技术领域

本发明涉及生物技术与医学领域， 特别涉及肌肉干细胞相关的细胞培养与细胞治 疗领 域。 背景技术

肌肉干细胞负责出生后肌肉组织的生长和再生 ， 且肌肉干细胞在体内没有致癌效 果， 不存在应用胚胎干细胞时会碰到的伦理问题， 因而在肌肉萎缩和重症肌无力等各种 肌肉退行性疾病的治疗方面有广阔的应用前景 。 肌肉干细胞临床应用的一个重要障碍是 无法在体外长期培养肌肉干细胞。 和大多数成体干细胞一样， 肌肉干细胞从体内分离之 后， 在体外培养系统中只能再分裂 2-4次， 几乎无法传代。

现有培养肌肉干细胞 (卫星细胞)的方法几乎都来源于 Bischoff博士在 1986年建立的 方法，后经过 Beauchamp等人的改进，形成现有的在 F10基础培养基中添加 10ng/ml FGF 进行培养的方法。 在此培养条件下， 肌肉干细胞可以增殖 3-5次。 在传代时， 肌肉干细 胞会经过一个严重的危机时期， 在这一危机时期， 绝大多数细胞都会死去， 残留的细胞 则分化为不具有干性的前体细胞。 所以体外培养 1-3代 (3-12天)后， 分离得到的肌肉干 细胞即全部分化为不具有干性的前体细胞， 肌肉干细胞的分子标记在这些前体细胞中都 无法检测到。 注射入小鼠体内后， 这些前体细胞参与肌肉损伤修复的能力非常弱 ， 不能 在体内形成有功能的干细胞， 完全不能进行移植后二次损伤的修复。 （Bischoff R. A satellite cell mitogen from crushed adult muscle. Dev Biol., 1986. 115(1): 140-147. Beauchamp, J R., et al., Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cell Biol, 2000. 151(6): p. 1221-34.)也就是说，采用现 有的肌肉干细胞体外培养系统， 培养后的肌肉干细胞传代后要经过一个危机期 ， 危机期 后得到的可以增殖的细胞绝大多数已经分化为 肌肉祖细胞， 丧失了肌肉损伤修复的能 力。 由于这一问题的存在， 使得通过在肌肉干细胞中进行基因修复治疗遗 传性的肌肉退 行性疾病的方法难以在临床治疗中使用。 发明内容

本发明的目的就是克服现有技术的缺陷， 提供一种肌肉干细胞培养基及其应用。 本发明第一方面提供了一种肌肉干细胞体外培 养方法， 为采用添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基 体外培养肌肉干细胞。 本发明的肌肉干细 胞体外培养方法适合体外长期培养肌肉干细胞 。

本发明第二方面提供了一种肌肉干细胞培养基 ， 为添加有血液细胞的细胞因子的细 胞培养基或血液细胞条件培养基。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 中所添加的血液细胞的细胞因子， 用 于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞， 均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动 物物种。

当添加动物血清培养细胞时， 本发明所述的添加有血液细胞的细胞因子的细 胞培养 基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括所 用动物血清中本就含有的细胞因子。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 可由在通用细胞培养基中添加血液 细胞的细胞因子的方法制备获得。

进一步的， 所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养 基。 更进一步的， 为 B细 胞条件培养基或 T细胞条件培养基。

所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞 因子中的多种： GM-CSF (粒细胞集 落剌激因子）、 sICAM-lC人可溶性细胞间粘附分子 1); IFN gamma(j干扰素)、 IL1C白介 素 1)、 IL-1 alpha receptor (白介素 1α受体）、 IL1 alpha (白介素 la)、 IL-3(白介素 3)、 IL2(白 介素 2)、IL-10(白介素 10)、IL-16(白介素 16)、IL13(白介素 13)、IL-17(白介素 17)、IP-10(干 扰素诱导蛋白 10)、SCYA2 (小诱导型细胞因子 A2)、MIG (干扰素 γ诱生单核因子）、 MIP-1 alpha (巨噬细胞炎性蛋白 la)、 TGF-beta (转化生长因子 β；)、 IL-4(白介素 4)、 TRAF6(TNF 受体相关因子 6)、 FGF (成纤维细胞生长因子；)、 IGF胰岛素样生长因子；)、 PDGF (血小板 衍生生长因子；)、 LIF (白血病抑制因子；)、 mTOR (哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；)、 LPS (细胞内 毒素)、 TLRl(Toll-样受体 1)、 IL12(白介素 12)、 IL23(白介素 23)、 NGF (神经生长因子）、 TNFalpha(a干扰素）、 IL1 beta (白介素 1β；)。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基中， 所述添 加的血液细胞的细胞因子总浓度不低于 6ng/m l， 较佳地为 50-4500 ng /ml。

进一步的， 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基 中， 任一添加的血液细胞的细胞因子的浓度均在 0.5ng/ml以上， 较佳的为 lng/ml以上， 再佳的为 10ng/ml以上， 更佳的， 25ng/ml以上， 更进一步的， 为 50ng/ml以上。

进一步的， 所添加的述血液细胞的细胞因子至少包括 IL1、 IL4、 IL13、 TNF alpha、 IL2禾 P IFN gamma o

进一步的， 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基 中， IL1、 IL4、 IL13、 TNF alpha、 IL2和 IFN gamma的浓度之和不低于 6ng/ml， 较佳地 为 50-1250ng/ml。

进一步的， 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基 中，所述 IL 1、 IL4、 IL 13、 TNF alpha、 IL2和 IFN gamma中任一种的浓度均不低于 0.5ng/ml， 较佳的为 lng/ml以上， 更佳为 10ng/ml以上， 一般可选择 50-500ng/ml。

本发明第三方面， 提供了前述血液细胞的细胞因子或血液细胞条 件培养基在肌肉干 细胞体外培养中的用途。

所述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养 基可促进肌肉干细胞在体外的增殖 并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。

本发明第四方面， 提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂， 为以采用本发明的 肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细 胞为主要活性成分的制剂。

进一步的， 所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用 本发明的肌肉干细胞体外 培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成 分。

进一步的， 所述制剂为注射剂、 手术植入剂。

所述制剂一般包含常用的制剂辅料。

本发明第五方面， 提供了一种对病人的肌肉退行性疾病细胞治疗 方法， 包括下列步 骤：

1 ) 收集病人的肌肉干细胞；

2 ) 采用本发明的肌肉干细胞培养基体外扩增培养 步骤 1)收集的肌肉干细胞至 得到足够多的肌肉干细胞；

3 ) 将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位 。

其中步骤 3)所述给药方式可采用注射剂的方式将肌肉干� ��胞肌肉注射至病人肌肉 损伤部位。

肌肉干细胞的注射剂可将扩增后的肌肉干细胞 经胰酶消化从培养皿中取下后， 重悬 在生理盐水中获得。

采用本发明的肌肉干细胞体外培养、 传代方法， 使得肌肉干细胞可以在体外大量扩 增并保持干性， 从而大大提高了可以用于再生医学治疗的干细 胞的数量， 使得由患者提 供少量肌肉组织， 分离肌肉干细胞， 进行基因修复， 体外扩增后将携带正确遗传信息的 肌肉干细胞注射如体内实现对多种遗传性肌肉 退行性疾病的细胞治疗的策略成为可能。

现有的肌肉干细胞培养方法无法在体外长期培 养具有分化潜能的肌肉干细胞， 无法 传代， 培养时间超过 12 天后全部细胞都分化为祖细胞， 丧失在体内修复肌肉损伤的能 力。 在现有培养条件下， 肌肉干细胞只能分裂 3-5 次， 即最多扩增为原始细胞数的 32 倍， 即丧失分裂能力， 因而要得到足够多的肌肉干细胞用于治疗， 就必须取非常大的肌 肉组织用来分离纯化肌肉干细胞， 在临床上基本不具有可行性。 在本发明的培养基中， 肌肉干细胞可以增殖十次以上， 即在每一代均可以扩增为原始细胞数的 1000倍以上。 更重要的是， 在本发明的培养基中， 肌肉干细胞可以连续传代， 并且继续保持干性和分 化潜能。这样最终得到的肌肉干细胞数目是起 始分离纯化的肌肉干细胞数目的 2 ^m x2 ⁿ 倍， m为每代分裂次数， n为传代数目。 采用本发明的方法得到的 m值至少为 12， n值至 少为 40， 即肌肉干细胞数目至少可以扩增为原始分离纯 化的肌肉干细胞数目的 4.5xl0 ¹⁵ 倍， 并且扩增后的肌肉干细胞均保持干性和完整分 化潜能， 能够在体内修复肌肉损伤。 注射入小鼠体内后， 这些干细胞可以较高效地参与肌肉损伤的修复 ， 也可以补充体内的 干细胞储备， 具有移植后二次损伤的修复能力。 这就使得通过微创手术， 提取少量肌肉 组织 (克级)， 分离纯化少量肌肉干细胞， 然后在体外扩增获得足够量的肌肉干细胞用于 再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。 附图说明

图 1、 添加细胞因子的 F10培养基中培养的 P0 代肌肉干细胞 (Pax7染色)。

图 2、 添加细胞因子的 F10培养基中培养的对照成纤维细胞 (Pax7染色)。

图 3、 添加细胞因子的 F10培养基中培养的 P8代肌肉干细胞 (Pax7染色）。

图 4、 添加细胞因子的 F10培养基中培养的 P22代肌肉干细胞 (Pax7染色)。

图 5、 在添加细胞因子的 F10培养基中培养的 P0代细胞的分化结果。

图 6、 在添加细胞因子的 F10培养基中培养的 P22代细胞的分化结果。

图 7、在添加细胞因子的 F10培养基中培养的表达 RFP的肌肉干细胞在体内参与肌 肉损伤修复结果。

图 8、在添加细胞因子的 F10培养基中培养的 RFP标记的肌肉干细胞能够参与肌肉 损伤的修复结果。体外培养的 RFP标记的肌肉干细胞注射入没有荧光标记的损 伤的肌肉 7天后， 切片观察红色细胞的整合情况， 发现在损伤部位有来源于注射的表达 RFP的肌 肉干细胞的红色肌纤维形成。

图 A为注射加入细胞因子培养的肌肉干细胞的修� �情况；

图 B为注射用 T细胞条件培养基培养的肌肉干细胞的修复情� �。 具体实施方式

本发明发现， 与血细胞共培养后可以促进肌肉干细胞的增殖 ， 且这一促进作用不依 赖于血细胞与肌肉干细胞之间的细胞接触。 血细胞条件培养基即可以促进肌肉干细胞的 增殖。 经过进一步细分， B细胞和 T细胞条件培养基均可以促进肌肉干细胞的增� �。 肌 肉干细胞在 T细胞条件培养基中培养后， 每代可连续分裂 10次以上， 并可在体外培养 系统中至少连续传代 40代。 经过一系列分离纯化步骤后， 分离到 T细胞所分泌出的细 胞因子， 这些细胞因子的组合可以促进肌肉干细胞在体 外的增殖。 经细胞因子处理过后 的肌肉干细胞表达肌肉干细胞所应表达的分子 标记， 其增殖能力显著提高， 可以连续传 代 40 代以上。 传代后的每一代细胞均表达肌肉干细胞的分子 标记， 具有较强的增殖能 力， 可以高效分化为成熟肌管。 更重要的是， 当这些用 T细胞条件培养基或细胞因子培 养的肌肉干细胞注射入诱导肌肉损伤后的小鼠 时， 注射的肌肉干细胞可以修复肌肉损 伤， 形成新的肌纤维， 表明本发明得到的是真正的肌肉干细胞。

本发明的肌肉干细胞体外培养方法， 为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养 基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细 胞。

本发明的关键在于对体外培养肌肉干细胞的培 养基进行了改进， 体外培养肌肉干细 胞的其他方面与常规细胞培养一致。

最佳培养条件： C0 ₂ 培养箱中 37°C培养。 C0 ₂ 培养箱中 C0 ₂ 浓度较佳为 5%(v/v)。 所述肌肉干细胞的体外培养是贴壁培养。

本发明所采用的肌肉干细胞培养基， 为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或 血液细胞条件培养基。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 中所添加的血液细胞的细胞因子与 所述待培养的肌肉干细胞应当来源于相同的动 物物种。 用于制备所述血液细胞条件培养 基的血液细胞与所述待培养的肌肉干细胞也应 当来源于相同的动物物种。 如培养鼠肌肉 干细胞， 则采用添加了鼠血液细胞细胞因子的细胞培养 基或鼠血液细胞条件培养基， 如 培养人肌肉干细胞， 则采用添加人血液细胞的细胞因子的细胞培养 基或人血液细胞条件 培养基， 其余类推。

所述物种 (Species), 为生物分类学的基本单位。 进一步的， 所述动物物种选自哺乳 动物。 更进一步的， 所述物种选自哺乳动物中的啮齿目、 偶蹄目、 奇蹄目、 兔形目、 灵 长目等的物种， 如鼠、 兔、 羊、 猪、 猴、 人等。

当添加动物血清培养细胞时， 本发明所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞 培养基 中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括加入 培养基的动物血清中本就含有的细胞因 子。 亦即， 当添加动物血清培养细胞时， 本发明还需额外添加与所培养的肌肉干细胞同 物种的血液细胞的细胞因子。

本发明所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞 培养基是指除常规细胞培养所需组分 夕卜， 还额外添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养 基。

本发明所述肌肉干细胞培养基中除添加的血液 细胞的细胞因子外的其他组分及含量 均与常规细胞培养基一致。 常规细胞培养基成分一般选自： 平衡盐水、 pH 调节液、 抗 生素、 动物血清、 细胞生长必须的氨基酸、 维生素、 葡萄糖、 pH 指示剂等。 所述平衡 盐水成分如氯化钙、 硝酸铁、 硫酸镁、 氯化钾、 氟化钠、 氯化钠、 磷酸钠等； 所述 pH 调节液如 3.7%碳酸氢钠、 HEPES溶液 (二羟乙基哌嗪乙垸磺酸)、 丙酮酸钠等； 所述抗生 素如青霉素、链霉素、 等； 常用的动物血清主要有牛血清和马血清。 维生素如氯化胆碱、 叶酸、 肌醇、 烟酰胺、 泛酸钙、 盐酸吡哆醛、 维生素 B6、 核黄素、 硫胺素等。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 可由在通用细胞培养基中添加血液 细胞的细胞因子的方法制备获得。 其中， 所述通用细胞培养基可选自各种常规细胞培养 基，如 DMEM、 RPMI 1640、 MEM、 DEME/F12、 F10、 CD293、 medium 231、 medium 106。 本发明实施例具体列举了在 F10培养基中添加各种血液细胞的细胞因子的肌 肉干细胞培 养基。 所述血液细胞条件培养基是指为： 培养过血液细胞的细胞培养基。 进一步的， 所述 血液细胞为淋巴细胞。 最佳的， 所述血液细胞为 B细胞和 /或 T细胞。

所述血液细胞条件培养基可由在通用细胞培养 基中培养血液细胞后分离获得。 在通 用细胞培养基中培养 B细胞后分离获得 B细胞条件培养基，在通用细胞培养基中培养 T 细胞后分离获得 T细胞条件培养基。

所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞 因子中的多种： GM-CSF、 sICAM-1 ; IFN gamma、 ILK IL-1 alpha 、 IL-1 alpha receptor IL-3、 IL2、 IL-10、 IL-16、 IL13、 IL-17、 IP-10、 SCYA2、 MIG、 MIP-1 alpha TGF-beta、 IL-4、 TRAF6、 FGF、 IGF、 PDGF、 LIF、 mTOR、 LPS、 TLR1、 IL12、 IL23、 NGF、 TNF alpha IL1 beta。

所有上述细胞因子可以在淋巴细胞条件培养基 中检测到， 尤其均存在于 T细胞条件 培养基中。

更佳的， 所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中 的至少六种； 或者， 所述血 液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少 七种； 或者， 所述血液细胞的细胞因子选 自上述细胞因子中的至少八种； 或者， 所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中 的 至少九种； 或者， 所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中 的至少十种。

为了维持肌肉干细胞的增殖并使其传代细胞保 持干性， 所述添加有血液细胞的细胞 因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中 ， 所述血液细胞的细胞因子总浓度不能过 低， 一般不应低于 6ng/ml， 较佳地为 50-4500 ng /ml。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基中， 任一添 加的血液细胞的细胞因子的浓度均在 0.5ng/ml 以上， 较佳的为 lng/ml 以上， 更佳为 lOng/ml以上， 一般可选在 50-500ng/ml的范围内。上述描述并非指细胞因子� ��浓度不能 高于 500ng/ml， 而是认为在此浓度范围内细胞因子可以较好地 发挥积极效果， 浓度过低 效果不明显， 浓度过高造成浪费。

经试验， 六种血液细胞的细胞因子： IL1、 IL4、 IL13、 TNF alpha、 IL2和 IFN gamma 对肌肉干细胞的增殖与干性的保持关系密切。 在本发明优选的技术方案中， 这 6种血液 细胞的细胞因子必须添加， 而其余血液细胞的细胞因子可添加也可以不添 加。

进一步的， 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基 中， IL1、 IL4、 IL13、 TNF alpha、 IL2和 IFN gamma的浓度之和不低于 6ng/ml， 较佳地 为 50-1250ng/ml。

进一步的， 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞的条件培养基 中， 所述 IL1、 IL4、 IL13、 TNF alpha、 IL2和 IFN gamma中任一种的浓度均在 0.5ng/ml 以上， 较佳的为 lng/ml以上， 更佳为 10ng/ml以上， 一般可选 50-500ng/ml。 所述细胞 因子的浓度高于 500ng/ml并不会对肌肉干细胞的增殖构成严重的� ��面影响，但考虑到成 本因素， 无需添加过多的细胞因子。 上述各细胞因子的浓度均指： 添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血 液细胞 的条件培养基中， 来源于与所培养的肌肉干细胞同物种的血液细 胞的细胞因子的终浓 度。

本发明揭示了血液细胞的细胞因子或血液细胞 条件培养基可用于肌肉干细胞体外 培养， 可促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖 的肌肉干细胞保持干性。

本发明还提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病 的制剂， 为以采用本发明的肌肉干细 胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要 活性成分的制剂。

所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用 本发明的肌肉干细胞体外培养方法 培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。

根据本发明的试验， 用于人体， 推荐的给药剂量约为 3xl0 ⁶ 个肌肉干细胞 /次。 可单 次给药， 也可以根据病人的肌肉恢复情况多次给药。 一般的给药方式为通过肌肉注射的 方式给药。 但本发明并不排除其他可能的给药方式。

所述制剂一般包含常用的制剂辅料。

常用的制剂辅料包括 (但并不限于):盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 多元 醇及其组合。 药物制剂应与给药方式相匹配。 本发明的制剂优选被制成针剂形式， 例如 用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液 通过常规方法进行制备。 其他可能的制剂 形式可通过常规方法进行制备。 本发明的制剂宜在无菌条件下制造。 此外， 本发明的制 剂还可与其他治疗剂一起使用。

本发明进一步提供了一种对病人的肌肉退行性 疾病细胞治疗方法， 包括下列步骤： 1 ) 收集病人的肌肉干细胞；

病人肌肉干细胞的收集可通过微创手术从病人 机体中提取少量肌肉样品， 而后从肌 肉样品中将肌肉干细胞分离纯化获得。 该技术为本领域技术人员熟知。

2 ) 采用本发明的肌肉干细胞培养基体外扩增培养 步骤 1)收集的肌肉干细胞至 得到足够多的肌肉干细胞；

基于本发明的肌肉干细胞培养技术， 收集了病人的肌肉干细胞后， 可以进一步利用 已知的基因工程手段对肌肉干细胞进行基因工 程改造， 修复缺陷基因或进行基因优化， 并进一步扩增改造后的肌肉干细胞， 以达到克服一些遗传或突变相关的肌肉疾病或 进一 步优化肌肉组织的目的。

3 ) 将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位 。

一般可采用注射剂的方式将肌肉干细胞肌肉注 射至病人肌肉损伤部位。 注射后应当 让病人进行适度锻炼， 促进肌肉干细胞的整合。 4-8周后检查修复效果。 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方 式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。 本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用， 本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与 应用， 在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明， 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结 构和分析、分析化学、细胞培养、重组 DNA 技术及相关领域的常规技术。 这些技术在现有文献中已有完善说明， 具体可参见 Sambrook等 MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989 and Third edition, 2001 ； Ausubel 等， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates ； the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ； Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ； METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe, eds.)， Academic Press, San Diego, 1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY , Vol.119 , Chromatin Protocols(P.B. Becker , ed.)Humana Press, Totowa, 1999等。 实施例 1、 鼠 T细胞条件培养基的制备

将野生型 C57/B6小鼠处死， 取出脾脏， 置于 70um滤网中， 加入 2-3毫升 PBS湿 润后， 使用辗磨棒辗磨脾脏， 加适量 PBS过滤， 收集细胞悬液。 lOOOrpm离心 5分钟， 弃上清， 使用 5毫升红细胞裂解液重悬细胞， 加入 5毫升 RPMI-1640培液， 并用滤网再 次过滤去除细胞碎片， lOOOrpm离心 5分钟收集细胞。 使用 RPMI-1640培液洗涤细胞两 次，调整细胞密度为 1 X 10 ⁹ cells每升，接种于细胞培养瓶，加入 ConA (终浓度为 5mg/L)， 于 37度 C0 ₂ 培养箱培养 48小时后补加等倍 RPMI-1640培液， 24小时后 3000rpm离心 5分钟， 将细胞上清转移至新离心管中， 于 -80摄氏度保存。

经检测， 获得的 T细胞条件培养基中含有下列浓度的细胞因子� �

检测方法： ELISA检测,参见 R&D公司 Mouse Cytokine Array, Panel A (Catalog # ARY006) 组分 A GM-CSF 200ng/ml

组分 B sICAM-1 120ng/ml

组分 C IFN gamma 160ng/ml

组分 D IL1 lOOng/ml

组分 E IL-1 alpha receptor lOOng/ml

组分 F IL-3 250ng/ml

组分 G IL2 200ng/ml

组分 H IL-10 80ng/ml

组分 I IL-16 130ng/ml 组分 J IL13 120ng/ml

组分 κ IL-17 300ng/ml

组分 L IP- 10 250ng/ml

组分 M SCYA2 80ng/ml

组分 N MIG 150ng/ml

组分 0 MIP-1 alpha 200ng/ml

组分 P TGF-beta 150ng/ml

组分 Q IL-4 250ng/ml

组分 R TRAF6 400ng/ml

组分 S FGF 25ng/ml

组分 τ IGF 50ng/ml

组分 U PDGF 80ng/ml

组分 V LIF lOOng/ml

组分 W IL-1 alpha 200ng/ml

组分 X mTOR 30ng/ml

组分 Y LPS 60ng/ml

组分 Z TLR1 55ng/ml

组分 Z' IL12 120ng/ml

组分 Y' IL23 200ng/ml

组分 X' NGF lOOng/ml

组分 W TNFalpha lOOng/ml

组分 V' IL1 beta lOOng/ml

在不同的细胞培养基或者不同操作人员的情况 下， τ细胞条件培养基中的细胞因子含量 会略有波动， 但这一波动并不足以影响本发明的实施。

人 T细胞条件培养基除培养用细胞为人 T细胞外， 其余参考鼠 T细胞条件培养基的方 法制备。

鼠 B细胞条件培养基的制备：

将野生型 C57/B6小鼠处死， 取出脾脏， 置于 70um滤网中， 加入 2-3毫升 PBS湿润滤 网后， 使用辗磨棒辗磨脾脏， 并加适量 PBS过滤， 收集细胞悬液， lOOOrpm离心 5分钟， 弃 上清， 使用 5毫升红细胞裂解液重悬细胞， 加入 5毫升 RPMI-1640培液， 并用滤网再次过滤 去除细胞碎片， lOOOrpm离心 5分钟收集细胞， 使用 RPMI-1640培液洗涤细胞两次， 调整细 胞密度为 l*10 ⁹ cell _S 每升， 接种于细胞培养瓶， 加入 LPS, 终浓度为 lmg/L， 于 37度 C0 ₂ 培养箱培养 48小时后补加等倍 RPMI-1640培液， 24小时后 3000rpm离心 5分钟， 将细胞上 清转移至新离心管中， 于 -80度保存。 人 B细胞条件培养基除培养用细胞为人 B细胞外， 其余参考鼠 B细胞条件培养基的方 法制备。

添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基的配 制：

各血细胞因子均可市购获得。

添加有血液细胞的细胞因子的肌肉干细胞培养 基的配制方法：

将 F10培养基干粉溶于超纯水， 过滤除菌， 按表 1和表 2加入无菌的各细胞因子， 10%胎牛血清， 100IU青霉素， lOO g/ml链霉素后混匀。

也可采用 1640培养基和 DMEM培养基，均能培养肌肉干细胞。

按下表加入细胞因子， 下表中各血液细胞的细胞因子均来源于鼠或来 源于人。

表 1

表 2

IL-17 120 1 10 20 5 5 150

IP- 10 40 0.5 5 10 1 10 80

SCYA2 60 0.5 5 10 2 5 50

MIG 50 0.5 5 10 2 5 50

MIP-1 alpha 100 1 10 20 5 10 200

TGF-beta 200 2 20 50 5 20 200

IL-4 100 100 100 100 100 100 100

TRAF6 50 0.5 5 10 2 5 50

FGF 10 0.2 2 5 1 2 20

IGF 10 0.2 2 5 1 2 20

PDGF 10 0.2 2 5 1 2 20

LIF 20 0.2 2 5 1 2 20

IL-1 alpha 10 0.5 5 2 50 2 20 mTOR 20 0.2 2 5 1 2 20

LPS 10 0.1 1 2 1 1 10

TLR1 50 0.5 5 10 5 10 50

IL12 40 0.4 4 10 5 10 50

IL23 20 0.2 2 5 2 5 20

NGF 10 0.2 2 5 2 5 20

TNFalpha 150 150 150 150 150 150 150 实施例 2、 肌肉干细胞的培养与检测

1 ) 肌肉干细胞的获取：

鼠肌肉干细胞： 将数只 3天新生小鼠处死， 取四肢肌肉置于加有 0.2%D型胶原酶 的 DMEM培养液中， 37度消化 1.5小时， 随后用 PBS洗涤肌肉三遍， 每次自然沉降肌 肉数分钟收集肌肉。先后使用巴斯德吸管和 18G针头吹吸肌肉数次， 直至肌肉团块被打 碎， 40um滤网过滤去除非肌肉杂质， lOOOrpm离心 5分钟， 重悬于加有 F10培液并接 种于 10cm培养皿中， 3小时后将上清转移至 0.05%1型胶原包被的 10cm培养皿中， 同 时加入 5ng/mlFGF细胞因子， 于 37度 C0 ₂ 培养箱培养过夜。 次日， 胰酶消化肌肉细胞， 1500rpm离心 5分钟， PBS洗涤细胞两次， 将细胞重悬于含有 1.5%BSA的 PBS中， 加 入 CD34抗体 (BD Pharmingen, cat No: 553733 ,稀释比： 1 :20)、 integrin α7 (R&D, cat No： FAB3518A, 稀释比： 1 : 10),37度孵育 45分钟， 5000rpm离心 5分钟收集细胞， PBS洗 涤细胞两次， 使用 Influx流式细胞分选仪分选 CD34和 integrina7双阳性细胞， 即为鼠 肌肉干细胞。

人肌肉干细胞： 获取人肌肉组织后， 使用无菌手术器械去除所有皮肤、 脂肪及骨骼 等非肌肉组织。称重后将肌肉剪成小块，每克 肌肉加入 3.5毫升 dispase ll和 D型胶原酶 等比混合液， 置于 37度 C0 ₂ 培养箱消化 15分钟， 使用 5毫升移液管吹吸肌肉组织， 重 复上述过程 2-3次， 直至所有肌肉团块已被消化。 加入 2倍于总体积的完全生长培养基 终止消化， lOOum滤网过滤后 329g离心 10分钟。 以初始每克肌肉 3.5毫升将沉淀重悬 于完全生长培养基， 加入 7倍体积的红细胞裂解液， 上下颠倒离心管数次， 40um滤网 过滤， 329g离心 10分钟收集细胞， 调整细胞浓度至 0.5-lxlO ⁶ cells/lOml将细胞接种于 gelatin包被的培养皿中。

2 ) 肌肉干细胞传代培养：

分别将实施例 1制备的各培养基加入分离纯化的肌肉干细胞� � 在 37°C 5% C0 ₂ 培 养箱中培养。 每 48小时传代一次， 传代后的细胞在 37°C5% C0 ₂ 培养箱中培养。

传代方法： 肌肉干细胞生长至密度达到 70%时， 用 37°C预热的 PBS洗一次， 加入

37°C预热的胰酶， 消化 1-2分钟， 加入 37°C预热的培养基终止反应。 重悬细胞， 室温 3000rpm离心 6分钟。 弃上清， 将沉淀的细胞重悬于 37°C预热的培养基中， 稀释 3倍， 均分入 3个培养皿， 在 37°C 5% C02培养箱中培养 48小时。

3 ) 检测：

每一代肌肉干细胞均进行肌肉干细胞的分子标 记 Pax7的免疫荧光染色， 检测其表达 水平。

每一代肌肉干细胞均进行体外分化实验， 检测其分化潜能。

每一代细胞均通过肌肉注射引入诱导肌肉损伤 的小鼠肌肉检测其修复肌肉损伤的能 力。

每种培养基最多检测 40代细胞。

肌肉干细胞的分子标记 Pax7的免疫荧光染色检测：

传代后的细胞取其中一盘， 用 PBS (磷酸缓冲液)洗 3 次。 用 4%甲醛固定， 室温 15 分钟。用 PBS洗 3次，加入 l% Tween20，室温 10分钟。用 PBS洗 3次，加入在 1% BSA (牛 血清白蛋白） 的 PBS中稀释的 Pax7抗体 (购自 DSHB), 室温孵育 1小时。 用 PBS洗三 次， 每次 5分钟。 加入在 1%BSA PBS溶液中 1 : 1000稀释的荧光标记的驴抗鼠二抗， 室温孵育 1小时。 用 PBS洗一次， 加入 20μΜ DAPI, 室温 5分钟， 用 PBS洗三次， 每 次 5分钟。 加入抗猝灭剂后封片。 在 Zeiss荧光显微镜下观察拍照。

能够观察到位于细胞核的荧光染色判断为阳性 。 不能观察到位于细胞核的荧光染色 判断为阴性。

体外分化实验：

取一盘培养后的肌肉干细胞， 将其用预热 37°C 的 PBS洗三次， 加入含有 2%马血清 的 DMEM培养基，在 37°C 5% C0 ₂ 培养箱中培养 72小时后，在显微镜下观察分化情况。 能够观察到 >90%的细胞分化为成熟肌管， 判断为保持良好分化潜能。 观察到部分细 胞分化为成熟肌管， 判断为部分保持分化潜能。 没有肌管形成， 判断为无分化潜能。

肌肉损伤修复试验：

诱导肌肉损伤的小鼠动物模型： 购自 Charlse River的野生型小鼠。

取一盘培养后的表达 RFP (红色荧光蛋白）的肌肉干细胞，用预热 37°C 的 PBS洗一次， 用预热 37°C 的胰酶消化 2分钟后， 取 lxlO ⁵ 个肌肉干细胞， 重悬于 200μ1 无菌的 PBS 中， 转入无菌的 lml注射器， 肌肉注射入诱导肌肉损伤的不表达 RFP的小鼠腓肠肌中。 小鼠培养 1个月后， 取腓肠肌冰冻切片， 进行 laminin染色以标记肌纤维的轮廓， DAPI 染色以标记 DNA， 在激光共聚焦显微镜下观察 RFP细胞是否存在于损伤部位。 染色方 法如下： 冰冻切片用 PBS洗 3次。 用 4%甲醛固定， 室温 15分钟。 用 PBS洗 3次， 加 入 1% Tween20,室温 10分钟。用 PBS洗 3次，加入在 1% BSA 的 PBS中稀释的 Laminin 抗体 (；购自 Abeam公司）， 室温孵育 1小时。用 PBS洗三次， 每次 5分钟。加入在 1%BSA PBS溶液中 1 : 1000稀释的荧光标记的驴抗兔二抗， 室温孵育 1小时。 用 PBS洗一次， 加入 20μΜ ϋΑΡΙ(;4',6-二脒基 -2-苯基吲哚；)， 室温 5分钟， 用 PBS洗三次， 每次 5分钟。 加入抗猝灭剂后封片。 在 Zeiss激光共聚焦显微镜下观察拍照。

在损伤部位可观察到较多的有红色荧光的肌纤 维存在判断为肌肉修复优良。 在损伤 部位仅观察到少数有红色荧光的肌纤维存在判 断为肌肉少量修复。 无法检测到任何有红 色荧光的肌纤维判断为肌肉未修复。

4 ) 试验结果（1#-14#分别对应采用表 1和表 2中 1#-14#的配方制备的添加有鼠血液细胞 的细胞因子的 F10细胞培养基

8# (鼠） ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/dd

9# (鼠） ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/dd

10# (鼠） ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/dd

1 1#(鼠） ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/dd

12# (鼠） ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/dd

13# (鼠） ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/dd

14# (鼠） ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/aa/cc ++/ab/cd ++/ab/cd ++/ab/dd 的免疫荧光染色检测阴性

aa: 保持良好分化潜能； ab: 部分保持分化潜能； bb : 无分化潜能

cc: 肌肉损伤修复良好； cd: 肌肉少量修复； dd: 肌肉未修复。

-: 该项检测未进行

部分实验结果图片参见附图。

5 ) 结果分析：

上述结果可见， 采用本发明的培养基， 对 40代肌肉干细胞进行 Pax7染色后， 发现 其均为 Pax7阳性， 每一代细胞均表达肌肉干细胞的分子标记 Pax7， 均能分化为成熟的 肌管细胞。 第 1到第 30代细胞均可修复肌肉损伤。 在小鼠体内， 目前已经检测的 18代 细胞均能够参加肌肉损伤的修复。 以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方 案， 并不能理解为对本发明的限制。 此外， 本文所列出的各种修改以及发明中方法、 组合物的变化， 在不脱离本发明的范围 和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是 显而易见的。 虽然已结合本发明的多种具 体优选实施例对本发明进行了具体的描述， 但应当理解， 本发明不应仅限于这些具体实 施例。 事实上， 各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显 而易见的修改来获取发明 都应包括在本发明的范围内。