso, la forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida. El medicamento de la presente invención se puede presentar en una forma adaptada a la administración oral o parenteral.

La forma adaptada a la administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.

La forma adaptada a la administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral.

Otra posibilidad es que el medicamento se presente en una forma adaptada a la administración sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, transdérmica o inhalada.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso de al menos una célula madre multipotencial, mesenquimal o mesenquimal Nestina positiva, donde el mamífero es un humano.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro que comprende:

a) poner en contacto al menos una célula madre multipotencial aislada con al menos una célula madre hematopoyética aislada, e

b) incubar el producto obtenido en el apartado (a) en un medio de cultivo adecuado para la división y/o diferenciación de la célula madre hematopoyética.

Tal como se demuestra en el apartado de ejemplos de la presente invención, la célula madre multipotencial, preferiblemente la célula madre mesenquimal y más preferiblemente la célula mesenquimal Nestina positiva comparte el mismo nicho en la médula ósea que las células madre hematopoyéticas. Por tanto, el primer paso del método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro consiste en poner en contacto dicha célula madre multipotencial aislada con al menos una célula madre hematopoyética en cualquier fase de desarrollo previo a su diferenciación.

La incubación de dicha mezcla celular debe llevarse a cabo en un medio de cultivo que permita la división y/o diferenciación de la célula madre hematopoyética.

En la presente invención se entiende por "medio de cultivo adecuado" cualquier solución que comprenda nutrientes necesarios para la división y/o diferenciación, o para la recuperación o aislamiento de cualquiera de las células derivadas de las células madre hematopoyéticas de la presente invención. Dicho cultivo se lleva a cabo en condiciones favorables de temperatura y pH. El medio de cultivo se selecciona, pero sin limitarse, de la lista que comprende DMEM (Dulbecco ^' s Modified Eagle ^' s Médium), RPMI 1640, F12, F10, MCDB 131 , MEM (Mínimum Essential Media) o DMEM/F12. Además, el medio de cultivo puede estar suplementado con otros componentes, como por ejemplo, pero sin limitarse, C0 ₂ , 0 ₂ , suero o sustituto de suero, aminoácidos, antibióticos, etc. No obstante puede ser empleado cualquier medio de cultivo conocido en el estado de la técnica para el cultivo de células madre hematopoyéticas. En el apartado de ejemplos de la presente invención se describen algunos tipos de medio de cultivo. La incubación descrita en el apartado (b) del método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro debe llevarse a cabo durante el tiempo deseado siempre que se mantengan las condiciones adecuadas para dicho mantenimiento de la hematopoyesis. Para ello puede ser necesaria la renovación periódica de dicho medio, o la adición de nuevo medio de cultivo, o la recuperación de parte del medio en el que se encuentren las células derivadas de cualquiera de las células madre hematopoyéticas de la presente invención. Una realización preferida de la presente invención se refiere al método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro, donde la célula madre multipotencial es una célula mesenquimal. Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método donde la célula madre mesenquimal es una célula Nestina positiva. Según otra realización preferida del método para el mantenimiento de la hematopoyesis in vitro, la célula madre constituye una población celular aislada.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar el mantenimiento de la capacidad hematopoyética de un mamífero que comprende:

a) analizar al menos un producto de expresión del gen que codifica para la proteína Nestina en las células de una muestra de tejido hematopoyético aislado de dicho mamífero y

b) asignar la presencia de dicho producto de expresión analizado en el apartado (a) al mantenimiento de la capacidad hematopoyética del órgano del que procede dicho tejido.

El término "producto de la expresión" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a cualquier producto resultante de la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Nestina del mamífero. Así pues, como producto resultante de la expresión se entiende, por ejemplo, el ARN mensajero que se obtiene de la transcripción de la secuencia nucleotídica, el ARN mensajero procesado, la proteína resultante de la traducción de cualquiera de los ARN mensajeros o la secuencia de cDNA (ADN complementario a la secuencia de ARN mensajero).

El análisis del producto de expresión se lleva a cabo mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. La presencia del producto de expresión descrito en un párrafo anterior indica la producción de proteína Nestina en las células del tejido aislado de dicho mamífero. La detección de dicha presencia depende de la sensibilidad de la técnica de detección que se emplee en el análisis. Una realización preferida de la presente invención se refiere al método para determinar el mantenimiento de la capacidad hematopoyética de un mamífero, que comprende:

a) determinar la concentración de al menos un producto de expresión del gen que codifica para la proteína Nestina en las células de una muestra de tejido hematopoyético aislada de dicho mamífero,

b) calcular la diferencia de la concentración del producto de la expresión del gen que codifica para la proteína Nestina determinada en el apartado (a) con respecto a la concentración de la expresión de dicho gen en un control positivo y/o negativo, y

c) asignar una diferencia significativa con respecto al control positivo, y/o la ausencia de una diferencia significativa con respecto al control negativo, calculadas en el apartado (b), al mantenimiento de la capacidad hematopoyética del tejido del que procede dicha muestra. El control negativo es, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de tejido hematopoyético donde las células no sean capaces de llevar a cabo el mantenimiento de la hematopoyesis, es decir, donde dichas células no son capaces, por ejemplo, de mantener la celularidad dentro de unos porcentajes deseados (conocidos por el experto en la materia) para cualquier tipo de célula derivada de una célula madre hematopoyética. Los porcentajes deseados de celularidad pueden ser, pero sin limitarse, porcentajes inferiores a un 20%, es decir, el control negativo presenta disfunción del mantenimiento de la hematopoyesis.

El control positivo es, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de tejido hematopoyético donde las células sean capaces de llevar a cabo el mantenimiento de la hematopoyesis, es decir, donde dichas células son capaces, por ejemplo, de mantener la celularidad dentro de unos porcentajes deseados (conocidos por el experto en la materia) para cualquier tipo de célula derivada de una célula madre hematopoyética. Los porcentajes deseados de celularidad pueden ser, pero sin limitarse, porcentajes superiores a un 20%, es decir, el control positivo presenta la capacidad de mantener la hematopoyesis.

El término "diferencia significativa" tal como se emplea en la presente invención hace referencia a una diferencia calculada en el apartado (b) del método mayor que un error estándar definido multiplicado por una seguridad definida. La seguridad definida puede tener un valor, por ejemplo, pero sin limitarse, de un 95% (p<0,05) o de un 99% (p<0,01 ). Por el contrario, la "ausencia de una diferencia significativa" hace referencia a una diferencia calculada en el apartado (b) del método igual o menor que un error estándar definido multiplicado por una seguridad definida.

Otra realización preferida se refiere al método para evaluar la capacidad hematopoyética de un mamífero, donde dicho mamífero es un humano. Tanto las células madre multipotenciales Nestina positivas como las células madre hematopoyéticas son células adultas, y se han obtenido sin destruir embriones, o sin afectar a la viabilidad de los mismos. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:

FIG. 1. Muestra que las células Nes:GFP ⁺ son células madre mesenquimales.

(A) n = 12.

(B) n = 4.

(C) n = 4.

(D) Células aisladas como CD45 ^" Nes:GFP ⁺ y CD45 ^" Nes:GFP ^" (recuadro) cultivadas durante 4 semanas con medio de diferenciación osteoblástica. (E) Diferenciación progresiva en adipocitos a partir de CFU-Fs obtenidos de células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ cultivadas durante 3 semanas con medio de diferenciación adipocítica (n = 4).

(F) Las células CD45 ^" Nes:GFP ^" no generaron ninguna colonia (recuadro). (G) Acan: expresión de agrecano durante las 3 semanas de cultivo con medio de diferenciación condrocítica.

(H) Acumulación de mucopolisacáridos Alcian blue ⁺ en pellets celulares procedentes de células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ cultivadas durantes 3 semanas con medio de diferenciación condrocítica (n = 4).

(I) Esferas clónales Las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ tras 7 días de cultivo en baja densidad; campo claro.

(J-K) expresión de GFP en una esfera tras 10 días de cultivo; (J) campo claro; (K) fluorescencia.

(L) Diferenciación de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ en linajes mesenquimales.

(M) Adipocitos refringentes multi- y uniloculares, así como células migrando desde la capa externa de la esfera, adheridas a la superficie de la placa de cultivo.

(N-O) Mesesferas clónales (n = 51 ) diferenciadas en OBs Col2.3-l_acZ ⁺ OBs y adipocitos Oil red 0 ⁺ .

(P) Ejemplo representativo de mesesfera clonal que acumuló mucopolisacáridos Alcian blue ⁺ tras 3 semanas en cultivo con medio de diferenciación condrocítica (n = 4).

(Q) Diferenciación progresiva de las mesesferas clónales cultivadas durante 3 semanas en medio de diferenciación condrocítica (n = 5-1 1 ), manifestada por la expresión aumentada de "(sex determining región Y)- box 9" (Sox9), agrecano (Acan) y de los colágenos tipo Ila1 (Col2o1) y tipo Xla2 (Col11a2).

Escala, 100 μιη (F, I, K, N, P); 500 μιη (H); 50 μιη (L-M, O). * p < 0.05; ** p < 0.01 ; *** p < 0.001 ; test t no pareado de dos colas; las barras de error indican error estándar.

FIG. 2. Muestra que las células Nes:GFP ⁺ están físicamente asociadas con las HSCs. (A, B) Inmunohistoquímica frente a CD150 (flechas), CD48 y marcadores de linajes hemopoyéticos en secciones de médula ósea de ratones Nes- Gfp. Imágenes representativas de HSCs CD150 ⁺ CD48 ^" Lin- localizadas adyacentes a las células Nes:GFP ⁺ del endostio (A) y de los sinusoides (B); (A) Los megacariocitos CD150 ⁺ CD48 / Lin ⁺ , indicados con asteriscos, se pudieron identificar fácilmente por su gran tamaño y tinción de CD150 homogénea. Deconvoluciones de las proyecciones Z.

(C) Las escasas células Nes:GFP ⁺ detectables en cultivos primarios mieloides estaban frecuentemente asociadas con "cobblestone-forming áreas", enriquecidas en progenitores hemopoyéticos. Imagen combinada de fluorescencia y contraste de fase.

Escala, 50 μηπ.

FIG. 3. Muestra cómo las células HSCs están localizadas cerca de las células Nes:GFP+ en la MO.

Inmunohistoquímica frente a CD15; Ter1 19, Gr-1 , CD3e, B220 y Mac-1 (Lin), y CD48 en secciones de médula ósea de ratones trangénicos Nes- Gfp. Las puntas de flecha señalan ejemplos de HSCs CD150+ CD48- Lin— . Las HSCs se hallaron frecuentemente localizadas adyacentes a (A, C) o cerca de (B, D) las células Nes:GFP+ del endostio, y la mayoría de ellas en contacto directo con (E, G-l) o cerca de (J-L) las células Nes:GFP+ que bordeaban los sinusoides. Los asteriscos indican megacariocitos CD150+ CD48+, fácilmente identificables por su gran tamaño y distribución citoplasmática homogénea de CD150. Rejilla, 50 μηπ.

FIG. 4. Muestra cómo la eliminación selectiva de las células que expresan nestina reduce de forma aguda el contenido y anidamiento de las células HSCs en la médula ósea.

(A) n = 5-10. (B) n = 5-7.

(C) n = 3-8.

(D-E) n = 4-5.

(F) n = 4-8.

(G) Distancias medias más cortas encontradas entre las células Nes:GFP ⁺ y las HSCs anidadas en la médula ósea, o entre éstas y la pared del hueso 2 h (n = 16), 48 h (n = 30) y 96 h (n = 14) más tarde.

(H-l) Ejemplos representativos de las HSCs teñidas con DyD (flecha fina) anidadas en menos de 2 h cerca de las células GFP ⁺ (flecha gruesa) en la médula ósea de los ratones Nes-Gfp. La matriz del hueso se visualizó mediante la señal harmónica secundaria generada por el colágeno cuando se ilumina mediante pulsos de femtosegundos con un láser de titanio:zafiro.

* p < 0.05, ** p < 0.01 , *** p < 0.001 ; test t no pareado de dos colas; las barras de error indican error estándar.

FIG. 5. Muestra que las células Nes:GFP+ de la médula ósea craneal son perivasculares. Microscopía intravital de la calvaría de los ratones transgénicos Nes-Gfp inyectados i.v. con Qdot (flecha fina).

(A-C) Células Nes:GFP+ (flecha gruesa) rodeando los vasos de la sutura coronal.

(D-F) Células Nes:GFP+ en el endostio.

FIG. 6. Muestra cómo la depleción celular selectiva en los ratones Nes-Cre/iDTR no altera el ciclo celular de los progenitores hemopoyéticos. Frecuencia de células CD48-, Lin-Sca-1 + c-kit+ (LSK) (A) y CD150+ CD48- LSK (B) en la médula ósea de ratones dobles transgénicos Nes- Cre/iDTR o de animales controles iDTR 24 h tras la inyección de toxina diftérica (DT). Las muestras de médula ósea, teñidas como se describe en el apartado de Materiales y Métodos, se fijaron y permeabilizaron, y se detectó TUNEL utilizando el kit Mebstain Apoptosis Kit Direct (MBL) y FACS. Cada punto corresponde a un ratón. ^** p < 0.01 , test t no pareado de dos colas.

FIG. 7. Muestra cómo la depleción celular selectiva en los cultivos de larga duración realizados a partir de la médula ósea de los ratones Nes-Cre/iDTR reduce el número de progenitores hemopoyéticos.

Se determinó el número de unidades formadoras de colonias en cultivo (CFU-C) en la fracción adherente (A) y los sobrenadantes (B) de cultivos mieloides (tipo Dexter) de médula ósea de ratones dobles transgénicos Nes-Cre / iDTR. La toxina diftérica (DT, 100 ng/ml) se añadió al medio al sembrar los cultivos y en los recambios semanales de la mitad del medio de cultivo. Los datos se normalizaron en base a cultivos similares de médula ósea de animales controles iDTR para descartar la toxicidad inespecífica de la DT in vitro (n = 3 ratones). ^** p < 0.05; test t no pareado de dos colas. Las barras de error indican error estándar.

FIG. 8. Muestra cómo la depleción celular selectiva en los ratones Nes-CreliDTR reduce la supervivencia pero no afecta la permeabilidad vascular o la histología de la médula ósea ni el hemograma.

(A) Supervivencia reducida de los ratones Nes-Cre/iDTR tras la ablación celular selectiva. Porcentaje de supervivencia de los ratones Nes-Cre / iDTR y Nes-Cre / iDTR / ROSA-Gfp tripleinyectados con toxina diftérica (DT, 4 [Ág/kg, i.p.; línea sin elementos en los extremos) o PBS (línea con puntas de flecha en ambos extremos) (n = 10), comparado con animales controles tratados con DT (línea con círculos negros en ambos extremos, n = 5). ^*** p < 0.001 (test de Logrank).

(B-C) Colorante FITC-Dextran, preparado e inyectado i.v. en los animales Nes-Cre I iDTR tratados con DT en la vasculatura de la médula ósea craneal (C), o en animales control (B).

(D-E) Histología de la médula ósea de los animales Nes-Cre I iDTR tratados con DT (E) e histología de los animales control (D). Ejemplos representativos de n = 4 ratones. Escala, 100 μηι (B-C); 50 μηι (D-E).

(F) Cantidad de eritrocitos (RBC), hemoglobina (Hgb), hematocrito (Hct), plaquetas (Plt), leucocitos (WBC) y progenitores hemopoyéticos (CFU-C) en la sangre en ratones Nes-Cre I iDTR y Nes-Cre I iDTR I ROSA-Gfp 24- 48 h después del tratamiento con DT comparado con los niveles observados en animales transgénicos inyectados con PBS o en ratones controles tratados con DT (n = 4-7). Test t no pareado de dos colas. Las barras de error indican error estándar.

FIG. 9. Muestra la expresión de genes críticos para el mantenimiento de las HSCs.

RT-PCR cuantitativa a partir de muestras de ARN obtenidas de las células CD45 ^" GFP ⁺ y CD45 ^" GFP ^" aisladas de la médula ósea de los ratones transgénicos Nes-Gfp para determinar la expresión de Cxcl12, "stem cell factor/ligando de kit (Kitl), interleucina-7 (IL7), "vascular cell adhesión molecule-V (Vcaml), osteopontina (Spp1) y caderina-N (Cdh2), Gapdh, angiopoyetina-1 (Angptl), en las células Nes:GFP ⁺ y en el resto de la población CD45 ^" de la médula ósea.

(A) n = 6.

(B) Los animales se inyectaron con salino, un agonista b-adrenérgico no selectivo (isoproterenol, b-AR) o un agonista selectivo para receptores adrenérgicos β ₃ (BRL37344; P3-AR) (2 mg/kg, i.p.) y se sacrificaron 2 h después, (n = 6).

(C) Expresión de las conexinas 45 (Gjc1 ) y 43 (Gja1 ). (n = 3). * p < 0.05, ** p < 0.01 , *** p < 0.001 ; test t no pareado de dos colas; las barras de error indican error estándar.

FIG. 10. Muestra los resultados de RT-PCR cuantitativa utilizando un gen "housekeeping" distinto.

(A-B) Se realizó PCR cuantitativa a partir de muestras de ARN obtenidas de las células CD45- GFP+ y CD45- GFP- aisladas de la médula ósea de los ratones transgénicos Nes-Gfp. Se obtuvieron resultados muy reproducibles utilizando la β-actina en vez de Gapdh como gen "housekeeping". Expresión de genes críticos para el mantenimiento de las HSCs (A) o para la diferenciación mesenquimal (B). (n = 3-7). * p < 0.05, ** p < 0.01 , *** p < 0.001 ; test t no pareado de dos colas. Las barras de error indican error estándar.

FIG. 11. Mesenfera humana representativa.

FIG. 12. Diferenciación osteoblástica de las mesenferas humanas. Se observan las tinciones de fosfatasa alcalina y de Von Kossa de las CFU-F derivadas de cada mesenfera humana primaria cultivada bajo condiciones de diferenciación osteoblástica.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores, que describen el uso de las células multipotenciales de la presente invención para el mantenimiento de la hematopoyesis. EJEMPLO 1. Determinación de que las células Nes:GFP ⁺ (Nestina positivas) son células madre mesenquimales (MSCs).

En primer lugar se planteó la hipótesis de las células Nes:GFP ⁺ fueran auténticas MSCs. De hecho, toda la capacidad unidades formadoras de colonias fibroblásticas (CFU-F) y clonogénica de la médula ósea residía en la fracción Nes:GFP ⁺ (FIG. 1A). El cultivo de todo el resto de células CD45 ^" Nes:GFP ^" de la médula ósea a igual o mayor densidad no generó ningún CFU-F. Tras sembrar las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ en distintas condiciones de cultivo, incluyendo medio para "MSCs", las células perdían rápidamente expresión de GFP (FIG. 1 B) y se diferenciaban en progenitores mesenquimales, como se determinó utilizando el ensayo CFU-F. Con el fin de analizar más exhaustivamente su potencial de diferenciación, las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ y CD45 ^" Nes:GFP ^" aisladas por FACS se sembraron en condiciones que favorecen la diferenciación en los linajes osteoblástico, adipocítico y condrocítico. La fracción CD45 ^" Nes:GFP ⁺ demostró una robusta capacidad de diferenciación hacia linajes mesenquimales, mientras que la fracción CD45 ^" Nes:GFP ^" no generó ninguna descendencia. Distintos genes necesarios para la diferenciación en OBs (FIG. 1 C), adipocitos (FIG. 1 E) y condrocitos (FIG. 1 G) se regularon al alza significativamente en las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ durante 3 semanas de cultivo con medio de diferenciación. El fenotipo maduro mineralizante, adipocítico o condrocítico se confirmó tras un mes en cultivo (FIG. 1 D, F, H), comprobando así su capacidad para diferenciación en múltiples linajes.

Dado que las células madre neurales, que expresan nestina, pueden autorrenovarse si se cultivan como esferas en flotación (Stemple & Anderson, 1992. Cell. Dec 1 1 ;71 (6):973-85, adaptamos condiciones del cultivo de células madre de la cresta neural (Pardal et al., 2007. Cell, 131 : 364-377) y de los pericitos (Crisan et al., 2008. Curr Protoc Stem Cell Biol, Chapter 2, Unit 2B 2 1 -2B 2 13) para expandir las células Nes:GFP ⁺ en placas de cultivo de baja adherencia. Las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ , pero no las CD45 ^" Nes:GFP ^" (aisladas por FACS), formaban esferas clónales cuando se sembraban a baja densidad (FIG. 1 1). Estas esferas mesenquimales, denominadas aquí "mesesferas", tenían un diámetro medio de 85 ± 6 μηι y seguían expresando GFP tras 7-10 días en cultivo (FIG. 1J-K). La eficiencia de formación de esferas (6.5 ± 0.7 %) era similar a la de las células madre de la cresta neural (Molofsky et al., 2003. Nature, 425: 962-967). La frecuencia de las esferas era notablemente similar (6.9 ± 0.7 %) cuando las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ se sembraron en placas de 96 pocilios (1 célula / pocilio). Se estudió la capacidad de autorrenovación de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ disociando las mesesferas y sembrándolas en las mismas condiciones. Se obtuvieron de media 4.4 ± 0.8 mesesferas secundarias a partir de cada esfera primaria (n = 19), una frecuencia menor a la descrita a partir de células madre neurales (Molofsky et al., 2003. Nature, 425: 962-967), posiblemente debido a la densa matriz extracelular producida por las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ , la cual dificulta una disociación eficaz de las esferas sin comprometer la viabilidad celular. Tras dos semanas en cultivo, las mesesferas clónales, así como los cultivos muticlonales a partir de células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ (FIG. 1 L), seguían proliferando pero mostraban una pérdida progresiva en la expresión de GFP y comenzaban a diferenciarse en linajes mesenquimales (FIG. 1 M). Con el fin de estudiar más exhaustivamente la capacidad de diferenciación mesenquimal de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ , cruzamos ratones transgénicos Nes-Gfp con una línea que expresa la recombinasa Cre bajo el fragmento proximal de 2.3 Kb del promotor del colágeno a1 (l) (Col2.3-Cre), expresado selectivamente en los OBs (Dacquin et al., 2002. Dev Dyn, 224: 245-251 ), y con la línea reportera ROSA26 / loxP-stop-loxP-LacZ (R26R). Después de dos semanas en cultivo, las mesesferas clónales obtenidas de animales triples transgénicos mostraron diferenciación espontánea en adipocitos, cuya identidad se confirmó mediante la tinción con Oil Red O, y en OBs identificados de forma inequívoca mediante la expresión de β-galactosidasa dirigida por el promotor Col2.3 (~ 53%; 27/51 ; FIG. 1 N-0). Cuando las mesesferas que habían mostrado ya signos de diferenciación adipocítica se sembraron en condiciones que favorecen la diferenciación en condrocitos, acumularon mucopolisacáridos característicos del cartílago (teñidos con "Alcian Blue"; FIG. 1 P) y aumentaron la expresión de genes necesarios para la diferenciación condrocítica (FIG. 1 Q). Estos datos demuestran claramente que las mesesferas Nes:GFP ⁺ son autorrenovables y multipotentes in vitro.

Conclusiones de acuerdo con lo mostrado en la FIG. 1 :

Según la FIG. 1A, toda la capacidad de generar unidades formadoras de colonias fibrobásticas (CFU-F) o actividad mesenquimal de la médula ósea está contenida en la población Nes:GFP ⁺ (n = 12). En la FIG 1 B el análisis de expresión por Q-PCR muestra una rápida reducción en la expresión de Gfp una semana después de sembrar las células con medio de formación de CFU-F.

En 1 C se muestran distintos marcadores de determinación hacia el linaje osteoblástico {alkaline phosphatase, Alpl; Runx2) y genes asociados con la diferenciación en OBs ("bone morphogenetic protein-4", Bmp4; osteoglicina, Ogn; osterix, Sp7; osteocalcina, Bglap; osteoactivina, Gpnmb). Dichos marcadores mostraron un aumento progresivo de expresión en CFU-Fs derivados de las células aisladas CD45 ^" Nes:GFP ⁺ cultivados durante 4 semanas en medio de diferenciación osteoblástica. En la FIG. 1 D se observa la confirmación de la presencia de células osteoprogenitoras únicamente en la población CD45 ^" Nes:GFP ⁺ por medio de la detección de la actividad fosfatasa alcalina y de los depósitos de calcio. Las células CD45 ^" Nes:GFP ^" no generaron ninguna colonia. En la FIG. 1 E se observa la diferenciación progresiva en adipocitos a partir de CFU-Fs obtenidos de células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ cultivadas durante 3 semanas con medio de diferenciación adipocítica, evidenciada por un aumento en la expresión de la adipsina (Cfd) y del "peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2" (Pparg). En la FIG. 1 F se muestra cómo el fenotipo diferenciado maduro de los adipocitos procedentes de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ aisladas se confirmó en los cultivos de 4 semanas de duración mediante la tinción "Oil Red O"; por el contrario, las células CD45 ^" Nes:GFP ^" no generaron ninguna colonia (recuadro). La FIG. 1 G muestra cómo la diferenciación progresiva en condrocitos de los CFU- Fs obtenidos de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ aisladas se manifestó por un aumento en la expresión de agrecano durante las 3 semanas de cultivo con medio de diferenciación condrocítica {Acan). En la FIG. 1 H se observa la acumulación de mucopolisacáridos Alcian blue ⁺ en pellets celulares procedentes de células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ cultivadas durantes 3 semanas con medio de diferenciación condrocítica. Tal como se muestra en la FIG. 1 1, las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ , pero no el resto de la población CD45 ^" de la médula ósea, forman esferas clónales tras 7 días de cultivo en baja densidad. La FIG. 1 L muestra cómo las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ aisladas y cultivadas juntas en placas de poliestireno rápidamente perdieron expresión de GFP y se diferenciaran en linajes mesenquimales; los adipocitos GFP- se evidenciaron por los depósitos lipoides refringentes bajo campo claro. En la FIG. 1 M se pueden observar adipocitos refringentes multi- y uniloculares, así como células migrando desde la capa externa de la esfera, adheridas a la superficie de la placa de cultivo. En la FIG. 1 N-0 se observa cómo tras 3 semanas en cultivo, el 53 % de las mesesferas clónales mostró signos de diferenciación multi-linaje en OBs Col2.3-LacZ ⁺ OBs y adipocitos Oil red O ⁺ . En la FIG. 1 Q se observa la diferenciación progresiva de las mesesferas clónales cultivadas durante 3 semanas en medio de diferenciación condrocítica, manifestada por la expresión aumentada de "(sex determining región Y)-box 9" (Sox9), agrecano (Acan) y de los colágenos tipo I la1 (Col2o1) y tipo Xla2 (Col11ct2). EJEMPLO 2. Demostración de que las células Nes:GFP ⁺ son distintas de otras células madre.

Tratando de dilucidar el origen y la identidad de las MSCs Nes:GFP ⁺ , se han realizado análisis comparativos del genoma completo de células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ de la médula ósea con el de distintas células madre, obtenido de las bases de datos "Gene Expression Omnibus" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y "Stem-base"

(http://www.stembase.ca/?path=/). Estos análisis han comprendido MSCs humanas y murinas, células madre embrionarias y neurales de ratón, células murinas multipotentes procedentes de carcinomas embrionarios, células satélite de ratón y células madre hematopoyéticas (HSCs) humanas (Tabla 1 ). Para poder comparar los datos procedentes del genoma humano y el murino, los genes de ratón homólogos a los humanos se identificaron utilizando HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene). Como resultado, la expresión de 9.000 genes pareados y con anotación en las bases de datos se utilizó finalmente para el estudio. Los análisis de agrupamiento jerárquico imparcial y de los componentes principales revelaron que las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ de médula ósea eran muy distintas de las células madre neurales adultas. Aunque las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ son diferentes de todas las células madre incluidas en el análisis, su patrón de expresión fue más próximo a las células osteoprogenitoras humanas CD45 ^" CD146 ⁺ (Sacchetti et al., 2007. Cell, 131 : 324-336).

Tabla 1. Lista de experimentos con chips de ADN y sus números de acceso.

m, ratón; BM, médula ósea; NSC, célula madre neural; h, humano; FB, sangre fetal; PB, sangre periférica; EB, cuerpos embrionarios; MSC, célula madre mesenquimal; ESC, célula madre embrionaria. I mBM CD45-Nes:GFP+

~ mBM CD45-Nes:GFP+

3 mBM CD45-Nes:GFP+

GSM314045 mNSC

5 GSM314046 mNSC

6 GSM314047 mNSC

7 GSM314048 mNSC

8 GSM148485 hBM CD45-CD146+

9 GSM148487 hBM CD45-CD146+

10 GSM148488 hBM CD45-CD146+

I I GSM148491 hBM CD45-CD146+

12 GSM87697 hFB Lin-CD34+ CD38+

13 GSM87693 hFB Lin-CD34+ CD38+

14 GSM87695 hFB Lin-CD34+ CD38+

15 GSM86779 hPB Lin-CD34+ CD38-

16 GSM86781 hPB Lin-CD34+ CD38-

17 GSM86783-4 hPB Lin-CD34+ CD38-

18 GSM72616 J1 -EB

19 GSM72618 J1 -EB

20 GSM72621 J1 -EB

1 GSM93543 P19

22 GSM93541 P19

3 GSM93545 P19

24 GSM86489 mBM CD45-CD31-CD34 low/- 5 GSM86492 mBM CD45-CD31-CD34 low/-

26 GSM86495 mBM CD45-CD31-CD34 low/- 7 GSM86435 mBM CD34+ clonal MSC

28 GSM86438 mBM CD34+ clonal MSC 9 GSM86441 mBM CD34+ clonal MSC

30 GSM86510 mf Sox9+ Col2+ MSC

31 GSM86504 mf Sox9+ Col2+ MSC

32 GSM86507 mf Sox9+Col2+ MSC

33 GSM73026 mMuscle Satellite Cell

34 GSM73029 mMuscle Satellite Cell

35 GSM73032 mMuscle Satellite Cell

36 GSM72622 J1-ESC

37 GSM72624 J1-ESC 38 GSM72626 J1-ESC

39 GSM194075 hBM MSC

40 GSM194076 hBM MSC

41 GSM194077 hBM MSC

42 GSM194078 hBM MSC

43 GSM194079 hBM MSC

44 GSM252290 mNSC

45 GSM252291 mNSC

46 GSM252292 mNSC

47 GSM252296 mNSC

Se realizaron análisis ontológicos genéticos de los transcritos que estaban significativamente regulados al alza o a la baja en las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ de la médula ósea, comparado con todas las demás células madre estudiadas. Estos análisis revelaron que la mayoría de los genes regulados al alza estaban implicados en procesos metabólicos y biosintéticos, mientras que la mayor parte de los genes regulados a la baja estaban involucrados en mitosis y división celular. Estos resultados indican que las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ de la médula ósea son relativamente quiescentes pero muy activas metabólicamente.

EJEMPLO 3. Demostración de que las células Nes:GFP ⁺ forman un nicho único perivascular.

Las HSCs se pueden identificar y aislar con gran pureza utilizando una combinación de marcadores SLAM (Kiel et al., 2005. Cell, 121 : 1 109- 1 121 ). Con el fin de evaluar la relación espacial entre las células Nes:GFP ⁺ y las HSCs, se realizó inmunohistoquímica en criocortes de médula ósea de ratones transgénicos Nes-Gfp utilizando marcadores de linajes hemopoyéticos (anti-Ter1 19, Gr-1 , CD3e, B220 y Mac-1 ), CD48 y CD150 (FIG. 2A-B y FIG. 3). Las células HSCs CD150 ⁺ CD48- Lin ^" representaban una subpoblación muy pequeña (-0.005%) de las células nucleadas de médula ósea. A pesar de la escasa frecuencia tanto de las HSCs como de las células Nes:GFP ⁺ , la inmensa mayoría (88%; 37/42) de las células CD150 ⁺ CD48- Lin- estaban localizadas a menos de 5 diámetros celulares de las células Nes:GFP ⁺ , y la mayoría (60%; 25/42) tenía una localización directamente adyacente a las células Nes:GFP ⁺ distribuidas en los sinusoides (62%) o el endostio (26%; FIG. 2A, B. FIG. 3). La inferencia estadística de la distribución de Poisson esperada para las células Nes:GFP ⁺ en el área de muestreo, demuestra que la co-localización observada de las células CD150 ⁺ CD48- Lin- y las Nes:GFP ⁺ es altamente significativa (p < 10 ^"16 ). Se cultivó médula ósea total en condiciones que promueven el crecimiento mieloide (tipo Dexter) con el fin de determinar si las células Nes:GFP ⁺ contribuyen a la capa estromal. A pesar del bajo número de células Nes:GFP ⁺ detectables en estos cultivos, estas células se localizaban frecuentemente asociadas con "cobblestone-forming áreas", enriquecidas en progenitores hemopoyéticos (FIG. 2C). Por tanto, estos resultados sugieren una estrecha asociación física entre las células Nes:GFP ⁺ y las HSCs en la MO.

EJEMPLO 4. Demostración de que las células nestina+ son necesarias para el anidamiento de las HSCs en la MO.

La elevada expresión de Cxcl12, Vcaml, Kitl, 117 y Angptl en las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ y su marcada reducción durante la movilización inducida por el factor de crecimiento de colonias de granulocitos (G-CSF) o tras la estimulación β-adrenérgica sugerían que las células nestina ⁺ podrían regular la atración de las HSCs y su tráfico en la médula ósea. Para poder determinar si las células nestina ⁺ jugaban un papel importante en el anidamiento de las HSCs en la médula ósea, se transplantaron 5 x 10 ⁶ células nucleadas de médula ósea de animales congénicos wild-type en ratones Nes-Cre I iDTR, Nes-Cre ^ERT2 I iDTR y controles iDTR letalmente irradiados, siguiendo un protocolo descrito anteriormente (Katayama et al., 2006. Cell, 124: 407-421 ). El anidamiento de CFU-Cs en la médula ósea se redujo en un 73% en los ratones Nes-Cre I iDTR y en un 90% en los animales Nes-Cre ^ERT2 1 iDTR (FIG. 4N), indicando que las células nestina ⁺ son de hecho necesarias para el anidamiento de progenitores hemopoyéticos en la MO.

Con el fin de determinar si las células nestina ⁺ de la médula ósea regulaban directamente el anidamiento de las HSCs, se visualizó mediante microscopía intravital la migración de HSCs previamente aisladas con elevado grado de purificación y posteriormente marcadas y trasplantadas en ratones transgénicos Nes-Gfp irradiados letalmente. Dado que estos estudios de imagen in vivo se pueden realizar sólo en la médula ósea del cráneo, pero no en los huesos largos (Lo Celso et al., 2009. Nature, 457: 92-96), se validó primero el modelo de calvaría comparando la frecuencia, distribución y propiedades fisiológicas (capacidad de formar CFU-C y mesesferas) de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ aisladas de la médula ósea del cráneo y de los huesos largos. Las células Nes:GFP ⁺ de la calvaría eran también perivasculares, como se comprobó por microscopía intravital de ratones transgénicos Nes-Gfp inyectados i.v. con Qdot para teñir la vasculatura (FIG. 5). La frecuencia de formación de mesesferas de las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ obtenidas de la médula ósea craneal era idéntica a la encontrada en la médula ósea de los huesos largos, y también exclusiva dentro de la población CD45 ^" . Las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ también contenían toda la actividad CFU-F de la médula ósea craneal. La frecuencia y morfología de las células Nes:GFP ⁺ de la médula ósea del cráneo no se afectaron por la irradiación letal, en concordancia con la característica radio-resistencia de las MSCs. Las células LSK CD150 ⁺ CD48 ^" se aislaron por citometría de flujo, se tiñeron con un colorante lipofílico fluorescente y se inyectaron i.v. en ratones transgénicos Nes-Gfp adultos irradiados letalmente. El anidamiento de las HSCs en la médula ósea se visualizó directamente en la médula ósea craneal 2, 48 y 96 h más tarde, mediante una combinación de microscopía confocal y "two-photon" (Lo Celso et al., 2009. Nature, 457: 92-96). Se escaneó toda la médula ósea craneal y se obtuvieron proyecciones Z a partir de las cuales se calculó la distancia más corta de las HSCs que habían anidado en la médula ósea respecto de las células Nes:GFP ⁺ y la superficie del hueso (FIG. 40). Los análisis realizados muestran claramente que las HSCs anidaron rápidamente cerca de las células Nes:GFP ⁺ de la médula ósea (FIG. 4O-Q), indicando que las células nestina ⁺ dirigen la migración de las HSCs en la médula ósea. EJEMPLO 5. Demostración de que las células Nestina positivas son necesarias para el mantenimiento de las HSCs en la médula ósea.

Para determinar si las células nestina ⁺ son de hecho necesarias para el mantenimiento de las HSCs en la médula ósea, intentamos eliminarlas cruzando los ratones Nes-Cre con una línea que expresa de manera inducible por Cre el receptor para la toxina diftérica (DT) (Buch et al., 2005. Nat Methods, 2: 419-426) {iDTR) y con la línea reportera ROSA26 I loxP- stop-loxP-GFP (ROSA-GFP) (Mao et al., 2001 . Blood, 97: 324-326). Una única inyección de DT (4 g/kg, i.p.) eliminó completamente en 24-48 h las células GFP ⁺ de la médula ósea (FIG. 4A), y provocó una reducción del ~ 45% en la celularidad total de la médula ósea (FIG. 4B), asociada con un incremento del ~ 40% en las células teñidas con yoduro de propidio, probablemente debido a la brusca reducción de citocinas y factores de crecimiento críticos para distintos progenitores hemopoyéticos (como IL-7, el ligando de c-kit y M-CSF) que son producidos en grandes cantidades por las células nestina ⁺ de la médula ósea. También se detectó un incremento de 2.3 veces en el número de progenitores hemopoyéticos Lin ^" CD48 ^" en el bazo de los ratones dobles transgénicos Nes-Cre I iDTR, comparado con controles transgénicos sencillos, 24-48 h después del tratamiento con DT (FIG. 4C), sugiriendo una migración extramedular de los progenitores hemopoyéticos.

Es de destacar que las HSCs resultaron ser extremadamente sensibles a la depleción celular selectiva en los ratones dobles transgénicos Nes-Cre I iDTR, como se manifestó por una reducción del ~ 75% en el número de células LSK (FIG. 4D) y del ~ 58% en el número de células LSK CD150 ⁺ CD48 ^" (FIG. 4E) de la médula ósea. Se estudió si esta mayor reducción en las HSCs se debía a apoptosis, pero no se detectó ninguna diferencia entre los dos grupos de animales en la frecuencia de células LSK CD48 ^" TUNEL ⁺ o LSK CD150 ⁺ CD48 ^" TUNEL ⁺ (FIG. 6). La reducción de progenitores hemopoyéticos en la médula ósea estaba directamente causada por la depleción celular selectiva en la médula ósea, ya que el tratamiento con DT de los cultivos primarios de médula ósea de los ratones dobles transgénicos Nes-Cre I iDTR redujo el número de progenitores hemopoyéticos en un ~ 70%, comparado con controles transgénicos sencillos (FIG. 7). El tratamiento con DT de los ratones dobles transgénicos Nes-Cre I iDTR y triples transgénicos Nes-Cre I ROSA-Gfp I iDTR fue letal en el 50% de los animales después de 24 h y en el 80% de ellos 48 h más tarde (n = 10), mientras que no afectó a la viabilidad de los ratones controles dobles transgénicos Nes-Cre I ROSA- Gfp y transgénicos sencillos (FIG. 8A). A pesar de la reducción en la celularidad total de la médula ósea, la permeabilidad vascular, la histología y el hemograma eran normales (FIG. 8B-F), sugiriendo que la mortalidad no se debía a un fallo hematopoyético sino a la depleción de las células nestina ⁺ o su progenie en órganos vitales, como el corazón y/o el cerebro. En las FIG. 8B-C se observa cómo el colorante FITC-Dextran, preparado e inyectado i.v., como se ha descrito anteriormente (von Andrian, 1996), en los animales Nes-Cre I iDTR tratados con DT, permanecía en la vascultaura de la médula ósea craneal (FIG. 8C), como ocurría en los animales controles (FIG. 8B), indicando la ausencia de daño vascular. En las FIG. 8D-E se observa cómo la histología de la médula ósea de los animales Nes-Cre I iDTR tratados con DT (8E) es similar a la de los animales controles (8D). La FIG. 8F muestra cómo la depleción celular selectiva en los ratones Nes-Cre I iDTR no afectó al hemograma o al número de progenitores circulantes. La cantidad de eritrocitos (RBC), hemoglobina (Hgb), hematocrito (Hct), plaquetas (Plt), leucocitos (WBC) y progenitores hemopoyéticos (CFU-C) en la sangre no cambiaron significativamente en los ratones Nes-Cre I iDTR y Nes-Cre I iDTR I ROSA-Gfp 24-48 h después del tratamiento con DT, comparado con los niveles observados en animales transgénicos inyectados con PBS o en ratones controles tratados con DT. Conclusiones basadas en lo mostrado en la FIG. 4:

En la FIG. 4A-E se observa que tras la ablación celular selectiva en ratones dobles transgénicos Nes-Cre I iDTR, los progenitores hemopoyéticos se desplazan de la médula ósea a sitios extramedulares. La FIG. 4A muestra cómo una única inyección de toxina diftérica (DT, 4 μg/kg, i.p.) en ratones triples transgénicos Nes-Cre I ROSA-Gfp I iDTR eliminó completamente la población GFP ⁺ de la médula ósea después de 24-48 h, como se reveló por la ausencia de células GFP ⁺ , comparado con los niveles normales en ratones controles triples transgénicos inyectados con PBS o en ratones dobles transgénicos Nes-Cre I ROSA-Gfp inyectados con DT. En la FIG. 4B se observa la celularidad reducida en la médula ósea de los fémures y tibias de los ratones Nes-Cre / iDTR y Nes- Cre / iDTR / ROSA-Gfp 24-48 h tras el tratamiento con DT, el cual no afectó a los animales que no tenían el transgén iDTR, como control. En la FIG. 4C se muestra la detección de un incremento de 2.8 veces en el número de células Lin ^" CD48 ^" detectadas en el bazo de los ratones Nestin- Cre I iDTR 24-48h después de la inyección con DT, comparado con animales controles dobles transgénicos inyectados con PBS o transgénicos sencillos tratados con DT. En la FIG. 4D-E se observa una reducción en el número de células HSCs de la médula ósea tras la ablación celular selectiva en los ratones Nes-Cre I iDTR. El tratamiento con DT en los ratones Nes-Cre I iDTR y Nes-Cre I ROSA-Gfp I iDTR causó 24-48 h más tarde una reducción del (D) ~ 75% en el número de células Lin ^" Sca-1 ⁺ c-kit ⁺ (LSK) y del (E) ~ 58% en las células LSK CD150 ⁺ CD48 ^" de la médula ósea. Las FIG. 4F-I muestran cómo las células nestina ⁺ de la médula ósea son necesarias para el anidamiento de las HSCs y de los progenitores hemopoyéticos. Por ejemplo, en la FIG. 4F se observa cómo la depleción de las células nestina ⁺ reduce el anidamiento de los progenitores hemopoyéticos en la médula ósea. Los ratones Nes-Cre I iDTR, Nes-Cre ^ERT2 I iDTR y los controles iDTR se inyectaron con DT (4 μg/kg, i.p.) y se irradiaron letalmente (1 .2 Gy, una dosis) 16-20 h después. Se inyectaron i.v. cinco millones de células nucleadas obtenidas de la médula ósea de animales congénicos en un volumen de 200 μΙ de PBS. La médula ósea se sembró 3 h más tarde en el medio para el crecimiento de unidades formadoras de colonias en cultivo (CFU-C). El número de CFU- Cs anidadas por cada fémur se corrigió para representar la médula ósea total multiplicando por 16.9, ya que un fémur contiene aproximadamente el 5.9% de la médula ósea total del ratón, como se describió anteriormente (Katayama et al., 2006. Cell, 124: 407-421 ). Uno o dos animales irradiados (de la misma edad, genotipo y género) no recibieron trasplante en cada experimento, para poder corregir los datos en caso de encontrar progenitores residuales del receptor. La eliminación selectiva de las células nestina ⁺ en los ratones Nes-Cre I iDTR y Nes-Cre ^ERT2 I iDTR comprometió significativamente el anidamiento de progenitores hemopoyéticos en la médula ósea. Por otra parte, en la FIG. 4G-I se observa cómo las HSCs anidan rápidamente cerca de las células GFP ⁺ en la médula ósea de los ratones transgénicos Nes-Gfp. Las células de la médula ósea de ratones congénicos se tiñó con anticuerpos biotinilados frente a los marcadores de linajes hemopoyéticos (detectados con estreptavidina conjugada con "Pacific Orange"), a-c-kit conjugado con APC, a-Sca-1 conjugado con "Pacific Blue", a-CD150 conjugado con PE y a-CD48 conjugado con FITC. Las células LSK CD150 ⁺ CD48 ^" se aislaron y se tiñeron con Vybrant DyD (Invitrogen). Un número de HSCs entre 5.000 y 1 1.000 se inyectó i.v. en ratones transgénicos Nes-Gfp letalmente irradiados como se ha descrito en estudios previos (Lo Celso et al., 2009. Nature, 457: 92-96 ).

EJEMPLO 6. Determinación de la expresión y regulación de genes de mantenimiento de las HSCs por las células Nes:GFP ⁺ . Con el fin de estudiar con mayor profundidad la regulación del nicho de las células madre hematopoyéticas (nicho hemopoyético, del inglés haematopoietic stem-cell niche) por el factor G-CSF y el Sistema Nervioso Central (SNS), se analizó la expresión de genes que regulan el mantenimiento de las HSCs y su atracción en la médula ósea (CXCL12/SDF-1 , ligando de c-kit, angiopoyetina-1 , interleucina-7, "vascular cell adhesión molecule-1 ", osteopontina y caderina-N) en células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ y CD45 ^" Nes:GFP ^" aisladas de la médula ósea de ratones tratados con G-CSF o inyectados con vehículo, como en estudios previos (Katayama et al., 2006. Cell, 124: 407-421 ). La expresión de estos genes fue extremadamente elevada (próxima o superior a la de Gapdh) en las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ y, con la excepción de Angptl, de 50 a 800 veces superior que en las células CD45 ^" Nes:GFP ^" de la médula ósea. Además, la expresión de estos genes (excepto osteopontina y caderina-N) disminuyó significativamente en las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ , pero no en las CD45 ^" Nes:GFP ^" , después de la movilización de las HSCs inducida por G-CSF (FIG. 9A) o tras la estimulación del receptor adrenérgico β3 (FIG. 9B). El uso de un gen "housekeeping" diferente mostró resultados muy similares (FIG. 10). La expresión de las conexinas 45 y 43 fue también de 200 a 500 veces superior en las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ que en las CD45 ^" Nes:GFP ^" (FIG. 9C), sugiriendo la existencia de acoplamiento electromecánico entre las células CD45 ^" Nes:GFP ⁺ inervadas por terminales nerviosos simpáticos (Katayama et al., 2006. Cell, 124: 407- 421 ; Mendez-Ferrer et al., 2008. Nature, 452: 442-447; Yamazaki y Alien, 1990. Am J Anat, 187: 261 -276). Por tanto, las citoquinas, las hormonas y el SNS regulan tanto la atracción de las HSCs como la formación del hueso en el nicho de la médula ósea por medio del control directo de las MSCs nestina ⁺ , donde la expresión de genes críticos para el mantenimiento de las HSCs y el destino celular (proliferación y diferenciación) está regulada de manera coordinada. Conclusiones acerca de la función de las células MSCs nestina ⁺ en el nicho hemopoyético. El papel relevante de las MSCs nestina ⁺ en el nicho hemopoyético está basado en las siguientes evidencias: i) En la presente invención se ha mostrado en condiciones de homeostasis una marcada proximidad, no azarosa, de ambas células madre. Esta asociación física se produce tanto en el endostio como en el parénquima medular, ii) Las MSCs nestina ⁺ están inervadas por el SNS, enriquecidas en la expresión de Cxcl12 y del receptor adrenérgico β3 funcional, iii) Las MSCs nestina ⁺ presentan niveles de expresión muy elevados de moléculas críticas para el mantenimiento y la quiescencia de las HSCs en el "nicho osteoblástico", tales como angiopoyetina-1 , osteopontina, caderina-N y ligando de c-kit.

En la presente invención muestran evidencias de que tanto la proliferación como la diferenciación osteoblástica de las MSCs nestina ⁺ de la médula ósea se inducen selectivamente por PTH y se inhiben por G-CSF y las fibras simpáticas que inervan las células nestina ⁺ . Por tanto, estos resultados extienden a las MSCs observaciones previas del efecto inhibidor del SNS en la formación del hueso y de la expansión de HSCs inducida por PTH (Adams et al., 2007. Nat Biotechnol, 25: 238-243; Calvi et al., 2003. Nature, 425: 841-846), ambos descritos como mediados exclusivamente por los OBs. iv) El G-CSF o los agonistas de receptores adrenérgicos β3, cuya activación también promueve la salida de HSCs de la médula ósea, redujeron significativamente la expresión de genes que controlan la atracción de las HSCs en el nicho de la médula ósea {Cxcl12, Kitl, Angptl y Vcaml). Los resultados que se muestran en la presente invención indican que la regulación coordinada de los linajes hemopoyéticos y mesenquimales también ocurre a nivel de las células madre, ya que los mecanismos homeostáticos neurales (SNS) y humorales (PTH) regulan en tándem el mantenimiento y la quiescencia de las HSCs y la proliferación y diferenciación de las MSCs. v) Es de destacar que los experimentos de depleción celular selectiva basados en dos líneas transgénicas independientes (ratones ¡DTR cruzados con animales Nes- Cre y Nes-Cre ^ERT2 ) resultaron en ambos casos en una rápida reducción en el número de células LSK CD150 ⁺ CD48 ^" de la médula ósea y en su movilización hacia el bazo. El hecho de que la depleción de células nestina ⁺ en cultivos primarios de médula ósea también redujo el número de progenitores hemopoyéticos demuestra que el efecto fue directamente causado por la ablación celular selectiva en la médula ósea. Por otro lado, esta reducción es más aguda y pronunciada que la descrita tras la eliminación selectiva de los OBs utilizando la expresión de timidina quinasa dirigida por Col2.3 (Zhu et al., 2007. Blood, 109: 3706-3712), apoyando el papel de las células nestina ⁺ en el nicho hemopoyético. vi) Finalmente, se ha demostrado que las células nestina ⁺ son necesarias para el anidamiento de las HSCs en la médula ósea utilizando dos métodos diferentes. En un grupo de experimentos, la eliminación de las células nestina ⁺ , utilizando ambos modelos de depleción basados en el DTR, comprometió el anidamiento de los progenitores hemopoyéticos en la médula ósea de animales receptores irradiados letalmente. No se observó el mismo efecto en la migración de leucocitos, en línea con evidencias recientes que apoyan la existencia de mecanismos distintos que regulan el tráfico de células sanguíneas maduras vs inmaduras. En otro grupo de experimentos que las HSCs aisladas con elevado grado de pureza, marcadas e inyectadas en animales receptores letalmente irradiados, rápidamente (en menos de dos horas) anidan cerca de las células Nes:GFP ⁺ de la médula ósea, como evidencia adicional del papel de las MSCs nestina ⁺ como células reguladoras de la atracción de las HSCs en el nicho de la médula ósea. En conjunto, estos estudios indican un papel relevante de las MSCs nestina ⁺ en el nicho hemopoyético.

Los estudios realizados permiten proponer la existencia de un nicho único en la médula ósea formado por la asociación MSC-HSC, estrictamente regulado a nivel local por el microambiente y también a distancia mediante señales humorales y del sistema nervioso autónomo.

EJEMPLO 7. ateriales y métodos

7.1. Animales.

Se utilizaron ratones transgénicos Nes-Gfp (Mignone et al., 2004. Cell Cycle, 6: 2161 -2170), FVB-Tg(Co/7a7-cre)1 Kry/Mmcd (Dacquin et al., 2002. Dev Dyn, 224: 245-251 ), B6.Cg(SJL)-TgN(/Ves-cre)1 Kln (Tronche et al., 1999. Nat Genet, 23: 99-103), Nes-Cre ^ERT2 , C57BL/6- Gt(ROSA)26Sortm1 (HBEGF)Awai/J (Buch et al., 2005. Nat Methods, 2: 419-426), B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm2Sho/J (Mao et al., 2001 . Blood, 97: 324-326), RCE.LoxP, Tg(CAG-Bgeo/GFP)21 Lbe/J (Z/EG) y B6.129S4- Gt(ROSA)26Sortm1 Sor/J (Jackson Laboratories) y ratones congénicos C57BL/6-CD45.1 (Frederick Cáncer Research Center). A menos que se indique en el pie de figura, todos los animales utilizados fueron adultos. Los procedimientos fueron aprobados por el comité de uso y mantenimiento de animales de Mount Sinai School of Medicine.

7.2. Extracción y cultivo de las células.

Para extraer las células, la médula ósea se eluyó con medio de FACS descrito en estudios previos (Molofsky et al., 2003. Nature, 425: 962-967), constituido por medio L-15 de Leibovitz (Invitrogen) suplementado con 1 mg/ml albúmina de suero bovino (BSA, Sigma), 10 mM HEPES (Sigma) pH 7.4 y 1 % penicilina-estreptomicina (PS, Invitrogen). Tras lisar los eritrocitos con 0.8% NH ₄ CI, la médula ósea se procesó enzimáticamente del mismo modo descrito para aislar las células de la cresta neural del intestino postnatal (Molofsky et al., 2003. Nature, 425: 962-967). Las células se enriquecieron inmuno-magnéticamente utilizando bolas magnéticas conjugadas con un anticuerpo anti-CD45 (Milteyi Biotec), siguiendo las indicaciones del fabricante, y se aislaron las células CD45 ^" GFP ⁺ y CD45 ^" GFP ^" por FACS. Para el ensayo de formación de esferas, las células se sembraron a densidad clonal (< 1 ,000 células/cm ² ) en placas de 35 mm {StemCell Technologies) o en pocilios únicos de placas de 96 pocilios (Corning) de adherencia ultra-baja. La composición del medio de cultivo se adaptó del de las células de la cresta neural (Pardal et al., 2007. Cell, 131 : 364-377) y del de los pericitos (Crisan et al., 2008a. Curr Protoc Stem Cell Biol, Chapter 2, Unit 2B 2 1 -2B 2 13) y contenía un 15% de extracto de embrión de pollo, preparado como se ha descrito anteriormente (Stemple y Anderson, 1992. Cell, 71 : 973-985), β- mercaptoetanol 0.1 mM, 1 % de aminoácidos no esenciales (Sigma), 1 % de suplemento N2 y 2% de suplemento B27 (Invitrogen), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-basic, "insulin-like growth factor-1 " (IGF-1 ), "epidermal growth factor" (EGF), "platelet-derived growth factor" (PDGF), "oncostatin M" (OSM) (Peprotech) y "leukemia inhibitory factor" (ESGRO®, Millipore) (todos a 20 ng/ml) en DMEM/F12 (1 : 1 ) / human endothelial (Invitrogen) (1 :2). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C con 5% CO ₂ en un incubador de cámara de agua y se dejaron sin tocar durante una semana para evitar la agregación celular. La mitad del medio de cultivo se cambió semanalmente.

7.3. Diferenciación in vitro. La diferenciación osteoblástica fue inducida cultivando las células durante 4 semanas con 50 g/ml ácido L-ascórbico 2-fosfato, glicerofosfato 10 mM (Sigma) y 15% FBS en a-MEM suplementado con PS (Invitrogen). La diferenciación adipocítica fue inducida con dexametasona 1 μΜ, indometacina 100 μΜ, 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX) 0.5 mM, 10 g/ml insulina (Sigma) y 10% FBS en a-MEM suplementado con PS. La diferenciación condrocítica fue inducida en cultivos de CFU-F confluentes preparados como se ha descrito anteriormente (Mendez-Ferrer et al., 2008. Nature, 452: 442-447), y también en pellets celulares, con dexametasona 10 ^"7 M, ácido L-ascórbico 10 ^"4 M, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM, 1 x ITS+1 (10 mg/L insulina bovina, 5.5 mg/L transferrina, 5 μg/L selenita de sodio, 4.7 μg/ml ácido linoleico, y 0.5 mg/ml albúmina de suero bovino; Sigma) y 10 ng/ml TGF^3 (Peprotech) en DMEM (Invitrogen) durante 4 semanas. Todos los cultivos se mantuvieron con 5% CO ₂ en un incubador de cámara de agua a 37°C, y la mitad del medio se cambió 2 veces por semana. Para estudiar la diferenciación en linajes mesenquimales, las células se lavaron con PBS suplementado con CaCl ₂ 0.1 mM y MgC 1 mM (modPBS) y se fijaron durante 10 min a temperatura ambiente con paraformaldehído (Sigma) al 3% en modPBS. Para detectar la actividad fosfatasa alcalina, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con 50 μg/ml Naftol AS-MX fosfato, 0.5% N,N- dimetilformamida y 0.6 mg/ml "Fast Red Violet LB" en Tris-HCI 0.1 M, pH 8.9. La formación de nodulos de calcio se examinó mediante la tinción de von Kossa. Para ello se lavaron las células 3 veces y se tiñeron con nitrato de plata al 5%, recién preparado, durante 30 min. Tras 3 lavados, la reacción se reveló con carbonato de sodio al 5% en formalina al 25% durante 5 min. Tras lavar 3 veces, las células se fijaron con tiosulfato de sodio al 5% durante 2 min y se dieron 3 lavados. Los adipocitos se tiñeron con "Oil Red O" de la siguiente manera: se lavaron las células con 60% isopropanol y se dejaron secar completamente. Se preparó una dilución 6:4 en agua destilada de una solución stock conteniendo 0.35 g/ml Oil Red O en isopropanol (Sigma), filtrada 20 min más tarde. Las células se incubaron durante 10 min con esta solución y se lavaron 4 veces. Para teñir los mucopolisacáridos característicos del cartílago, los cultivos y pellets celulares fijados se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con 1 % Alcian blue 8GX (Sigma) en ácido acético al 3%, pH 2.5, y se lavaron 4 veces. 7.4. Trasplante in vivo.

Los cubos cerámicos porosos (~ 3 mm ³ ) conteniendo un 65% de hidroxiapatita de fosfato cálcico y un 35% de fosfato tricálcico (Ceraform®) se lavaron dos veces para eliminar pequeños fragmentos desprendidos de los cubos, se autoclavaron y se recubrieron con 0.1 mg/ml fibronectina de plasma bovino (Sigma). Para eliminar el aire de los osículos y asegurar el recubrimiento total de su superficie, los osículos se colocaron en un tubo conteniendo la solución de fibronectina y se agitaron durante 1 min mientras se aplicaba presión negativa mediante succión con una jeringa de 60 mi con una aguja de 21 g atravesando la tapa del tubo. Se reemplazó la tapa por una nueva y se repitió el mismo procedimiento. Los osículos cubiertos con fibronectina se dejaron secar toda la noche en una campana de flujo laminar. Las células recién aisladas se introdujeron en los osículos mediante el mismo proceso descrito, mientras que las esferas se depositaron sobre la superficie de los osículos. En ambos casos las células se dejaron adherir a los osículos, en el medio de crecimiento de las esferas, durante 24 h en el incubador. Los osículos se implantaron s.c. bajo la piel dorsal de animales adultos anestesiados, procedentes de la misma carnada, pero que no tenían los transgenes.

7.5. Análisis histológicos. Dos meses después del trasplante, los animales anestesiados se inyectaron con 100 U de heparina sódica (i.p., Sigma) para evitar la coagulación, y se perfundieron a través del ventrículo izquierdo con ~ 20 mi MgCI ₂ 2 mM en PBS frío, seguido de 100 mi paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 0.2%, EGTA 5 mM y MgCI ₂ 2 mM en PBS, pH 7.4, a 4 °C. Los osículos se recuperaron y se post-fijaron durante 2 h a 4 °C con la misma solución fijadora. Tras dos lavados con MgCI ₂ 2 mM en PBS frío, los osículos se lavaron durante 10 min con MgCI ₂ 2 mM, 0.01 % desoxicolato sódico (Sigma) y 0.02% Nonidet P-40 (Roche) en PBS. Se realizó la tinción de X-gal con K ₃ Fe(CN) ₆ 5 mM, K4Fe(CN) ₆ 5 mM, MgCI ₂ 2 mM, 0.01 % desoxicolato sódico (Sigma), 1 mg/ml 5-Bromo-4-cloro-3- indoxil-beta-D-galactopiranósido (X-gal, BioSynth AG®) y 0.02% Nonidet P-40 (Roche) en PBS a 37 °C y con movimiento durante toda la noche. Los osículos se descalcificaron parcialmente con EDTA 0.25 M durante 2 ó 3 días y se procesaron para sección con criostato (10 μηπ) utilizando una cuchilla de carburo de tungsteno (Diamond Knives) y portas cubiertos con 4x metacrilato y el sistema de transferencia con cintas adhesivas CryoJane (Instrumedics). La inmunohistoquímica con amplificación de la señal se realizó del mismo descrito anteriormente (Mendez-Ferrer et al., 2008. Nature, 452: 442-447). La inmunohistoquímica para la detección de los marcadores SLAM se ha descrito en estudios previos (Kiel et al., 2005. Cell, 121 : 1 109-1 121 ).

7.6. Tratamiento in vivo.

El isoproterenol o el agonista BRL37344 (2 mg/kg; Sigma) se inyectaron i.p. 2 h antes de sacrificar a los animales; los agonistas adrenérgicos estaban también presentes a una concentración de 50 μΜ durante la digestión enzimática y la separación celular por FACS, realizados a 37° C y temperatura ambiente, respectivamente. Los tratamientos con G-CSF (Katayama et al., 2006. Cell, 124: 407-421 ) o PTH (Adams et al., 2007. Nat Biotechnol, 25: 238-243) han sido descritos en estudios previos.

7.6. Extracción de RNA y PCR cuantitativa.

Las células separadas por FACS se recuperaron directamente en solución de lisis y se extrajo el RNA utilizando el kit Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit (Invitrogen). La transcripción inversa se realizó con el Reverse Transcription System (Promega). El protocolo de PCR cuantitativa se ha descrito previamente (Mendez-Ferrer et al., 2008. Nature, 452: 442-447). Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados se han incluido en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias de cebadores usados para la PCR cuantitativa.

Producto

Cebadores Secuencia (Pb) Anillamiento (°C)

Cxcl12_Fw SEQ ID NO: 1

Cxc/72_Rv SEQ ID NO: 2 1 18 60

Gfp_Fw SEQ ID NO: 3

Gfp_Rv SEQ ID NO: 4 280 60

Kitl_Fw SEQ ID NO: 5

Kitl_Rv SEQ ID NO: 6 65 60

Angpt1_Fw SEQ ID NO: 7

Angpt1_ Rv SEQ ID NO: 8 138 60

IL7_FVJ SEQ ID NO: 9

/L7_Rv SEQ ID NO: 10 102 60

Vcaml _Fw SEQ ID NO: 1 1

Vcam1_ Rv SEQ ID NO: 12 121 60

Spp1_F\N SEQ ID NO: 13

Spp1_Rv SEQ ID NO: 14 149 60

Ogn_Fw SEQ ID NO: 15

Ogn_Rv SEQ ID NO: 16 122 60

Alpl_Fw SEQ ID NO: 17

Alpl_Rv SEQ ID NO: 18 73 60

Gpnmb_Fw SEQ ID NO: 19 Gpnmb_Rv SEQ ID NO: 20 65 60

Runx2_Fw SEQ ID NO: 21

Runx2_Rv SEQ ID NO: 22 128 60

Sp7_Fw SEQ ID NO: 23

Sp7_Rv SEQ ID NO: 24 275 60

Bglap_Fw SEQ ID NO: 25

Bglap_Rv SEQ ID NO: 26 183 60

Bmp4_Fw SEQ ID NO: 27

Bmp4_ Rv SEQ ID NO: 28 69 60

Pparg_Fw SEQ ID NO: 29

Pparg_Rv SEQ ID NO: 30 100 60

Cfd Fw SEQ ID NO: 31

Cfd_Rv SEQ ID NO: 32 50 60

Acan Fw SEQ ID NO: 33

Acan_Rv SEQ ID NO: 34 269 60

Sox9_Fw SEQ ID NO: 35

Sox9_Rv SEQ ID NO: 36 186 60

Gjc1_Fw SEQ ID NO: 37

Gjc1_Rv SEQ ID NO: 38 245 60

Gja1_Fw SEQ ID NO: 39

Gja1_Rv SEQ ID NO: 40 1 19 60

Gapdh_Fw SEQ ID NO: 41

Gapdh_Rv SEQ ID NO: 42 77 60

Nota: La abreviatura Fw se refiere a cebadores con secuencias directas (del inglés Forward) y la abreviatura Rv se refiere a cebadores con secuencias inversas (del inglés Reverse). El tamaño del fragmento que se consigue amplificar con cada uno de los pares de cebadores Fw/Rv correspondientes está medido en pares de bases (pb). El parámetro "anillamiento" indica la temperatura de hibridación óptima entre los cebadores Fw y Rv y la secuencia de ADN molde. EJEMPLO 8. Ensayos con biopsias de médula ósea humana. 8.1. Extracción y cultivo de las células.

Se lavaron con PBS los aspirados medulares obtenidos de donantes sanos. Las células de la médula ósea se obtuvieron por centrifugación. Las células sanguíneas de la serie roja se lisaron y las muestras fueron enzimática y mecánicamente digeridas como se ha descrito en las muestras murinas.

Las muestras fueron inmunomagnéticamente deplecionadas de la mayor parte de células CD45+ empleando bolas magnéticas conjugadas con un anticuerpo antihumano (Miltenyi Biotec) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las células CD45- fueron aisladas mediante un separador automático (FACS) y se sembraron a densidad clonal (< 1 ,000 células/cm ² ) en las mismas condiciones que promueven el crecimiento de mesenferas murinas, con la excepción del que los factores de crecimiento eran de origen humano.

Las esferas tenían la misma apariencia que las esferas murinas formadas en 7-10 días (Fig. 1 1 ).

Las esferass primarias se cogieron individualmente, y fueron digeridas con colagenasa (StemCell Technologies), y sembradas en tres medios de cultivo diferentes:

1 - Medio formador de mesenferas (medio B).

2- Medio formador de mesenferas modificado, en el que el extracto de embrión de pollo se substituye por un 10% de suero humano (medio A).

3- Medio aMEM libre de fenol, conteniendo 10% FBS y 1 % penicilina-streptomicina (Invitrogen), condiciones que promueven el crecimiento de las unidades formadoras de colonias de fibroblastos (CFU- F).

El número de esferas secundarias y CFU-F obtenidas de cada esfera primaria se indica en la Tabla 3.

Medio A Medio B

43.5 ± 6.6 esferas (n = 24) 1 7.4 ± 2.1 Esferas (n = 16)

Tabla 3. Número de esferas secundarias y CFU-F generadas a partir de cada esfera primaria.

Se observa una expansión significativa de las células formadoras de esferas se observa después del subcultivo in vitro. La función MSC de las esferas primarias se confirmó por la generación de un elevado número de CFU-F de cada esfera primaria (Tabla 3). Estas CFU-F fueron fosfatasa alcalina+ y podían diferenciarse en adipositos y osteoblastos mineralizantes, como se comprobó mediante tinción de Von Kossa de los depósitos de calcio (Fig. 12).

Para testar la autorrenovación in vitro, las esferas secundarias fueron digeridas y subcultivadas bajo las mismas condiciones. Una media de 436.4 ± 42.3 esferas terciarias fueron obtenidas de cada esfera secundaria (n = 13). Por tanto, estos datos demostraron una expansión de las células formadoras de esferas de 3,230 a 18,983 veces. Esta expansión fue aproximadamente 6 veces mayor en el medio A, que no tenía productos animales. Dichas condiciones de cultivo serían potencialmente útiles para expandir células madre mesenquimales (MSCs) humanas. Para testar in vivo la autorrenovación, las esferas primarias aisladas fueron unidas a osículos cerámicos fosfocálcicos, e implantados subcutáneamente en ratones inmunodeficientes. Se extrajeron los osículos tras dos meses, fueron digeridos enzimáticamente, y separados por FACS usando combinaciones de los marcadores de MSC CD105, CD140b y CD146, y subcultivados en medio formador de mesenferas. La capacidad formadora de mesenferas de cada población se indica en la Tabla 4.

\ CD105+ CD140b+ CD146+ CD140b+

\ 32 (9/28) 47 (65/137)

\ 1 1 (4/38) 5.5 (1/18)

10.5 (4/38)

Tabla 4: Auto-renovación in vivo de las mesenferas humanas. Se indica la eficiencia de formación de esferas (como porcentaje con respecto al número de células sembradas) de cada población dentro de los diferentes osículos.

A pesar del bajo número de mesenferas que fueron positivas para los marcadores de MSCs clásicos, fueron enriquecidas en células formadoras de esferas, lo que indica que las mesenferas humanas pueden auto- renovarse in vivo.

Nuestros estudios previos sugieren que se requieren las MSCs Nestina positivas para la auto-renovación de HSC. Para testar el posible uso de las mesenferas humanas para promocionar la auto-renovación in vitro y/o expansión, las mesenferas humanas primarias formadas tras 10 días en cultivo fueron co-cultivadas con células CD34+ de médula ósea humana en medio libre de suero (StemSpan, StemCell Technologies), suplementado con 10 mg/ml heparin (Sigma), 10 ng/ml factor de células madre de ratón, 20 ng/ml de trombopoietina humana y 10 ng/ml de FGF-1 humano (R&D). La presencia de mesenferas en el medio de cultivo fue asociado a una expansión de 21 veces en el número de células CD34+ después de 12 días de cultivo, frente al crecimiento en ausencia de mesenferas, en las mismas condiciones. La capacidad hematopoyética de estas células se está testando actualmente. Estos resultado sugieren que las MSCs cultivadas en estas condiciones podrían potencialmente ser usadas para promover in vitro la expansión y la auto-renovación de las células HSC.