CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un adsorbente de micotoxinas que se emplea en alimentos balanceados para evitar los efectos nocivos de los tricotecenos tipo A y B, y con especial énfasis de la Vomitoxina (o Deoxinivalenol ) y de la toxina T-2 en animales. Asimismo, esta invención se refiere a una premezcla para preparar el adsorbente de micotoxinas de la invención; un aditivo para alimento balanceado de animales o una formulación de alimento balanceado para animales que incluyen dicho adsorbente de micotoxinas; y el uso de dicho adsorbente de micotoxinas en la preparación de un aditivo para alimento balanceado de animales para tratar o prevenir uno o más efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos, particularmente tricotecenos A y B, y especialmente de la Vomitoxina (o Deoxinivalenol) y de la toxina T-2.

ANTECEDENTES Las micotoxinas son compuestos químicos de bajo peso molecular, producidos por hongos, que tienen efectos patológicos tanto en humanos como en animales . Existen cientos de micotoxinas que son producidas por diversos hongos que contaminan granos y alimentos ya sea en el campo o en los silos de almacenamiento. En el campo, el hongo que más comúnmente afecta a los granos es Fusaríum sp que produce las toxinas Zearalenona, Fumonisina y Tricotecenos (Vomitoxina, Toxina T-2, DAS), entre otras.

En particular, los tricotecenos son micotoxinas producidos principalmente por varias especies de hongos del género Fusarium (ej . F. Sporotrichioid.es, F. graminearum, F. poae y F. culmorum) y pueden ser producidos por miembros de otros géneros, tales como: Myrothecium, Cephalsporium, Trichoderma y Trichothecium. Los tricotecenos, están caracterizados químicamente por la presencia de un sistema básico de un anillo tetracíclico de scirpenol.

Químicamente, los tricotecenos son compuestos que tienen anillos sesquiterpenos caracterizados por un núcleo de 12 , 13-epoxy-9-tricoteceno y tienen un número variable de sustituciones con grupos hidroxilo o acetoxi en las posiciones 3, 4, 7, 8 y 15 de la molécula. Regularmente, algunos tricotecenos solo difieren entre ellos por un solo grupo acetilo.

En total existen cuatro grupos de tricotecenos, sin embargo, el género Fusarium solo produce tricotecenos del tipo A y B. Considerando que el interés pecuario se centra más en los tricotecenos del género Fusarium, estos dos grupos son los de mayor interés .

Ejemplos de tricotecenos del tipo A son la Toxina T- 2, la Toxina HT2, el Diacetoxiscirpenol (DAS) y el Neosalaniol, y entre los tricotecenos más importantes del tipo B se tiene el Deoxinivalenol (DON), mejor conocido como Vomitoxina, y el Nivalenol .

La estructura básica de los tricotecenos se presenta en fórmula (I) y las sustituciones a ésta estructura básica que forman los grupos A y B se presentan en la tabla 1.

Fórmula (I). Estructura básica de los tricotecenos . Tablal . Estructura de los tricotecenos de los grupos A y

B.

a El Peso Molecular (g/mol) , R1-R5 están expresados en la Fórmula 1.

Regularmente los tricotecenos producen en los animales los siguientes efectos nocivos: Vómito, diarreas, irritación, hemorragias y necrosis en el tracto digestivo.

Particularmente, las micotoxinas más potentes de este grupo son la Toxina T-2 y el Diacetoxiscirpenol (DAS); las lesiones orales causadas por estas micotoxinas en aves son características (Véase Figura 4). En cambio, el tricoteceno de mayor prevalencia en los granos y alimentos balanceados, que con mayor frecuencia se encuentra en altos niveles de concentración, es el Deoxinivalenol (DON) o vomitoxina, cuyo nombre deriva del hecho que produce vómito y rechazo del animal al alimento.

Se ha observado que la presencia de los tricotecenos en los alimentos balanceados conduce una reducción en el consumo de alimento por parte de los animales. Especialmente los porcinos resultan ser muy sensibles a los efectos de los tricotecenos .

Aunque la diferencia entre los efectos tóxicos de la toxina T-2 y la vomitoxina (DON) no es muy notoria en lo que respecta al consumo de alimento, ambas toxinas difieren notablemente en el resto de sus efectos tóxicos. Los efectos de estas toxinas se deben a que, en ambos casos, se alteran los niveles de dopamina, triptófano, serotonina y los metabolitos de la serotonina en el cerebro de roedores y porcinos ( Prelusky et al 1992) .

Se ha observado que la concentración en el cerebro de estas sustancias es alterada de la misma manera que lo hacen las sustancia anoréxicas, por lo cual ha sido sugerido que la reducción en el consumo de alimento por los animales se debe, al menos en parte, al resultado de la alteración de los niveles de los neurotransmisores en el cerebro. Es probable que también en un futuro se encuentre una relación entre éstos efectos tóxicos y el sistema nervioso periférico.

Considerando lo anterior, la industria está convencida que la mejor manera de enfrentar el problema de las micotoxinas en los alimentos para animales es la prevención. Para lo cual, ha realizado esfuerzos en contar con un programa adecuado de manejo de granos que permita disminuir la posibilidad de que el grano y el alimento lleguen a contaminarse con estas toxinas. Incluso, ha tratado de implementar programas que permitan impedir que los granos ya contaminados logren llegar hasta las instalaciones de almacenamiento.

Asi, se han investigado ya diversas formas de tratar el grano contaminado para obtener granos de buena calidad, sin embargo, todas estas medidas de prevención han resultado ser insuficientes. En este respecto, según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) gran parte de los granos del mundo se encuentran contaminados con micotoxinas y la razón de ésta estimación se debe precisamente al fracaso en los programas hasta ahora implementados en la Industria {Bhat y Vasanthi 1999) .

Una de las soluciones que se ha propuesto para resolver el problema de la contaminación con micotoxinas en los alimentos para animales, es el empleo de Adsorbentes de micotoxinas, los cuales son usados como aditivos en los alimentos y funcionan atrapando o adsorbiendo las micotoxinas cuando se encuentran en el ambiente acuoso del tracto gastrointestinal del animal una vez dicho animal consume el alimento contaminado. Estos adsorbentes de micotoxinas evitan, principalmente, que las micotoxinas sean absorbidas por el animal, que pasen a su sistema circulatorio y que causen, consecuentemente, sus efectos nocivos .

Desde hace varios años, ya se conoce el uso de aluminosilicatos , arcillas, zeolitas e incluso organoaluminosilicatos como adsorbentes de micotoxinas (Phillips et al 1988 , Kubena et al 1990) .

En el estado de la técnica, encontramos diversos documentos que se refieren a adsorbentes de micotoxinas . Por ejemplo, el documento DE3810004 (1989) divulga el uso de bentonita para la unión de micotoxinas en humanos y animales. Este documento revela que la bentonita es efectiva en la unión de zearalenona, algunos tricotecenos (como deoxinivalenol y toxina T-2), ocratoxina y toxina PR.

Por otra parte, el documento W09113555 (1991), describe una composición sólida, seca, biodegradable , y recubierta con un agente secuestrante, para usarse como aditivo para adsorber micotoxinas en alimento contaminado. Dicha composición comprende un mineral de filosilicato como montmorillonita cálcica.

El documento S.L. Lemke, P.G. Grant y T.D. Phillips "Adsortion of Zearalenone by Organophilic Montmorillonite Clay" J Agrie. Food Chem. (1998), pp . 3789-3796, describe una arcilla de montmorillonita modificada orgánicamente (organofilica) que es capaz de adsorber zearalenona.

El documento WO 00/41806 (2000) divulga adsorbentes de micotoxinas que comprenden un silicato laminado orgánicamente modificado que comprende un compuesto de onio cuaternario, en donde dicho compuesto de onio incluye al menos un grupo alquilo C10-C22 y un sustituyente aromático, y en donde el 2 al 30% de los cationes intercambiables del silicato laminado son intercambiados con compuestos de onio cuaternario.

Además, encontramos en el estado de la técnica el documento WO02052950 (2002), que describe un organomineral modificado con una amina cuaternaria de cadena larga, por ejemplo con dioctadecil trimetilamina, octadeciltrimetilamina, octadecildimetilamino y compuestos similares. Este organomineral modificado se usa como aditivo de alimento para adsorber micotoxinas en animales.

El documento US20040028678 (2004) describe el uso de un silicato laminado activado con ácido para adsorber aflatoxinas, ocratoxinas, Fumonisina, zearalenona, deoxinivalenol , toxina T-2 y ergotamina.

El documento US20080248155 (2008) describe el uso de una composición que comprende estevensita para la adsorción de micotoxinas, como por ejemplo, la micotoxina T-2.

El documento US20100330235 (2010) describe un adsorbente de micotoxinas, por ejemplo Aflatoxina, Zearalenona, Ocratoxina A y Fumonisina Bl, basado en la combinación de un silicato orgánico con estructura amorfa y dodecilamina (una amina primaria que tiene una cadena de carbono de doce carbonos alifática, lineal y no polar) .

Recientemente, otras soluciones han sido también propuestas para resolver el problema de la descontaminación de alimento con micotoxinas. Por ejemplo, el documento US20120070516 (2012) divulga un método para volver menos dañino el alimento contaminado con micotoxinas, como deoxinivalenol y toxina T-2, usando básicamente biomasa lignocelulósica de plantas o sus componentes de biomasa aislados; También encontramos el documento US20120219683 (2012), que describe un adsorbente de micotoxinas, como deoxinivalenol y toxina T-2, que comprende un material de arcilla y carbón activado para descontaminar el alimento con micotoxinas indeseables . Sin embargo, ninguno de los adsorbentes de micotoxinas conocidos en el arte previo, ha conseguido disminuir la biodisponibilidad de los tricotecenos . En el caso de la Toxina T-2, la disminución de la biodisponibilidad ha resultado ser moderada y en el caso de la Vomitoxina, es nula.

En la presente solicitud, sostenemos que la falta de adsorción efectiva de la vomitoxina (DON) y/o la toxina T- 2 con los adsorbentes de micotoxinas conocidos, se debe principalmente a las características altamente polares de dichas toxinas, ocasionando que la interacción de la vomitoxina (DON) y/o la toxina T-2 con el medio acuoso sea mayor que con la superficie de los adsorbentes de micotoxinas conocidos .

Este planteamiento también ayudaría a explicar la razón de por qué los organoaluminosilicatos conocidos que comprenden una cadena alquílica no polar y que han sido utilizados hasta ahora para adsorber otras micotoxinas diferentes a las Aflatoxinas, han resultado ser realmente muy poco efectivos para adsorber Vomitoxina.

Por tanto, no encontramos que en ninguno de los documentos del estado de la técnica se haya logrado resolver cabalmente el problema de la descontaminación de alimentos con micotoxinas, y particularmente el evitar, reducir o eliminar los efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo de los animales asociados con la intoxicación por tricotecenos, particularmente tricotecenos A y B, y más particularmente, los efectos tóxicos asociados con la intoxicación con Vomitoxina y toxina T-2. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente solicitud han encontrado de manera inesperada un adsorbente de micotoxinas que permite una alta adsorción tanto de vomitoxina como de la toxina T-2, cuyo valor objetivo de adsorción de vomitoxina resulta ser particularmente elevado, y mantiene también la adsorción de otras micotoxinas, como aflatoxinas, ocratoxina A, fumonisina Bl y zearalenona.

En un primer aspecto de la presente solicitud, la invención se refiere a un adsorbente de micotoxina que se emplea en alimentos balanceados para evitar los efectos nocivos de las micotoxinas, particularmente de los tricotecenos tipo A y B, y con especial énfasis de la Vomitoxina (o Deoxinivalenol ) y la toxina T-2 en animales.

En otro aspecto, la invención se refiere a una premezcla para preparar el adsorbente de micotoxinas, a un aditivo para alimento balanceado de animales y una formulación de alimento balanceado para animales que incluyen el adsorbente de micotoxinas de la invención.

La invención además se refiere al uso de un adsorbente de micotoxinas en la preparación de un aditivo para alimento balanceado de animales y en la preparación de una formulación de un alimento balanceado, para tratar o prevenir uno o más efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos, particularmente tricotecenos A y B, y especialmente de la Vomitoxina (o Deoxinivalenol) y de la toxina T-2.

La presente invención proporciona un proceso para preparar un adsorbente de Tricotecenos especialmente para Vomitoxina mediante la reacción de un aluminosilicato base de una capacidad de intercambio catiónico de al menos 20 miliequivalentes/lOOg y un compuesto orgánico funcionalizado con una cadena de alta polaridad. Específicamente se utiliza un alquil fenol etoxilado que ha sido cuaternizado para poder fijarlo a la superficie del aluminosilicato .

Más aún, la presente invención se refiere al uso de un organoaluminosilicato de la invención mezclado junto con un aluminosilicato para agregar a un alimento contaminado con micotoxinas. La invención también se dirige a un método para preparar un alimento balanceado para animales que evita los problemas de micotoxicosis en animales .

El organoaluminosilicato de la invención se usa adicionándolo al alimento contaminado ya sea en forma granular o en polvo, ya sea solo o en combinación con un aluminosilicato conocido, para una mejor adsorción de las micotoxinas, que se eliminan conjuntamente a través de las heces .

Así, por medio de la práctica de la presente invención, se consigue evitar que las micotoxinas de los alimentos contaminados sean absorbidas en el tracto gastrointestinal del animal. De esta manera, se mejora substancialmente la salud de los animales, lo cual se ve reflejado tanto en la ganancia de peso en el animal, como en la productividad de los productos derivados como el huevo o la leche.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1 representa gráficamente los resultados en corporal después de 23 días de experimentación usando el adsorbente de micotoxina de la invención contra DON en cerdos (letras diferentes son estadísticamente diferentes con p<0.05 ) .

La Figura 2 representa gráficamente las ganancias de peso después de 23 días de experimentación utilizando el adsorbente de micotoxina de la invención contra DON en cerdos (letras diferentes son estadísticamente diferentes con p<0.05 ) .

La Figura 3 representa gráficamente los resultados en peso corporal después de 28 días de experimentación in vivo usando el adsorbente de micotoxina de la invención contra toxina T-2 en pollos (letras diferentes son estadísticamente diferentes con p<0.05).

Las Figuras 4A y 4B ilustran las lesiones orales debidas al efecto de la toxina T-2 en pollo de engorda.

La Figura 5 representa gráficamente los resultados en peso corporal después de 23 días de experimentación usando el adsorbente de micotoxina de la invención contra DON en cerdos (letras diferentes son estadísticamente diferentes con p<0.05 ) .

La Figura 6 representa gráficamente las ganancias de peso después de 23 días de experimentación usando el adsorbente de micotoxina de la invención contra DON en cerdos (letras diferentes son estadísticamente diferentes con p<0.05 ) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención fundamenta en el hecho de que una modificación la superficie de los aluminosilicatos mediante tratamiento dado puede ser utilizada para aumentar su capacidad de adsorción de micotoxinas. El tratamiento a seguir depende de lo que se pretende lograr, pero generalmente con él se manipulan dos características principales de la superficie que son el carácter hidrofílico y el carácter hidrofóbico u organofílico {Lara et al 1998) .

Particularmente, en la presente invención la modificación de la superficie se realiza con un compuesto orgánico de cadena funcionalizada de forma tal que la superficie logre tener un carácter altamente polar. El compuesto orgánico que se utiliza para la modificación de la superficie puede ocupar parte o todos los sitios activos de la superficie del aluminosilicato .

El aluminosilicato utilizado puede ser un tectosilicato o un filosilicato o una mezcla de ambos, con la condición de que el material que sea usado tenga una capacidad de intercambio catiónico de al menos 20 miliequivalentes por 100 gramos de material, y preferentemente 55 miliequivalentes por 100 gramos de material .

La selección del compuesto orgánico depende de la especificidad y eficiencia que se desee obtener en la adsorción de las micotoxinas, pero en general el compuesto orgánico utilizado es un derivado de alquil fenol etoxilado. Este compuesto orgánico se utiliza en una proporción del 25% al 120% de la capacidad de intercambio catiónico del aluminosilicato utilizado. La reacción se lleva a cabo en medio acuoso con agitación a una temperatura entre 15 y 85 °C y con un tiempo de 0.25 a 3 horas. El producto se separa mediante filtración, se seca a una temperatura entre 40 y 150 °C y se granula o se muele a mallas entre 100 y 325.

El aditivo objeto de la presente invención es un adsorbente de baja inclusión que se adiciona a los alimentos contaminados con Tricotecenos , a razón de 0.025% a 0.2% del peso del alimento.

Particularmente, en una primera modalidad, la invención se refiere a un adsorbente de micotoxinas caracterizado porque comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado de fórmula (I) :

en donde R representa alquilo con 1 a 22 átomos de carbono,

X es un halógeno y n puede ser 1 a 12.

En otra modalidad, la invención se refiere a un adsorbente de micotoxinas caracterizado porque comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado de fórmula (I), en donde el aluminosilicato puede ser un tectosilicato, un filosilicato o una mezcla de ambos.

En otra modalidad más, la invención se refiere a un adsorbente de micotoxinas caracterizado porque comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado de fórmula (I), en donde R representa un grupo alquilo Cs de cadena sencilla o R representa un grupo alquilo Cg de cadena sencilla.

Otra modalidad particular adicional de la invención se refiere a un adsorbente de micotoxinas caracterizado porque comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado de fórmula (I), en donde X es bromo y/o n = 9. Otra modalidad es que X puede también ser cloro.

Además, el adsorbente de micotoxinas de conformidad con la invención, también consiste en un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (la) :

En otra modalidad, el adsorbente de micotoxinas de conformidad con la invención comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (I) o (la) y que tiene una capacidad de intercambio catiónico de al menos 20 miliequivalentes por 100 gramos de material.

El adsorbente de micotoxina de conformidad con la invención puede comprender además un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (I) o (la), que se utiliza en una proporción del 25% al 120% de la capacidad de intercambio catiónico del aluminosilicato utilizado.

En una modalidad más, adsorbente de micotoxinas de conformidad con la invención puede comprender un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (I) o (la), que tiene una capacidad de intercambio catiónico de al menos 20 miliequivalentes por 100 gramos de material y más preferentemente de 55 miliequivalentes por 100 gramos de material .

La invención también se refiere a un adsorbente de micotoxina que comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (I) o (la), en donde dicho derivado de alquil fenol etoxilado se utiliza en una proporción del 25% al 120% de la capacidad de intercambio catiónico del aluminosilicato utilizado.

Otra modalidad de la invención consiste en un aditivo para alimento balanceado de animales que comprende un adsorbente de micotoxinas de la invención, una premezcla para preparar un adsorbente de micotoxinas de la invención o un aditivo para alimento balanceado de animales de conformidad con la invención.

La invención se refiere además a una formulación de alimento balanceado para animales que incluye un adsorbente de micotoxinas de conformidad con la invención, asi como al uso de un adsorbente de micotoxinas de la invención en la preparación de un aditivo para alimento balanceado de animales para tratar o prevenir uno o más efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos . La invención involucra el uso de un adsorbente de micotoxinas caracterizado porque comprende un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (I) o (la) en la preparación de un aditivo para alimento balanceado de animales para tratar o prevenir uno o más efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos A y/o B, tal como vómito, diarrea, irritación, hemorragias o necrosis en el tracto digestivo asociada con la intoxicación por tricotecenos .

En la presente invención, uno o más efectos nocivos o uno o más síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos pueden ser seleccionados del grupo que consiste de: Diacetoxiscirpenol (DAS), Toxina HT-2 (HT-2), Toxina T-2 (T-2), Neosolaniol (NEO), Deoxinivalenol (DON) o Vomitoxina, 3-Acetildeoxinivalenol (3-AcDON) , Nivalenol (NIV) , Fusarenon-X (Fus-X), Tricotecolona (TRI) y una combinación de los anteriores.

También, otra modalidad más de la invención se refiere al uso de un aditivo para alimento balanceado de animales de conformidad con la invención en la preparación de una formulación de alimento balanceado para reducir o eliminar los efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos en animales, específicamente los efectos nocivos los tricotecenos A y/o B, y más específicamente del Deoxinivalenol (o Vomitoxina) y toxina T-2.

La invención también consiste en un adsorbente de micotoxinas de conformidad con la invención para su uso como aditivo para forraje de animales para tratar o prevenir uno o más efectos nocivos o uno o más síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos , en donde el aditivo para forraje de animales es para tratar o prevenir el vómito, la diarrea, la irritación, hemorragias, necrosis o lesiones orales.

La presente invención se refiere además a un proceso para preparar un adsorbente de micotoxinas caracterizado por las siguientes etapas:

a) poner en contacto un aluminosilicato con capacidad de intercambio catiónico de al menos 20 miliequivalentes por 100 gramos de material en un medio acuoso con agitación a una temperatura entre 15 y 85 °C y con un tiempo de 0.25 a 3 horas con un derivado de alquil fenol etoxilado de fórmula (I) o (la) en una proporción del 25% al 120% de la capacidad de intercambio catiónico del aluminosilicato utilizado ; b) Separar mediante filtración;

c) Secar a una temperatura entre 40 y 150°C; y d) Granular o moler a mallas entre 100 y 325. Los siguientes ejemplos muestran que el valor objetivo de adsorción de vomitoxina y de la Toxina T-2 mediante el adsorbente de micotoxinas de la invención resulta ser particularmente elevado. Dichos ejemplos, que incluyen alternativas de obtención del compuesto orgánico derivado del alquil fenol etoxilado, la preparación del adsorbente de micotoxinas y su evaluación "in vivo", son proporcionados con el fin de ilustración y no de limitación . EJEMPLO 1

MÉTODO DE SÍNTESIS DE UN DERIVADO DE ALQUIL FENOL ETOXILADO.

(MÉTODO CON TRIFENILFOSFINA)

MATERIAS PRIMAS A UTILIZAR PARA PRODUCIR 49 G.

Trifenilfosfina, 60 g

Trietilamina 21 mL

Cloruro de metileno 300 mL

Bromo 12 mL

Nonil fenol etoxilado 10 moles óxido de etileno 50 g disueltos en 50 mL de cloruro de metileno.

Hexano-acetato de etilo 1:1

Éter etílico

Hexano

Acetato de etilo.

Bencildimetilamina 10.7 mL

PROCEDIMIENTO

1. En un matraz de fondo redondo de 1000 mi equipado con agitador magnético se adicionan 300 mL de cloruro de metileno y se disuelven 60 g de trifenilfosfina y 21 mL de trietilamina.

2. La mezcla se enfría a 0 °C en un baño con hielo. 3. Utilizando un embudo de adición en sistema abierto se añaden muy lentamente 12 mL de bromo.

4. Al terminar la adición de bromo se deja reaccionar la mezcla a la misma temperatura por con agitación constante por 10 minutos

5. Se disuelven 50g el Surfacpol 9010 en 50 mi de cloruro de metileno y se añaden al matraz de la reacción. 6. Se deja la reacción a 0 °C por 30 minutos más. 7. Posterior a esto se quita el enfriamiento y se deja la reacción llegar a temperatura ambiente agitando 2 horas más .

8. Posterior a esto, la mezcla de reacción se filtra en un embudo Büchner con fondo de vidrio poroso empacado con sílice.

9. Al filtrado se le evapora el disolvente a presión reducida, el residuo se disuelve en una mezcla de hexano-acetato de etilo 1:1 generando un precipitado (oxido de trifenilfosfina ) el cual se elimina por filtración .

10. Mientras precipite oxido de trifenilfosfina el residuo se lava nuevamente con la mezcla de hexano- acetato de etilo.

11. El aceite amarillo se diluye en éter etílico y se agrega hexano para cristalizar los residuos secundarios, finalmente el líquido se filtra una vez más a través de un embudo Büchner con fondo de vidrio poroso empacado con sílice.

12. El filtrado de concentra a presión reducida obteniéndose 47 g de un aceite ligeramente amarillo el cual se emplea de inmediato en la siguiente etapa de reacción sin previa purificación.

13. Se mezclan 47 g del bromuro de Surfacpol 9010 con 10.7 mi de bencildimetilamina en un matraz redondo de 250 mi y se agita.

14. La mezcla se calienta a 120°C durante 24 horas, al cabo de las cuales se enfría a temperatura ambiente .

15. Se añade suficiente cloruro de metileno y el crudo se purifica en columna de sílica gel Flash eluyendo inicialmente con cloruro de metileno/metanol 20:1 y gradualmente aumentando la polaridad con metanol anhidro hasta llegar a una mezcla eluyente de CH2Cl ₂ /MeOH 2:1.

16. Se obtiene 49 g de un derivado de alquil fenol etoxilado de la invención (al cual denominados: "QUAT

Q5" o "Q5"), como un aceite de color café y con un rendimiento del 75 % por las dos etapas.

EJEMPLO 2

MÉTODO DE SÍNTESIS DE UN DERIVADO DE ALQUIL FENOL ETOXILADO.

(MÉTODO CON TRIBROMÜRO DE FÓSFORO)

MATERIAS PRIMAS A UTILIZAR PARA PRODUCIR 38 G.

Nonil fenol etoxilado 10 moles óxido de etileno 50 g Cloroformo 100 mL

Tribromuro de Fósforo PBr3 4 mL.

Dimetilbencilamina 10 mL

Solventes para elución, diclorometano y metanol.

PROCEDIMIENTO

1. En un matraz de fondo redondo de 500 mi se disuelven 50 g de nonil fenol etoxilado 10 en 150 mL de cloroformo, la solución se lleva a 0 °C mediante un baño de hielo, se agita por un periodo de 15 minutos.

2. Se agregan 4 mL de PBr3 mediante una jeringa, la mezcla se agita a la misma temperatura 1 hora.

3. Se mantiene con agitación a temperatura ambiente durante 48 h.

4. Se evapora el disolvente a presión reducida.

5. El crudo se purifica por cromatografía en columna utilizando como eluyente el sistema CH2Cl2/MeOH 15:1. 6. El producto obtenido se transfiere a un matraz de fondo redondo de 250 mL y se agregan 10 mi de dimetilbencilamina .

7. La mezcla se calienta a 120°C durante 24 horas, al cabo de las cuales se enfria a temperatura

ambiente .

8. El producto se purifica por columna utilizando como eluyente el sistema CH2Cl2/MeOH 15:1 obteniéndose 38 gramos de un derivado de alquil fenol etoxilado de la invención (50% de rendimiento), al cual

denominados: "QUAT Q5" o "Q5".

EJEMPLO 3

PREPARACIÓN DEL ADSORBENTE DE MICOTOXINAS DE LA INVENCIÓN

MATERIAS PRIMAS A UTILIZAR.

- Las características del compuesto orgánico utilizado para el tratamiento de superficie se muestran en la Tabla 2.

- EL aluminosilicato base utilizado es un aluminosilicato del tipo Bentonita, con capacidad de intercambio catiónico de 55 meq/100g.

Tabla 2. Características del derivado de alquil fenol etoxilado "QUAT 5" o "Q5".

FORMULACIÓN.

El diseño experimental inicial se desarrolló con base en el porcentaje de sustitución de la capacidad de intercambio catiónico (CIC) del aluminosilicato base. Se tomó como base un porcentaje de sustitución del 60% a 120% de CIC.

DESARROLLO EXPERIMENTAL DE FORMULACIONES.

MATERIALES Y EQUIPOS.

1. Vidriería de laboratorio.

2. Agitador magnético.

3. Estufa de secado.

. Mortero o molino de laboratorio .

5. Tamiz malla 200.

PROCEDIMIENTO.

· El procedimiento de intercambio se lleva a cabo de acuerdo al estado de la técnica (S.L. Lemke, P.G. Grant y T.D. Phillips "Adsortion of Zearalenone by Organophilic Montmorillonite Clay" J Agrie. Food Chem. (1998), pp . 3789-3796). La fase final de la reacción se lleva a cabo con un tiempo de 2 horas.

• Filtrar la mezcla.

• Secar la muestra en la estufa a una temperatura de alrededor de 105 °C • Moler la muestra.

• Tamizar en malla 200.

• Realizar análisis correspondientes según la muestra.

EJEMPLO 4

Evaluación in vivo en cerdos con un adsorbente de micotoxinas de la invención diseñado para adsorber Vomitoxina (o Deoxinivalenol ) .

En este ejemplo se utiliza como adsorbente de micotoxinas, un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (la), el cual denominamos como: "QUAT 5" o "Q5".

Análisis de resultados del Ejemplo 4

En este experimento se emplearon 18 cerdas recién destetadas, distribuidas en 3 grupos, con 6 cerdas cada uno, considerando a cada animal como una repetición. Las dietas fueron identificadas como se muestran en la tabla

Tabla 4. Diseño del experimento para la evaluación in vivo del adsorbente de micotoxina de la invención contra DON.

GRUPO DON ADSORBENTE DOSIS CERDAS/REPLICA REPLICAS TOTAL ppm AD kg/T CERDAS

1 0 NO 0 1 6 6

2 4.5 NO 0 1 6 6

3 4.5 Q5 1.5 1 6 6

TOTAL 18 Los resultados de peso corporal después de 23 días de experimentación se muestran gráficamente en la Figura 1 para los pesos finales y en la Figura 2 para las ganancias de peso acumuladas.

En las Figuras 1 y 2 además se puede observar claramente que el producto "QUAT 5" o "Q5" protegió a los animales de la intoxicación con Vomitoxina. El efecto de la toxina, se observa en el grupo que consumió solo la Vomitoxina pues se presentó diferencia estadística con respecto al grupo control negativo. La eficacia del producto "QUAT 5" o "Q5" se puede calcular con respecto a la recuperación del peso relativo al grupo control negativo. De esta manera se tiene que el producto experimental "QUAT 5" o "Q5" protegió al animal un 47.7%.

Conclusión del Ejemplo 4

Con base en los resultados obtenidos se observa que el adsorbente de micotoxina "QUAT 5" o "Q5" es un producto que ayuda a reducir o eliminar los efectos nocivos o síntomas en el tracto digestivo asociados con la intoxicación por tricotecenos en animales, específicamente los efectos nocivos los tricotecenos A y/o B, y más específicamente del Deoxinivalenol (o Vomitoxina) .

EJEMPLO 5

Evaluación in vivo del adsorbente de micotoxinas de la invención contra los efectos adversos de 1,8 ppm de toxina T-2 proveniente de un cultivo de Fusarium Sporotrichioides , en pollos de engorde en fase de crecimiento (días 1 a 28 de edad) . En este ejemplo, fue probado un adsorbente de micotoxinas que comprende un organoaluminosilicato preparado con el cuaternario de amonio derivado de alquil fenol etoxilado de fórmula (la), al cual como en los ejemplos anteriores denominamos "QUAT 5" o "Q5". Asi también, evaluamos otro adsorbente de micotoxinas que comprende un organoaluminosilicato preparado con un cuaternario de amonio con cadena de alta polaridad derivada de glucosa, al cual denominamos "QUAT 3" O "Q3".

La Toxina T2 utilizada en este ejemplo provino de un cultivo de Fusaríum Sporotrichioid.es y el alimento utilizado fue uno comercial para pollo de engorda.

En la presente prueba, se usaron 112 pollos de 1 día de edad, distribuidos en 4 tratamientos de 4 repeticiones con 7 pollos por repetición. La tabla 5 muestra la distribución de los tratamientos. Tabla 5. Diseño del experimento para la evaluación in vivo de adsorbentes de micotoxinas contra Toxina T2.

Variables de respuesta a determinar a. Variables productivas o de desempeño.

- Peso corporal semanalmente

- Consumo de alimento semanal y total.

- Conversión alimenticia semanal y del ciclo. b. Variables tóxico-patológicas.

- Mortalidad.

- Observación de lesiones orales.

Al final del experimento se sacrificaron 8 aves por tratamiento, es decir 2 por repetición para peso relativo de los siguientes órganos: ríñones, hígado y bolsa de fabricio.

Análisis de resultados del ejemplo 5

Los resultados de peso corporal después de 28 días de experimentación se muestran gráficamente en la Figura 3 y la Tabla 6, donde también se muestra la ganancia de peso y la conversión alimenticia.

Tabla 6. Pesos Inicial, Final (28 días), Ganancia de peso, conversión Alimenticia.

Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Como puede observarse tanto en la Figura 3 como en la Tabla 6, el efecto de la Toxina T2 al nivel de 1.8 ppm sí afectó a los animales, porque se presentó diferencia estadística tanto en el peso final como en la ganancia de peso entre los grupos control positivo y control negativo. También se observa que el adsorbente con el "QUAT 5" o "Q5" protegió a los pollos hasta un 74.6% respecto al control y estadísticamente no hubo diferencia con respecto al grupo control negativo, por lo que el prototipo sí logró disminuir la toxicidad de la Toxina T2. Contrariamente, es importante notar que el adsorbente de micotoxina con el "QUAT 3" o "Q3" no protegió a los pollos contra las 1.8 ppm de la Toxina T2

Observamos también que el consumo de alimento no se vio afectado a pesar de la presencia de lesiones orales en los animales y de que la disminución del consumo de alimento es una característica de la intoxicación con Toxina T-2. Estos efectos pueden apreciarse en la Tabla 7, donde también se observa el efecto de la Toxina T-2 en las Xantofilas que son los pigmentos.

Tabla 7. Consumo de alimento y Xantofilas en suero de los tratamientos.

Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Como mencionamos antes, una de las características típicas de la intoxicación con Toxina T-2 es la presencia de lesiones orales en las aves, lo cual confirmamos sí fue observado en este experimento. La Figura 4 ilustra las lesiones orales en las aves provocadas por esta toxina. Con el objetivo de tener una estimación numérica del grado de lesión ocasionado por la Toxina T-2, se llevó a cabo una revisión de estas lesiones obteniendo la siguiente clasificación numérica: Sin lesión: 0. Lesión leve +:1. Lesión moderada ++: 2. Lesión severa +++: 3. Con base en esta clasificación se puede observar en la Tabla 8 que a pesar de que si hubo lesiones en el grupo con el adsorbente de micotoxinas "QUAT 5" o "Q5", éstas fueron inferiores al control positivo. Las lesiones en el grupo control negativo son debidas al tipo de alimento en harina. Con base en esta escala se tiene que el adsorbente de micotoxinas con el "QUAT 5" proporcionó una protección parcial, sin embargo estas lesiones no afectaron de manera importante la ganancia de peso.

Tabla 8. Lesiones orales observadas en las aves tras el consumo de Toxina T2.

Al final del experimento las aves sacrificadas fueron evaluadas para diversos parámetros tanto biológicos como histopatológicos para estudiar los efectos de la Toxina T2 y la eficacia del prototipo en la disminución de estos efectos . Las tablas completas de estas determinaciones que incluyen mediciones del tamaño de órganos como: hígado y riñon, hematología, respuesta vacunal e histopatología de órganos, se presentan a continuación.

Tabla 9 .

Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Tabla 10 .

Peso relativo Peso relativo de la bolsa de

Tratamientos del timo Fabricio

(%) (%)

Medias + error

Medias + error estándar estándar

Control 0.318 + 0.013

0.254 + 0.017 ^a

negativo

Control

0.282 + 0.020

positivo 0.248 + 0.016 ^a

Toxina T-2

Desafio QUAT 0.328 + 0.016

0.237 + 0.013 ^a

5 Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Tabla 11 .

Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Tabla 12 .

Glóbulos

rojos

Hemoglobina Hematocrito Plaquetas (eritrocito

g/dL %

Tratamiento s)

10 ⁶ /μΙ,

Medias + Medias + Medias + Medias + error error error error estándar estándar estándar estándar

Control 2.44 + 0.06 12.3 + 0.37 31.3 + 0.83

28 + 1.92 ^a negativo

Control

12.1 + 0.46 31.8 + 1.56

positivo 2.46 +0.12 ^a 31 + 4.95 ^a Toxina T-2 Desafio 2.34 + 0.13 12.4 + 0.27 30.4 + 1.49

29 + 3.22 ^a

QUAT 5

Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Tabla 13.

Medias con letras diferentes son estadísticamente significativas para p<0.05.

Tabla 14.

Inhibición de la

hemoagl tinación de

Tratamientos Ne castle (18 dias post

vacunadón)

Log ₂

Medias + error estándar

Control negativo 9.207 + 0.30 ^

Control positivo

8.717 + 0.29

Toxina T-2

Desafio QUAT 5 9.709 + 0.29 ^a Histopatologia

Control negativo: Proventrículo (12) :

Se observan acúmulos linfoides en la zona glandular (1/12) . Sin cambios significativos (11/12).

Hígado (12) :

Sin cambios significativos (11/12).

Se observan cúmulos de linfocitos alrededor de los espacios portas y entre los sinusoides (1/12) .

Diagnóstico morfológico: Hepatitis linfocítica leve multifocal .

Bazo, molleja, timo, lengua, riñon (12):

Sin cambios significativos (12/12).

Bolsa de Fabricio (12) :

Sin cambios significativos (11/12).

Se observa en un folículo un centro de necrosis rodeado por células gigantes (granuloma) (1/12).

Diagnóstico morfológico: Bursitis granulomatosa leve zonal. (Etiología bacteriana) .

COMENTARIOS: No se observaron lesiones por micotoxinas . Control positivo:

Lengua (12): Sin cambios significativos (4/12).

Sobre el epitelio de revestimiento se observan placas densas compuestas por restos celulares entremezclados con restos de queratina y colonias bacterianas. En la submucosa adyacente a dichas placas se aprecian cúmulos de linfocitos y macrófagos entremezclados con restos celulares necróticos (8/12) . Diagnósticos Morfológicos: Estomatitis y glositis erosiva y necrótica con presencia de bacterias intralesionales .

Laringe (12) : Sin cambios significativos (4/12) . En la submucosa y alrededor de las glándulas se observa moderado o abundante infiltrado inflamatorio compuesto principalmente por linfocitos (8/12) .

Diagnósticos Morfológicos : Laringitis linfocitica moderada a grave difusa.

Proventriculo (12): Sin cambios significativos

(11/12) .

Se observa moderada hiperplasia del tejido linfoide asociado (1/12).

Hígado (8) : Alrededor de los espacios porta y en el parénquima se aprecian agregados multifocales de linfocitos (8/12) y focos de hematopoyesis extra medular (1/12) .

Diagnóstico Morfológico: Colangiohepatitis linfocitica moderada, multifocal.

Se aprecian en el citoplasma de los hepatocitos escasas vacuolas que corresponden a grasa (3/12).

Diagnóstico Morfológico: Esteatosis de leve a moderada difusa .

Molleja (12) : Se aprecian pérdida de solución de continuidad úlcera entremezcladas con abundantes colonias bacterianas y moderado infiltrado heterofílico (7/12) . Diagnóstico Morfológico: Ventriculitis ulcerativa moderada multifocal .

Se observan escasas erosiones en la zona de recubrimiento (5/12) .

Diagnóstico Morfológico: Erosiones discretas, multifocales . Bazo, timo ( 12 ) :

Sin cambios significativos (12/12).

Riñon (12) : Se observan en los túbulos degeneración y necrosis de las células epiteliales (4/12) . En algunos glomérulos se observan muy celulares por proliferación de las células del mesangio y engrosamiento de la membrana debido a la proliferación de las células endoteliales (4/12). En el espacio intersticial se observan cúmulos de linfocitos (4/12) .

Diagnóstico morfológico:

Glomerulopatia membrana proliferativa moderada difusa con nefritis intersticio linfocitica moderada multifocal. Desafío "QUAT 5" o "Q5":

Lengua (12): Sin cambios significativos (6/12).

Sobre el epitelio de revestimiento se observan placas densas compuestas por restos celulares entremezclados con restos de queratina y colonias bacterianas. En la submucosa adyacente a dichas placas se aprecian cúmulos de linfocitos y macrófagos entremezclados con restos celulares necróticos (6/12) .

Diagnósticos Morfológicos: Estomatitis y glositis erosiva y necrótica con presencia de bacterias intralesionales .

Laringe (12) : Sin cambios significativos (6/12) . En la submucosa y alrededor de las glándulas se observa moderado o abundante infiltrado inflamatorio compuesto principalmente por linfocitos (6/12) .

Diagnósticos Morfológicos : Laringitis linfocitica moderada a grave difusa. Proventrículo (12): Sin cambios significativos (11/12) .

Se aprecia en la zona glandular acumulo linfoide asociado (1/12) .

Hígado (12): Sin cambios significativos (5/12).

Alrededor de los espacios porta y en el parénquima se aprecian agregados multifocales de linfocitos (2/12).

Diagnósticos Morfológicos: Colangiohepatitis linfocítica moderada, multifocal

Se aprecian en el citoplasma escasas vacuolas que corresponden a grasa, en el intersticio se observan espacios claros (edema) (5/12).

Diagnóstico Morfológico: Esteatosis leve difusa.

Molleja (12) : Se aprecian pérdida de solución de continuidad úlcera entremezcladas con abundantes colonias bacterianas y moderado infiltrado heterofilico (4/12) . Diagnóstico Morfológico: Ventriculitis ulcerativa moderada multifocal .

Se observan escasas erosiones en la zona de recubrimiento (8/12).

Diagnóstico Morfológico: Erosiones discretas, multifocales . Conclusión del Ejemplo 5

Se demostró que a 1.8 ppm de Toxina T2 en el alimento, se tienen efectos sobre los parámetros productivos en pollo de engorda, ya que hubo un efecto importante sobre la ganancia de peso. Con base en los resultados presentados se llega a la conclusión que el adsorbente de micotoxinas con el "QUAT 5" tuvo una protección eficiente en pollo contra el efecto tóxico de 1.8 ppm de Toxina T2. Por el contrario el adsorbente con el "QUAT 3" no presentó un efecto protector.

Por consiguiente, se concluye que la formulación del adsorbente de micotoxina con el "QUAT 5" es la adecuada para el adsorbente no solo de Vomitoxina sino también de Toxina T2 y de Tricotecenos en general.

Por lo anterior, se apreciará que aunque las modalidades especificas de la invención se han descrito en la presente para propósitos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse de la naturaleza y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas .

EJEMPLO 6

Evaluación "in vivo" en cerdos con un adsorbente de micotoxinas de la invención diseñado contra Vomitoxina (o

Deoxinivalenol )

Se llevó a cabo un experimento más con cerdos para evaluar la eficacia del adsorbente de micotoxinas, un aluminosilicato orgánicamente modificado con un derivado de alquil fenol etoxilado que tiene la fórmula (la), el cual denominamos como: "QUAT 5". Esto con el objetivo de verificar el buen comportamiento que se tuvo en el Ejemplo

4. Análisis de resultados del Ejemplo 6

En este experimento se emplearon 24 cerdas recién destetadas, distribuidas en 4 grupos, con 6 cerdas cada uno, considerando a cada animal como una repetición. Las dietas fueron identificadas como se muestran la tabla 15. En esta ocasión solo se utilizó una contaminación de 2500 ppb de Vomitoxina, con el objetivo de tener valores cercanos a los recomendados como máximos en la Unión Europea (900 ppb) .

Tabla No 15. Diseño del experimento para la evaluación in vivo de adsorbentes de micotoxinas contra DON.

Los resultados de peso corporal después de 23 días de experimentación se muestran gráficamente en la figura 5 para los pesos finales y en la figura 6 para las ganancias de peso acumuladas.

En las figuras 5 y 6 se observa claramente que el adsorbente de micotoxinas "QUAT 5" presenta una protección contra 2500 ppb de Vomitoxina del 74.1%. Conclusión

Con base en los resultados obtenidos se observa que el adsorbente de micotoxinas "QUAT 5" muestra que a una contaminación de 2500 ppb de DON, ofrece una recuperación importante del consumo y del peso de los animales . Se obtuvo una protección basada en el peso del 74.1%.