本发明涉及基因工程技术领域， 具体地说， 涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基 因序列及其应用。

背景技术

能源是人类社会发展的基础， 目前全球正面临着能源危机， 石油资源供应紧张。 由 于生物能源的可再生性， 生物能源的开发越来越受到关注， 而微藻生物柴油以其不与人 争粮、 不与粮争地、 不与畜争料的独特优势吸引了越来越多科研工 作者的关注。

不同种类的微藻合成三酰甘油 （triacylglycerol, TAG) 的能力各不相同。 研究发现， 绿藻、 硅藻等真核微藻的油脂含量比较高， 有希望成为生物柴油的生产藻种。 缺刻缘绿 藻（Myrmeda zVzd«¾ Reisigl H4301 )是一种淡水单细胞微藻， 隶属绿藻门 （Chlorophyta), 该藻能大量积累 TAG, 尤其是在缺氮条件下， 是潜在的微藻生物柴油藻种。

TAG是植物中最主要的贮存脂质， 对植物的生长发育也起着重要作用。 目前已经发 现 TAG的合成酶有二酰甘油酰基转移酶 （DGAT; EC 2.3.1.20)、 磷脂： 二酰甘油酰基转 移酶 （PDAT; EC 2.3.1.158) 和二酰甘油转酰基酶 （DGTA)。 其中， DGAT是 TAG合成 的最主要酶， 它沿着 Kennedy途径催化 TAG合成的最后一步， 也是该合成途径中唯一的 限速酶。 到目前为止， 发现 DGAT有三个家族， 分别为 DGAT1、 DGAT2禾 P DGAT3。

中国期刊 《上海海洋大学学报》， 2012年 9月， 第 21卷第 5期， 刊出的论文 "缺刻 缘绿藻转录组测序及脂质代谢相关基因注释"� �该论文作者为了能深入地了解缺刻缘绿藻 花生四烯酸和脂质的代谢过程，利用 Roche 454 GS FLX测序仪对该藻转录组进行高通量 的焦磷酸测序， 得到高质量读序 （read) 382468条， 占原始读序的 97.14%， 平均每条读 序长 322bp， 总大小达 123Mb， 再经 CAP3 软件拼接得到 22714 条重叠群、 25621 条 singleton 将这些序列与公共数据库进行同源性搜索、 比较、 基因功能注释和分类， 并基 于转录组中所注释的基因构建了缺刻缘绿藻脂 质代谢途径。 但是该论文并未披露缺刻缘 绿藻二酰甘油酰基转移酶的 cDNA序列， 而且本领域技术人员均知， 高通量测序方法存 在误差， 测出的 cDNA序列并非 100%准确， 存在误差的可能性极大， 因此根据该论文本 领域技术人员也难以得出准确的缺刻缘绿藻二 酰甘油酰基转移酶基因序列。

中国专利文献 CN201210477507.7, 公开日 2013.02.27， 发明名称为 "一种编码缺刻 缘绿藻二酰甘油酰基转移酶的 DNA序列及其应用 "， 基于缺刻缘绿藻转录组测序数据， 筛选获得了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移 酶 （MiDGAT2) 基因的 cDNA全长序列， 通过同源比对分析确定该酶为 DAGT2基因家族， 并进一步获得了 MiDGAT2的 DNA全 长序列， 然后通过将该 MiDGAT2在酵母的 TAG合成缺陷株 H1246中表达， 证实该基因 编码蛋白确实具有 TAG的合成能力。 然而， 缺刻缘绿藻是一种真核藻类， 其内可能并不 只包含一种二酰甘油酰基转移酶， 而可能是由多个同工酶来催化 TAG 的合成。 同工酶

( Isozyme / Isoenzyme) 是指性质不同 （ Vmax和 /或 Km不同） 但催化反应相同的酶， 又称为同功异构酶。 它们可以以不同的量出现在一种生物的不同组 织或器官中， 也可以 出现在任何真核生物细胞不同的细胞器。 其差异可以是在蛋白质的一级结构上， 也可以 是在四级结构或翻译后加工上。 其存在可被细胞用来根据细胞内特定的生理状 况而对酶 活性进行调节。 同工酶是基因分化的产物， 而基因的分化又是生物进化过程中为适应愈 趋复杂的代谢而引起的一种分子进化， 以适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同 需 要， 是基因编码的蛋白质表现型。 因此， 发现并研究缺刻缘绿藻的其它二酰甘油酰基转 移酶及其基因序列， 对于研究缺刻缘绿藻的物种进化、 遗传变异等具有重要的意义， 同 时也将为通过基因工程方法合成 TAG提供新的途径。 发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种分离的多肽。

本发明的再一的目的是， 提供一种分离的多核苷酸。

本发明的另一的目的是， 提供一种重组表达载体。

本发明的第四个目的是， 提供一种基因工程化的宿主细胞。

本发明的第五个目的是， 提供上述多肽、 多核苷酸、 重组表达载体或宿主细胞的用 途。

为实现上述第一个目的， 本发明采取的技术方案是：

一种分离的多肽， 所述的多肽的氨基酸序列如 SEQ ID N0.3所示。

为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是：

一种分离的多核苷酸， 它包含一核苷酸序列， 所述的核苷酸序列选自下组： a) 编码如上所述多肽的多核苷酸； 或

b ) 与 a) 所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个优选例中， 所述的核苷酸序列选自下组：

a) SEQ ID N0.1或 SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列； 或

b ) 与 a) 所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是： 一种重组表达载体， 所述的重组表达载体是由如上所述的多核苷酸 与质粒或病毒所 构建的重组表达载体。

在一个优选例中， 所述的质粒是 pYES2质粒。

为实现上述第四个目的， 本发明采取的技术方案是：

一种基因工程化的宿主细胞， 所述的宿主细胞选自于下列中的一种：

a) 用如上所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞 及其后代细胞；

b ) 用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主 细胞及其后代细胞。

在一个优选例中， 所述的宿主细胞是细菌细胞、 真菌细胞、 植物细胞或动物细胞， 或这些宿主细胞的后代。

在另一优选例中， 所述的宿主细胞是酵母细胞。

为实现上述第五个目的， 本发明采取的技术方案是：

如上所述的多肽、 如上所述的多核苷酸、 如上所述的重组表达载体、 或如上任一所 述的宿主细胞在生产三酰甘油中的用途。

在一个优选例中， 所述的用途具体是催化 C18: l脂肪酸生成三酰甘油。

本发明优点在于：

本发明基于缺刻缘绿藻转录组测序数据， 得到了一条与已知 DGAT基因有很高相似 性的长 309bp的片段， 基于该片段序列并利用 cDNA末端快速扩增技术 （RACE) 克隆 到该基因的 cDNA全长序列， 通过同源比对分析确定该酶为 DAGT2基因家族， 并进一 步克隆获得基因全长。通过将该基因在酵母的 TAG合成缺陷株 H1246中表达， 即基因功 能互补试验，发现该基因编码蛋白确实具有 TAG的合成能力，从而证实了该基因的功能， 并通过底物偏好性实验证实该基因所编码的蛋 白更倾向于 C18: l脂肪酸。 该基因的克隆 为通过遗传操作实现 TAG的大规模合成提供了新途径。

附图说明

图 1. pMD19T载体图谱。

图 2. pYES2载体图谱。

图 3.缺刻缘绿藻 ΜίΖ Γ2β基因结构示意图。灰色线是非转录区，黑� ��线为内含子， 黑色框为外显子。

图 4.酵母油脂的薄层色谱图。从左道到右道依次� ��野生型酵母 Scy62、缺陷株 Η1246、 携带 pYES2的缺陷株、 转 MiDGAT2B的缺陷株和 TAG标准品。 图 5.酵母细胞的 Bodipy染色图片。从左到右依次为野生型酵母 Scy62、缺陷株 H1246、 携带 pYES2的缺陷株、 转 MiDGAT2B的缺陷株。

图 6. M1DGAT2B酶蛋白的底物偏好性分析结果。

具体实施方式

本发明的技术路线是：

1 )在温度为 25 °C、 光照强度为 115 μιηοΐ photons m" ² -^ ¹ 的条件下， 于 BG-11培养基 中培养缺刻缘绿藻。 收集藻细胞， 并提取基因组 DNA和 RNA;

2 )自缺刻缘绿藻转录组测序数据中筛选得到一� �与已知 DGAT基因有很高相似性的 长 309bp的片段， 基于该片段序列， 利用 RACE技术得到缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移 酶基因的 cDNA序列全长， 经序列比对发现它与本课题组已经克隆到的 DGAT2家族中 另一基因的 cDNA序列（专利申请号 CN201210477507.7 )不同，二者只有 48%的同源性， 为此， 我们将本次克隆得到的缺刻缘绿藻二酰甘油酰 基转移酶基因命名为 MiDGAT2H。 然后， 利用缺刻缘绿藻 RNA反转录的 cDNA为模板对 MiDGAT2B的 cDNA全长序列进 行验证；

3 )根据 MiDGAT2B全长的 cDNA序列设计引物， 利用缺刻缘绿藻基因组 DNA作为 模板进行 PCR扩增， 得到 MiDGAT2B的 DNA全长序列；

4 )根据 MiDGAT2B的 cDNA全长序列设计引物，利用 PCR构建 pMD19T/MiDGAT2B 质粒；

5 )对 pYES2载体和 pMD19T/MiDGAT2B质粒进行双酶切 (XbaVEcoRD , 回收目的 片段， 再用 T4连接酶连接得到重组表达载体 pY-MiDAGT2B ;

6 )将重组表达载体 pY-MiDAGT2B用电穿孔仪电击法转化酵母缺陷株 H1246, 应用 尿嘧啶缺陷的合成培养基 （SC-U培养基） 筛选转化株， 得到转基因酵母 Y-M1DGAT2B ;

7 ) 将转基因、 转空载体和未转基因的酵母 H1246以及野生型酵母 Scy62接种于 SC 培养基， 72h后收集酵母细胞， 冷冻干燥；

8 ) 利用薄层色谱 （TLC ) 检测酵母总脂成分， 证实了转基因酵母 Y-MiDGAT2B 含 有三酰甘油。 同时还利用油体特异荧光染料 Bodipy对转基因、 缺陷型及野生型酵母进行 细胞染色，发现转基因酵母 Y-MiDGAT2B重建了油体，从而证明了 Μ _Ζ 'ΖΧ Γ2β编码蛋白 具有 TAG的合成功能；

9 ) 测定分析 MiDGAT2B所编码 M1DGAT2B酶蛋白的底物偏好性。

如本文所用， 术语"本发明的多肽"、 "ΜίΖ Γ2β编码蛋白"、 "MiDGAT2B酶蛋白" 或 " MiDGAT2B蛋白"可互换使用， 都指具有二酰甘油酰基转移酶氨基酸序列 （SEQ ID

N0.3 ) 的蛋白或多肽。 其包括含有或者不含起始甲硫氨酸的二酰甘油 酰基转移酶。 其可 含有或不含有信号肽序列。

如本文所用， 术语 "本发明的基因"、 "MiDGAT2B "指具有二酰甘油酰基转移酶编 码基因序列 （8£0 10 ^«).1或8£0 10 ^«).2 ) 的多核苷酸。 其可含有或不含有信号肽编 码序列。

如本文所用， "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来 （如果是天然的物质， 原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天 然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯 化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同 存在的其他物质中分开， 则为分离 纯化的。

如本文所用， "分离的 M1DGAT2B蛋白或多肽"是指 M1DGAT2B多肽基本上不含 天然与其相关的其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。 本领域的技术人员能用标准的蛋白 质纯化技术纯化 MiDGAT2B蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯� ��胺凝胶上能产生单 一的主带。 MiDGAT2B多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原 核或真核宿主 （例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞） 中产生。 根据重 组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。 本发明 的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基 ， 还可包括或不包括信号肽序列。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、 基因组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链或非编码 链。 编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID N0.2所示的编码区序列相同或者是简并 的变异体。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式 提供， 更佳地被纯化至均质。

本发明的 ΜίΖ Γ2β核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人 工合成的方法获得。 对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是 开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法 所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常常需要进行两次或 多次 PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在 一起。

一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是将其 克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。 此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。 通常， 通过先 合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 蛋白 （或其片段， 或其衍生物） 的 DNA序列。 然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子 （或如 载体） 和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列 中。

应用 PCR技术扩增 DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。� �别是很难从 文库中得到全长的 cDNA时， 可优选使用 RACE法（RACE-cDNA末端快速扩增法）， 用 于 PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信 息适当地选择，并可用常规方法合成。 可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增 的 DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 MiDGAT2B蛋 白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

通过常规的重组 DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列用来 表达或生产重组的 M1DGAT2B多肽。 一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码 MiDGAT2B多肽的多核苷酸，或用含有该多核苷酸� ��重组表达载 体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。

本发明中， MiDGAT2B多核苷酸序列可插入到重组表达载体中� �� 术语 "重组表达载 体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒 如腺病毒、 逆转录病毒或其他载体。 只要能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都 可以用。 表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点 、 启动子、 标记基因和翻译控制 元件。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作 详细说明。 下列实施例中未注明具体 条件的实验方法， 通常按照常规条件如 J.萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 科学 出版社， 2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分 比和份数按重量计算。

实施例 1

1、 实验材料

1 ) 缺刻缘绿藻 Myrmecia incisa Reisigl H4301 ) 购自捷克布拉格查理斯大学藻类培 养中心（CAUP)。在温度为 25 °C、光照强度为 115 μιηοΐ photons ιη· ² ·^光 /暗比为 12h/12h 的条件下培养， 培养基为 BG-11。 2 ) pMD 19T载体（载体图谱见图 1 )、 pYES2载体（载体图谱见图 2 )购自 Invitrogen 公司。 酵母缺陷株 H1246和野生型 Scy62来源瑞典农业科技大学 Dr. Stymne实验室， 将 酵母接种于 SC培养基 （购自上海酶联生物科技有限公司）， 在 30°C下以 200rpm转速振 荡培养。 SMART ^TM RACE cDNA扩增试剂盒购自 Clontech公司。 活酵母用油体特异荧光 染料 Bodipy购自 GE MED SCIENTIFICS INC. U. S.A。 TAG标准品购自英国 Nu-Chek公 司。

2、 实验方法

1 ) 取 lOOmg新鲜的缺刻缘绿藻细胞置于预冷的研钵中� �� 加入液氮充分研磨。

2 ) CTAB法提取基因组 DNA和 TRIzol法抽提总 RNA， -20°C保存备用。

3 )根据缺刻缘绿藻转录组测序数据筛选得到一� �与已知 DGAT基因有很高相似性的 长 309bp的片段，根据该序列设计引物，利用 SMART™RACE cDNA扩增试剂盒进行 PCR 扩增。 5'-RACE采用巢式 PCR， 第一轮的 PCR反应条件为： 94°C变性 30s、 68°C退火 30s 及 72°C延伸 2min， 20个循环， 引物为 GSP1 ( AGGTCGCCTGTGAACTTGGGGATGT , SEQ ID N0.4 ) 和 UPM; 第二轮 PCR反应取 1.5μί第一轮 PCR产物直接作为第二轮反 应模板， 反应条件为 94°C变性 30s、 70°C退火 lmin和 72°C延伸 2min， 共 30个循环， 引 物为 GSP2 ( ACGGTGACATGGCGCAC AGGGTTGG, SEQ ID N0.5 )禾口 NUPMo 3 '-RACE 反应条件同 5'-RACE第二轮 PCR反应条件。 随后， 产物进行胶回收， TA克隆并送上海 生工生物工程公司测序。 将测序得到的 5'-和 3 '-片段与已知的序列片段进行拼接， 就可 以得到 MiDGAT2B基因的 cDNA全长序列。

4 ) 根据 RACE技术得到的 MiDGAT2B的 cDNA全长序列设计引物： MiDGAT2BF : 5' CAGTTACAAATCGCGTTCTGCTTA 3' ( SEQ ID NO.6 ) ； MiDGAT2BR： 5' TCCCCAGTCAAGAGTGTGCTACTC 3' ( SEQ ID N0.7)， 以缺刻缘绿藻 RNA反转录的 cDNA为模板进行 PCR扩增。 PCR反应程序为 94°C预变性 5min， 35个循环包含 94°C变 性 30s、 64°C退火 45s、 72°C延伸 2min， 最后 72 °C延伸 10min。 PCR产物胶回收后连接 pMD19T载体，转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆� �菌落 PCR 验证，菌液送到上海生工生物工程有限公司测 序， 以证实缺刻缘绿藻 ΜίΖ Γ2β的序列。

5 )根据 MiDGAT2B的 cDNA全长序列设计引物， 以缺刻缘绿藻基因组 DNA为模板 进行 PCR扩增。 扩增条件为 94°C预变性 5min， 35个循环包含 94°C变性 45s、 65 °C退火 45s、 72°C延伸 2min， 最后 72°C延伸 10min。 PCR产物按上述方法经胶回收、 TA克隆， 送上海生工生物工程公司测序， 得到缺刻缘绿藻 MiDGAT2B的 DNA全长序列。

6 ) 根据 MiDGAT2B 的 cDNA 全长序列设计引物： 上游引物 F _: gaattcAAAATGGAGCTGGCCTCAGC ( SEQ ID N0.8， 小写字母为 EcoRI酶切位点， 酶 切位点后的 AAA 为酵母一致性序列）； 下游引物 R: tctagaCTACTCGATGATGTGCAG ( SEQ ID N0.9, 小写字母为 Xbcd酶切位点）， 它们含有 Xbcd和 EcoRI的酶切位点， 利 用 PCR方法构建 pMD19T/MiDGAT2B质粒。 25μί的 PCR扩增反应体系包含 2.5μί的 Ex Tag缓冲液、 2μί的 dNTP、 2μ∑的 Mg ²⁺ 、 2μ∑的 cDNA模板、 引物各 1 μί、 0.25μ∑ 的 Ex Taq酶及 14.5μί无菌水。 扩增条件为 94°C预变性 5min， 35个循环包含 94°C变性 45s、 64°C退火 45s、 72°C延伸 2min， 最后 72 °C延伸 10min。 PCR产物按上述方法经胶回 收、 TA克隆， 送上海生工生物工程公司测序保证序列的准确 性。

7 ) 从大肠杆菌 DH5a中抽提 pMD19T/MiDGAT2B质粒， 用限制性内切酶 Xbal和 EcoRI进行双酶切消化反应， 同时对 pYES2质粒也进行 XbaVEcoRI双酶切反应。 反应体 系为 4μί的 ΙΟχΜ缓冲液、 4μί的 0.1% BSA、 DNA约 2 g、 Xbal及 EcoBJ各 1 μί、 加 无 RNase水至 20μί。 37°C消化反应 4h。 割胶回收酶切后的目的片段， 并用 T4 DNA连 接酶将酶切后的 MiDGAT2B片段与 pYES2片段连接得到重组表达载体 pY-MiDGAT2B。 连接反应体系为 2.5μί的缓冲液， DNA约 0.3pmol (MiDGAT2B ,载体 DNA约 0.03pmol

( pYES2片段）， Ι μί的 T4 DNA连接酶， 加无 RNase水至 25μί。 16°C连接过夜。 连接 后转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞， 按照上述方法进行克隆、 菌落 PCR验证和测序。 从 大肠杆菌 DH5a中抽提 pY-MiDGAT2B质粒， -20°C保存备用。

8 ) 酵母感受态细胞制备。 将酵母接种于 SC培养基中， 30°C复苏培养过夜， 然后按 1 : 100放大培养， 以 200rpm转速振荡培养至细胞密度约为 l x l0 ⁸ cells/mL (约 4~5h)。 冰 上冷却 15min使细胞停止生长， 4°C条件下以 5000rpm转速离心 5min收集酵母细胞， 预 冷无菌水洗涤细胞 3次， 同样条件下离心收集。 20mL预冷的 1M山梨醇洗涤细胞 1次， 然后溶于 0.5mL预冷的 1M山梨醇， 调整细胞的浓度在 l x l0 ^1Q cells/mL。 冰上保存细胞， 便于电击使用。

9 )利用电穿孔仪（Bio-Rad公司）电击，将重组的� ��体 pY-MiDGAT2B转化酵母 H1246 感受态细胞。取在冰上预冷的待转化的重组表 达载体 pY-MiDGAT2B约 5~10μΐ 5~200ng) 与感受态细胞混匀， 并与 0.2cm的电击杯一起冰上预冷，然后将 DNA与细胞混合液转移 到预冷的电击杯轻轻混匀， 冰浴 5min后， 选择程序 Sc2电击一次， 移走电击杯， 立刻加 入 lmL预冷的 1M山梨醇， 轻轻转移到新的 YPD培养基中， 30°C轻微振荡 5h， 将菌液 涂布于含有 1M山梨醇的 SC-U培养基上， 30°C倒置静置培养 48-72h， 挑取菌落于液体 SC-U培养基中培养。菌落 PCR验证后， 用含 2%葡萄糖的 SC-U培养基保存菌种。另外， 按上述同样方法将空载体 pYES2电转到 H1246上。 10) 将保存的菌液接种到 SC培养基中， 30°C下以 200rpm转速振荡培养 72h， 收集 酵母， 冻干。

11 ) 提取冻干后酵母的总脂。 提取方法： 准确称量 50mg酵母粉置于试管中， 加入 lmL氯仿:甲醇 （1 :2)， 再加入 200-300μί玻璃珠， 涡旋震荡 15min， 镜检观察细胞壁是 否破碎完全。 4000rpm离心 15min后， 将上清液吸出至新试管中， 加入 400μί 50mM柠 檬酸及 600μί氯仿， 充分混匀后， 4000rpm离心 15min， 小心吸取下层溶液， 放入酯化 瓶中用氮气吹干。

12)薄层色谱 （TLC)验证转基因酵母的三酰甘油。 所用展开剂为己垸:乙醚:冰醋酸 ( 80/20/1， v/v/v)。 显色剂： 10% (w/v) CuS0 ₄ '5H ₂ 0加到 8% (v/v) 磷酸溶液。 在提取 的酵母总脂中加入 30μί氯仿， 用毛细管点样到硅胶 60 F254板 （Merck公司） 上， 将板 放入层析缸中展开， 取出， 喷显色剂， 140°C烘焙 10min。

13 )将活酵母用油体特异荧光染料 Bodipy染色， 用激光共聚焦显微镜 （Leica公司） 观察， 拍照。

14 ) MiDGAT2B蛋白底物偏好性实验： 所用展开剂为己垸:乙醚:冰醋酸 （80/20/1， v/v/v) o 显色剂： 10% (w/v) CuS(V5H ₂ 0加到 8% (v/v) 磷酸溶液。 在提取的酵母总脂 中加入 30μί氯仿， 用毛细管点样到制备型硅胶 60 F254板 （Merck公司） 上， 将板放入层 析缸中展开， 取出晾干， 于 254nm紫外光下刮出带有 TAG的硅胶， 碾成粉末， 用正己垸 洗脱 TAG于酯化瓶中， 氮气吹干用于甲酯化。加入 lmL含 4%硫酸的甲醇溶液。充氮气后， 于 85 °C水浴锅酯化反应 lh， 便于将结合的脂肪酸分子充分解离并甲基化。 酯化反应后， 向上述酯化瓶中分别加入 lmL去离子水和 lmL正己垸， 充分混匀，然后在 5500 rpm下离心 10min。收集上清液至样品瓶中，氮气浓缩， 4°C保存用于气相色谱分析。采用 Angilent 6890 plus型气相色谱仪进行脂肪酸组成分析， 色谱柱为 HP-5型毛细管柱 （30mx0.25mm); 升 温程序为 50°C保留 lmin， 25 °C/min升温至 200°C， 3 °C/min升温至 230°C， 最后保留 18min; 分流比为 50: 1 ; 氮气、 氢气、 空气的流速分别为 30mL/min、 450mL/min、 40mL/min。 进 样量为 1μί。 以上实验均重复三次。

3、 结果

1 )根据 RACE技术获得并经过 PCR扩增验证，得到缺刻缘绿藻 MiDGAT2B的 cDNA 全长序列 ( SEQ ID N0.1 ): 其 5'-非翻译区 ( 5'-UTR) 长 170bp， 3'-UTR长 1460bp， 开 放阅读框架长 1068bp。 利用缺刻缘绿藻基因组 DNA为模板进行 PCR扩增反应， 产物经 序列分析后得到 MiDGAT2B的 DNA全长序列 （ SEQ ID N0.2): 总长 4149bp， 存在 6个 内含子， 它们的长分别为 253bp (第 374-626bp )、 248bp (第 754-1001bp)、 279bp (第 1141-1419bp )、 178bp (第 1613-1790bp ) 282bp (第 1927-2208bp ) 和 235bp (第 2339-2573bp), 将该基因的编码序列分成 7个外显子 （图 3 )。 Μ _Ζ 'ΖΧ Γ2β编码的氨基酸 序列如 SEQ ID N0.3所示。

2) 转基因酵母 Y-MiDGAT2B经半乳糖诱导培养后， 其脂肪的 TLC检测结果显示， MiDGAT2B表达产物能够使 TAG合成缺陷株酵母 H1246中重新合成 TAG (图 4)。

3 ) 利用油体特异荧光染料 Bodipy对酵母进行细胞染色， 与 TAG合成缺陷株酵母 H1246相比较， 发现转基因酵母 Y-MiDGAT2B重建了油体（图 5 )， 从而更进一步地证明 了 MiDGAT2B编码蛋白具有 TAG的合成功能。

4)酵母含有 4种脂肪酸， 分别是 C16:0， C16: l， C18:0禾 P C18: l， 但其 TAG的气相 色谱检测结果显示， TAG主要含有 C16: l和 C18: l两种脂肪酸。 DGAT的作用是在二酰 甘油的甘油骨架的第三碳位上转一个酰基， 从而生成三酰甘油。 因此， 如果气相色谱检 测结果中 C18: l 越多， 则说明有更多的 C18: l 被用于 TAG 的合成。 为了进一步分析 MiDGAT2B蛋白和 MiDGAT2蛋白（专利申请号 CN201210477507.7克隆的 MiDGAT2基 因所编码的 MiDGAT2蛋白）的底物偏好性，我们采用了 C16: l与 C18: l的峰面积比值这 个参数。结果（图 6)显示，转^«/)(^^2酵母株的 TAG中 C16: l与 C18: l的比值为 1.3394， 与野生型 Scy62的 （1.3420) 相近， 经 SPSS 13.0软件分析， 无显著差异 （P>0.05 ); 但 转 Μζ'Ζ Γ2β酵母株， 该比值为 1.2501， 差异显著 （Ρ<0.05 )。 这些结果说明 MiDGAT2 与 MiDGAT2B对 C16: l和 C18: l的底物具有显著差异的选择性， MiDGAT2B更倾向地利 用 C18: l来合成 TAG。

以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶基因序列及其 应用

<130> /

<160> 9

< 170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 2698

<212> DNA

<213> Myrmecia incisa

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg ggcatcttcg aagcctgctt tggctttagt 60 gcaacgggta gggtcgcaac atagtcggtt tcaaaccagc gtgtatcaac tctctgttca 120 gctgttcaat ctgtcacagt tacaaatcgc gttctgctta gcaccgtgtg atggagctgg 180 cctcagcgaa gagctcgttt ctgtcagcgt ggcaacttgc ctgggccaag ctatcgtggg 240 cgaccagtct gatcctaccc aaagctgcgg ccatctacac tgttggcatc tacttcagca 300 cgccccagtg ctggctgttc acgctctacc tgctgttctg tgaggacgtg ctgattcgcc 360 tcctcgtggc cgggtacctg gcgtggatct ttgtggggcc tgggcgcgat gcagccaaga 420 atgtgacgtg gcgcccgtac atgcggcgct ggggcttgtg gaactacctc gcggcctact 480 tccgcgcaga gcttgtcaag acagcagagc tggacccctc caagagctac ctgttcggcg 540 tgcaccccca tggcgtgctc accatggcgt cctggatcaa cttttcgacc gagagcactg 600 gcttcagcga caagttccca ggcatcgaga tgcacgtcgg cacgctcaac tggaacttcg 660 tcacgcccat cgcgcgcgag tttctgctga tgcatggcgc ctgcgatgtg acgcgcgaca 720 cgctgtgcgc gctgctgagc aggccggggc gcgctgtgat ggtggccatc ggtggtgcag 780 ctgaagcact gcatgcgttt ccgggcacct atgacctggt gttggccaag aggaagggct 840 ttgtgaaagt ggcgatgatg acaggcgcat cgctcgtccc cgtgctgtgc tttggtgaga 900 acgaggtgat gacgaccgtg aaagtggagc acggctcctt cacgcacaag ctgcagcgct 960 tcctcaaggg catcgtgggc ttcacgattc ccgtctgcta tggccgcggc ctgtttggca 1020 tccgctatgg catcctgccc aaccctgtgc gccatgtcac cgtcgtcggg gcgcccatcg 1080 acatccccaa gttcacaggc gacctgcaca gcgaggaagg gcaggcagcc gtcaaccgag 1140 cgcacgcaaa gtacatcgcc gcgctgcagg ctttgtggga gcagcacaag gaccagtatg 1200 ccaagcagag gcgcagcagc ctgcacatca tcgagtagca cactcttgac tggggaaccc 1260 tgtccgtgta ggtctcggca cgatcccaga catgcctggg gtgaagcagc atgtctgaat 1320 acccttgacg ttttcacagc cttgatgttt ccgcagcctg cacctcatcg agtcgcgagt 1380 gcaagcccga taccctgcgg cctcggcccg ttttccagcc agccagggtg tagcagcccg 1440 cacatcgtag agtagcagca tggtgggttt ggctcgggcg aagcacctcg ccagcgggaa 1500 cttcttgagg cttaatctat gcaggggtgc agaggaatgc cacattgaat gtcatcacat 1560 aagattgctt atgaaaggca gctttcgtga accgctttca gcgcaatggt gcaggaccac 1620 gtgagggcat gtgactatga gtggcacact ttgccaagct gcagggggtc agcctgctga 1680 tcaggaacgg ctttgtggtt tcggacctct ggaggactat gttggtcatc ctcggggctt 1740 gacacgctta cctggtggtc tttgtaggtt gtgcaagttt agtttcaagt tggcaccggc 1800 agtggccccc cgtgtatgtg ggctgcacag ctgagaagcc tggttttgta catgctggtg 1860 cggcaggtat gggcaacatg tcagagtggc aagcacaagt catgcagggt agaccatcag 1920 ggtgatatct gcatcgactt cgtgcggtct ggactgactg aggcttggct ttgtgaggct 1980 tgccttgcct tttgtgtcat gttccagaag aacacagctg ctgcaaacct tgtggatgtt 2040 ggtcatgtga tgcctgcacc tcgcaggcgt ctcagctgac acattatggc tattgcggtg 2100 M¾¾¾¾ ¾¾ ¾¾¾S0S¾so¾

09 n¾ogagggoa¾ag

¾ ¾¾¾8 ¾¾ggs8: οΐ ς ΐ

^sxoux Quu yn <£\Z> ∑dd <ZIZ> ζζί <uz>

6PIP

§o¾§o¾o¾¾ ¾oo¾¾o§ ¾¾§§¾o§ o§¾o¾o¾§ ο湯 ooo§i§o: § ¾¾o¾¾ ¾¾¾¾¾ ο3: : ο 0 ¾§¾¾o¾o 0¾¾¾§¾ o湯 gg¾ gg¾ p pg ¾^p o ooggg¾og ogg¾o¾o¾

096£ ¾o¾ ¾o ¾§¾§¾o ¾ o§o¾¾ o¾¾¾¾o¾ §¾¾¾¾¾§o 006£ o o o o ¾ogog¾ gg po o g¾ go¾og o¾ggg

Q ^£ ¾¾§§§00 §¾4¾¾¾ ¾¾¾0¾¾ ¾¾0¾¾ ¾ §§¾0§§¾ ¾¾¾¾0¾

08z,e ¾¾oo¾g o^ o ^ ^ ^i ^ ^ ¾o¾gggg ogg ¾gg

0 /^ ¾o¾ ¾oo¾¾o¾ ¾¾§§§o ¾o ¾¾ o§¾o§¾ ¾§¾¾§0¾ 099£ ¾¾¾o ¾§ ¾§¾¾oo¾ §§¾o¾¾¾o

009 £ §o¾¾¾o 'S 'S 'S ¾ ¾¾§§o ¾¾ §¾¾ ¾¾o¾o¾¾o ¾o §o§§ Q £ 'S 'S o¾¾¾¾ ¾o§¾¾¾ §¾¾00¾¾ ¾0¾0¾0¾ 0¾0¾¾¾¾¾ 081£ oo¾¾¾o§ ¾¾oo¾ o¾ §¾ ¾§¾o§¾ §¾¾o¾§ ¾§¾o§§ o¾§o¾o¾§ o¾o¾o¾ ¾¾§§¾o¾ oo¾¾ §§¾ o¾¾o¾¾o ¾0¾¾0§¾§ 09££ ¾¾o¾¾o¾ ¾o§§¾¾ §§ ¾o§§o¾§¾ o¾¾o¾ ¾ §¾oo¾¾ ¾¾o¾o¾o 00££ ¾o§§¾¾¾ ^ §¾¾o§§oo ¾o§¾¾¾o ¾o¾¾§¾ Q Zi 1¾W。^ §¾oo¾¾o§ o¾o¾¾o§§ § ρ οι §¾¾¾ ¾ §¾§¾o o 08ΐ£ ¾§§o¾§¾ §¾ο§§ο¾¾ §¾o¾¾o§ o¾o§§§ §¾o¾o¾¾

0^i£ o§¾¾¾¾ 0¾¾¾¾0§§ ¾¾§0¾00¾ §¾0¾§¾¾ ¾0§0¾0¾ ^ ^ 090£ wo¾o§¾ ¾¾¾¾¾o¾ ¾¾¾¾o¾o ¾o¾oo¾¾¾ §¾¾o¾§§

000 £ §¾o¾¾ ^ 'S o §§¾§§

Q Z ¾§¾¾ ¾o ¾ ¾¾ §o ¾o¾ ¾§§§ ^ ^ m'S 'S

§o o§§o¾ ooo^^ ooo ¾¾O¾¾§O §O ¾§O¾O： οΕθ3: ο§

0^8^ ¾¾oo¾o¾ o¾¾§o¾¾ oo¾¾¾¾ o¾¾o¾o§ ¾¾¾§§§¾0

Q Z VS'S ^ §¾ ¾§ OOI^ OOEE §§§¾o¾¾ ^ ^ ^ ¾§o¾o¾o ΟΟΖ, Εθ3ρο ο§ ¾o§o§¾¾o ¾¾oo¾¾ § ¾oo¾§¾¾o¾ o¾o¾§§¾ §¾o§¾o§ ¾§o¾o¾o§

08^^ o¾§o§¾o ¾§oo¾¾¾o ¾¾¾ ¾¾o¾o§¾ ρ§Ε§οοο

Ο^ : §¾¾ ogg ¾o^oog gogo ggog g¾ g¾ogg¾ ¾gggogo¾o¾

Q Z ^ ^ ¾¾¾¾§oo ¾o¾o§ ¾¾o ¾¾o§ ¾o¾¾§¾ ¾¾¾¾ 00½ ¾¾§o ¾¾¾ ¾o¾o¾¾ ¾¾§¾o¾o o¾o¾ O 00003 0^000 § Ot^ §¾0¾0¾§ ΕΕΟΟΟΟ^ΟΕ §0：^000§0§ §§§0§0§0 ΟΕΟΙ^^ΟΟ^ ^

Q^ZZ 'S vs 33:^ρ¾0ΐ o3^p^ 'S 'S ο¾¾§ο¾ο¾ )ΖΖΖ §§¾§ο¾ο §§¾ο¾¾¾ 'Svs ^ ο¾ο¾¾ § ¾ο¾§ο¾ο¾ ο: §Εθθ§:^ 09Ϊ ^^ vs ^VS JS EOO O^ EO ¾¾¾ΟΟ§¾Ο

Οθΐ^ ο¾¾¾¾¾ο §¾¾¾ο¾ ¾¾¾¾ο§ο ο§ο: §Εΐ§ο §§¾¾ο¾ ο¾§§¾¾ο OtO ¾ο¾¾§§ο o¾o§¾¾ ¾o¾¾¾o¾ §o¾o§¾¾ o¾¾o¾¾o ¾o§¾§o§ 086Ϊ o¾¾¾o§ ¾o¾¾oo¾§ ¾¾o¾o¾§ ¾ §¾¾o 0^61 p 。EO§。 owoop o¾o¾§¾¾ ¾¾¾§oo¾§o

eTl80/^T0lM3/I3d 99-S80/ST0Z; OAV ςζ <uz>

V <o\z> ςςζ

siH ^η3 Ί ^J3 S ^¾ V ^§J V ^u 19 ^B 1V 1 ^u 19 ^ds V ^S TH ^U I9 ⁿ 19 ςζζ ozz ςζζ

dii naq naq B^y ^B 1V ⁹ 1I ¾1V ^S TH «IV ^§J V ^US V ΐ ^Β Λ

ui9 ^ΐθ ^η ΐ9 ^η ΐ9 -I9S ^S !H ^Η ^Ί ^ΐθ ¾。¾ί s^l ο¾ 9Π 00ε 06Ζ dsy 9ΐΙ ο¾ ¾ιν ^ΐθ ΐ ^Β Λ Ι ^Β Λ ·"!丄 Ι ^Β Λ ^S !H ^§J V FA ^{0 US} V ^{0 η3} Ί

³ Π ^ΐθ 1 V ³ ΙΙ ^ΐθ 9¾ ^η 。Ί ^ΐθ ^§J V ^ΐθ 1 Α。 ^ΐΐ OLZ 99Ζ 09Ζ

^J ¾L 9¾ ^19 FA 911 ^ΐθ ^η3 Ί ⁹ ¾ ^§J V ^U I9 ^η3 Ί ^S !H ^J ¾L ³ ¾ί

^A D SiH ^η ΐ9 FA Κ FA ^N \D ^US V ⁿ I9 ^ΐθ ³ ¾ί o z ςζζ ozz ςζζ s^D ^Η ^Ί Κ ο¾ FA ^Η ^Ί ^B IV ^ΐθ 1¾M «IV Κ FA ozz ς\ζ o\z

3^ ^ΐθ ^sAr i ^§J V ^B IV ^η3 Ί FA ^η3 Ί ^ds V °¾ ³ ¾i ^B IV

SIH ^Η ^Ί BIV o ^B IV ^B IV ^ΐθ ^ΐθ 9Π BIV W FA m ^ΐθ

061 ?81 081

ο ¾γ J9§ na na Bjy SAQ na 丄 dsy ¾γ 丄 dsy SAQ Bjy ς OL\ ςη

^io ^{s Η3} Ί ^Η3 Ί 9¾ ⁿ io ^§j v ^B iv ⁹ ii ^{O J} ¾L FA ^SX H ^US V 091 ςς\ on ςπ usy nsq jqx ^9 p SIH ]A[ ⁿ I9 ⁹ 1I ^19 ^{0 3X} H dsy^S s¾

(M sei οετ

^ΐθ ^J3 S ⁿ I9 ^J3 S ^3X H us v an άιχ JSS ¾IV ¾ Α ςζ\ oz\ ς\ \

^19 ^S !H o¾ SiH ^19 ⁹ ¾ ^η3 Ί 1 ^J3 S °¾ ^ds V ^η3 Ί ⁿ I9

0Π ?01 001

^B IV FA ^η3 Ί ⁿ 19 ^B 1V ^§J V ⁹ ¾d ¾IV ^B 1V ^η3 Ί -^X ^us V ¾

96 06

ti3 Aio dix ¾v ¾y 19]A[ -^X〇 ¾y ώ _nj丄 p¾v usy sAq BIV^IV 08 OA S9 dsy SJV ^B 1V ΐ ^Β Λ ^η3 Ί

09 OS na §jy ajj na dsy \ SAQ 3¾J na na 丄 na 丄 3¾j na

s^D ui9 o¾ -iqx -I9S ^3X H ^ΐΐ ^ΐθ Α ^ΐΐ «IV «IV

¾1V °¾ ^η3 Ί 911 nsq JSS -iqi ¾1V ¾ ^η3 Ί ^B 1V ^ώ 1 ^B 1V

99 .S80/ST0Z OAV 3/:i O 8m80sl£ 99/-s8oiAV

tYsiHεΐζl Λ>