【발명의 명칭】

돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 및 그 용도

【기술분야】

유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드， 상기

3차원 췌장 오거노이드의 제조 방법， 및 상기 3차원 췌장 오거노이드의 약물 효과 검증 및 /또는 약물 스크리닝을 위한 용도가 제공된다.

【발명의 배경이 되는 기술】

기존 신약개발 연구를 통해 개발된 대부분의 항암 치료제들은 임상에서 부작용이나 낮은 효용성 때문에 실제 암환자들에게 활발하게 활용되지 못하고 있다. 또한 같은 암환자라 하더라도 동일한 항암치료제에 대한 반응성이 상이한 경우가 많아， 환자 개개인의 개별적 반웅성에 대한 연구가 필요한 상황이다.

최근 인간 게놈 프로젝트의 완성을 통해 사람의 유전자 정보에 대한 염기서열 분석 참고 정보;가 축적되었고 (Lander E. S. , Linton L. M.， Birren B. , Nusbaum C. , Zody M. C. , Baldwin J., et al . . (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome . Nature 409, 860-921. 10.1038/35057062), 이로 인해 인간에 대한 whole genome sequencing (WGS)이 점차 접근 가능한 수준으로 도래하여 향후 암 연구에 더욱 활발히 이용될 것으로 기대된다 . 그러나 종전의 이차원적 세포 배양 방법을 통해서 유래된 암세포 조직에 대한 정보들이 정확하게 in vivo 하의 상황을 반영하지 못하여, 새로운 세포 배양 방법에 대한 요구가 확장되고 있다. 이러한 요구를 충족할 수 있는 기술로서 3차원 오거노이드 배양 기술이 대두되고 있다. 3차원 오거노이드는 줄기세포로부터 유래하여 3차원적인 구조를 이루며 자라나는， 특정 장기를 모사하고 스스로 형태를 이루는 세포들을 말한다 (Clevers, H. 2016. Modeling development and disease with organoids . Cell. 165： 1586-1597. http： //dx . doi . org/10.1016/ j . eel 1.2016.05.082) . 이러한 3차원 오거노이드는 유전자 정보를 온전하게 담고 있어 실제 암을 더욱 in vivo 에 가깝게 모델링 할수 있는 시스템이다.

항암 치료 연구에 있어서 가장 중요한 것은 암을 실제와 가깝게 모사하는 in vitro 모델과 in vivo 동물 모델이다. 이러한 암 모델링을 위해 가장 기본적으로 사용되는 방법은 세포배양이다. 쥐나 사람의 조직에서 유래한 암세포주를 단분자층 상태로 지속적으로 배양하여 in vi tro 상에서 관찰 및 실험을 수행할 수 밌도록 구축하는 방법은 현재까지 가장 활발하게 이용되고 있다. 그러나 이러한 이차원적 배양 방법은 세포들이 실제로 3차원 적으로 존재하는 in vivo 상황을 반영하지 못한다는 단점이 있다 (Lee et al . , 2008 ； Vunj ak-Novakovi c and Freed, 1998) . 반면 3.차원 오거노이드 배양 방법을 통해 배양된 세포들은 실제 유래된 환자의 암세포 조직과 거의 유사한 유전자 정보를 가지고 있다 (Dong Gao et al . , 2014. Organoid Cul tures Der ived from Pat ients wi th Advanced Prostate Cancer , Cel l , 176—187， https： //doi . org/10. 1016/j . eel 1 .2014.08.016) . 따라서 이러한 3차원 오거노이드를 이용한 응용연구는 실제 환자에게 맞춤형 의료를 제공하는 발판이 될 것으로 기대된다.

【발명의 내용】

【해결하고자 ^' 하는 과제】

일 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 제공한다.

^' 다른 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는， 3차원 췌장 오거노이드 제조 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 효과 검증용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 약물을 처리하는 단계를 포함하는， 약물 효과 검증 방법 또는 약물 반응성 검증에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.

_. 다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는， 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 핵형을 분석하여 유전형에 따른 오거노이드 핵형 양상을 야생형과 비교하는 단계를 포함하는， 암화 모델로서 오거노이드의 용도 (또는 사용 방법 )을 제공한다. 다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 분열속도 및 양상을 관찰하는 단계를 포함하는， 유전자형에 따른 오거노이드의 성장 확인 방법을 제공한다.

[과제의 해결 수단]

본 발명은 WGS 와 같은 유전자 분석 방법과 유전자 변이 마우스의 일반 조직과 암 조직에서 얻은 오거노이드를 이용해, 암을 in vivo 에 가깝게 모델링 하고， 유전자 변이에 따른 약물 효용성 검증에 유용하게 적용하는 것을 목표로 하고 있다. 본 발명은 WGS 과 유전자 조작 쥐， 사람 환자 유래 오거노이드를 이용해 유전자형에 맞는 drug 처리를 통해 신규한 항암 치료제 검증 방법을 제시하고자 한다. 본 명세서에서 제공되는 유전자 변이 마우스 유래 췌장 오거노이드에서 WGS를 통해 각각의 유전형을 가진 오거노이드를 장기적으로 배양하여 ^' 다른 유전적 변이를 수반하는지 확인하여 암화되는 과정에서의 유전적 변이 축적을 비교할 수 있다.

본 발명은 생체에서 3차원으로 존재하는 생체 조직， 특히 암 조직을 생체와 유사하게 모사 가능한 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 오거노이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

오거노이드는 성체줄기세포 (adul t stem ce l l , ASC) , 배아줄기세포 (embryoni c stem cel l , ESC) , 유도만능줄기세포 ( induced p lur i potent stem cel l , iPSC) 등으로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3차원 세포집합체를 의미한다. 세포를 3차원 배양법으로 다시 웅집 재조합하여 생체 환경과 유사하게 만듦으로써， 2D 배양법으로 배양된 2D 세포주의 한계를 극복하여 생체의 생리활성거능을 유사하게 재현할 수 있어서, 질병 모델링， 약물 스크리닝 등에 적용 가능하다.

본 명세서에 사용된 바로서， 췌장 오거노이드는 췌장 세포 (예컨대, 췌장 성체줄기세포)를 3차원 배양법으로 배양하여 얻어진 3차원 세포 집합체를 의미한다.

일 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 제공한다.

본 명세서에서， 상기 유전자 변이 마우스는 다음의 변이 중에서 선택된 하나 이상의 변이를 갖는 마우스를 의미한다:

( 1) BRCA2 유전자의 변이；

(2) 텔로머라아제 RNA 성분 (Te l omerase RNA component； TERC)의 넉아웃; 및 (3) BubRl 단백질의 아세틸화 잔기의 변이를 유도하는 유전자 변이. 일 구체예에서， 상기 유전자 변이 마우스는

(1) BRCA2 유전자의 변이，

(1) BRCA2 유전자의 변이 및 (2) 텔로머라아제 RNA 성분 (Telomerase RNA component; TERC)의 넉아웃, 또는

(3) BubRl 단백질의 아세틸화 잔기의 변형을 유도하는 유전자 변이 을 포함하는 것일 수 있다.

BRCA2 (breast cancer 2) 유전자는 마우스 ( /s muscu !s)^ 5번 염색체 (Chr 5： 150.52 - 150.57 Mb)에 위치하는 유전자로서， GebBank Accession No. NM_001081001.2 ( NP_001074470.1 암호화 유전자)， GebBank Accession No. NM_009765.3 (NPᅳ 033895.2 암호화 유전자) 등에서 선택된 것일 수 있다. 상기 유전자 변이 마우스에 ^' 있어서， BRCA2 유전자의 변이는 BRCA2 유전자의 엑손 11의 전부 결실을 의미할 수 있다. 일 구체예에서， 상기 유전자 변이 마우스는 특정 조건 결실 마우스， 예컨대， 대립유전자에서 Cre recombinase 매개 액손 11 결실이 유도 (예컨대, 4- Hydroxytamoxifen 과 같은 tamoxifen 류 화합물에 의하여 조건 결실 유도)되는 마우스일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cre recombinase 매개 액손 11 결실 유도를 위하여， 상기 유전자 변이 마우스는 Cre recombinase 유전자가 도입된 것일 수 있으며， 예컨대, 상기 Cre recombinase 유전자 도입은 BRCA2 유전자의 액손 11 결실 마우스와 Cre recombinase 유전자 삽입 마우스의 교배， Cre recombinase 유전자를 포함하는 통상적인 백터 (예컨대 아데노바이러스 백터 등)의 통상적인 방법으로의 도입 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cre recombinase는 Bacteriophage PI 유래의 것일 수 있으며， UniProtKB P06956 (GenBank Accession No. YP_006472.1; 암호화 유전자 (mRNA)： NC 305856.1의 CDS (436..1467))로 표현될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

텔로머라아제 RNA 성분 (Telomerase RNA component； TERC)는 진핵세포에 존재하는 ncRNA (non-coding RNA)로서 , 텔로미어의 연장 활성을 갖는 텔로머라제 (ribonucleoprotein)의 RNA 성분을 의미한다. 마우스 musculus) 텔로머라아제 RNA 성분은 GebBank Accession No. NR— 001579.1에 의하며 암호화되는 RNA 일 수 있다. 상기 유전자 변이 마우스에 있어서， 텔로머라아제 RNA 성분의 넉아웃은 상기 텔로머라아제 RNA 성분의 전장 RNA 서열 (397nt) 중 하나 이상의 RNA 의 결실 또는 원래 염기와 다른 종류로의 치환을 의미하는 것일 수 있으며， 예컨대， 전장 RNA 서열의 넉아웃 (결실), 타겟팅 백터를 이용한 TERC 유전자의 대체 (replacement) 등일 수 있다. 상기 BubRl (mitotic checkpoint serine/threonine kinase; Bublb)은 spindle checkpoint 작용 및 염색체. 분리에 수반되는 카이네이즈를 암호화하는 유전자로서， kinetochore 에 위치하고， anaphase— promot ing complex/cyclosome (APC/C) 억제 및 세포분열 후기 (anaphase) 진입을 지연시키는 작용을 하고， spindle checkpoint 기능 이상이 다양한 암에서 관찰된다. 마우스 musculus) BubRl 유전자는 GebBank Accession No. 匪_009773.3 (NP_033903.2 암호화 유전자)일 수 있다. 상기 유전자 변이 마우스에 있어서， 상기 BubRl 유전자는 아세틸화 잔기가 치환된 BubRl 단백질을 암호화하도록 변형된 것일 수 있으며， 상기 아세틸화 잔기는 예컨대， NP— 033903.2의 아미노산 서열 중 243번째 아미노산 잔기 라이신 00 (K243)일 수 있으며， 상기 변이는 상기 아세틸화 잔기 (예컨대， K243)의 아세틸화를 억제하는 변이일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 BubRl 유전자 변이는 BubRl 단백질의 K243이 아르기닌 (R)로 변형된 변형 BubRl 단백질을 암호화하도록 변이된 것일 수 있다.

상기와 같은 유전자 변이 마우스의 췌장으로부터 생성된 오거노이드는 야생형 마우스 (상기 변형을 갖지 않는 마우스)와 비교하여 생체 환경 모사 능력이 우수하며， 특히 생체 내 암 환경을 보다 유사하게 모사할 수 있어서， 항암제 등의 다양한 약물 효과 (반옹성) 시험 및 /또는 약물 스크리닝에 보다 유라하게 적용될 수 있다 .

다른 예는 유전자 변이 마우스의 췌장 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는， 3차원 췌장오거노이드 제조 방법을 제공한다.

상기 유전자 변이 마우스는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 3차원 배양 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(i) 유전자 변이 마우스로부터 분리한 췌장 조직을 해리시키는 단계;

(ii) 상기 해리된 췌장 조직으로부터 췌관세포 (ductal cell)를 포함하는 세포 펠렛을 수집하는 단계; 및

(iii) 상기 수집된 세포 펠렛을 생체 기질 물질과 함께 배양하는 단계.

상기 췌장 조직을 해리시키는 단계 (단계 (i))은 췌장 조직에 해리 용액을 처리하여 사용하여 수행할 수 있다. 상기 해리 용액은 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (예컨대， ltnl 내지 10ml， lml 내지 5ml， 3ml 내지 10ml， 또는 3 내지 5m , 콜라게나아제 (예컨대 , 콜라게나아제 P) (예컨대， 0.1mg/ml 내지 5mg/ml, O.lmg/ml 내지 3mg/ml, 0.5mg/ml 내지 5mg/ml , 0.5mg/ml 내지 5mg/ml , 0.5mg/ml 내지 2tng/ml , 또는 0.8mg/ml 내지 1.5mg/ml), DNase (예컨대， DNase 1) (예컨대， 0.01mg/ml 내지 lmg/ml， 0.01mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.0 lmg/ml 내지 0.2mg/ml, 0.05mg/ml 내지 lmg/ml , 0.05mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.05mg/ml 내지 0.2mg/ml, 또는 0.08mg/ml 내지 0.15mg/ml) 등을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서， 상기 해리 용액은 췌장 조직 (Vpan= 약 1.08mg/匪 ³ )에 대하여 0.5 내지 5 ml, 0.5 내지 4 ml, 0.5 내지 3 ml, 1 내지 5 ml， 1 내지 4 ml, 또는 1 내지 3ml 의 양으로 사용할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니고, 췌장 조직의 양에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다. 이 때， 조직의 해리를 보다 용이하게 하기 위하여， 물리적 해리 (예컨대， 가위， 나이프 등으로 잘게 절단하는 단계 등)를 해리 용액 처리와 동시에 또는 순서에 관계없이 이시적으로 수행할 수 있다.

상기 췌관세포 (ductal cell)를 포함하는 세포 펠렛을 수집하는 단계 (ii)는 해리된 췌장 조직으로부터 췌관세포 (ductal cell)를 분리하는 단계 (ii-1) 및 상기 분리된 췌관세포를 원심분리하여 세포 펠렛을 수집하는 단계 (ii-2)를 포함할 수 있다. 상기 해리된 췌장 조직으로부터 췌관세포를 분리하는 단계. (ii-1)은 상기 단계 (i)에서 얻어진 해리된 췌장 조직을 여과시켜 통과하지 못한 세포들 중에서 췌관세포를 분라하여 취하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 여과는 췌관세포를 통과시키자 않는 크기 (예컨대，

50卿 내지 200//m, 50m 내지 170/iin, 50//m 내지 150/zm, 50zm 내지 120卿,

80； 내지 200 ， 80/m 내지 170 m, 80im 내지 150^m, 80 내지 120 ， 또는 90 ^' 내지 110 )의 공극 (pore)을 갖는 통상의 세포 여과기를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 췌관 세포의 분리는 현미경 관찰 등 통상의 세포 확인 수단에 의하여 수행될 수 있다. 상기 세포 펠렛을 수집하는 단계 (ii-2)는 상기 (ii-1)에서 분리된 췌관세포를， 예컨대， lOOOrpm 내지 2000rpm, lOOOrpm 내지 1800rpm, lOOOrpm 내지 1600rpm, 1200rpm 내지 ^" 2000rpm, 1200rpm 내지 1800rpm, 1200rpm 내지 _. 1600rpm, 1400rpm 내지 2000rpm, 1400rpm 내지 . 1800rpm, 또는 1400rpm 내지 1600rpm으로 1 내자 20분， 1 내지 15분， 1 내지 12분, 5 내지 .20분， 5 내지 15분， 5 내지 12분, 8 내지 20분， 8 내지 15분， 또는 8 내지 12분 동안 원심분리하여 펠렛을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 수집된 세포 펠렛을 생체 기질과 함께 배양하는 단계 ( i)에서 상기 생체 기질은 매트리젤 (Matrigel), 세포외기질 (Extracellular matrix; ECM), 기저막 추출물 (Basement Membrane Extract; BME), 히알루론산 (hyaluronic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 매트리젤은 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종 세포에서 분비되는 젤라틴 유사 단백질 흔합물을 의미한다. 상기 세포외기질은 세포에서 합성되고 세포외에 분비， 축적된 분자들을 포함하는 생체 고분자의 집합체로서， 콜라겐， 엘라스틴 등의 섬유성 단백질， 글리코사미노글리칸 등의 복합 단백질， 피브로넥틴， 라미닌 둥의 세포 부착성 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. ^· 상기 단계 (iii)의 배양은 통상적인 세포 배양 조건， 예컨대， 35 내지 36 ^° C 및 8 내지 12% C0 ₂ 조건에서 진행될 수 있다. 또한， 상기 배양 기간은, 계대 배양 전까지 1 내지 14일， 1 내지 10일， 1 내지 7일, 3 내지 14일， 3 내지 10일 또는 3 내지 7일 동안 수행할 수 있으며， 그 이후， 1 계대 당 1 내지 14일, 1 내지 10일， 1 내지 7일， 3 내지 14일， 3 내지 10일 또는 3 내지 7일씩 계대배양을 1회 또는 2회 이상 반복하여 최대 12개월, 9개월， 또는 6개월까지 지속적으로 배양하는 것도 가능하다. 상기 배양에 사용되는 배지는 Advanced DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12) , penici 11 in/ streptomycin, HEPES(Hank' s Balanced Salt Solution), GlutaMAX, N ^ᅩ 아세틸시스테인 (N—acetylcysteine)， 조건배지 (예컨대， ^■ Rspol— conditioned medium) , 니코틴아미드 (nicotinamide) , 가스트린 (예컨대， 가스트린 1)， 성장인자 (예컨대， EGF, FGF 등)， Noggin, Noggin-조건배지 둥으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

앞서 설명한 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를는 상기 3차원 췌장 오거노이드 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 효과 검증용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노아드에 약물을 처리하는 단계를 포함하는， 약물 효과 검증 방법 또는 약물 효과 검증에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 약물은 췌장 질환의 치료 약물， 예컨대, 앞서 설명한 BRCA2 변이， 텔로머라아제 RNA 성분 (Telomerase RNA component； TERC) 변이， 및 /또는 BubRl 변이와 관련된 췌장 질환에 대한 치료 약물일 수 있으며， 예컨대 췌장암에 대한 항암제일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 약물은 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (hi stone deacetyl ase inhibi tor ; HDACi； 예컨대 , Tr i chostat in A (TSA) , suberoyl ani 1 ide hydroxami c acid (SAHA) , LMK-235 , FK-228 (Romidepsin) 등) , PARP-1 (Poly [ADP-r ibose] polymerase 1) 억제제 (예컨대， 올라파립 (Olapar ib) , Vel i ar ib (ABT-888) , Inipar ib (BSI—201) 등)， plkl (polo-l ike kinase 1) 억제제 (예컨대， BI2536 , Volasert ib (BI 6727) , Rigosert ib (ON-01910) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 아상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물 효과는 약물이 달성하고자 하는 생체 작용을 의미하는 것으로， 상기 췌장 질환 (예컨대, 췌장암)의 경감， 완화， 치료 등의 효과를 의미할 수 있고， 상기 췌장 질환이 췌장암인 경우， 상기 약물 효과는 췌장암의 경감， 제거， 진행 또는 전이 억제 등을 의미하는 것일 수 있다.

상기 3차원 ^, 췌장 오거노이드에 약물 처리시 그 크기 및 /또는 개수가 감소한 경우, 상기 약물은 췌장 질환 (예컨대， 췌장암)에 효과가 있는 것으로 결정 (또는 판단)할 수 있다. 따라서， 상기 검증 방법 또는 검증에 정보를 제공하는 방법은， 상기 약물을 처리하는 단계 이후에， 먁물.처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수를 측정하여， 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 위하여， 상기 비교하는 단계는 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 단계는 약물—처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수를 측정하는 단계와 동시에 또는 순서에 상관없이 이시적으로 수행될 수 있다. 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드는 상기 약물 처리 전의 3차원 췌장 오거노이드 또는 3차원 췌장 오거노이드 중 일부에 약물을 처리하고 남은 일부의 3차원 췌장 오거노이드일 수 있다. 또한， 상기 검증 방법 또는 검증에 정보를 제공하는 방법은， 상기 비교하는 단계 이후에， 상기 약물이 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수가 상기 약물이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하여 감소한 경우, 상기 약물을 췌장 질환 (예컨대， 췌장암)에 효과가 있는 것으로 결정 (또는 판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드를 포함하는 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드에 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 후보 물질은 모든 생체 활성 물질 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 생체활성의 소분자 화합물 (smal l mo lecular chemi cal ) 펩타이드， 단백질 (예컨대， 항체， 기타 단백질 약물 등)， 핵산분자， 추출물 (예컨대, 동물 또는 식물 추출물) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 약물 스크리닝 방법은 췌장 질환에 대하여 치료 효과를 갖는 약물을 스크리닝하기 위한 것일 수 있다. 상기 췌장 질환은 앞서 설명한 BRCA2 변이， 텔로머라아제 RNA 성분 (Telomerase RNA component； TERC) 변이， 및 /또는 BubRl 변이와 관련된 췌장 질환일 수 있으며 예컨대 췌장암일 수 있다.

상기 3차원 췌장 오거노이드에 후보 물질 처리시 그 크기 (또는 부피 이하 '크기 ¹ 는 부피를 포함하는 의미로 사용됨) 및 /또는 개수가 감소한 경우， 상기 후보 물질은 췌장 질환 (예컨대， 췌장암)에 효과가 있는 약물로 결정 (또는 판단)할 수 있다. 따라서, 상기 스크리닝 방법은, 상기 후보 물질을 처라하는 단계 이후에 , 후보 물질 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수를 측정하여, 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 위하여, 상기 비교하는 단계는, 상기 후보 물질이 처라되지 않은 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며， 이 단계는 후보 물질 처리된 3차원 ^' 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수를 측정하는 단계와 동시에 또는 순서에 상관없이 이시적으로 수행될 수 있다. 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드는 상기 후보 물질 처리 전의 3차원 췌장 오거노이드 또는 3차원 췌장 오거노이드 중 일부에 후보 물질을 처리하고 남은 일부의 3차원 췌장 오거노이드일 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법은， 상기 비교하는 단계 이후에， 상기 후보 물질이 처리된 3차원 췌장 오거노이드의 크기 및 /또는 개수가 상기 후보 물질이 처리되지 않은 3차원 췌장 오거노이드와 비교하여 감소한 경우， 상기 약물을 췌장 질환 (예컨대, 췌장암)에 효과가 있는 후보 약물로 결정 (또는 판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 핵형을 분석하여 유전형에 따른 오거노이드 핵형 양상을 야생형과 비교하는 단계를 포함하는， 암화 모델로서 오거노이드의 용도 (또는 사용 방법)을 제공한다.

다른 예는 상기 유전자 변이 마우스의 췌장 유래의 3차원 췌장 오거노이드의 분열속도 및 양상을 관찰하는 단계를 포함하는， 유전자형에 따른오거노이드의 성장 확인 방법을 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명은 유전자 생체 모사도가 우수한 변형 마우스의 췌장 유래의

3차원 췌장 오거노이드， 그 배양방법， 및 그 용도를 제공하는 것으로， 상기 3차원 췌장 오거노이드는 약물 처리 후의 약물 효용성 (효과， 반웅성) 검증 및 /또는 약물 스크리닝에 유용하게 적용될 수 있다. 또한， 오거노이드의 - 유전자형 분석을 통한 핵형 분석， 분열속도 및 양상 관찰에도 적용 가능하다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 BRCA2 및 /또는 TERC 유전자 결실 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드의 배양 모습을 도립 현미경 (Zeiss)을 통하여 관찰한 이미지이다.

도 2a 는 오거노이드에서의 유전자 변이 (BRCA2 유전자의 액손 11 결실 , 및 CreER™ 유전자 삽입 :reEl ^ 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M: band size 구분을 위한 DNA marker , DW(disti 1 led water): PCR 의 negative control, WT: wild-type, Brca ^11/F11' . Brca2 exon 11 번에 loxP 가 flank 된 것을 확인한 band, »7 ^/_ : TERC 유전자가 knockout 된 것을 확인한 band, Cre-Elf ^M Cre recombinase 유전가 삽입된 것을 확인한 band).

도 2b 는 도 2a 에서 BRCA ^11/F11 유전형을 가진 것으로 확인된 오거노이드에 4-0HT 처리 여부에 따른 PCR 산물을 보여주는 젤 전기영동 결과로서, (―)는 4-0HT 를 처리하지 않은 경우의 결과이고， (+)는 4— 0HT 를 처리하여 BRCA2 유전자의 액손 11의 결손을 유도한 경우의 결과이다.

도 3은 BubRl의 K243R 변이 유전자 이식된 변이 마우스 유래 췌장 오거노이드 배양 결과를 도립 현미경 (Zeiss)을 통하여 관찰한 이미지이다. 도 4는 유전자 변이 마우스 BubRl ^K243R/ 유래 췌장 오거노이드에서의 BubRl의 K243R 변이 유전자의 삽입 여부를 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M: band size 구분을 위한 DNA marker , DW(dist i 1 led water)： PC 의 negative control ) .

도 5는 BRCA2 유전자 결실 ^^^^ _rca ^11/F11 ;CreElf ^M ) 유래 췌장 오거노이드에 histone deacetylase inhibitor (HDACi)를 처리한 모습을 보여주는 사진이다.

도 6은 BRCA2 유전자 결살 ^^스 Brca ^11/FU ;CreEl ^M ) 유래 췌장 오거노이드에 PARP-1 inhibitor 또는 plkl inhibitor 를 단독 또는 histone deacetylase inhibitor (HDACi)와 함께 처리한 모습을 보여주는 사진이다. 도 7은 IncuCyte S3 Live—Cell Analysis System (Essen bioscience) 장비를 이용하여 Live cell tracking 을 통해 야생형 유전자를 가진 마우스 췌장 오거노이드에 TSA Trichostatin A) 를 luM 처리 후 24시간 동안 관찰한 결과이다 (Scale bar: 2.1隱) .

도 8은 교배를 통해 3번의 세대를 거친 (G3) Brca ^n/Fn ; mW^；

Cre-ER™ 마우스로부터 췌장 오거노이드에 4-Hydroxytamoxi f en(4— 0HT)를 처리 여부에 따른 오거노이드 성장 정도를 보여주는 사진이다.

도 9는 BubRl ^K243R/+ 마우^ 유래 췌장 오거노이드의 면역형광분석 결과를 보여주는 형광 이미지로서， 왼쪽은 야생형 마우스 유래 췌장 오거노이드의 결과를， 오른쪽은 BubRl ^K243R/+ 아 一^ 유래 췌장 오거노이드의 결과를 각각 보여준다.

.【발명을 실시하기 위한구체적인 내용】

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나， 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1: 유전자 이식 쥐에서 유래한 췌장오거노이드의 구축 박테리오파지 P1을 이용한 Cre-loxP recombination 을 통하여 BRCA2 유전자의 _exon 11 위치에 ΙοχΡ 를 측면 위치시켜 CreER recombinase 를 이용한 조건적인 BRCA2의 결손 유도가 가능한 ᅳ ᅳ Brca ^11FfU 엑손 11 결실) (Jos Jonkers , Ral h Meuwissen, Hanneke van der Gulden, Hans Peterse, Martin van der Valk and Anton Berns . 2001. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer . Nature Genetics. Vol . 29, pages 418-425) , Telomerase RNA component (TE C) 유전지 ^를 knockout 시켜 telomerase 의 활성을 상실시킨 마우스 OT — )， 및 CMV promoter 를 가진 CMV— Cre 마우스 iCreElf ^M )^ 준비하였다.

1.1. BRCA2의 액손 11타겟팅 백터 제작

BRCA2 locus 를 타겟팅하기 위하여， genomic 129/Sv 1 ibraryCAgi lent technologies)로부터 마우스 BRCA2 유전자 (匪 _001081001.2)의 액손 8-12를 포함하는 13.5-kb 람다 파지 클론을 분리하고， 상기 phage inset 를 Not I 로 절제하고 pGEM5 (Promega)에 서브클로닝한 후， loxP—PGKneor—PGKtk— ΙοχΡ dual selection cassette (Thermo fisher scientific)를 마우스 BRCA2 유전자의 인트론 11의 Avrll 위치에 삽입하고， 인트론 10의 NspV 위치에 단일 ΙοχΡ 부위를 상기 floxed selection cassette 와 direct orientation으로 삽입하였다.

1.2. Telomerase RNA component (TERC) 유전자타겟팅 백터 제작

Telomerase RNA component (TERC) 유전자 (GebBank Accession No.

NR— 001579.1)가 완전히 결실된 마우스로서， Jackson lab (Stock No: 004132, B6.Cg-TerctmlRdp/J)에서 입수하여 하기 실험에 사용하였다.

1.3. BRCA2의 엑손 11결실 마우스 Brca ^11/F11 ;CreEl )^ 제작

상기 실시예 1.1에서 준비된 백터를 분리 및 정제하고 E14 subclone IB10의 129/Ola 유래 마우스 배아줄기세포 (ES cells) (The Netherlands Cancer Institute)에 전기천공으로 도입하였다. Southern blot 에 의하여 floxed selection marker 와 ΙοχΡ 부위가 정확하게 삽입된 콜로니를 선별하고， Cre 발현 플라스미드 pOG231 (Addgene) 및 PGKpuro (Addgene)를 10:1의 몰비로 흔합한 흔합물을 상기 배아줄기세포에 전기천공으로 도입시켜 일시적으로 Cre recombinase 활성 — 및 퓨로마이신 내성을 유도하였다. 전기천공 20시간 후， 퓨로마이신 (1.8/zg/ml)을 배지에 첨가하여 48시간 동안 배양하고， 사멸 세포를 제거하고 생존 배아줄가세포를 non-selective 배지에서 10일 동안 추가 배양하였다. 얻어진 배아줄기세포 클론을 Southern blotting 으로 분석하여 floxed marker 의 성공적 결실, 단일 ΙοχΡ 부위의 삽입, 및 조건적 대립유전자 생성을 확인하였다.

상기 얻어진 mutant 129/Ola 배아줄기세포 12 내지 15개를 C57B1/6 blastocysts 내에 주입하여 germline chimera 를 생성시키고， 이를 FVB/N 마우스 (Jackson Laboratory)와 교배하여 비근교계 이종접합 자손 (outbred heterozygous offspring)을 생산하였다 (BRCA2 conditional mutant). 상기 얻어진 BRCA2 conditional mutant ¾ Cre 마우스 (CMV promoter 를 가진 CMV- Cre 마우스 iCreElf ^M Y, Jackson Laboratory, Stock No. 004847)와 교배하여 germline 에서 floxed 대립유전자의 Cre-매개 결실을 수행하여， BRCA2 조건 결실 마우스 ;πΠΫ ^/+ ;CreElf ^M 표시 )를 제작하였다.

1.4. BRCA2의 액손 11 결실 및 TERC 유전자 knockout 마우스 {Brca^ ^11/Fn . -mW^ XreEi )≤ί 제작

상기 실시예 1.3에서와 같이 Brca ^u/F11 마우스를 ^ ^마우스와 교배하여 나온 손으— —^^Brca ^11/FU ;CreElf ^M 마우스를 얻고， 이 Brca ^11/F11 ;CreE^ ^M 마우스를 m ^/+ 마우스 (실시예 1.2)와 교배하여 얻은 자손들로부터 Brca ^11/F11 ;CreElf ^M ; »7 마우스를 얻고， 이들을 교배하여 멘델리안 확를로 마우스를 얻었다.

1.5. BubRl의 K243R 변이 유전자가 이식된 마우스 (BubRl^^^)의 제작

site-directed mutagenesis를 통해， BubRl (GenBank NP_033903.2; 코딩 유전자: NM_009773.3)의 243 번째 라이신 (K)이 아르기닌 (R)으로 치환 (K243R)을 유도하도록 변이된 BubRl 유전자를 pBluescript KS (+) 백터 (Addgene)를 사용하여 129/Sv embryonic stem (ES) cell (Agilent Technologies)에 삽입하고， 이것을 C57BL/6 마우스의 blastocysts 에 주입하여， K243R 변이를 갖는 BubRl을 암호화하는 변이 유전자가 이식된 heterologous 변이 마우스 Βίώΐ ^Κ243Κ/+ 를 얻었다 (Inai Park et al . 2013. Loss of BubRl acetylation causes defects in spindle assembly checkpoint signal ing and promotes tumor format ion. Journal of Cell Biology. 202 (2)：295 참조).

실시예 2: BRCA2 및 /또는 TERC 유전자 결실 돌연변이 마우스 유래 췌장오거노이드 제작

상기 실시예 L3, 및 실시예 1.4에서 제작한 각각의 돌연변이 마우스로부터 하기하는 방법으로 췌장 오거노이드를 제작하였다:

각각의 마우스를 안락사시킨 후 해부하여 췌장 조직을 얻었다. 해리용액 (Dissociation solution)으로서 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; GIBC0®) 3~5 ml, collagenase P (Roche) lmg/ml 및 DNase KSigma Aldrich) O.lmg/ml 를 흔합한 흔합물을 37 ^° C water bath 에서 데워서 준비하였다. 상기 얻어진 마우스 췌장 조직 전체 (Vpan=1.08mg/隱 ³ )을 100 麵 Petri dish 에 옮긴 후， 상기 준비된 해리용액 lOOul 를 넣고 가위나 나이프를 이용하여 5-10회 잘게 절단하였다. 잘게 절단된 췌장 조직 (^ =1:081 /隱 ³ )을 50ml 코니칼 튜부 (conical tube)로 옮기고， 여기에 해리용액 3 내지 5ml 를 넣고， 상기 튜브를 230 rpm 및 37 ^° C의 진탕배양기에 넣어 인큐베이션하고， 10 내지 15분 후 꺼내어, 여기에 차가운 FBS 10-15 ml 를 넣어주었다. 100 세포여과기 (cell strainer)에 상기 얻어진 해리된 췌장조직을 통과시키고， HBSS를 이용해 2- 3 번 세척하였다. 세포여과기를 통과하지 못한 췌장 조직을 현미경으로 관찰하여 ductal cell 을 골라 picking하였다. Picking 된 ductal cell 을 1500rpm 으로 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 수집한 후， HBSS 로 세척하는 과정을 2회 반복하였다.

얻어진 cell pellet 와 matrigel (Corning) 200ul 을 cell pellet 과 matrigel 의 부피비가 1:5이 되도록 흔합한 후， 각각 12 well 또는 24 well plate 에 각 웰당 (12 well plate 기준 100— 150ul) 의 양으로 seeding하였다. Seeding후 약 한 시간 뒤， matrigel 이 굳으면 배지를 12 well plate 기준 1ml， 24 well plate 기준 500ul 의 양으로 넣고 37 ^° C 및 10% C0 ₂ 의 인큐베이터에서 48-72시간 이상 동안 인큐베이팅 하였다. 이 때 사용된 배양 배지 조성은 다음과 같다: Advanced DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F_12; Thermo Fisher Scientific)에 l%(vol/vol) penicillin/streptomycin, lOmM HEPES, 1% GlutaMAX, 1:50 B27 supplement (Gibco) , 1 mM N— acetylcysteine, 5%(vol/vol ) Rspol— condit ioned medium(Hans CI ever s lab) , 10 mM nicotinamide, 10 nM recombinant human [Leul5]-gastr in KSigma Aldrich) , 50 ng/ml recombinant mouse EGF(Peptron) , 100 ng/ml recombinant human FGFlO(Peptron) , ^' 및 25 ng/ml recombinant human Noggin(Peptron) 또는 5%(vol/vol ) Noggin一 condit ioned. medium(Hans CI ever s lab)을 흔합.

BRCA2 유전자 및 /또는 TERC 유전자의 결실을 유도하기 위하여， 오거노이드에 4-Hydroxytamoxifen(4-0HT)를 처리하였다. 구체적으로， 마우스에서 최초로 췌장을 분리한 후 오거노이드로 배양 구축 후 24-48시간 경과한 시점부터 하기의 (실시예 4 및 5 참조) 약물 스크리닝을 위한 약물 처리 시점 직전까지， 상기 오거노이드 배양액에 4— Hydroxy tamoxifen (4— OHT)를 400nM이 되도록 녹여서 3주 이상 배양하였다.

상기와 같은 췌장 오거노이드 배양 결과를 Inverted microscope (Zeiss)로 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이， BRCA2 유전자 및 /또는 TERC 휴전자의 결실 여부 (4-0HT 처리 여부)와 무관하게, 췌장 오거노이드가 성공적으로 생성됨을 확인할 수 있다. BRCA2 유전자 ^' 가 결손된 오거노이드는 다소 형태가 작았지만 점차 배양하게 되면서 야생형과 비슷한 양상으로 성장함을 확인할 수 있다.

상기 얻어진 췌장 오거노이드를 lysis 하여 추출한 genomic DNA 에 대하여 genomic PCR DNA 젤 전기영동을 수행하여 , 상기 오거노이드의 유전자 ¾을 확인하였다. 구체적으로， 95 ^° C에서 denature 1분， 55 ^° C에서 annealing 30 초， 72 ^° C에서 elongation 1분씩 을 30 cycle 반복하여 PCR 하였고， 전기영동은 l%(w/v) agarose gel 에 PCR product 5ul 를 5ul 의 Bromophenol blue 흑은 xylene 과 섞어 100mV 로 전기영동 하였다. 이 때 사용된 프라이머는 다음과 같다:

[표 1]

상기 얻어진 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a는 오거노이드에서의 유전자 변이 (BRCA2 유전자의 엑손 11 결실 Brca ^11/F11 TERC 유전자의 knockout (mT^l , 및 CreER™ 유전자 삽입 iCreEl )을 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 ('M: band size 구분을 위한 DNA marker , DW: PCR 의 negative control, WT: wild- type, Brca ^11/Fn : Brca2 exon 11 번에 loxP가 flank된 것을 확인한 band, mT^ ^' : TERC 유전자가 knockout 된 것을 확인한 band, Cre-El Cre recombinase 유전가삽입된 것을 확인한 band). 도 2b는 도 2a에서 BRCA ^11/F11 유전형을 가진 것으로 확인된 오거노이드에 4-0HT 처리 여부에 따른 PCR 산물을 보여주는 젤 전기영동 결과로서, (ᅳ)는 4-0HT를 처리하지 않은 경우의 결과이고, (+)는 4-0HT를 처리하여 BRCA2 유전자의 엑손 11의 결손을 유도한 경우의 결과이다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 4-0HT를 처리한 경우, 4— 0HT를 처리하지 않은 경우와 비교하여 PCR 산물의 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있으며， 이는 BRCA2 유전자의 액손 11의 결손을 나타낸다.

실사예 3: BubRl의 K243R 변이 유전자 이식된 heterologous 변이 마우스유래 췌장오거노이드 제작

실시예 2의 방법을 참조하여， 상기 실시예 1.5에서 제작한 BubRl의

K243R 변이를 유도하는 변이 유전자가 knock-in 된 heterologous 변이 마우스 (BubRl ^K243R/+ )로부터 췌장 오거노이드를 제작하였다. 비교를 위하여， 야생형 마우스 유래의 췌장 오거노이드를 실시예 2를 참조하여 제작하였다. 상기 얻어진 췌장 오거노이드를 Inverted mi croscope (Zei ss)로 관찰한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이， 아생형 마우스와 마찬가지로， 변이 마우스 (BubRl ^K243R/+ )로부터 성공적으로 췌장 오거노이드를 생성할 수 있음을 확인할 수 있다.

상기 얻어진 췌장 오거노이드를 lysi s 하여 추출한 genomi c DNA 에 대하여 genomi c PCR DNA 젤 전기영동을 수행하여， 상기 오거노이드의 유전자형을 확인하였다. 구체적으로， 95 ^° C에서 denature 1분， 55 ^° C에서 anneal ing 30 초， 72 ^° C에서 elongat ion 1분씩 을 30 cyc le 반복하여 PCR 하였고, 전기영동은 1% agarose gel 에 PCR product 5ul 를 5ul 의 Bromophenol blue 혹은 xylene 과 섞어 100mV 로 전기영동 하였다. 이 때 사용된 프라이머는 다음과 같다:

[표 2]

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 유전자 변이 마우스 BLibRf ^243R 유래 췌장 오거노이드에서의 BubRl의 K243R 변이 유전자의 삽입 여부를 확인한 젤 전기영동 결과를 보여주는 사진이다 (M : band s i ze 구분을 위한 DNA marker DW: PCR 의 negat ive control ) . 도 4의 BubRl ^K243R/+ 으―로 표기된 레인에서 확인되는 바와 같이, 145bp 및 219bp에서 밴드가 관찰되며， 이는 해당 유전자의 knock-in 이 성공적으로 일어나 있음을 의미한다.

실시예 4: 돌연변이 마우스 유래 췌장 오거노이드의 약물 반웅성 시험

상기 실시예 2의 방법을 참조하여， BRCA2 유전자 결실 유래 췌장 오거노이드를 준비하고, BRCA2 유전자의 부분적 결실 (엑손 11의 결실)을 유도하기 위하여， 4- Hydroxytamoxi fen — 0HT)를 400nM의 양으로 첨가하여 3주 이상 배양하였다 (상기 실시예 2 참조) . 비교를 위하여， 4-0HT 처리되지 않은 오거노이드 (BRCA2 유전자가 정상임)를 함께 준비하였다.

BRCA2 유전자가 정상인 오거노이드 (4-0HT 미처리) 및 BRCA2가 부분적으로 결실된 (액손 11 결실) 오거노이드를 동일한 양으로 24 wel l pl ate 에 seeding 하였다. Seeding 한 다음 날， 항암제인 hi stone deacetylase inhibi tor (HDACi )를 에 배양 배지 (실시예 2 참조)와 흔합하여 오거노이드에 처리하였다. 이 때 사용된 HDACi 종류와 처리 농도를 아래의 표 3에 나타내었다:

[표 3]

이 때 이미 BRCA2 가 knockout 된 췌장 오거노이드에 HDACi와 4- 0HT의 처리는 동시에 수행하지 않았다.

HDACi 처리 ( 1차 처리) 3일 후에 배양 배지를 새 배지로 교체하고 각

HDACi를 표 3에 기재된 농도로 다시 처리 (2차 처리)하였다. 다만 오거노이드 seeding 후 24—48 시간 정도 시간이 지난 후 첫번 째 HDACi 를 처리하였고 그로부터 3일 뒤 2차 처리를 하였습니다. HDACi 의 1차 처리 후 6일 되는 시점에 도립 현미경을 이용하여 상기 HDACi 처리된 오거노이드의 모습을 관찰하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이， 시험된 약물에 대한 반웅성이 BRCA2 유전자 유무에 따라 상이하게 나타나는 것을 관찰하였고， 이를 통해 Brca 靡 ¹ 마우스 췌장 오거노이드가 BRCA2 유전자와 관련된 약물의 효과 확인 및 /또는 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.

또한， 상기한 방법으로， PARP-1 inhibitor 인 Olaparib (10uM), 또는 plkl inhibitor 인 BI2536(10nM)을 단독 또는 HDACi (TSA 200nM)와 조합하여 처리한 경우의 오거노이드의 모습을 관찰하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이， 시험된 약물에 대한 반웅성이 BRCA2 유전자 유무에 따라 상이하게 나타나는 것을 관찰하였고， 이를 통해 Brcaf ^11/Fn 마우스 췌장 오거노이드가 BRCA2 유전자와 관련된 약물의 효과 확인 및 /또는 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있다. 또한， IncuCyte S3 Live—Cell Analysis System (Essen bioscience) 장비를 이용하여 Live cell tracking 을 통해 야생형 유전자를 가진 마우스 췌장 오거노이드에 TSACTrichostatin A) 를 luM 처리 후 24시간 동안 관찰한 결과를 도 7에 나타내었다. 각각와 이미지는 4시간 단위로 촬영된 이미지이다. Scale bar 는 2.1画를 나타낸다.

실시예 5. Brca ^11/FU ； ;Cre-EI^ 췌장 오거노이드를 지속 배양하여 대안적 텔로미어 유지기작 (Alternative Lengthening of Telomeres; ALT)에 의한 암화를모사하는모델 구축

Brca^ ^11/FU ^TR —； Cre-E ^M ^^스 교배를 통해 3번의 generation 을 거쳐 얻어진 Brca ^11/FU ^TR ;Cre-Elf ^M genea/urn 3 (G3) 마우스의 췌장 오거노이드를 통해 telomerase 없이 telomere의 길이를 유지하여 지속 분열하는 alternative lengthening of telomeres (ALT) 기작을 모사하는 암 모델을 구축하였다. 기존의 ALT 연구에서 사용된 이차원 배양 ALT 세포주가 가지는 단점， 즉 유전체적 변이가 이미 축적되어 있고, 체내 환경적 특성을 모두 반영하지 못한다는 단점을 극복하기 위해， Brca2Fll/Fll;mTR-/-;Cre-ERTM 마우스의 3중 교배를 통한 ALT 유도 마우스 (G3)를 제작하였다. 또한, 해당 마우스에서 장기의 체내환경을 모사하고 성장 저해 여부를 직접적으로 확인할 수 있는 췌장유래 오거노이드를 구축하고， 실제 ALT가 유도되어 텔로머레이즈의 결손으로 인한 성장 저해가 극복되는 것을 확인하였다.

상기 마우스 췌장 오거노이드 ALT 모델 구축을 위하여， 실시예 2를 참조하여， 교배를 통해 3번의 세대를 거친 (G3) Brcaf ^n/FU ; mT ^； Cre- EJ ^M 마우스로부터 췌장 오거노이드를 구축한 후， tamoxifen (4-0HT)를 미처리 혹은 처리하여 Brca2 결손을 유도하지 않거나 유도하였다. 4-0HT 처리량은 400nM로 하였으며， 췌장 오거노이드를 plate 에 seeding 하고 하루 뒤부터 약물 처리 전까지 2를에 한번씩 지속적으로 처리하였다. 그 후, 3일에 한번씩 오거노이드를 도립 현미경 (inverted microscope; Zeiss)으로 관찰하여 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 [1]， [II], [III] 순서대로 10일째 되는 날 계대를 하여 성장 정도를 비교하였다.

[I] 에서 BRCA2 와 TERC가 함께 결손된 오거노이드 (+4-0HT)가 TERC 만 결손된 오거노이드 (-4-0HT)에 비해 다소 성장이 더딘 것을 확인하였다.

[II] (Mechanically dissociated from [1])에서 TERC 단독 결손 오거노이드 (-4-0HT)는 이전 계대에 비해 성장이 저해되고 있음을 확인하였고， TERC 와 Breac 함께 결손된 오거노이드 (+4-0HT)는 이전 계대에 비해 성장이 완화된 것을 확인하였다.

[III] (Mechanically dissociated from [II])에서 TERC 단독 결손 오거노이드 (-4-0HT)는 성장이 크게 저하되어 더 이상 지속 가능한 배양이 불가능한 것을 확인한 것에 비해， TERC 와 Brca2 가 함께 결손된 오거노이드 (+4-0HT)는 지속적인 배양이 가능한 상태임을 확인하였다. 이러한 결과는 ALT 기작이 활성화 되어 암화가 진행되는 오거노이드가 배양되었음을 확인시켜주는 것이다.

실시예 6. BubR ²⁴³ ^ 쥐 췌장 오거노이드에 I腿 unofluorescence assay UFA)를 통한 이미징

실시예 2 및 3을 참조하여， BubRl ^K243R/+ 마우스 췌장 오거노이드를 배양한 후 DAPI (파란색)， Tub 1 in (초톡색)， 및 BubRl (빨간색) 염색을 통해， 구축된 오거노이드가 유전체 불안정성을 연구하는 새로운 모델로서 활용 가능함을 확인하였다.

우선， 배양된 오거노이드를 15ml conical tube 로 옮긴 후， cold PBS를 15ml까지 채우고， 1200 rpm으로 5 min동안 원심분리 하고， PBS 로 세척하는 과정을 3 회 반복하여 matrigel 을 제거하였다. 4%(w/v) paraformaldehyde (PFA)를 넣어 세포를 고정하고， 30분동안 incubation 후， PBS로 3회 세척하였다. Triton X-100 용액 (in PBS; 농도: 1%(ν/ν))을 세포 시료에 넣고 1시간동안 incubation한 후， Triton X— 100 용액 (in PBS; 농도: 2%(v/v))을 넣어주고 2회 세척하였다. 그 후， Blocking buffer (BSA 0.279g, goat serum 450ul , Triton X-100 180ul, PBS 20X 450ul , DW 7920ul) 를 넣고 30 분동안 incubation하였다. BubRl 항체 (BD bioscience)를 처리하고 16 시간동안 incubat ion하였다. 0.2%(v/v) PBS-T (Triton X-100 solution in PBS)로 20분간 3회 세척하였다. HRP tag 아 달린 이차 항체 (secondary antibody) (Thermo Fisher Scientific) 를 넣고 16 시간동안 incubation하였다. 0.2¾>(v/v) PBS-T로 20분간 3회 세척하고， FITC conjugation 된 Tublin 항체 (Abeam)를 1:1000 비율로 처리하고 2일동안 incubation하였다. 0.2%(v/v) PBS—T 로 20분간 3회 세척 후， DAPI를 넣고 하루 동안 incubation하였다. 상층액 제거 후， 8well chamber로 옮겨 confocal 현미경을 사용해 형광 이미지를 관찰한다.

상기 관찰된 형광 이미지를 도 9에 나타내었다. 도 9의 왼쪽은 야생형 마우스로부터 유래한 췌장 오거노이드의 결과이고， 오른쪽은 BubRl ^M 마우스로부터 유래한 췌장 오거노이드의 결과이다.