Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung von Mutanten des fluoreszierenden Proteins CGFP (fluorescence protein of clytia gregaria).

Fluoreszierende Proteine

Eine Vielzahl an Coelenteraten sind biolumineszent (Morin et al., 1974) und emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1962) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht wie das phenotypisch beobachtete grüne Licht von Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das Aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phenotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al, 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al, 1994).

Grün fluoreszierende Proteine konnten aus unterschiedlichen Organismen isoliert werden. Hierzu zählen die Hydozoa (aequoria, halistaura obelia) und Anthropoden (acanthotilum, sea cactus, cavernularia, renila, ptilosarcus, stylatula) (Morin et al., 1971; Morin et al., 1971 TL, Wampler et al., 1971, Wampler et al., 1973, Cormier et al., 197.3, Cormier et al., 1974, Levine et al., 1982).

Eine Zusammenfassung einiger fluoreszierender Proteine findet sich in Tabelle 1 :

Tabelle 1

Übersicht über einige fluoreszierende Proteine. Angegeben ist der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages.

Die fluoreszierenden Proteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften. Die spektralen Charakteristika der fluoreszierenden Proteine können sich sowohl auf der Exitations- als auch auf der Emmisionsseite unterscheiden. Eine Übersicht der Spektren der Fluoreszenz und der Anregungswellenlänge findet sich in Tabelle 2.

Tabelle 2

Übersicht über einige fluoreszierende Proteine. Angegeben ist der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, die Anregungs- und Emissionswellenlängen, die bei Spektralanalysen bestimmt worden sind.

Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen wurde bereits zuvor beschrieben. Eine Übersicht findet sich in Tabelle 3 : ~

Tabelle 3

Übersicht über einige fluoreszierende Proteine. Angegeben ist der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des fluoreszierenden Proteins und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen.

Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von fluoreszierenden Proteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten fluoreszierenden Proteinen sind in der Literatur beschrieben (Delagrave et al., 1995; Ehrig et al., 1995; Heim et al., 1996).

Fluoreszierende Proteine finden bereits in unterschiedlichsten Gebieten eine Anwendung. Die Verwendung von fluoreszierende Proteinen beim "Fluorescence Resonance Energy Tranfer"(FRET), "Bioluminescence Resonance Energy Transfer' (BRET) und anderen Energietransferverfahren wurde bereits in der Literatur beschrieben (Mitra et al., 1996; Ward et al., 1978; Cardullo et al,

1988; US patent no„4,777,128; US patent no. 5,126,508; US patent no. 4,927,923; US_.,patent no. 5,279,943). Weitere Nicht-radioaktive Methoden zum Energietransfer mittels GFP wurden in ebenfalls bereits beschrieben (PCT appl. WO 98/02571 and WO 97/28261)

Reportersvsteme

Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.

1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.

2. Reportergen. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehört die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).

Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im- sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.

Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.

Herstellung der Mutanten

Zur Herstellung der Mutanten wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stratagene (Katalog Nummer #200521; Revision #063001b; Auflage 2003) verwendet.

CGFP-Mutanten

In der Literatur wurden bereits fluoreszierende Proteine beschrieben, die durch Austausch einzelner Aminosäuren verändertet? spektrale, physikochemische oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Zu diesen gehört EGFP (Falkow et al., 1996).

Durch Einfügen von Mutationen in das zuvor beschriebene fluoreszente Protein CGFP konnte überrascherweise die Mutante imCGFP identifiziert werden, die veränderte physikochemische Eigenschaften aufweiset.

Die physikochemischen Veränderungen der Mutante basieren auf einer veränderten "maturation time".

Als „maturation time" (kurz maturation time) bezeichnet man bei Proteinen den Zeitraum zur vollständigen Ausdifferenzierung oder Ausbildung der funktionellen Struktur. Hierbei spielt die Proteinfaltung und Ausbildung von Primär-, Sekundär-, oder Tertiärstrukturen eine entscheidende Rolle.

B ei der Expression der Mutante imCGFP in eukaryotischen Zellen stellte sich überraschenderweise heraus, das sich der Anteil fluoreszenter Zellklone deutlich vergrösserte.

Das fluoreszente Protein imCGFP weist eine Kombination von zwei Mutationen auf, die zu veränderten physikochemischen und biochemischen Eigenschaften führen. Bei diesen Mutationen handelt es sich um Aminosäureaustausche an den Positionen 164 und 169. An Position 164 wurde ein Isoleucin (I) durch ein Alanin (A) und an Position 169 ein Alanin (A) durch ein Cystein (C) ersetzt.

Das fluoreszente Protein imCGFP zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu CGFP aus Clytia gregaria mit einer Identität von 99 % (gezeigt in Figur 4).

Das fluoreszente Protein imCGFP zeigt eine veränderte Fluoreszenzintensität.

Das fluoreszente Protein imCGFP zeigt eine veränderte Expremierbarkeit in eukaryotischen Systemen.

Die Erfindung betrifft das fluoreszente Protein imCGFP mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO: 1.

Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente des fluoreszenten Proteins imCGFP. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch Kombinationen aus dem Aminosäureaustausch an Position 164 mit einem Aminosäureäustausch an Position 169 durch eine von Cystein abweichende Aminosäure.

Die Erfindung betrifft auch Kombinationen aus dem Aminosäureaustausch an Position 169 mit einem Aminosäureäustausch an Position 164 durch eine von Alanin abweichende Aminosäure.

Die Erfindung betrifft auch Kombinationen aus dem Aminosäureaustausch an Position 164 mit einer oder mehreren anderen Mutationen.

Die Erfindung betrifft auch Kombinationen aus dem Aminosäureaustausch an Position 169 mit einer oder mehreren anderen Mutationen.

Die Erfindung betrifft CGFP Proteine, die im Bereich der Aminosäurepositionen 154 bis 179 bevorzugt 165 bis 170, insbesondere 164 und 169 eine oder mehrere Aminosäureaustausche aufweisen, welche zu veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften führen.

Die Aminosäuresequenz des fluoreszenten Proteins .CGFP ist repräsentiert durch SEQ DD NO: 4. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO: 3.

Die Erfindung betrifft CGFP Proteine, die im Bereich der Aminosäurepositionen 154 bis 179 bevorzugt 165 bis 170, insbesondere 164 und 169 eine oder mehrere Aminosäureaustausche auf- weisen in Kombination mit einer oder mehreren Mutationen außerhalb des bevorzugten Bereichs, die zu veränderten physikochemischen oder biochemischen Eigenschaften führen.

Die Erfindung betrifft auch Fragmente von CGPF' Proteinen, die im Bereich der Aminosäurepositionen 154 bis 179 bevorzugt 165 bis 170, insbesondere 164 und 169 eine oder mehrere Aminosäureaustausche aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch chimäre Proteine bestehend aus Fragmenten von CGFP Proteinen die im Bereich der 154 bis 179 bevorzugt 165 bis 170, insbesondere 164 und 169 eine oder mehrere Aminosäureaustausche aufweisen und anderen fluoreszenten Proteinen oder Fragmenten anderer fluoreszenter Proteine,

Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90% aufweisen.

Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des fluoreszenten Proteins imCGFP Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfmdungsgemäß.

Ebenfalls sind Mutanten des fluoreszenten Proteins imCGFP Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.

Die Veränderung von fluoreszenten Proteinen im ähnlichen Bereich der Protemstruktur sind erfin- dungsgemäß.

Das Protein imCGFP eignet sich als Reportergen für die Technik des „high content Screening" (HCS). HCS steht als Übergriff für moderne Mikroskopie-Technologien zur Zellanalyse. Kennzeichnend für HCS-Verfahren ist die quantitative Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer oder subzellulärer Ebene

Das Protein imCGFP eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.

Das Protein imCGFP eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen

Das Protein imCGFP eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.

Das Protein imCGFP eignet sich als sich als Markerprotein, speziell bei der FACS (Fluorescence activated cell sorter) Sortierung.

Das Protein imCGFP eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine, für Glykoproteine.

Das Protein imCGFP eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.

^' Das Protein imCGFP eignet sich als Protein für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ,BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.

Das Protein imCGFP eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen, für Transporter, für Ionenkanäle.

Das Protein imCGFP eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrate für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.

Das Protein imCGEP eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt Si Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.

Das Protein imCGFP eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).

■ Das Protein imCGFP eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die kon- fokale Mirkoskopie.

Das Protein imCGFP eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechslewirkungen (DNA : deoxyribonucleic acid; RNA : ribonucleic acid).

Das Protein imCGFP eignet sich als Marker oder Fusionsproteine für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.

Das Protein imCGFP eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryo- nalentwicklung.

Das Protein imCGFP eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.

Das Protein imCGFP eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.

Das Protein imCGFP eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.

Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte Protein imCGFP eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzie- rungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.

Das Protein imCGFP eignet sich als Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".

Das Protein imCGFP eignet sich als für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.

Das Protein imCGFP eignet sich als zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemas, in bakteriellen Systemen, in Hefen Systemen, in i&kulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.

Das Protein imCGFP eignet sich als zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.

Das Protein imCGFP eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.

Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Proteins imCGFP speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von imCGFP auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von imCGFP zur Färbung speziell von Nahrungs- mittein, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von imCGFP zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von imCGFP zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von imCGFP zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.

Die Erfindung betrifft' Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Die Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid expremieren.

Die Erfindung betrifft Organismen, die ein funkionelles Äquivalente von imCGFP expremieren.

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden

Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides. - _*

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden -Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine erkannt werden.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Die Erfindung betrifft das fluoreszente Protein imCGFP mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und der Nukleotidsequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 1.

Die Erfindung betrifft Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Die Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid expremieren

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptides.

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine erkannt werden.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diag- nostik.

Die Erfindung betrifft Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Die Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid expremieren

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen. ,

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptides.

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine erkannt werden. _≤

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als

Marker- und Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Erfindungsgemäß ist ein fluoreszierendes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.

Erfindungsgemäß ist des weiteren ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Protein kodiert, dass seine Sequenz die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.

^■ Bestandteil der Erfindung ist ein fluoreszierendes Protein, dadurch gekennzeichnet dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die SEQ DD NO :4 wiedergegeben ist, jedoch im

Bereich der Positionen 154 bis 179 eine oder mehrere Mutationen aufweist, welche zu einer schnelleren Faltungszeit des Proteins führen, sowie dessen funktionellen Fragmente.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Protein wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben kodiert.

Erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül gemäß wie in den vorhergehenden 4 Abschnitten beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass es einen funktionellen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält.

Bestandteil der Erfindung ist ein rekombinanter RNA oder DNA-Vektor, welcher eine Nukleinsäure wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben umfasst.

Erfmdungsgemäß ist ein Organismus, enthaltend einen Vektor wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben.

Bestandteil der Erfindung . ist ein Verfahren zur Expression eines erfmdungsgemäßen Polypepetides in Bakterien, eukaryontischen Zellen, oder in in vitro Translationssystemen.

Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Aufreinigung eines wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben exprimierten Polypeptides.

Bestandteil der Erfindung ist die Verwendung, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder 6 als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenen.

Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines erfindungsggmäßen Proteins als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder

Reportergenproteinen..

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein fluoreszierendes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Einfügung von einer' oder mehrerer Mutationen eine schnellere Faltungszeit im Vergleich zur ursprünglichen Sequenz aufweist.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein fluoreszierendes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es durch

Einfügung von einer oder mehrerer Mutationen eine veränderte Faltungszeit im Vergleich zur ursprünglichen Sequenz aufweist.

Bestandteil der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung eines fluoreszierendes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Einfügung von einer oder mehrerer Mutationen eine

veränderte Faltungszeit im Vergleich zur ursprünglichen Sequenz aufweist, wobei eine oder mehrere Mutationen mit gängigen Mutagenesemethoden eingeführt werden.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfϊndungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als Komponente von Homo- oder Hetero- Di- oder Multimeren fluoreszenter Proteine, welche direkt oder durch Linker miteinander verbunden sind.

Eine Veränderung der RNA-Stabilität oder RNA-Faltung des fluoreszierenden Proteins CGFP oder Mutanten des fluoreszierenden Proteins CGFP kann ebenfalls zu veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften des Proteins führen.

Nukleotid- und Aminosäuresequenzen

Das mutante fluoreszierende Protein imCGFP wird durch die folgende Nukleotidsequenz codiert

_. (SEQ ID NO: 1):

5 ^Λ - . ^{' ■ •}

ATGACTGCACTTACCGAAGGAGCAAAACTGTTCGAGAAAGAAATTCCCTACATTACA G AGTTGGAAGGAGACGTTGAAGGAATGAAATTCATCATCAAAGGTGAAGGTACTGGCG - ACGCTACTACTGGCACCATCAAAGCGAAATATATTTGCACAACTGGTGACCTTCCTGT ACCATGGGCTACCATCTTGAGTAGTTTGTCGTATGGTGTTTTCTGTTTCGCTAAGTATC CACGCCACATTGCCGACTTTTTCAAGAGCACACAACCAGATGGTTATTCACAAGACAG AATCATTAGTTTTGACAATGATGGACAATACGATGTCAAAGCCAAGGTTACTTATGAA AACGGAACACTTTATAATAGAGTCACAGTCAAAGGTACTGGCTTCAAATCAAACGGCA ACATCCTTGGTATGAGAGTTCTCTACCATTCACCACCACACGCTGTCTACATCCTTCCT GACCGTAAAAAΪΌGTGGCATGAAAGCCGAGTACAATAAGTGCTTCSACGTTATGGGC GGTGGTCACCAAATGGCGCGTCACGCCCAATTCAATAAACCACTAGGAGCCTGGGAA.., GAAGATTATCCGTTGTATCATCATCTTACCGTATGGACTTCTTTCGGAAAAGATCCGG ATGATGATGAAACTGACCATTTGACCATCGTCGAAGTCATCAAAGCTGTTGATTTGGA AACATACCGtTAA-3 ^*

Die für die Aminosäurepositionen 164 und 169 kodierenden Nukleotide sind unterstrichen.

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2):

MfALTEGAKLFEKEPYrTELEGDVEGMKFIIKGEGTGDATTGTIKAKYICTTGDLPV PWAT ILSSLSYGVFCFAKYPRHIADFFKSTQPDGYSQDPJISFDNDGQYDVKAKVTYENGTLYN R VTVKGTGFKSNGNILGMRVLYHSPPHAVYlLPDRKNGGMKAEYNKCFDVMGGGHQMAR

HAQFNKPLGAWEEDYPLYHHLTVWTSFGKDPDDDETDHLTIVEVIKAVDLETYR

Die Aminosäurepositionen 164 und 169 sind unterstrichen.

Das fluoreszierende Protein CGFP wird durch die folgende Nukleotidsequenz codiert (SEQ ID NO: 3):

ATGACTGCACTTACCGAAGGAGCAAAACTGTTCGAGAAAGAAATTCCCTACATTACA G

AGTTGGAAGGAGACGTTGAAGGAATGAAATTCATCATCAAAGGTGAAGGTACTGGCG ACGCTACTACTGGCACCATCAAAGCGAAATATATTTGCACAACTGGTGACCTTCCTGT ACCATGGGCTACCATCTTGAGTAGTTTGTCGTATGGTGTTTTCTGTTTCGCTAAGTATC CACGCCACATTGCCGACTTTTTCAAGAGCACACAACCAGATGGTTATTCACAAGACAG AATCATTAGTTTTGACAATGATGGACAATACGATGTCAAAGCCAAGGTTACTTATGAA

AACGGAACACTTTATAATAGAGTCACAGTCAAAGGTACTGGCTTCAAATCAAACGGC A ACATCCTTGGTATGAGAGTTCTCTACCATTCACCACCACACGCTGTCTACATCCTTCCT GACCGTAAAAATGGTGGCATGAAAATTGAATACAATAAGGCTTTCGACGTTATGGGCG GTGGTCACCAAATGGCGCGTCACGCCCAATTCAATAAACCACTAGGAGCCTGGGAAG AAGATTATCCGTTGTATCATCATCTTACCGTATGGACTTCTTTCGGAAAAGATCCGGAT

GATGATGAAACTGACCATTTGACCATCGTCGAAGTCATCAAAGCTGTTGATTTGGAA A CATACCGTTGA-3'.

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 4):

MTALTEGAKLFEKEJPYTTELEGDVEGMKFIIKGEGTGDATTGTRKAKYICTTGDLP VPWAT ILSSLSYGVFCFAKYPRHIADFFKSTQPDGYSQDRΠSFDNDGQYDVKAKVTYENGTLYN R VTVKGTGFKSNGΦ^GMRVLYHSPPHAVYILPDRKNGGMKIEYNKAFPVMGGGHQMAJR. HAQFNKPLGAWEEDYPLYHHLTVWTSFGKDPDDDETDHLTIVEVIKAVDLETYR

Kurzbeschreibung der Figuren

Die Fig. 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-imCGFP.

Die Fig. 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-imCGFP .

Die Fig. 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-CGFP .

Die Fig. 4 zeigt das Spektrum von imCGFP. Anregungsspektrum ( — ); Fluoreszenz ( ); X-

Achse : Wellenlänge in nm; Y-Achse : relative Fluoreszenzintensität.

Beispiele

Beispiel 1

Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pTriplEx2 der Firma Clontech verwendet. Die Klonierung erfolgte in die SfII Position des Expressionsvektors unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden. Das Derivat des Vektors wurde als pTriplEx2-imCGFP bezeichnet. Der Vektor pTriplEx2-imCGFP wurde zur Expression von imCGFP in bakteriellen Systemen verwendet.

Die Fig. 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-imCGFP.

Beispiel 2

Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Die Klonierung erfolgte in die BamHI/Notl Position des Expressionsvektors unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden.. Das Derivat des Vektors wurde als pcDNA3-imCGFP bezeichnet. Der Vektor pcDNA3-imCGFP wurde zur Expression von imCGFP in eukaryotischen Systemen verwendet.

Die Fig. 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3 -imCGFP.

Beispiel 3

Bakterielle Expression

Die bakterielle Expression erfolgte im E. coli Stamm BL21(DE3) durch^ Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTriplEX2-imCGFP und pTriplEX2. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37 ⁰ C für 3 Stunden inkubiert und die Expression für 4

Stunden durch Zugabe von EPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in PBS resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Die Fluoreszenz wurde mit Hilfe eines Fluorometers bestimmt.

Beispiel 4

Eukaryotische Expression

Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-imCGFP, pcDNA3-CGFP und pcDNA3.1(+) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37 ⁰ C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit

Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte im Fluorometer bei Raumtemperatur.

Beispiel 5

Vergleich der fluoreszenten Proteine CGFP und imCGFP

In Tabelle 4 sind die Ergebnisse des Vergleich zusammengefasst. Dargestellt sind die Anzahl der fluoreszenten Zellen nach transienter Transfektion von CHO Zellen mit den Vektoren pcDNA3- CGFP oder pcDNA3-imCGFP oder pcDNA3(+) [ohne cDNA Insertion].

Tabelle 4

Die angegebenen Zahlen in den Spalten pcDNA3-CGFP, pcDNA3-imCGFP und pcDNA3 entsprechen der Anzahl an fluoreszenten Zellen nach transienter Transfektion mit dem entsprechenden Vektor (von 10000 transfizierten Zellen).

Beispiel 6

Untersuchung der maturation time von CGFP und imCGFP

In Tabelle 5 sind die Ergebnisse der Untersuchung zusammengefasst. Dargestellt sind die Anzahl der fluoreszenten Bakterienklone bei 20 ⁰ C und 37 ⁰ C.

Zur Untersuchung wurden jeweils 100 Bakterienklone, die das fluoreszente Protein CGFP (wt) oder eine Mutante des fluoreszenten Proteins CGFP expremieren, bei 20 ⁰ C und 37 ⁰ C inkubiert. Anschliessend wurde die Fluoreszenz der Zellmasse im- Fluorometer bestimmt und die reative Fluoreszenzintensität verglichen. ^■ .

Tabelle 5

Die angegebenen Zahlen in den Spalten 2O ⁰ C und 37 ⁰ C entsprechen der Anzahl an fluoreszenten BakterienHonen nach der Transfektion mit den Vektoren pTriplEx2-CGFP oder ρTriplEx2- imCGFP und anschliessender Induktion.

Beispiel 7

Spektrum des fluoreszierenden Proteins CGFP und imCGFP

Zur Messung des Emissionsspektrums wurden E. coli BL21(DE3) mit den Plasmiden pTriplEX2- CGFP oder pTriplEX2-imCGFP transformiert. Die Induktion erfolgte durch die Zugabe von- 1 mM IPTG und einer Inkubation von 4 Stunden bei 37 ⁰ C. Anschließend wurden die Bakterien geerntet und in PBS resuspendiert. Die Lyse erfolgte durch Ultraschall. Anschließend erfolgte die Messung der Fluoreszenz im Fluorometer.

Die Figur 4 zeigt die Exitation und Emission des imCGFP

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