Gegenstand der Erfindung sind Mutanten und Allele des zwf- Gens coryneformer Bakterien kodierend für Varianten der Zwf-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC: 1.1.1.49) und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.

Stand der Technik

Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser

Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S- (2-Aminoethyl) -L-Cystein (AEC) .

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-

Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure- Produktion untersucht. Eine zusammenfassende Darstellung über verschiedenste Aspekte der Genetik, des Stoffwechsels und der Biotechnologie von Corynebacterium glutamicum findet sich bei Pühler (chief ed.) im Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338, 2003.

Die Nukleotidsequenz des für die Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum kodierenden

Gens ist unter anderem in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) allgemein verfügbar. Sie kann weiterhin der Patentanmeldung WO 01/00844 als Sequenz Nr. 243 (= AX065117) entnommen werden.

In der WO 01/70995 ist eine Verbesserung der fermentativen Produktion von L-Aminosäuren durch coryneforme Bakterien durch die Verstärkung des Gens zwf beschrieben.

In der WO 01/98472, WO 03/042389 und US 2003/0175911 Al wird von neuen Mutationen im zwf-Gen berichtet.

Moritz et al . (European Journal of Biochemistry 267, 3442- 3452 (2000) ) berichten über physiologische und biochemische Untersuchungen an der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum. Nach Untersuchungen von Moritz et al . besteht die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus einer Zwf-Untereinheit und einer OpcA-Untereinheit .

Die mikrobielle Biosynthese von L-Aminosäuren in coryneformen Bakterien ist ein komplexes System und vielschichtig mit diversen anderen Stoffwechselwegen in der Zelle vernetzt. Daher kann keine Vorhersage gemacht werden, welche Mutation die katalytischen Aktivität der Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase dergestalt verändert, dass die Produktion von L-Aminosäuren verbessert wird. Es ist daher

wünschenswert weitere Varianten der Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase zur Verfügung zu haben.

Der besseren Übersichtlichkeit halber ist die Nukleotidsequenz des für die Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase beziehungsweise des für die Zwf-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum kodierenden zwf-Gens („Wildtyp-Gen") gemäß den Angaben der NCBI-Datenbank in SEQ ID NO :1 und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz der kodierten Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase in SEQ ID NO: 2 und 4 dargestellt. In SEQ ID NO: 3 sind stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream) gelegene Nukleotidsequenzen zusätzlich angegeben.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt neue Maßnahmen zur verbesserten Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind erzeugte beziehungsweise isolierte Mutanten coryneformer Bakterien, die bevorzugt Aminosäuren ausscheiden, und welche ein Gen bzw. Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Aktivität kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, bei der an der Position 321 beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthalten ist. Der Austausch von Glycin gegen L-Serin wird bevorzugt.

Das Polypeptid, das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthalten ist, kann ebenfalls als Zwf-Polypeptid oder Zwf- Untereinheit der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bezeichnet werden.

Bei den coryneformen Bakterien wird die Gattung

Corynebacterium bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Aminosäure-ausscheidende Stämme, die auf folgenden Arten beruhen:

Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,

Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,

Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und

Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,

wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.

Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeicnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

Bekannte Vertreter Aminosäure ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien sind beispielsweise

die L-Lysin produzierenden Stämme

Corynebacterium glutamicum DM58-l/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in EP 0 358 940,

Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) beschrieben in Menkel et al . (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)), Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) beschrieben in EP 1 108 790,

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP- 3304) beschrieben in US 5,250,423,

oder die L-Tryptophan produzierenden Stämme

Corynebacterium glutamicum K76 (=FermBP-1847) beschrieben in US 5,563,052,

Corynebacterium glutamicum BPS13 (=FermBP-1777) beschrieben in US 5,605,818, und Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 beschrieben in US 5,235,940.

Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) und in der US- A-5,250,434.

Stämme mit der Bezeichnung ,,ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Die genannten Stämme von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 und FERM BP-1542) sind in der US-A 5,250,434 beschrieben.

Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Hierzu gehören insbesondere L- Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L- Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L- Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L- Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin. Zu den L-Aminosäuren gehört ebenfalls das L- Homoserin .

Die erfindungsgemäßen Mutanten scheiden bevorzugt die genannten proteinogen Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan aus. Der Begriff Aminosäuren umfasst auch deren Salze wie beispielsweise das Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat im Falle der Aminosäure L-Lysin.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, das die Minsäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthalten ist. Der Austausch Glycin gegen L-Serin wird bevorzugt. Gegebenenfalls enthält die Aminosäuresequenz des Polypeptids darüberhinaus an der Position 8 einen Aminosäureaustausch L-Serin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, vorzugsweise L-Threonin.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, das an der Position 321 der

Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 entsprechenden Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin enthält, wobei das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion

(PCR) unter Verwendung eines Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 307 von SEQ ID NO : 3 oder SEQ ID NO: 11 und aus der komplementären

Nukleotidsequenz zwischen Position 2100 und 1850 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 ausgewählt werden. Beispiele für derartige geeignete Primerpaare sind in SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 und in SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20 dargestellt. Als Ausgangsmaterial (,,template"-DNA) wird chromosomale DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der Art Corynebacterium glutamicum.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, das eine Minsäuresequenz mit einer Länge entsprechend 514 L-Aminosäuren umfasst, wobei an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin, enthalten ist. Gegebenenfalls enthält die Aminosäuresequenz des Polypeptids darüberhinaus einen Aminosäureaustausch L-Serin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, vorzugsweise L-Threonin, an der Position 8.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, das an Position 312 bis 330 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 312 bis 330 von SEQ ID NO: 6 oder 8 enthält. Bevorzugt enthält die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 307 bis 335 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 292 bis

350 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 277 bis 365 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 262 bis 380 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 247 bis 395 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 232 bis 410 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 202 bis 440 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 172 bis 470 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 82 bis 500 von SEQ ID NO : 6 oder 8 oder Position 2 bis 512 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 2 bis 513 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 2 bis 514 von SEQ ID NO: 6 oder 8. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des kodierten Polypeptids 514 Aminosäuren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 beziehungsweise an der entsprechenden Position der Aminosäuresequenz jede Aminosäure ausgenommen Glycin enthält, wobei dem Austausch gegen L-Serin der Vorzug gegeben wird und dessen Aminosäuresequenz außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6. Ein Beispiel für eine Aminosäuresequenz, die mindestens 99% Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 besitzt, ist in SEQ ID NO: 8 und 10 gezeigt. Das Polypeptid dieser Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase besitzt zusätzlich zu dem Aminosäureaustausch an Position 321 den Aminosäureaustausch L-Serin gegen L-Threonin an der Position 8.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 beziehungsweise an der entsprechenden Position der

Aminosäuresequenz jede Aminosäure ausgenommen Glycin enthält, wobei dem Austausch gegen L-Serin der Vorzug gegeben wird und dessen Nukleotidsequenz außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5. Ein Beispiel für eine Nukleotidsequenz eines zwf-Allels, die mindestens 99% Identität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 besitzt, ist in SEQ ID NO:7 gezeigt. Die

Nukleotidsequenz dieses zwf-Allels besitzt zusätzlich zu dem Nukleotidaustausch Guanin gegen Adenin an Position 961 (Siehe SEQ ID NO: 5) den Nukleotidaustausch Thymin gegen Adenin an der Position 22 (Siehe SEQ ID NO: 7). Ein weiteres Beispiel für eine Nukleotidsequenz eines zwf-Allels, die mindestens 99% Identität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID N0:5 besitzt, ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses zwf-Allels besitzt zusätzlich zu dem Nukleotidaustausch Guanin gegen Adenin an Position 961 (Siehe SEQ ID NO: 5) und dem Nukleotidaustausch Thymin gegen Adenin an der Position 22 (Siehe SEQ ID NO: 7) die Nukleotidaustausche Cytosin gegen Thymin an Position 138, Cytosin gegen Thymin an Position 279, Thymin gegen Cytosin an Position 738, Cytosin gegen Thymin an Position 777 und Guanin gegen Adenin an Position 906 (Siehe SEQ ID NO: 9).

Es ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Dementsprechend kann das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthaltene zwf- Allel, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, zusätzlich zu der in SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO : 8 beziehungsweise SEQ ID NO: 10 gezeigten Aminosäuresequenz einen (1) oder mehrere konservative Aminosäureaustausch (e) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche .

Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.

Ein Beispiel für einen konservativen Aminosäureaustausch ist der Austausch Serin gegen Threonin an Position 8 von SEQ ID NO: 6, der zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 beziehungsweise SEQ ID NO: 10 führt.

Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung wurde durch Vergleich der Aminosäuresequenz mit dem Clustal-Programm (Thompson et al . , Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)) festgestellt, dass die Aminosäuresequenzen der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase verschiedener Bakterien wie bespielsweise Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coeliclor, Streptomyces avermitilis, Corynebacterium efficiens und Corynebacterium glutamicum ein Sequenzmotiv bestehend aus der Abfolge Val-Ile-Phe-Gly- AIi-Afa-Gly-Asp-Leu, ein Sequenzmotiv bestehend aus der Abfolge Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys oder auch ein Sequenzmotiv bestehend aus der Abfolge Arg-Trp-Ala-Gly-Val- Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg enthalten. Die Bezeichnung „Ali" steht für die Aminosäuren AIa oder VaI,

die Bezeichnung „Afa" für die Aminosäuren Lys oder Thr und die Bezeichnung „Bra" für die Aminosäuren He oder Leu.

Dementsprechend sind solche Mutanten coryneformer Bakterien bevorzugt, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe Val-Ile-Phe- Gly-Ali-Afa-Gly-Asp-Leu, Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys und Arg-Trp-Ala-Gly-Val-Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg umfasst und an Position 321 beziehungsweise der entsprechenden oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz jede Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin, enthält. Gegebenenfalls enthält die Aminosäuresequenz darüberhinaus einen Aminosäureaustausch L-Serin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, vorzugsweise L-Threonin, an der Position 8 gemäß SEQ ID NO: 2.

Das Aminosäuresequenzmotiv Val-Ile-Phe-Gly-Val-Thr-Gly-Asp- Leu ist beispielsweise in der SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 von Position 32 bis 40 enthalten. Das Aminosäuresequenzmotiv Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys ist beispielsweise in der SEQ ID NO: 6, 8 beziehungsweise 10 von Position 203 bis 210 enthalten. Das Aminosäuresequenzmotiv Arg-Trp-Ala-Gly-Val- Pro-Phe-Tyr-Leu-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg ist beispielsweise in der SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 von Position 354 bis 367 enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Mutanten coryneformer Bakterien, die ein zwf-Allel enthalten, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 beziehungsweise SEQ ID NO: 10 umfasst .

Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen, das endständige Methionin bei der Proteinsynthese entfernt wird.

Unter dem Begriff „einer zu Position 321 der Aminosäuresequenz entsprechenden Position" oder „einer zu Position 321 der Aminosäuresequenz vergleichbaren Position" versteht man die Tatsache, dass durch Insertion oder Deletion eines für eine Aminosäure kodierenden Kodons im N- terminalen Bereich (bezogen auf die Position 321 von SEQ ID NO: 6, 8 oder 10) des kodierten Polypeptids die

Positionsangabe und Längenangabe im Falle einer Insertion formal um eine Einheit erhöht oder im Falle einer Deletion um eine Einheit verringert wird. Beispielsweise rückt durch Deletion des für die Aminosäure L-Asparagin kodierenden AAC-Kodons an Position 4 von SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 das L- Serin von Position 321 an Position 320. Die Längenangabe wäre dann: 513 Aminosäuren. In gleicher Weise wird durch Insertion oder Deletion eines für eine Aminosäure kodierenden Kodons im C-terminalen Bereich (bezogen auf die Position 321) des kodierten Polypeptids die Längenangabe im Falle einer Insertion formal um eine Einheit erhöht oder im Falle einer Deletion um eine Einheit verringert. Derartige vergleichbare Positionen lassen sich durch Vergleich der Aminosäuresequenzen in Form eines „alignments" beispielsweise mit Hilfe des Clustal-Programmes leicht identifizieren .

Durch derartige Insertionen und Deletionen wird die enzymatische Aktivität im wesentlichen nicht berührt. „Im wesentlichen nicht berührt" bedeutet, dass sich die enzymatische Aktivität der genannten Varianten um maximal

10%, maximal 7,5%, maximal 5%, maximal 2,5% oder maximal 1% von der Aktivität des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 6 oder 8 beziehungsweise 10 unterscheidet.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend auch zwf- Allele, die für Polypeptid Varianten von SEQ ID NO: 6 oder 8

beziehungsweise 10 kodieren, die eine oder mehrere Insertion (en) oder Deletion (en) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren.

Die Sequenzmotive Val-Ile-Phe-Gly-Ali-Afa-Gly-Asp-Leu, und Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys und Arg-Trp-Ala-Gly-Val- Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg werden durch derartige Insertionen/Deletionen vorzugsweise nicht zerrissen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mutanten können klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer Bakterien unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N' -Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) , Ethylmethansulfonat (EMS) , 5-Bromuracil, oder ultraviolettes Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im Manual of Methods for General

Bacteriology (Gerhard et al . (Eds . ) , American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978) ) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben. Typische Mutagenesen unter

Verwendung von MNNG umfassen Konzentrationen von 50 bis 500 mg/1 oder auch höhere Konzentrationen bis zu maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1 bis 30 Minuten bei einem pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen wird die Zahl der lebensfähigen Zellen um einen Anteil von ca. 50% bis 90% oder ca. 50% bis 99% oder ca. 50% bis 99,9% oder mehr reduziert .

Aus der mutagenisierten Zellpopulation werden Mutanten beziehungsweise Zellen entnommen und vermehrt. Vorzugsweise wird in einem weiteren Schritt deren Fähigkeit untersucht, in einer Satzkultur (batch) unter Verwendung eines geeigneten Nährmediums Aminosäuren, bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, auszuscheiden. Geeignete Nährmedien und Testbedingungen sind unter anderem in der US 6,221,636, in der US 5,840,551, in der US 5,770,409, in der US 5,605,818,

in der US 5,275,940 und in der US 4,224,409 beschrieben. Bei Verwendungen von geeigneten Roboteranlagen, wie beispielsweise bei Zimmermann et al . (VDI Berichte Nr. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Deutschland 2004, 439-443) oder Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005) ) beschrieben, können zahlreiche Mutanten in kurzer Zeit untersucht werden. Auf diese Weise werden Mutanten identifiziert, die im Vergleich zum Elternstamm beziehungsweise nicht mutagenisierten Ausgangsstamm vermehrt Aminosäuren in das Nährmedium oder in das

Zellinnere ausscheiden. Dazu gehören beispielsweise solche Mutanten, deren Aminosäuresekretion um mindestens 0,5% erhöht ist.

Anschließend wird aus den Mutanten DNA bereitgestellt, beziehungsweise isoliert und mit Hilfe der Polymerase-

Kettenreaktion unter Verwendung von Primerpaaren, die die Amplifizierung des zwf-Gens beziehungsweise des erfindungsgemäßen zwf-Allels oder der erfindungsgemäßen Mutation an Position 321 erlauben, das entsprechende Polynukleotid synthetisiert. Vorzugsweise wird die DNA aus solchen Mutanten isoliert, die in erhöhter Weise Aminosäuren ausscheiden.

Hierzu können beliebige Primerpaare aus der stromaufwärts und stromabwärts der erfindungsgemäßen Mutation gelegenen Nukleotidsequenz und der dazu komplementären

Nukleotidsequenz ausgewählt werden. Ein Primer eines Primerpaares umfasst hierbei bevorzugt mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 1267 von SEQ ID NO : 3 oder SEQ ID NO: 11. Der dazugehörige zweite Primer eines Primerpaares umfasst mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz von Position 2100 und 1271

von SEQ ID NO : 3 oder SEQ ID NO: 11. Ist die Amplifikation der Kodierregion gewünscht, so wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 307 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 2100 und 1850 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 ausgewählt. Ist die Amplifikation eines Teils der Kodierregion, wie beispielsweise in SEQ ID NO: 14 und 15 dargestellt, erwünscht, so wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 309 und 1267 von SEQ ID NO : 3 oder SEQ ID NO: 11 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1848 und 1271 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 ausgewählt. Geeignete Primerpaare sind beispielsweise das unter SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 wiedergegebene Primerpaar zwf-Kl und zwf-K2 oder das unter SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20 wiedergegebene Primerpaar zwf-Ll und zwf-L2. Der Primer kann überdies mit Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, mit einer Biotin- Gruppe oder weiteren Accessoirs, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, ausgerüstet sein. Die Gesamtlänge des Primers beträgt im Allgemeinen maximal 30, 40, 50 oder 60 Nukleotide.

Für die Herstellung von Polynukleotiden durch Amplifikation ausgewählter Sequenzen, wie dem erfindungsgemäßen zwf- Allel, aus vorgelegter, beispielsweise chromosomaler DNA

(„template DNA") durch Amplifikation mittels PCR, werden im Allgemeinen thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt. Beispiele derartiger DNA-Polymerasen sind die Taq- Polymerase aus Thermus aquaticus, die unter anderem von der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) vertrieben wird, die Vent-Polymerase aus Thermococcus litoralis, die unter anderem von der Firma New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) vertrieben wird oder die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, die unter anderem von der Firma Stratagene (La Jolla, USA) vertrieben wird. Bevorzugt werden Polymerasen mit ,,proof-reading"-Aktivität . „proof-

reading"-Aktivität bedeutet, dass diese Polymerasen in der Lage sind, fehlerhaft eingebaute Nukleotide zu erkennen und den Fehler durch erneute Polymerisation zu beheben (Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland (1998) ) . Beispiele für Polymerasen mit „proof-reading"-Aktivität sind die Vent- Polymerase und die Pfu-Polymerase .

Die Bedingungen im Reaktionsansatz werden nach Angaben des Herstellers eingestellt. Die Polymerasen werden vom Hersteller im Allgemeinen zusammen mit dem gebräuchlichen

Puffer geliefert, welcher üblicherweise Konzentrationen von 10 - 100 rtiM Tris/HCl und 6 - 55 rtiM KCl bei pH 7,5 - 9,3 aufweist. Magnesiumchlorid wird in einer Konzentration von 0,5 - 10 rtiM zugesetzt, falls es nicht in dem vom Hersteller gelieferten Puffer enthalten ist. Dem Reaktionsansatz werden weiterhin Desoxynucleosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,1 - 16,6 rtiM zugesetzt. Die Primer werden im Reaktionsansatz mit einer Endkonzentration von 0,1 - 3 μM vorgelegt und die Template-DNA im optimalen Fall mit 10 ² bis 10 ⁵ Kopien. Es können auch 10 ⁶ bis 10 ⁷ Kopien eingesetzt werden. Die entsprechende Polymerase wird dem Reaktionsansatz in einer Menge von 2-5 Units zugegeben. Ein typischer Reaktionsansatz hat ein Volumen von 20 - 100 μl .

Als weitere Zusätze können der Reaktion Rinderserumalbumin, Tween-20, Gelatin, Glycerin, Formamid oder DMSO beigesetzt werden (Dieffenbach und Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995) .

Ein typischer PCR-Verlauf besteht aus drei unterschiedlichen, sich aufeinanderfolgend wiederholenden Temperaturstufen. Vorab wird die Reaktion mit einer

Temperaturerhöhung auf 92 ⁰ C - 98 ⁰ C für 4 bis 10 Minuten gestartet, um die vorgelegte DNA zu denaturieren. Dann folgen sich wiederholend zuerst ein Schritt zur Denaturierung der vorgelegten DNA von 10 - 60 Sekunden bei ungefähr 92-98 ⁰ C, dann ein Schritt zum Binden der Primer an

die vorgelegte DNA von 10 - 60 Sekunden bei einer bestimmten, von den Primern abhängigen Temperatur („Annealing-Temperatur") , die erfahrungsgemäß bei 5O ⁰ C bis 6O ⁰ C liegt und sich für jedes Primerpaar einzeln berechnen läßt. Genaue Informationen dazu findet der Fachmann bei

Rychlik et al . (Nucleic Acids Research 18 (21) : 6409-6412) . Anschließend folgt ein Synthese-Schritt zur Verlängerung der vorgelegten Primer („Extension") bei dem jeweils für die Polymerase angegebenen Aktivitätsoptimum, üblicherweise je nach Polymerase im Bereich von 73 ⁰ C bis 67 ⁰ C bevorzugt 72 ⁰ C bis 68 ⁰ C. Die Dauer dieses Extensionschrittes hängt von der Leistungsfähigkeit der Polymerase und Länge des zu amplifizierenden PCR-Produktes ab. In einer typischen PCR dauert dieser Schritt 0,5 - 8 Minuten, bevorzugt 2 - 4 Minuten. Diese drei Schritte werden 30 bis 35 mal, gegebenenfalls bis zu 50 mal wiederholt. Ein abschließender „Extension"-Schritt von 4 - 10 Minuten beendet die Reaktion. Die auf diese Weise hergestellten Polynukleotide werden auch als Amplifikate bezeichnet; der Begriff Nukleinsäurefragment ist ebenfalls gebräuchlich.

Weitere Anleitungen und Informationen zur PCR findet der Fachmann beispielsweise im Handbuch „PCR-Strategies" (Innis, Feifand und Sninsky, Academic Press , Inc., 1995), im Handbuch von Diefenbach und Dveksler „PCR Primer - a laboratory manual" (CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1995), im Handbuch von Gait „Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham „PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) .

Die Nukleotidsequenz wird anschließend beispielsweise nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et al . (Proceedings of the National Academies of Sciences, U. S.A., 74, 5463- 5467 (1977)) mit den von Zimmermann et al . (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990) ) angegebenen Modifikationen bestimmt und das von dieser Nukleotidsequenz kodierte

Polypeptid insbesondere bezüglich der Aminosäuresequenz analysiert. Dazu wird die Nukleotidsequenz in ein Programm zur Übersetzung von DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz eingegeben. Geeignete Programme sind beispielsweise das Programm „Patentin", das bei Patentämtern, beispielsweise dem US-Patentamt (USPTO) erhältlich ist, oder das „Translate Tool", das auf dem ExPASy Proteomics Server im World Wide Web (Gasteiger et al . , Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)) verfügbar ist.

Auf diese Weise werden Mutanten identifiziert, deren zwf-

Allele für Polypeptide mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodieren, welche an Position 321 der Aminosäuresequenz, beziehungsweise der entsprechenden oder vergleichbaren Position, jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthalten. Bevorzugt wird der Austausch gegen L-Serin. Gegebenenfalls enthält die Aminosäuresequenz darüberhinaus einen Aminosäureaustausch L-Serin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, vorzugsweise L-Threonin, an der Position 8 beziehungsweise an der entsprechenden oder vergleichbaren Position.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend eine Mutante eines coryneformen Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch folgende Schritte erhältlich ist:

a) Behandlung eines coryneformen Bakteriums, das die Fähigkeit besitzt Aminosäuren auszuscheiden, mit einem mutagenen Agenz,

b) Isolierung und Vermehrung der in a) erzeugten Mutante,

c) vorzugsweise Bestimmung der Fähigkeit der Mutante in einem Medium mindestens 0,5% mehr Aminosäure auszuscheiden oder im Zellinneren anzureichern als das in a) eingesetzte coryneforme Bakterium,

d) Bereitstellung von Nukleinsäure aus der in b) erhaltenen Mutante,

e) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls/ Amplifikates/ Nukleinsäurefragments unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, der Nukleinsäure aus d) , und eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 1267 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 und einem zweitem Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 2100 und 1271 von SEQ ID NO: 3 oder 11.

f) Bestimmung der Nukleotidsequenz des in e) erhaltenen Nukleinsäuremoleküls, und Bestimmung der kodierten Aminosäuresequenz ,

g) gegebenfalls Vergleich der in f) bestimmten

Aminosäuresesequenz mit SEQ ID NO: 6, 8 oder 10, und

h) Identifizierung einer Mutante, die ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid kodiert, welches an Position 321 oder an vergleichbarer Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin, und welche gegebenenfalls an Position 8 oder an vergleichbarer Position jede proteinogene

Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Threonin, enthält .

Die auf diese Weise erzeugten Mutanten enthalten typischerweise eine (1) Kopie des beschriebenen zwf Allels.

In der SEQ ID NO: 5, 7 und 9 sind beispielhaft die

Kodierregionen von zwf-Allelen erfindungsgemäßer Mutanten wiedergegeben. Die Kodierregion des Wildtypgens ist als SEQ ID NO :1 wiedergegeben. SEQ ID NO :1 enthält an Position 961

die Nukleobase Guanin, an Position 962 die Nukleobase Guanin und an Position 963 die Nukleobase Cytosin. SEQ ID NO : 1 enthält an Position 961 bis 963 das für die Aminosäure Glycin kodierende GGC Kodon. SEQ ID NO: 5 enthält an Position 961 die Nukleobase Adenin. Durch diese Guanin

Adenin Transition entsteht an Position 961 bis 963 das für die Aminosäure L-Serin kodierende AGC Kodon.

SEQ ID NO :1 enthält an Position 22 die Nukleobase Thymin, an Position 23 die Nukleobase Cytosin und an Position 24 die Nukleobase Cytosin. SEQ ID NO :1 enthält dementsprechend an Position 22 bis 24 das für die Aminosäure Serin kodierende TCC Kodon. SEQ ID NO: 7 enthält an Position 22 die Nukleobase Adenin. Durch diese Thymin-Adenin Transversion entsteht an Position 22 bis 24 das für die Aminosäure L-Serin kodierende AGC Kodon.

Darüber hinaus können die in SEQ ID NO: 5 und 7 dargestellten Nukleotidsequenzen weitere Basenaustausche enthalten, die sich durch die Mutagenesebehandlung ergeben haben, sich jedoch nicht in einer veränderten Aminosäuresequenz äußern. Derartige Mutationen werden in der Fachwelt auch als stille oder neutrale Mutationen bezeichnet. Diese stillen Mutationen können ebenfalls in dem für Mutagenesebehandlung eingesetzten coryneformen Bakterium bereits enthalten sein. Beispiele für derartige stille Mutationen sind die Cytosin-Thymin Transition an Position 138, die Cytosin-Thymin Transition an Position 279, die Thymin-Cytosin Transition an Position 738, die Cytosin-Thymin Transition an Position 777 und die Guanin- Adenin Transition an Position 906 wie in SEQ ID NO: 9 dargestellt.

Die für die Mutagenese verwendeten coryneformen Bakterien besitzen bevorzugt bereits die Fähigkeit, die gewünschte Aminosäure in das sie umgebende Nährmedium beziehungsweise Fermentationsbrühe auszuscheiden oder im Zellinneren anzureichern.

L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Aspartatkinase. Unter „feed back" resistenten Aspartatkinasen versteht man Aspartatkinasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere

Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC

(Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als lysC ^FBR -Allele bezeichnet. Im Stand der Technik (Tabelle 1) sind zahlreiche lysC ^FBR -Allele beschrieben, die für Aspartatkinase-Varianten kodieren, welche Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtypprotein besitzen. Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von

Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO: 21 und das von diesem Gen kodierte Protein in SEQ ID NO: 22 dargestellt.

Tabelle 1 lysC -Allele kodierend für feed back resistente

Aspartatkinasen

L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise einen oder mehrere der in Tabelle 1 aufgelisteten Aminosäureaustausche .

Bevorzugt werden folgende lysC ^FBR -Allele : lysC A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Threonin) , lysC A279V (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen

Valin) , lysC S301F (Austausch von Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Phenylalanin) , lysC T308I (Austausch von Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Isoleucin) , lysC S301Y (Austausch von Serin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Tyrosin) , lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Asparaginsäure) , lysC R320G (Austausch von Arginin an Position 320 des kodierten

Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Glycin), lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Isoleucin) , lysC S381F (Austausch von Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Phenylalanin) und lysC S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Alanin) .

Besonders bevorzugt werden das lysC ^FBR -Allel lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten

Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Isoleucin) und ein lysC ^FBR -Allel enthaltend mindestens einen Austausch ausgewählt aus der Gruppe A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Threonin) und S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 22 gegen Alanin) .

Das lysC ^FBR -Allel lysC T311I ist in dem bei der DSMZ hinterlegten Stamm DM1797 enthalten. DM1797 ist eine Mutante von Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

Nach der oben beschriebenen Art und Weise wurde, ausgehend von Stamm DM1797, eine als DM1816 bezeichnete Mutante isoliert, die ein zwf-Allel enthält, das für ein Polypeptid kodiert, bei dem an Position 321 der Aminosäuresequenz L- Serin enthalten ist. Die Nukleotidsequenz der Kodierregion

des zwf-Allels der Mutante DM1816 ist als SEQ ID NO: 9 und die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids als SEQ ID NO: 10 beziehungsweise 12 dargestellt. Die Mutante DM1816 enthält darüber hinaus Nukleotidaustausche in der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 307 von SEQ ID NO: 3. Diese Nukleotidaustausche sind in SEQ ID NO: 11 dargestellt. SEQ ID NO: 11 enthält an Position 208 Guanin anstelle Adenin, an Position 235 Adenin anstelle Guanin, an Position 245 Cytosin anstelle Thymin, an Position 257 Guanin anstelle Adenin und an Position 299 Guanin anstelle Adenin. SEQ ID NO: 11 enthält weiterhin an Position 329 Adenin anstelle Thymin, an Position 445 Thymin anstelle Cytosin, an Position 586 Thymin anstelle Cytosin, an Position 1045 Cytosin anstelle Thymin, an Position 1084 Thymin anstelle Cytosin, an Position 1213 Adenin anstelle Guanin und an Position 1268 Adenin anstelle Guanin.

Darüberhinaus können L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien verwendet werden, die eine abgeschwächte Homoserin-Dehydrogenase oder Homoserinkinase aufweisen oder andere Eigenschaften besitzen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.

L-Tryptophan produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Anthranilatsynthase . Unter „feed back" resistenter Anthranilatsynthase versteht man

Anthranilatsynthasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung (5 bis 10%, 10% bis 15% oder 10% bis 20%) durch Tryptophan oder 5- Fluorotryptophan (Matsui et al . , Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 - 5332(1987)) oder ähnliche Analoga aufweisen. Die für diese desensibilisierten Anthranilatsynthasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als trpE ^FBR -Allele bezeichnet. Beispiele für derartige Mutanten beziehungsweise Allele sind beispielsweise in der US 6180373 und EP0338474 beschrieben.

Die erhaltenen Mutanten zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess .

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 beziehungsweise an einer entsprechenden oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthält, wobei der Austausch gegen L-Serin bevorzugt ist.

Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann aus einer erfindungsgemäßen Mutante isoliert werden.

Weiterhin können für die Mutagenese des zwf-Gens in-vitro Methoden eingesetzt werden. Bei der Verwendung von in-vitro Methoden werden isolierte Polynukleotide, welche ein zwf- Gen eines coryneformen Bakteriums, vorzugsweise das im Stand der Technik beschriebene Wildtyp-Gen von Corynebacterium glutamicum, enthalten, einer mutagenen Behandlung unterzogen.

Bei den isolierten Polynukleotiden kann es sich beispielsweise um isolierte Gesamt-DNA beziehungsweise chromosomale DNA oder auch um Amplifikate des zwf-Gens handeln, die mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt wurden. Derartige Amplifikate werden auch als PCR-Produkte bezeichnet. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) . Es ist ebenfalls möglich, das zu mutagenisierende zwf-Gen zunächst in einen Vektor, beispielsweise in einen Bakteriophagen oder in ein Plasmid einzubauen.

Geeignete Methoden für die in-vitro Mutagenese sind unter anderem die Behandlung mit Hydroxylamin nach Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics . A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, 1992), die Verwendung mutagener Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 und R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995) ) und der Einsatz einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase, die eine hohe Fehlerquote aufweist. Eine derartige DNA-Polymerase ist beispielsweise die Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, Nr.600550) der Firma Stratagene (LaJoIIa, CA, USA).

Weitere Anleitungen und Übersichten zur Erzeugung von Mutationen in-vivo oder in-vitro können dem Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,

Stuttgart, Deutschland, 1995) , dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei an Position 321 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthalten ist. Bevorzugt wird der Austausch gegen L-Serin. Gegebenenfalls enthält die Aminosäuresequenz des Polypeptids darüberhinaus einen Aminosäureaustausch L-Serin gegen eine andere Aminosäure, vorzugsweise L-Threonin, an Position 8.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von 514 Aminoäuren umfasst und wobei an Position 321 jede proteinogene L- Aminosäure ausgenommen Glycin, vorzugsweise L-Serin, enthalten ist.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches von Position 312 bis 330 der Aminosäuresquenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 312 bis 330 von SEQ ID NO : 6 oder 8 enthält. Bevorzugt enthält die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 307 bis 335 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 292 bis 350 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 277 bis 365 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 262 bis 380 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 247 bis 395 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 232 bis 410 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 202 bis 440 von SEQ ID NO : 6 oder 8 oder Position 172 bis 470 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 82 bis 500 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 2 bis 512 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 2 bis 513 von SEQ ID NO: 6 oder 8 oder Position 2 bis 514 von SEQ ID NO: 6 oder 8. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des kodierten Polypeptids 514 Aminosäuren .

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 der Aminosäuresequenz beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L- Serin, enthält und das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids

identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 307 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 2100 und 1850 von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 ausgewählt werden. Beispiele für derartige geeignete Primerpaare sind in SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 und in SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20 dargestellt. Als Ausgangsmaterial (,,template"-DNA) wird chromosomale DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der Art Corynebacterium glutamicum.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das mit der zu SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Polypeptid mit

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 der Aminosäuresequenz beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin, und gegebenenfalls an einer der Position 8 entsprechenden Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Threonin, enthält.

Anleitungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al . (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255- 260 (1991) ) . Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride

gebildet, bei denen die Sonde d.h. ein Polynukleotid umfassend die zu SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 komplementäre Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten beziehungsweise identifizierten Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) .

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 5O ⁰ C - 68 ⁰ C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 90% Identität zur Nukleotidequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 5O ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 52 ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 54 ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 56 ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 58 ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 6O ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 62 ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 64 ⁰ C - 68 ⁰ C, ca. 66 ⁰ C - 68 ⁰ C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64 ⁰ C - 68 ⁰ C oder ca. 66 ⁰ C - 68 ⁰ C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2x SSC oder 0,Ix SSC zu senken. Gegebenenfalls enthält der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2 ⁰ C von 5O ⁰ C auf 68 ⁰ C können

Polynukleotidfragmente isoliert werden, die mindestens 90%

oder mindestens 91%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz beziehungsweise komplementären Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen und für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodieren, welches den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch enthält. Die Nukleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen Polynukleotids wird mit bekannten Methoden bestimmt. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558). Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen kodieren für Polypeptide mit Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase Enzymaktivität, die mindestens 90% bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch sind mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 und den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz jede Aminosäure ausgenommen Glycin enthält, wobei dem Austausch gegen L-Serin der Vorzug gegeben wird und das eine Aminosäuresequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6. Ein Beispiel für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu

mindestens 99% identisch ist mit der von SEQ ID NO: 6, ist in SEQ ID NO : 8 und SEQ ID NO: 10 gezeigt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position 321 beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz jede Aminosäure ausgenommen Glycin enthält, wobei dem Austausch gegen L-Serin der Vorzug gegeben wird und das eine Nukleotidsequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5. Ein Beispiel für ein Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, und eine Nukleotidsequenz besitzt, die mindestens 99% identisch ist mit der von SEQ ID NO: 5, ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses zwf-Allels besitzt zusätzlich zu dem Nukleotidaustausch Guanin gegen Adenin an Position 961 (siehe SEQ ID NO: 5) den Nukleotidaustausch Thymin gegen Adenin an der Position 22 (siehe SEQ ID NO: 7) . Ein weiteres Beispiel für eine Nukleotidsequenz eines zwf- Allels, die mindestens 99% Identität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 besitzt, ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses zwf-Allels besitzt zusätzlich zu dem Nukleotidaustausch Guanin gegen Adenin an Position 961 (siehe SEQ ID NO: 5) und dem Nukleotidaustausch Thymin gegen Adenin an der Position 22 (siehe SEQ ID NO: 7) die Nukleotidaustausche Cytosin gegen Thymin an Position 138, Cytosin gegen Thymin an Position 279, Thymin gegen Cytosin an Position 738, Cytosin gegen Thymin an Position 777 und Guanin gegen Adenin an Position 906 (siehe SEQ ID NO: 9).

Darüberhinaus sind solche isolierte Polynukleotide bevorzugt, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Enzymaktivität kodieren, welches an Position 321 der Aminosäuresequenz beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position jede Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin, enthält, und die mindestens ein Sequenzmotiv beziehungsweise eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe Val-Ile-Phe- Gly-Ali-Afa- Gly-Asp-Leu, Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys, und Arg-Trp-Ala-Gly-Val-Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg enthalten.

Die Bezeichnung „Ali" steht für die Aminosäuren AIa oder VaI, die Bezeichnung „Afa" für die Aminosäuren Lys oder Thr und die Bezeichnung „Bra" für die Aminosäuren He oder Leu.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10 umfasst. Gegebenenfalls enthält das kodierte Polypeptid einen (1) oder mehrere konservative Aminosäuraustausch (e) . Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid mit Glucose-6-

Phosphat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10 einschließlich einer Verlängerung am N- oder C-Terminus um mindestens eine (1) Aminosäure umfasst. Diese Verlängerung beträgt nicht mehr als 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 oder 2 Aminosäuren beziehungsweise Aminosäurereste.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch zwf-Allele, die für Polypeptid Varianten von SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 kodieren, die eine oder mehrere Insertionen oder Deletionen

enthalten. Bevorzugt enthalten diese maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren. Das Sequenzmotive Val-Ile-Phe-Gly-Ali-Afa- Gly-Asp-Leu und/oder Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys und/oder Arg-Trp-Ala-Gly-Val-Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly- Lys-Arg wird durch derartige Insertionen/Deletionen vorzugsweise nicht zerrissen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9 oder 11 umfasst.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 307 von SEQ ID NO: 11, bevorzugt die Nukleotidsequenz zwischen Position 198 und 304 von SEQ ID NO: 11 und ganz besonders bevorzugt die Nukleotidsequenz zwischen Position 208 und 299 von SEQ ID NO: 11 umfasst.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein isoliertes Polynukleotid enthaltend das zwf-Allel der Mutante DM1816.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein isoliertes Polynukleotid, das einen Teil der Kodierregion eines erfindungsgemäßen zwf-Allels umfasst, wobei das isolierte Polynukleotid in jedem Fall den Teil der Kodierregion umfasst, der den Aminosäureaustausch an der Position 321 der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids enthält.

Insbesondere ist ein Nukleinsäure-Molekül beziehungsweise DNA-Fragment umfasst, das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 307 bis 335 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 292 bis 350 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 277 bis 365 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 262 bis 380 von SEQ ID NO : 2 , oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz

entsprechend Position 247 bis 395 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 232 bis 410 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 202 bis 440 von SEQ ID NO : 2 kodiert, oder das für mindestens eine

Aminosäuresequenz entsprechend Position 172 bis 470 von SEQ ID NO : 2 kodiert, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 82 bis 500 von SEQ ID NO : 2 kodiert, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 2 bis 512 von SEQ ID NO : 2 kodiert, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 2 bis 513 von SEQ ID NO : 2 kodiert, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 2 bis 514 von SEQ ID NO : 2 kodiert beziehungsweise ein entsprechendes

Leseraster beinhaltet, wobei an der Position entsprechend 321 von SEQ ID NO: 2 jede proteinogene Aminsäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin, enthalten ist und wobei gegebenenfalls an der Position entsprechend 8 jede proteinogene Aminosäure außer L-Serin, bevorzugt L- Threonin, enthalten ist.

Ein Beispiel eines erfindungsgemäßen Leserasters umfassend ein Polynukleotid, das für mindestens die Aminosäuresequenz von Position 307 bis 335 entsprechend SEQ ID NO: 2 kodiert, wobei an der Position entsprechend 321 der

Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure (Xaa) ausgenommen Glycin enthalten ist, ist nachfolgend aufgeführt :

gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag Asp Lys Thr Ser AIa Arg GIy GIn Tyr AIa AIa GIy Trp GIn 307 310 315 320 nnn tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac Xaa Ser GIu Leu VaI Lys GIy Leu Arg GIu GIu Asp GIy Phe Asn

325 330 335

Es ist ebenfalls als SEQ ID NO: 13 dargestellt. Die von diesem Leseraster kodierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID

NO: 14 dargestellt. Die Position 15 in SEQ ID NO: 14 entspricht der Position 321 von SEQ ID NO: 6, 8, 10 oder 12.

Bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 307 bis 335 von SEQ ID NO : 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 292 bis 350 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 277 bis 365 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 262 bis 380 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 247 bis 395 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 232 bis 410 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 202 bis 440 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 172 bis 470 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 82 bis 500 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 2 bis 512 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend

Position 2 bis 513 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10, oder mindestens entsprechend Position 2 bis 514 von SEQ ID NO: 6 oder 8 beziehungsweise 10 kodieren.

Ein Beispiel eines erfindungsgemäßen Leserasters umfassend ein Polynukleotid, das für mindestens die Aminosäuresequenz entprechend Position 307 bis 335 von SEQ ID NO: 6 kodiert, ist nachfolgend aufgeführt: gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag

Asp Lys Thr Ser AIa Arg GIy GIn Tyr AIa AIa GIy Trp GIn 307 310 315 320 agc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac

Ser Ser GIu Leu VaI Lys GIy Leu Arg GIu GIu Asp GIy Phe Asn

325 330 335

Das Leseraster ist ebenfalls als SEQ ID NO: 15 dargestellt. SEQ ID NO: 16 zeigt die von diesem Leseraster kodierte

Aminosäuresequenz . Die Position 15 in SEQ ID NO: 16 entspricht der Position 321 von SEQ ID NO: 6, 8, 10 oder 12.

Ganz besonders bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 919 bis 1005 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine

Nukleotidsequenz entsprechend Position 874 bis 1050 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 829 bis 1095 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 784 bis 1140 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 739 bis 1185 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 694 bis 1230 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 604 bis 1320 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 514 bis 1410 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 244 bis 1500 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 4 bis 1536 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 4 bis 1539 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 4 bis 1542 von SEQ ID NO: 5, 7 oder 9, umfassen.

Die erfindungsgemäßen Leseraster, wie sie beispielhaft in SEQ ID NO: 13 und 15 als Nukleotidsequenz und in SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 16 in Form der kodierten Aminosäuresequenz gezeigt sind, können darüberhinaus eine oder mehrere Mutationen enthalten, die zu einem oder mehreren konservativen Aminosäureaustauschen führen.

Bevorzugt führen die Mutationen zu maximal 4%, zu maximal 2% oder zu maximal 1% konservativen Aminosäureaustauschen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Leseraster eine oder mehrere stille Mutationen enthalten. Bevorzugt enthalten

die erfindungsgemäßen Leseraster höchstens 4% und besonders bevorzugt höchstens 2% bis höchstens 1% stille Mutationen.

Die erfindungsgemäßen, isolierten Polynukleotide können dazu verwendet werden, um rekombinante Stämme von Mikroorganismen herzustellen, die im Vergleich zum

Ausgangs- beziehungsweise Elternstamm in verbesserter Weise Aminosäuren in das sie umgebende Medium abgeben oder im Zellinneren anhäufen.

Eine verbreitete Methode zum Einbau von Mutationen in Gene coryneformer Bakterien ist die des Allelaustausches, die auch unter der Bezeichnung „gene replacement" bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende Mutation enthält, in den gewünschten Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross over"-Ereignisse in das Chromosom des gewünschten Stammes inkorporiert beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht.

Von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) wurde diese Methode verwendet um ein lysA-Allel, welches eine Deletion trug, und um ein lysA-Allel, welches eine Insertion trug in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens einzubauen. Von Schäfer et al . (Gene 145, 69-73 (1994)) wurde diese Methode eingesetzt um eine Deletion in das hom-thrB Operon von C. glutamicum einzubauen. Von Nakagawa et al . (EP 1108790) und Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) wurde diese Methode eingesetzt um verschiedene Mutationen ausgehend von den isolierten Allelen in das Chromosom von C. glutamicum einzubauen. Auf diese Weise gelang es Nakagawa et al . eine als Val59Ala bezeichnete Mutation in das Homoserin-Dehydrogenase Gen (hom) , eine als Thr311Ile bezeichnete Mutation in das Aspartatkinase-Gen (lysC bzw. ask) , eine als Pro458Ser bezeichnete Mutation in

das Pyruvat-Carboxylase-Gen (pyc) und eine als Ala213Thr bezeichnete Mutation in das Glucose-6-phoshat-Dehydrogenase Gen (zwf) von C. glutamicum Stämmen einzubauen.

Für ein erfindungsgemäßes Verfahren kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid verwendet werden, welches die gesamte Kodierregion umfasst, wie beispielsweise in SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 gezeigt, oder welches einen Teil der Kodierregion umfasst, wie beispielsweise die Nukleotidsequenz, die für mindestens die Aminosäuresequenz entsprechend Position 307 bis 335 von SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 kodiert und die als SEQ ID NO: 13 und 15 dargestellt sind. Der Teil der Kodierregion entsprechend SEQ ID NO: 13 und 15 hat eine Länge von ≥ 87 Nukleobasen. Bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion, deren Länge ≥ 267 Nukleobasen beträgt, wie beispielsweise

Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position von 277 bis 365 von SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 kodieren. Ganz besonders bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion, deren Länge ≥ 357 Nukleobasen beträgt, wie beispielsweise

Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position von 262 bis 380 von SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 kodieren.

Das DNA-Fragment enthaltend die interessierende Mutation liegt bei dieser Methode typischerweise in einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, vor, das vorzugsweise von dem mit der Mutation zu versehenden Stamm nicht oder nur begrenzt repliziert wird. Als Hilfs- oder Zwischenwirt, in dem der Vektor replizierbar ist, wird im Allgemeinen ein Bakterium der Gattung Escherichia bevorzugt der Spezies Escherichia coli verwendet.

Beispiele für derartige Plasmidvektoren sind die von Schäfer et al . (Gene 145, 69-73 (1994)) beschriebenen pK*mob und pK*mobsacB Vektoren, wie beispielsweise pKlδmobsacB, und die in der WO 02/070685 und WO 03/014362

beschriebenen Vektoren. Diese sind in Escherichia coli aber nicht in coryneformen Bakterien replikativ. Besonders geeignet sind Vektoren, die ein konditional negativ dominant wirkendes Gen wie beispielsweise das sacB-Gen (Levansucrase-Gen) von beispielsweise Bacillus oder das galK-Gen (Galaktosekinase-Gen) von beispielsweise Escherichia coli enthalten. (Unter einem konditional negativ dominant wirkenden Gen versteht man ein Gen, das unter bestimmten Bedingungen nachteilig beispielsweise toxisch für den Wirt ist, unter anderen Bedingungen aber keine negativen Auswirkungen auf den das Gen tragenden Wirt hat.) Diese ermöglichen die Selektion auf Rekombinationsereignisse, bei denen der Vektor aus dem Chromosom eliminiert wird. Weiterhin wurde von Nakamura et al . (US-A-6, 303, 383) ein Temperatur-sensitives Plasmid für coryneforme Bakterien beschrieben, das lediglich bei Temperaturen unterhalb von 31 ⁰ C replizieren kann.

Der Vektor wird anschließend durch Konjugation beispielsweise nach der Methode von Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) oder Transformation beispielsweise nach der Methode von Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) oder der Methode von Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) in das coryneforme Bakterium überführt. Gegebenenfalls kann die Überführung der DNA auch durch Partikelbeschuss erzielt werden.

Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"- Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation und erhält ein rekombinantes Bakterium.

Zur Identifizierung und Charakterisierung der erhaltenen Stämme können unter anderem die Methoden der Southern Blotting Hybridisierung, der Polymerase-Kettenreaktion, der

Sequenzbestimmung, die Methode des „Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) (Lay et al . Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) oder Methoden der Enzymologie eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines coryneformen Bakteriums, bei dem man

a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid in ein coryneformes Bakterium überführt,

b) das im Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhandene Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Gen, das für eine Aminosäuresequenz mit Glycin an Position 321 oder an einer vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz kodiert, gegen das Polynukleotid aus a) austauscht, das für eine

Aminosäuresequenz kodiert, die an der Position 321 oder an einer vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz eine andere L-Aminosäure, vorzugsweise L-Serin, und gegebenenfalls an Position 8 oder an einer vergleichbaren Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt die Aminosäure L-Threonin, besitzt, und

c) das gemäß Schritt a) und b) erhaltene coryneforme Bakterium vermehrt.

Auf diese Weise erhält man ein rekombinantes coryneformes Bakterium, welches anstelle des Wildtyp zwf-Gens ein (1) erfindungsgemäßes zwf-Allel enthält.

Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus besteht darin, dass man

a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

Enzymaktivität kodiert, in einen Mikrorganismus überführt,

b) das Polynukleotid in dem Mikroorganismus repliziert, und

c) den gemäß Schritt a) und b) erhaltenen Mikroorganismus vermehrt.

Auf diese Weise erhält man einen rekombinanten Mikroorganismus, welcher mindestens eine (1) Kopie oder mehrere Kopien eines erfindungsgemäßen Polynukleotids enthält, das für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die an Position 321 oder einer vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids, jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthält, wobei der Austausch gegen L-Serin bevorzugt wird. Gegebenenfalls enthält das Polypeptid an Position 8 oder einer vergleichbaren Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt die Aminosäure L-Threonin.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind dementsprechend Wirte beziehungsweise Wirtszellen, bevorzugt Mikroorganismen, besonders bevorzugt coryneforme Bakterien und Bakterien der Gattung Escherichia, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten. Gegenstand der Erfindung sind gleichfalls Mikrorganismen, die unter Verwendung der isolierten Polynukleotide hergestellt wurden. Derartige Mikroorganismen oder Bakterien werden auch als rekombinante Mikroorganismen oder rekombinante Bakterien bezeichnet. In gleicher Weise sind Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten, Gegenstand der Erfindung. Schließlich sind Wirte, die diese Vektoren enthalten, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die erfindungsgemäßen, isolierten Polynukleotide können ebenfalls zur Erzielung einer Überexpression der von ihnen kodierten Polypeptide verwendet werden.

Unter Überexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms. Im Falle der vorliegenden Erfindung werden zwf-Allele beziehungsweise Polynukleotide überexprimiert, die für

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen kodieren, die an Position 321 der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin enthalten, wobei der Austausch gegen L-Serin bevorzugt wird. Gegebenenfalls enthält das kodierte Protein außerdem einen Austausch von L-Serin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Threonin an Position 8 der Aminosäuresequenz. Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme - sogenannte Aminopeptidasen - N-terminale Aminosäuren, insbesondere das N-terminale Methionin, vom gebildeten Polypeptid abgespalten werden können. Die genannte Erhöhung der Konzentration oder Aktivität eines Genproduktes lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide um mindestens eine Kopie erhöht.

Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Gen oder Allel in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise pZl (Menkel et al . ,

Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) oder die von Tauch et al . (Journal of Biotechnology 99, 79- 91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren. Ein Übersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al . (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens eine

zusätzliche Kopie des interessierenden Gens oder Allels in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefügt.

In einer Ausführungsform, wie sie beispielsweise bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) für das hom-thrB-Operon beschrieben ist, wird ein in C. glutamicum nicht-replikatives Plasmid, welches das interessierende Gen enthält, in ein coryneformes Bakterium überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens beziehungsweise Allels.

In einer anderen Ausführungsform, die in der WO 03/040373 und US-2003-0219881-A1 beschrieben ist, wird eine oder mehrere Kopie (n) des interessierenden Gens mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse in einen gewünschten Ort des Chromosoms von C. glutamicum eingefügt. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine Kopie eines lysC- Allels, das für eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, in das gluB-Gen von C. glutamicum eingebaut.

In einer weiteren Ausführungsform, die in der WO 03/014330 und US-2004-0043458-A1 beschrieben ist, wird mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse am natürlichen Ort mindestens eine weitere Kopie, vorzugsweise in tandem- Anordnung zu dem bereits vorhandenen Gen oder Allel, des interessierenden Gens eingebaut. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine tandem-Duplikation eines lysC ^FBR -Allels am natürlichen lysC-Genort erzielt.

Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Patek et al . (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)

beschrieben. Weiterhin können die hinlänglich bekannten von Mann et al . (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Mann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des zwf-Allels, typischerweise im Abstand von ungefähr 1 - 500 oder 1 -307 Nukleotiden vom Startkodon, eines rekombinanten coryneformen Bakteriums eingefügt werden, welches anstelle der an Position 321 natürlicherweise vorhanden Aminosäure Glycin eine andere proteinogene Aminsäure enthält. Ein derartiger Promotor kann naturgemäß ebenfalls stromaufwärts des zwf-Allels einer erfindungsgemäßen Mutante eingefügt werden. Es ist weiterhin möglich ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid, das für eine erfindungsgemäße Variante der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, mit einem Promotor zu verknüpfen und die erhaltene Expressionseinheit in ein extrachromosomal replizierendes Plasmid oder in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums einzubauen.

Darüberhinaus kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. Ein Beispiel für eine mutierte Promotorregion des zwf-Gens beziehungsweise zwf-Allels ist die Nukleotidsequenz umfassend Position 208 bis 299 von SEQ ID NO: 11. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression des betreffenden Gens oder Allels durch Veränderung der

Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Durch die Maßnahmen der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000%,

bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus beziehungsweise Elternstammes erhöht. Unter einem Ausgangs-Mikroorganismus oder Elternstamm versteht man einen Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Erfindung durchgeführt werden.

Eine Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist bei Moritz et al . (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000) beschrieben.

Die Konzentration des Proteins kann über 1- und 2- dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot- Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual . 2 ^nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)) bestimmt werden.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend Verfahren zur Überexpression der erfindungsgemäßen Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenasen . Ein erfindungsgemässes Verfahren zur Überexpression besteht unter anderem darin, dass man die

Kopienzahl eines erfindungsgemässen Polynukleotids, das für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Variante kodiert, bei der an Position 321 oder der entsprechenden Position der kodierten Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und bei der gegebenenfalls an Position 8

oder der entsprechenden Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin enthalten ist, um mindestens eine (1) oder um mehrere Kopien erhöht. Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren besteht darin, dass man einen Promotor funktionell mit dem Polynukleotid verknüpft.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mikroorganismen, die eine erhöhte Konzentration oder Aktivität der erfindungsgemäßen Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Varianten in ihrem Zellinneren aufweisen.

Zusätzlich kann es für die verbesserte Produktion von L- Aminosäuren vorteilhaft sein, in den erfindungsgemäßen Mutanten oder rekombinanten Stämme eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen oder Allele.

So kann für die Herstellung von L-Lysin eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• ein für ein Dihydrodipicolinat-Synthase kodierendes Gen dapA, wie beispielsweise das in der EP 0 197 335 beschriebene dapA-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,

• ein für eine Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierendes Gen zwf, wie beispielsweise das in der JP-A-09224661 und EP-A-1108790 beschriebene zwf-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,

• die in der US-2003-0175911-A1 beschriebenen zwf-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für ein Protein

kodieren, bei dem beispielsweise das L-Alanin an Position 243 der Aminosäuresequenz durch L-Threonin ersetzt ist oder bei dem die L-Asparaginsäure an Position 245 durch L-Serin ersetzt ist,

• ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes Gen pyc, wie beispielsweise das in der DE-A-198 31 609 und EP 1108790 beschriebene pyc-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,

• das für das in der EP 1 108 790 beschriebene pyc-Allel von Corynebacterium glutamicum, das für ein Protein kodiert, bei dem L-Prolin an Position 458 der Aminosäuresequenz durch L-Serin ersetzt ist,

• die in der WO 02/31158 beschriebene pyc-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für Proteine kodieren, welche gemäß Aspruch 1 einen oder mehrere der

Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe L- Glutaminsäure an Position 153 ersetzt durch L- Asparaginsäure, L-Alanin an Position 182 ersetzt durch L- Serin, L-Alanin an Position 206 ersetzt durch L-Serin, L- Histidin an Position 227 ersetzt durch L-Arginin, L- Alanin an Position 452 ersetzt durch Glycin und L- Asparaginsäure an Position 1120 ersetzt durch L- Glutaminsäure tragen (Figur 2A von WO 02/31158 gibt zwei verschiedene Startpositionen für die Pyruvat-Carboxylase an, die sich um eine Länge entsprechend 17 Aminosäuren unterscheiden. Dementsprechend entspricht die Position 153 nach Anspruch 1 von WO 02/31158 der Position 170 von Fig.2A von WO 02/31158, die Position 182 nach Anspruch 1 der Position 199 von Fig.2A, die Position 206 nach Anspruch 1 der Position 223 von Fig. 2A, die Position 227 nach Anspruch 1 der Position 244 von Fig.2A, die Position 452 nach Anspruch 1 der Position 469 von Fig. 2A, die Position 1120 nach Anspruch 1 der Position 1137 von Fig.2B. In Figur 2A von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch A (Alanin) gegen G (Glycin) an

Position 472 angegeben. Die Position 472 des Proteins mit der N terminalen Sequenz MTA entspricht der Position 455 des Proteins mit der N-terminalen Sequenz MST gemäß Fig. 2A. In Fig. 2B von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch D (Asparaginsäure) gegen E

(Glutaminsäure) an Position 1133 des Proteins mit dem N- Terminus MTA angegeben.),

• ein für eine Aspartatkinase kodierendes lysC Gen wie beispielsweise das als SEQ ID NO: 281 in der EP-A-1108790 (Siehe auch Zugangsnummer AX120085 und 120365) und das als SEQ ID NO: 25 in der WO 01/00843 (Siehe Zugangsnummer AX063743) beschriebene lysC-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,

• ein für eine feed-back resistente Aspartatkinase Variante kodierendes lysC ^FBR Allel, insbesondere entsprechend

Tabelle 1,

• ein für ein Lysin-Export-Protein kodierendes Gen lysE, wie beispielsweise das in der DE-A-195 48 222 beschriebene lysE-Gen des Wildtyps Corynebacterium glutamicum,

• das für das Zwal-Protein kodierende Gen zwal des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum (US 6,632,644)

überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Allele des zwf-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• ein für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierendes Gen pgi, wie beispielsweise das in der US 6,586,214 und US 6,465,238 beschriebene pgi-Gen von Corynebacterium glutamicum,

• ein für die Homoserin-Dehydrogenase kodierendes Gen hom, wie beispielsweise das in der EP-A-0131171 beschriebene hom-Gen von Corynebacterium glutamicum,

• ein für die Homoserin-Kinase kodierendes Gen thrB, wie beispielsweise das von Peoples et al . (Molecular

Microbiology 2 (1988): 63 - 72)) beschriebene thrB-Gen von Corynebacterium glutamicum und

• ein für die Phosphofruktokinase kodierendes Gen pfkB, wie beispielsweise das in der WO 01/00844 (Sequenz Nr. 57) beschriebene pfkB-Gen von Corynebacterium glutamicum,

abzuschwächen oder auszuschalten.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert .

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Als Mutationen zur Erzeugung einer Abschwächung kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in

Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense

mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht- konservativen Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stopp-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen

Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stopp-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation.

Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) , dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine

Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden. Weitere Maßnahmen sind im Stand der Technik beschrieben.

Die durch die Massnahmen der Erfindung erhaltenen isolierten coryneformen Bakterien zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess .

Unter isolierten Bakterien sind die erfindungsgemäßen, isolierten beziehungsweise erzeugten Mutanten und

rekombinanten Bakterien, insbesonders coryneformer Bakterien, zu verstehen, welche ein zwf-Allel enthalten, das für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die den beschriebenen Aminosäureaustausch an Position 321 der Aminosäuresequenz und gegebenenfalls einen

Aminosäureaustausch L-Serin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Threonin, an Position 8 enthält.

Die Leistung der isolierten Bakterien bzw. des Fermentationsprozesses unter Verwendung derselben bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Produkt-Konzentration (Produkt pro Volumen) , der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) und der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder auch anderer Prozess- Parameter und Kombinationen davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw. den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben verbessert.

Die erfindungsgemäßen, isolierten coryneformen Bakterien können kontinuierlich - wie beispielsweise in der

PCT/EP2004/008882 beschrieben- oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,

Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.

Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch

„Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und

Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrübenoder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,

Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,

Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.

Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden.

Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 2O ⁰ C bis 45 ⁰ C und vorzugsweise bei 25 ⁰ C bis 4O ⁰ C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich.

Geeignete Fermentationsmedien sind unter anderem in der US 6,221,636, in der US 5,840,551, in der US 5,770,409, in der US 5,605,818, in der US 5,275,940 und in der US 4,224,409 beschrieben.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure bei dem man

a) ein isoliertes coryneformes Bakterium in einem geeignetem Medium fermentiert, wobei das Bakterium ein für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Enzymaktivität kodierendes Gen enthält, wobei in den Aminosäuresequenzen des Polypeptids das Glycin an der Position 321 oder der entsprechenden Position durch eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Serin, ersetzt ist und wobei gegebenenfalls das L-Serin an Position 8 oder der entsprechenden Position gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Threonin, ersetzt ist, und

b) die L-Aminosäure in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen des isolierten coryneformen Bakteriums anreichert .

Die auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend zu einem festen oder flüssigen Produkt weiterverarbeitet .

Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medium enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine

Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.

Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse des Mikroorganismus, b) die im Laufe der Fermentation gebildete gewünschte Aminosäure, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des/der eingesetzten Fermentationsmediums/

Fermentationsmedien beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.

Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben der jeweiligen erwünschten L- Aminosäure erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu zählen L-Aminosäuren, die im Vergleich zur erwünschten Aminosäure weniger als 30%, 20% oder 10% ausmachen. Hierzu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.

Typische für industrielle Zwecke geeignete

Fermentationsbrühen haben einen Aminosäuregehalt von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg bis 150 g/kg. Der Gehalt an Biomasse (als getrocknete Biomasse) beträgt im Allgemeinen 20 bis 50 g/kg.

Im Falle der Aminosäure L-Lysin sind im Stand der Technik im wesentlichen vier verschiedene Produktformen bekannt.

Eine Gruppe L-Lysin haltiger Produkte umfasst konzentrierte, wässrige, alkalische Lösungen von

aufgereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865) . Eine weitere Gruppe, wie beispielsweise in der US 6,340,486 und US 6,465,025 beschrieben, umfasst wässrige, saure, Biomasse-haltige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder kristalline Formen von aufgereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin, das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene

Produktform enthält neben L-Lysin den größten Teil der während der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus mit einem Anteil von >0% - 100%.

Entsprechend der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren, bei denen die L-Aminosäure aus der Fermentationsbrühe gesammelt, isoliert oder gereinigt wird, um das L-Aminosäure haltige Produkt oder die gereinigte L-Aminosäure herzustellen.

Zur Herstellung von festen, reinen L-Aminosäuren werden im wesentlichen Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung von Aktivkohle und Methoden der Kristallisierung angewendet. Im Falle des Lysin erhält man auf diese Weise die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat (LVS2-H2SO4) .

Im Falle des Lysin ist in der EP-B-0534865 ein Verfahren zur Herstellung wässriger, basischer L-Lysin haltiger Lösungen aus Fermentationsbrühen beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen 9 bis 11 eingestellt. Die mineralischen Bestandteile (anorganischen

Salze) werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation aus der Brühe abgetrennt und entweder als Dünger verwendet oder verworfen.

Bei Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.

Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen) oder durch Säurezugabe.

Die chemischen Bestandteile der Biomasse sind unter anderem die Zellhülle, beispielsweise das Peptidoglykan und das Arabinogalaktan, das Protein bzw. Polypeptid, beispielsweise das Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Polypeptid, Lipide und Phospholipide und Nukleinsäuren (DNA und RNA) , beispielsweise Polynukleotide enthaltend die erfindungsgemäße Mutation. Als Folge der Massnahmen der Inaktivierung und/oder der weitereren Verfahrensschritte (beispielsweise Ansäuerung, Sprühtrocknung, Granulation etc.) liegen Nukleinsäuren typischerweise als Fragmente mit eine Länge von unter anderem ≥40 - 60 bp, >60 - 80 bp, >80 - 100 bp, >100 - 200 bp, >200 - 300 bp, >300 - 400 bp, >400 - 500 bp, >500 - 750 bp, >750 - 1000 bp, >1000 -1250 bp,

>1250 - 1500 bp, >1500 - 1750 bp, >1750 - 2000 bp, >2000 - 2500 bp, >2500 - 3000 bp, >3000 - 4000 bp, >4000 - 5000 bp vor.

In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, sodass keine (0 %) oder höchstens 30%, höchstens 20%, höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen ≥ 0% bis ≤ 100% entfernt .

Schließlich kann die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe vor oder nach der vollständigen oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säure wie beispielsweise Propionsäure auf einen sauren pH Wert gestellt werden (GB 1,439,728 oder EP 1 331 220). Es ist gleichfalls möglich die Fermentationsbrühe mit der vollständig enthaltenen Biomasse anzusäuern (US 6,340,486 oder US 6,465,025). Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSO ₃ , GB 1,439,728) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert werden.

Bei der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0%) , bevorzugt zu mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100%) oder nahezu vollständig das heißt > 95% oder > 98% im Produkt.

In diesem Sinne bedeutet der Begriff

„Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.

Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers,

Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der

Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP2004/006655 beschrieben, zu rieselfähigen Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise grobkörnigem Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein gewünschtes Produkt isoliert.

Es ist ebenfalls möglich, die Fermentationsbrühe direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation zu trocknen.

Unter „rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen AuslaufÖffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint .

Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint.

Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die

entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur

„Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.

Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.

Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5 %) an Körngrößen unter 100 μm Durchmesser enthält.

„Lagerbar", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder länger, bevorzugt mindestens 1,5 Jahre oder länger, besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) der jeweiligen Aminosäure auftritt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines L-Aminosäure, bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, haltigen Produktes, bevorzugt Tierfuttermittel-Additivs, aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) Kultivierung und Fermentation eines L-Aminosäure ausscheidenden coryneformen Bakteriums, welches mindestens ein zwf-Allel enthält, das für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, bei der an Position 321 oder der vergleichbaren Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin enthalten ist, und wobei gegebenenfalls an Position 8 oder der

vergleichbaren Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Threonin, enthalten ist, in einem Fermentationsmedium,

b) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%, und

c) Trocknung der gemäß a) und/oder b) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Produkt in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten

wobei gegebenenfalls vor Schritt b) oder c) eine Säure ausgewählt aus der Gruppe Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Salzsäure hinzugefügt wird.

Vorzugsweise wird im Anschluss an Schritt a) oder b) Wasser aus der L-Aminosäure haltigen Fermentationsbrühe entfernt (Aufkonzentration) .

Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten (EP0743016A) Stearaten.

Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberfläche der erhaltenen Granulate mit Ölen zu versehen so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder Mischungen pflanzlicher Öle verwendet werden. Beispiele für derartige Öle sind Sojaöl, Olivenöl, Sojaöl/Lecithingemische . In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Öl im Produkt beträgt 0,02 bis 2,0 Gew.-%,

bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs .

Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100 bis 1800 μm oder einem Anteil von ≥ 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 μm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 μm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.- besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%.

Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der

Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.

Schließlich kann das Produkt auch durch Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-4100920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.

Zur Einstellung einer gewünschten Aminosäurekonzentration im Produkt kann je nach Anforderung die entsprechende Aminosäure während des Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flüssiger oder fester Form hinzugefügt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.

Im Falle des Lysin wird bei der Herstellung Lysin-haltiger Produkte das Verhältnis der Ionen so eingestellt, dass das Ionenverhältnis entsprechend nachstehender Formel

2x [SO ₄ ^2" ] + [Cl ^" ] - [NH ₄ ⁺ ] - [Na ⁺ ] - [K ⁺ ] -2x [Mg ⁺ ] -2x [Ca ²⁺ ] / [L-Lys]

0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68 bis 0,90 ergibt so wie von Kushiki et al . in der US 20030152633 beschrieben.

Im Falle des Lysin hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an Lysinbase von 71 Gew.-% , 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind ebenfalls möglich.

Im Falle einer elektrisch neutralen Aminosäure wie dem L- Tryptophan hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Aminosäuregehalt von mindestens 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 30 Gew.-% und maximal 50 Gew.-%, 60 Gew.-%, 70 Gew.-%, 80 Gew.-%, 90 Gew.-% oder bis 95 Gew.-%.

Der Wassergehalt des festen Produktes beträgt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein L-Lysin haltiges Futtermitteladditiv auf Fermentationsbrühebasis, welches folgende Merkmale aufweißt

a) einen Lysingehalt (als Base) von mindestens 10 Gew.-% bis maximal 73 Gew.-%,

b) einen Wassergehalt von höchstens 5 Gew.-%, und

c) einen Biomassegehalt ensprechend mindestens 0,1 % der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Biomasse,

wobei die gegebenenfalls inaktivierte Biomasse aus erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien gebildet wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein L-Tryptophan haltiges Futtermitteladditiv auf Fermentationsbrühebasis, welches folgende Merkmale aufweißt

a) einen Tryptophangehalt von mindestens 5 Gew.-% bis maximal 95 Gew.-%,

b) einen Wassergehalt von höchstens 5 Gew.-%, und

c) einen Biomassegehalt ensprechend mindestens 0,1 % der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Biomasse, wobei die gegebenenfalls inaktivierte Biomasse aus erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien gebildet wird.

Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum mit der

Bezeichnung DM1797, die den Aminosäureaustausch lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, wurde am 28. Oktober 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 16833 hinterlegt.

Die erfindungsgemäße Mutante Corynebacterium glutamicum DM1816, die L-Serin an Position 321 der Aminosäuresequenz des Zwf-Polypeptids enthält, wurde am 09. Februar 2005 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 17119 hinterlegt.

Beispiel 1

Mutagenese des L-Lysin produzierenden Stammes DM1797

Der Corynebacterium glutamicum Stamm DM1797 wurde als Ausgangsstamm für die Mutagenese mit N-Methyl-N' -Nitro-N- Nitrosoguanidin (MNNG) eingesetzt. Der Stamm DM1797 ist eine Aminoethylcystein-resistente Mutante von

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 und unter der Bezeichnung DSM16833 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.

Der Stamm DM1797 wurde in 10 ml LB-Bouillon (Merck,

Darmstadt, Germany) , die in einem 100 ml Erlenmeyerkolben enthalten waren, für 24 Stunden bei 33 ⁰ C und 200 rpm auf einem Rotations-Schüttler vom Typ Certomat BS-I (B. Braun Biotech International, Melsungen, Deutschland) kultiviert. Anschließend wurde die Kultur abzentrifugiert, das Sediment in 10 ml 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert, die erhaltene Suspension erneut abzentrifugiert und das erhaltene Sediment in 10 ml 0,9% NaCl-Lösung aufgenommen. 5 ml dieser Zellsuspension wurden mit 400μg/ml MNNG für 15 Minuten bei 3O ⁰ C und 200 rpm auf einem Schüttler (siehe oben) behandelt. Anschließend wurde der Mutageneseansatz abzentrifugiert und das Sediment in 10 ml 2% Na-Thiosulfat in 0,9% NaCl-Puffer (pH = 6,0) aufgenommen. Die Zellsuspension wurde anschließend im Verhältnis 1:1000, 1:10000 und 1:100000 mit 0,9% NaCl-Lösung verdünnt, und

Aliquots auf Hirn-Herz-Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland) ausplattiert. Auf diese Weise wurden ungefähr 2500 Mutanten isoliert .

Beispiel 2

Leistungstest der Mutanten des Stammes DM1797

Die in Beispiel 1 erhaltenen Mutanten wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.

Dazu wurden die Klone zunächst auf Hirn-Herz-Agarplatten (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 24 Stunden bei 33 ⁰ C vermehrt. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde je eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) . Als Medium für die Vorkultur wurde das

Medium MM verwendet. Die Vorkultur wurde 24 Stunden bei 33 ⁰ C und 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde ebenfalls das Medium MM verwendet.

Medium MM

CSL 5 g/l

MOPS 20 g/l

Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/l

Salze :

(NH ₄ ) ₂ SO ₄ ) 25 g/l

KH ₂ PO ₄ 0,1 g/l

MgSO ₄ * 7 H ₂ O 1,0 g/l

CaCl ₂ * 2 H ₂ O 10 mg/1

FeSO ₄ * 7 H ₂ O 10 mg/1

MnSO ₄ * H ₂ O 5,0mg/l

Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/1

Thiamin * HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/1

CaCO ₃ 25 g/l

CSL (Corn Steep Liquor) , MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO ₃ zugesetzt.

Die Kultivierung erfolgte in Volumina von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen enthalten waren. Die Temperatur betrug bei 33 ⁰ C, die Umdrehungszahl war 250 rpm und die Luftfeuchte 80%.

Nach 24 Stunden wurde die optische Dichte (OD) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt. Eine Mutante, die sich durch eine erhöhte Lysinbildung auszeichnete, wurde als DM1816 bezeichnet.

Tabelle 1

Beispiel 3

Sequenzierung des zwf-Gens der Mutante DM1816

Aus dem Klon DM1816 wurde mit der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein DNA-Abschnitt amplifiziert, welcher das zwf-Gen trägt. Hierfür wurden folgende Oligonukleotide als Primer verwendet :

zwf-Ll (SEQ ID NO: 19) :

5 ^S agaagctgac gctgtgttct 3 ^S

zwf-L2 (SEQ ID NO : 20 ) :

5 ^S cattggtgga ctcggtaact 3 ^S

Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Sie ermöglichen die Amplifizierung eines ca. 1,95 kb langen DNA-Abschnittes, welcher das zwf-Gen trägt. Der Primer zwf-Ll bindet an die Region entsprechend Position 59 bis 78 des zu SEQ ID NO: 3 komplementären Stranges . Der Primer zwf-L2 bindet an die Region ensprechend Position 2026 bis 2007 des Stranges gemäß SEQ ID NO: 3.

Die PCR-Reaktion wurde mit der Phusion High Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Der Reaktionsansatz wurde nach Herstellerangaben angesetzt und enthielt bei 50 μl Gesamt- Volumen 10 μl des mitgelieferten 5 x Phusion HF Buffer, Desoxynucleosidtriphosphate in einer Konzentration von jeweils 200 μM, Primer in einer Konzentration von 0,5 μM, ungefähr 50 ng Template-DNA und 2 Units Phusion Polymerase. Durch Zugabe von H2O wurde das Volumen auf 50 μl eingestellt.

Der PCR-Ansatz wurde zuerst einer einleitenden Denaturierung bei 98 ⁰ C für 30 Sekunden unterzogen. Darauf folgten sich 35x wiederholend ein Denaturierungsschritt bei 98 ⁰ C für 20 Sekunden, ein Schritt zum Binden der Primer an die vorgelegte DNA bei 6O ⁰ C für 20 Sekunden und der

Extensionsschritt zur Verlängerung der Primer bei 72 ⁰ C für 60 Sekunden. Nach dem abschliessenden Extensionsschritt für 5 Minuten bei 72 ⁰ C wurde der PCR-Ansatz einer Agarosegel- Elektrophorese (0,8% Agarose) unterworfen. Ein DNA-Fragment von ca. 1,85 kb Länge wurde identifiziert, aus dem Gel isoliert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen, (Hilden, Deutschland) aufgereinigt .

Die Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragmentes bzw. PCR-Produktes wurde von der Firma Agowa (Berlin,

Deutschland) bestimmt. Die erhaltene Sequenz der Kodierregion des zwf-Allels ist in der SEQ ID NO: 9 dargestellt. Die sich mit Hilfe des Programmes Patentin ergebende Aminosäuresequenz des Proteins ist in der SEQ ID NO: 10 dargestellt.

Die Nukleotidsequenz der Kodierregion des zwf-Allels der Mutante DM1816 enthält an Position 961 die Nukleobase Adenin (Siehe SEQ ID NO: 5 oder 9) . Das Gen des Wildtyps (Siehe SEQ ID NO: 1) enthält an dieser Position die Nukleobase Guanin. Diese Guanin-Adenin Transition führt zu einem Aminosäureaustausch von Glycin zu Serin an Position 321 der resultierenden Aminosäuresequenz. Diese Mutation wird im Folgenden als zwfG321S bezeichnet. Weiterhin enthält das zwf-Allel von DM1816 noch den Nukleotidaustausch Thymin gegen Adenin an Position 22 der

Nukleotidsequenz. Diese Thymin-Adenin Transversion führt zu einem Aminosäureaustausch von Serin zu Threonin an Position 8 der resultierenden Aminosäuresequenz .

Ausserdem enthält das zwf-Allel von DM1816 noch fünf weitere Nukleotidaustausche, die nicht zu einem

Aminosäureaustausch führen („stille Mutationen") : eine Cytosin-Thymin- Transition an Position 138, eine Cytosin- Thymin- Transition an Position 279, eine Thymin-Cytosin - Transition an Position 738, eine Cytosin-Thymin- Transition an Position 777 und eine Guanin-Adenin- Transition an Position 906.

Beispiel 4

Konstruktion des Austauschvektors pKl8mobsacB_zwfG321S

Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein Teil der Kodierregion, das heisst ein sogenanntes internes Fragment bzw. interner Bereich, des zwf-Allels amplifiziert, der die Mutation zwfG321S trägt. Als Template wurde die in Beispiel

3 gewonnene chromosomale DNA verwendet. Folgende Oligonukleotide wurden als Primer für die PCR ausgewählt:

zwf-intl-bam (SEQ ID NO: 23) :

5 ^S ctag-ggatcc-acgtacgcgatgccgcaagt 3 ^S

zwf-int2-bam (SEQ ID NO: 24) :

5 ^S ctag-ggatcc-tcaggctgcacgcgaatcac 3 ^S

Sie wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg,

Deutschland) synthetisiert und ermöglichen die

Amplifizierung eines ca. 1 kb langen DNA-Abschnittes der Kodierregion. Die Nukleotide 11 bis 30 des Primers zwf- intl-bam binden an die Region entsprechend Position 546 bis 565 des zu SEQ ID NO: 3 koplementären Stranges. Die Positionen 546 und 565 von SEQ ID NO: 3 entsprechen den Positionen 239 und 258 in SEQ ID NO: 1. Die Nukleotide 11 bis 30 des Primers zwf-int2-bam binden an die Region entsprechend Position 1527 bis 1508 des Stranges gemäß SEQ ID No. 3. Die Position 1527 und 1508 von SEQ ID N0:3 ensprechen den Positionen 1220 und 1201 von SEQ ID NO: 1. Außerdem enthalten die Primer die Sequenzen für Schnittstellen der Restriktionsendonuklease BamHI, die in der oben dargestellten Nukleotidabfolge durch Unterstreichen markiert sind.

Die PCR-Reaktion wurde mit der Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Der Reaktionsansatz hatte die oben beschriebene Zusammensetzung. Die PCR wurde mit einer Ausnahme wie oben durchgeführt: der 72 °C-Extensionsschritt in der 35-fachen Wiederholung wurde jeweils nur für 30 Sekunden durchgeführt.

Das ca. 1 kb lange Amplifikat wurde mit der

Restriktionsendonuklease BamHI behandelt und durch Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert.

Es wurde anschließend aus dem Gel isoliert und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen aufgereinigt .

Das dergestalt gereinigte DNA-Fragment enthält die beschrieben zwfG32IS-Mutation und besitzt BamHI kompatible Enden (zwfG32IS-Fragment bzw. 'zwf in Figur 1) . Es wurde anschließend in den von Schäfer et al . (Gene, 145, 69-73 (1994) beschriebenen, mobilisierbaren Vektor pKlδmobsacB eingebaut, um einen Allel- beziehungsweise Mutationsaustausch zu ermöglichen. Hierzu wurde pKlδmobsacB mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und die Enden mit alkalischer Phosphatase (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert . Der so vorbereitete Vektor wurde mit dem zwfG32IS-Fragment gemischt und der Ansatz mit dem Ready-To-Go T4 DNA Ligase Kit (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) behandelt.

Anschließend wurde der E. coli Stamm S17-1 (Simon et al. , Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) mit dem Ligationsansatz transformiert (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. VoI .1. ILR-Press, CoId Spring Habor, New York, 1989) . Die Selektion auf Plasmid-tragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Tansformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrock et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual. 2 ^nd Ed. CoId Spring Habor, New York, 1989), der mit 25 mg/1 Kanamycin supplementiert worden war.

Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktionsspaltung jeweils einmal mit dem Enzym BamHI und einmal mit dem Enzym SacI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pKl8mobsacB_zwfG321S genannt und ist in Figur 1 dargestellt .

Beispiel 5

Einbau der Mutation zwfG321S in den Stamm DM1797

Der in Beispiel 4 beschriebene Vektor pKlδmobsacB zwfG321S wurde nach dem Protokoll von Schäfer et al . (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) in den C. glutamicum Stamm DM1797 durch Konjugation transferiert. Der Vektor kann in DM1797 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er als Folge eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt. Die Selektion von Transkonjuganten, d. h. von Klonen mit integriertem pKlδmobsacB zwfG321S erfolgte durch Ausplattieren des Konjugationsansatzes auf LB-Agar, der mit 25 mg/1 Kanamycin und 50 mg/1 Nalidixinsäure supplementiert worden war. Kanamycin-resistente Transkonjuganten wurden anschließend auf mit Kanamycin (25 mg/1) supplementierten LB-Agarplatten ausgestrichen und für 24 Stunden bei 33 ⁰ C inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden hatte, wurden die Klone 30 Stunden unselektiv in LB-Flüssigmedium kultiviert, anschließend auf LB-Agar, der mit 10% Sucrose supplementiert worden war ausgestrichen und 24 Stunden bei 33 ⁰ C bebrütet.

Das Plasmid pKlδmobsacB zwfG321S enthält ebenso wie das Ausgangsplasmid pKlδmobsacB neben dem Kanamycin- Resistenzgen eine Kopie des für die Levan-Sucrase aus Bacillus subtilis kodierenden sacB-Gens . Die durch Sucrose induzierbare Expression des sacB-Gens führt zur Bildung der Levan-Sucrase, die die Synthese des für C. glutamicum toxischen Produktes Levan katalysiert. Auf mit Sucrose supplementiertem LB-Agar wachsen daher nur solche Klone, bei denen das integrierte pKlδmobsacB zwfG321S als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert hat. In Abhängigkeit von der Lage des zweiten

Rekombinationsereignisses in bezug auf den Mutationsort findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw. der Einbau der Mutation statt oder es verbleibt die ursprüngliche Kopie im Chromosom des Wirtes .

Anschließend wurde ein Klon gesucht, bei dem der gewünschte Austausch, d. h. der Einbau der Mutation zwfG321S, erfolgt war. Hierzu wurde von 10 Klonen mit dem Phänotyp „Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und „Nicht-Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" die Sequenz des zwf-Gens bestimmt. Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der die Mutation zwfG321S trägt. Dieser Stamm wurde als C. glutamicum DM1797_ zwfG321S bezeichnet.

Beispiel 6

Vergleich der Leistung des Stammes DMl797_zwfG321S mit der des AusgangsStammes DM1797

Der Leistungtest wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Der Stamm DMl797_zwfG321S zeigte im Vergleich zu DM1797 deutlich erhöhte Lysinausscheidung ähnlich wie DM1816 (Siehe Tabelle 1) .