Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
N'-{N-[3-OXO-LUPEN-28-OYL]-9-AMINONONANOYL}-3-AMINO-3-PHENYLPROPEONIC ACID AND THE PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE DERIVATIVES THEREOF, A METHOD FOR THE PRODUCTION AND THE USE THEREOF IN THE FORM OF A MEDICINAL AGENT
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2008/054250
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to organic chemistry and medicine, in particular to virology. More specifically the invention relates to a novel chemical compound n'-{n-[3-oxo-lupen-28-oyl]-9-aminononanoyl} -3-amino-3-phenylpropeonic acid of formula (I) and to the pharmaceutically acceptable salts and medicinal forms thereof exhibiting an anti-viral (anti-HIV) and imminostimulating activity. A method for obtaining the compound of formula (I) and the use thereof for producing a medicinal agent exhibiting an anti-viral (anti-HIV) and imminostimulating activity is also disclosed.

Inventors:
DZHEMILEV, Usein Memetovich (pr. Oktyabrya, 112/3-62Ufa, 4, 45005, RU)
ДЖЕМИЛЕВ Усеин Меметович (пр-т Октября, д. 112/3 кв. 62, Уф, 4 Ufa, RU)
TOLSTIKOV, Genrikh Alexandrovich (ul. Voevodskogo, 8Novosibirsk, 63009, RU)
ТОЛСТИКОВ Генрих Александрович (ул. Воеводского, д. 8 Новосибирс, 6 Novosibirsk, RU)
POKROVSKY, Andrei Georgievich (p. Koltsovo, 32-41Novosibirskaya obl, 9, 63055, RU)
ПОКРОВСКИЙ Андрей Георгиевич (р.п. Кольцово, д. 32 кв. 41, Новосибирская обл, 9 p. Koltsovo, RU)
Application Number:
RU2007/000587
Publication Date:
May 08, 2008
Filing Date:
October 24, 2007
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
INSTITUT NEFTEKHIMII I KATALIZA ROSSIISKOI AKADEMII NAUK (prospect Oktyabrya, 141Ufa, 5, 45007, RU)
ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИИ И КАТАЛИЗА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (проспект Октября, д. 141 Уф, 75 Ufa, RU)
DZHEMILEV, Usein Memetovich (pr. Oktyabrya, 112/3-62Ufa, 4, 45005, RU)
ДЖЕМИЛЕВ Усеин Меметович (пр-т Октября, д. 112/3 кв. 62, Уф, 4 Ufa, RU)
TOLSTIKOV, Genrikh Alexandrovich (ul. Voevodskogo, 8Novosibirsk, 63009, RU)
ТОЛСТИКОВ Генрих Александрович (ул. Воеводского, д. 8 Новосибирс, 6 Novosibirsk, RU)
POKROVSKY, Andrei Georgievich (p. Koltsovo, 32-41Novosibirskaya obl, 9, 63055, RU)
International Classes:
C07K5/062; A61K38/05; A61P31/18; C07J53/00; C07J63/00
Foreign References:
RU2211843C12003-09-10
US5468888A1995-11-21
US6369109B12002-04-09
RU2211843C12003-09-10
Other References:
CICHEWICZ R.H.; KOUZI S.A. MED.RES.REV. vol. 24, 2004, page 90
HUANG L. ET AL. BIOORG.MED.CHEM. vol. 14, 2006, page 2279
'Remington's Pharmaceutical Sciences', 1985, MACK PUBLISHING COMPANY page 1418
SVINARCHUK P.P. ET AL. BIOCHIMIE vol. 75, 1993, page 243
Y.KASHIWADA ET AL. J.MED.CHEM. vol. 39, 1996, page 1016
FRIEMEL H.: 'Immunological methods', 1979 page 518
'Enzyme-linked immunoassay technique', 1998
See also references of EP 2088152A1
Attorney, Agent or Firm:
OBSCHESTVO S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTJU "SOJUZPATENT" (ul. Iliinka, 5/2Moscow, 5, 10373, RU)
Download PDF:
Claims:

формула изобретения

1. N'-{N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aминo-3-фeнил- пропионовая кислота формулы 1 :

1 или ее фармацевтически приемлемая соль или пролекарственная форма.

2. соединение по п. 1, где фармацевтически приемлемой солью является литиевая, аммонийная, натриевая, калиевая или кальциевая соль.

3. способ получения соединения по любому из пп. 1 и 2, включающий следующие стадии: а) обеспечивают исходное сырье, содержащее бетулин 8; б) бетулин формулы 8 подвергают каталитическому гидрированию с образованием дигидробетулина 15; в) окисляют дигидробетулин 15 с образованием дигидробетулоновой кислоты 10; г) образовавшуюся дигидробетулоновую кислоту W выделяют и очищают через соль; д) полученную очищенную дигидробетулоновую кислоту 10 обрабатывают хлористым оксалилом с получением хлорангидрида кислоты и.; е) хлорангидрид кислоты iχ конденсируют с 9-aминoнoнaнoвoй кислотой с получением амида 12; ж) полученный амид 12 вводят в реакцию с метиловым эфиром 3-фeнил- 3-aминoпpoпиoнoвoй кислоты с образованием метилового эфира дипептида 13; з) гидролизуют метиловый эфир дипептида 13 с получением кислоты формулы 1;

1 и) при необходимости переводят кислоту формулы 1. в фармацевтически приемлемую соль или пролекарственную форму.

4. способ по п. 3, в котором в качестве исходного сырья используют соединение бетулин или суммарный продукт экстракции коры берёзы, содержащий 85-90% бетулина и 8-10% лупеола 14.

5. способ по п. 3, в котором окисление дигидробетулина 15 проводят хромовой кислотой.

6. способ по п. 3, в котором получение фармацевтически приемлемой соли осуществляют путем взаимодействия кислоты I ^ с эквивалентным количеством гидроксида щелочного или щелочноземельного металла или гидроксида аммония в растворителе, выбранном из- числа низших алкиловых спиртов или их смеси.

7. фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество N'- (N- [3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aминo-3-фeнил-пpoпиoнoвoй кислоты или её фармацевтически приемлемой соли или пролекарственной формы вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

8. применение N'-(N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aминo-3- фенил-пропионовой кислоты или её фармацевтически приемлемой соли или пролекарственной формы для изготовления лекарственного средства, обладающего противовирусной (анти-вич) и иммуностимулирующей активностью.

Description:

N'-{N-[3-OKCO-лупAH-28-Oил-9-AMиHOHOHAHOил}-3-AM HO-3- фенил-пропионовая кислота и её фармацевтически приемлемые производные, способ получения и применение в качестве лекарственного средства.

область техники

изобретение относится к области органической химии и медицины, в частности вирусологии. более конкретно изобретение касается нового химического соединения - N'-{N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3- aминo-3-фeнил-пpoпиoнoвoй кислоты формулы 1 и её фармацевтически приемлемых солей или пролекарственных форм, обладающих противовирусной (анти-вич) и иммуностимулирующей активностью:

1

сочетание противовирусной и иммуностимулирующей активности делают данные соединения перспективными для применения в медицине в качестве противовирусного и иммуностимулирующего лекарственного средства.

предшествующий уровень техники

производные тритерпенов лупанового ряда в последнее время активно исследуются в качестве противовирусных (анти-вич) агентов. описан синтез целого ряда производных бетулиновой (зβ-гидpoкcи-лyпeн-20(29)-28-oвoй) кислоты. в частности, синтезированы 3-O-aцилaты, среди которых выделяются диметилсукцинаты 2, 3, дипептиды, например, 4, а также бифункциональные производные, например, соединение 5. [сiсhеwiсz R.H., коuzi S. а., Med.Res.Rev.,2004,V.24,Nl,90; Huang L., но Ph., Lее к.-н., сhеп сh.-н, Bioorg.Med.Chem.,2006,14,2279].

2 R = CH 2 C(CHa) 2 CO 2 H 3 R = C(CH 3 ) 2 CH 2 CO 2 H

подходом, который может расширить ассортимент агентов, перспективных для разработки анти-вич препаратов, является использование в качестве исходного соединения бетулоновой (3-oкco-лyпeн-20(29)-28-oвoй) кислоты 6. это вещество синтезируется проще, чем бетулиновая (зβ-гидpoкcи-лyпeн-20(29)-28-oвaя) кислота ^поскольку является промежуточным продуктом в схеме синтеза бетулиновой кислоты из бетулина 8. последний получается экстракцией коры берёзы с выходом до 25% [кrаsutskу P.A., Nat.Prod.Rep.,2006]

противовирусная активность бетулоновой кислоты и её производных изучена в малой степени. известно, что дипептид бетулоновой кислоты, имеющий структуру N'-{N-[3-oкco-лyпeн-20(29)-28-oил-9-aминoнoнaнo л}-3-aминo-3-фeнилпpoпиoнoвoй кислоты 9, обладает иммуностимулирующей и противовирусной активностью [пат.рф. Ns2211843, б.и. ш 25, 2003].

это соединение, описанное ранее нами, может рассматриваться в качестве ближайшего аналога соединения настоящего изобретения.

раскрытие изобретения

задачей настоящего изобретения является расширение арсенала высокоактивных противовирусных агентов и получение соединений, обладающих повышенной анти-вич активностью по сравнению с аналогами. поставленная задача достигается новыми химическими соединениями, полученными на основе дигидробетулоновой (з-oкco-лyпaн-28-oвoй) кислоты 10, в частности N'-{N-[3-oкco- лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aминo-3-фe ил-пpoпиoнoвoй кислотой 1 и её солями и пролекарственными формами, обладающими высокой противовирусной активностью и иммуностимулирующим действием.

таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к N'- {N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aм инo-3-фeнил-пpoпиoнoвoй кислоте формулы 1;

1 или ее фармацевтически приемлемой соли или пролекарственной форме. в одном из воплощений фармацевтически приемлемой солью является литиевая, аммонийная, натриевая, калиевая или кальциевая соль.

в следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения N'-{N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3- aминo-3-фeнил-пpoпиoнoвoй

кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или пролекарственной формы, способ согласно настоящему изобретению включает следующие стадии: а) обеспечивают исходное сырье, содержащее бетулин 8; б) бетулин формулы 8 подвергают каталитическому гидрированию с образованием дигидробетулина 15; в) окисляют дигидробетулин 155 с образованием дигидробетулоновой кислоты 10; г) образовавшуюся дигидробетулоновую кислоту 10 выделяют и очищают через соль; д) полученную очищенную дигидробетулоновую кислоту 10 обрабатывают хлористым оксалилом с получением хлорангидрида кислоты 11.; е) хлорангидрид кислоты 11, конденсируют с 9-aминoнoнaнoвoй кислотой с получением амида 12; ж) полученный амид 12 вводят в реакцию с метиловым эфиром 3-фeнил- 3-aминoпpoпиoнoвoй кислоты с образованием метилового эфира дипептида 13; з) гидролизуют метиловый эфир дипептида 13 с получением кислоты формулы 1,; и) при необходимости переводят кислоту формулы 1. в фармацевтически приемлемую соль или пролекарственную форму.

в одном из воплощений способа в качестве исходного сырья используют соединение бетулин или суммарный продукт экстракции коры берёзы, содержащий 85-90% бетулина и 8-10% лупеола 14. в следующем воплощении способа окисление дигидробетулина 15 проводят хромовой кислотой. в еще одном из воплощений получение фармацевтически приемлемой соли осуществляют путем взаимодействия кислоты I ^ с эквивалентным количеством гидроксида щелочного или щелочноземельного металла или гидроксида аммония в растворителе, выбранном из числа низших алкиловых спиртов или их смеси.

в еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество N'-{N-[3-oкco- лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aминo-3-фe ил-пpoпиoнoвoй кислоты или её фармацевтически приемлемой соли или пролекарственной формы вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

наконец еще в одном аспекте настоящее изобретение касается применения N'- {N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aм инo-3-фeнил-пpoпиoнoвoй кислоты или её фармацевтически приемлемой соли или пролекарственной формы для изготовления лекарственного средства, обладающего противовирусной (анти-вич) и иммуностимулирующей активностью.

несомненным неожиданным преимуществом соединения настоящего изобретения, его солей и пролекарственных форм является возможность применения в качестве перорального противовирусного лекарственного (анти-вич) средства, что определяется низкими значениями ингибирующих концентраций в отношении вируса.

новое соединение - дипептид 1, имеющий строение N'-{N-[3-oкco-лyпaн-28- oил-9-aминoнoнaнoил}-3-aминo-3-фeнил-пpoп иoнoвoй кислоты, является нетоксичным, обладает противовирусной (анти-вич) активностью и иммуностимулирующим действием.

способ настоящего изобретения обеспечивает получение нового соединения - дипептида 1 , с высоким выходом, причем в качестве исходного сырья для синтеза может быть использовано доступное местное сырье - бетулин, получаемый экстракцией берёзовой коры (бересты), являющейся крупнотоннажным отходом деревообрабатывающей промышленности и не находящим в настоящее время широкого квалифицированного использования.

варианты осуществления изобретения

определения

термин «фapмaцeвтичecки приемлемые coли» включает производные соединения настоящего изобретения, где исходное соединение модифицировано путем получения его нетоксичных солей с основаниями, а также относится к фармацевтически приемлемым сольватам соединения настоящего изобретения и его солей.

подходящие фармацевтически приемлемые соли включают обычно используемые нетоксические соли, например, соли неорганических оснований, к примеру, соли щелочных металлов (например, соли лития, натрия, калия), соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция, магния), соли аммония; или соли органических оснований, к примеру, соли аминов (как-то соли метиламина,

б диметиламина, циклогексиламина, бензиламина, пиперидина, этилендиамина, этаноламина, диэтанолашша, триэтаноламина, тpиc(гидpoкcимeтилaминo)этaнa, монометилмоноэтаноламина, прокаина и кофеина), соли основных аминокислот (как- то соли аргинина и соли лизина), соли тетраалкиламмония и др., которые могут образовываться при взаимодействии с карбоксильной группой соединения настоящего изобретения. перечень других подходящих солей можно найти в Rеmiпgtоп's рhаrmасеutiсаl Sсiепсеs, 17 th еd., масk рublishiпg соmрапу, еаstоп, Pa, p.1418 (1985).

фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать стандартными химическими способами, известными специалисту в данной области, например из свободной кислотной формы соединения настоящего изобретения и основания или путем взаимопревращения солей. как правило, такие соли можно получить взаимодействием формы свободной кислоты со стехиометрическим количеством соответствующего основания. такие взаимодействия типично осуществляют в воде или в органическом растворителе или в их смеси. как правило, предпочтительны неводные среды, подобные эфиру, этилацетату, этанолу, изопропанолу или ацетонитрилу.

термин «пpoлeкapcтвo» или «пpoлeкapcтвeннaя фopмa» соединения настоящего изобретения включает любые соединения, которые становятся соединениями формулы 1 при введении млекопитающему, например, после метаболического превращения пролекарства. в контексте настоящего изобретения термин «пpoлeкapcтвo» включает такие функциональные производные соединения настоящего изобретения, как сложные эфиры и амиды.

примеры сложных эфиров включают алифатические эфиры, например, эфиры низших алкилов, как-то метиловый .эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, изопропиловый эфир, бутиловый эфир, изобутиловый эфир, mреw-бутиловый эфир, пентиловый эфир и 1-циклoпpoпилэтилoвый эфир; эфиры низших алкенилов, как-то виниловый эфир и аллиловый эфир; эфиры низших алкинилов, как-то этиниловый эфир и пропиниловый эфир; эфиры низших гидроксиалкилов, как-то гидроксиэтиловый; эфиры низших алкоксиалкилов, как-то метоксиметиловый эфир и 1-мeтoкcиэтилoвый эфир; эфиры необязательно замещенных арилов, как-то, к примеру, фениловый эфир, толиловый эфир, mреш-бутилфениловый эфир, салициловый эфир, 3,4-димeтoкcифeнилoвый эфир и бензамидофениловый эфир; и

эфиры низших арилалкилов, как-то бензиловый эфир, тритиловый эфир и бензгидриловый эфир.

амид а означает группу, представленную формулой -соNR'R", где каждый из R' и R" означает атом водорода, низший алкил, арил, алкил- или арилсульфонил, низший алкенил или низший алкинил, и охватывает, к примеру, низшие алкиламиды, такие как метиламид, этиламид, диметиламид и диэтиламид; ариламиды, такие как анилид и толуидин; и такие алкил- или арилсульфонилы, как метилсульфониламид, этилсульфониламид и толилсульфониламид.

термин «тepaпeвтичecки эффективное количество)) соединения данного изобретения обозначает количество, эффективное, когда его вводят человеку или пациенту, не являющемуся человеком, для получения благоприятного лечебного эффекта, такого как облегчение симптомов, например, количество, эффективное для ослабления симптомов вирусной инфекции, и предпочтительно, количество, достаточное для ослабления симптомов заражения вич. в некоторых случаях у пациента, страдающего от инфекции вич, симптомы заражения могут отсутствовать. таким образом, терапевтически эффективное количество соединения также является количеством, достаточным для предупреждения существенного возрастания или, по существу, для снижения детектируемого уровня вируса или антител к вирусу в крови, сыворотке или тканях пациента. существенное возрастание или снижение детектируемого уровня вируса или антител к вирусу представляет собой любое обнаруживаемое изменение, которое является статистически значимым при использовании стандартного параметрического критерия, такого как, например, t- критерий стъюдента, где р < 0,05.

синтез соединения формулы I может быть осуществлен в соответствии со следующей схемой 1 : бетулин 8 (или суммарный продукт экстракции коры берёзы, содержащий 85-90% бетулина и 8-10% лупеола 14) подвергают каталитическому гидрированию, приводящему к дигидробетулину 15 (или к его смеси с дигидролупеолом 16). затем следует окисление, например, хромовой кислотой, дающее дигидробетулоновую кислоту 10, либо её смесь с лупанолом 18. выделение и очистка кислоты 10 ведётся через соль. вторым полезным продуктом (в случае использования природной смеси тритерпенов) является лупанон 17.

обработка дигидробетулоновой кислоты 10 хлористым оксалилом даёт хлорангидрид кислоты п, конденсацией которого с 9-aминoнoнaнoвoй кислотой

получали амид 12. взаимодействие полученного амида 12 с метиловым эфиром 3- фeнил-3-aминoпpoпиoнoвoй кислоты приводит к образованию метилового эфира дипептида lз д гидролизом которого получают целевой продукт I в форме свободной кислоты.

при необходимости свободная кислота формулы I может быть превращена в фармацевтически приемлемую соль (например, соль аммония, лития, натрия, калия, магния или кальция) известными специалистам в данной области способами, например нейтрализацией дипептида I соответствующими гидратами окисей.

схема 1.

фармацевтические препараты

соединение формулы 1, его соль или пролекарственную форму можно вводить в виде чистого химического вещества, но предпочтительно, их вводят в виде фармацевтической композиции или препарата. соответственно, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы 1 и/или его фармацевтически приемлемую соль и/или пролекарственную форму вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, адъювантами, разбавителями или другими ингредиентами.

соединение настоящего изобретения можно вводить перорально, местно, парентерально, ингаляцией или спреем, подъязычно, трансдермально, введением, ректально, в виде глазной мази или другими способами, в стандартных лекарственных формах, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и среды.

кроме целевого соединения, композиции изобретения могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, подходящих для введения человеку или другому животному. носители должны быть достаточно высокой чистоты и достаточно малотоксичными для того, чтобы представлять их подходящими для введения животному, которое лечат. носитель может быть инертным или может обладать собственными фармацевтически благоприятными свойствами. количество носителя, используемого в сочетании с

соединением, является достаточным для обеспечения практического качества материала для введения на стандартную дозу соединения.

примерами фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов являются сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; измельченный в порошок трагакант; желатин; тальк; твердые смазывающие вещества, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сезамовое масло, оливковое масло и кукурузное масло; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновая кислота; эмульгаторы, такие как твины; смачивающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия; красители; корригенты; таблетирующие вещества; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; апирогенная вода; изотонический физиологический раствор, раствор глюкозы и растворы, забуференные фосфатом.

в частности, фармацевтически приемлемые носители для системного введения включают сахара, крахмалы, целлюлозу и ее производные, солод, желатин, тальк, сульфат кальция, растительные масла, синтетические масла, полиолы, альгиновую кислоту, растворы, забуференные фосфатом, эмульгаторы, изотонический физиологический раствор и апирогенную воду. предпочтительными носителями для парентерального введения являются пропиленгликоль, этилолеат, пирролидон, этанол и кунжутное масло.

в фармацевтическую композицию можно включать необязательные активные средства, которые существенно не влияют на активность соединения настоящего изобретения.

одно или несколько соединений изобретения, в том числе, фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или амиды, в эффективных концентрациях смешивают с подходящим фармацевтическим носителем, эксципиентами, адъювантом или средой. в случаях, в которых соединения обнаруживают недостаточную растворимость, можно использовать способы солюбилизации. такие способы известны специалистам в данной области техники и включают применение сорастворителей, таких как диметилсульфоксид (дмсо), применение поверхностно-

активных веществ, таких как твин, или растворение в водном растворе бикарбоната натрия, и другие способы.

после подмешивания или добавления соединениями) настоящего изобретения полученная смесь может представлять собой раствор, суспензию, эмульсию или подобный препарат. форма полученной смеси зависит от ряда факторов, в том числе, предполагаемого способа введения и растворимости соединения в выбранном носителе или среде. эффективную концентрацию, достаточную для смягчения симптомов заболевания, расстройства или состояния, от которого лечат, можно определить эмпирически.

фармацевтические композиции, содержащие соединения общей формулы 1, могут находиться в форме, подходящей для перорального применения, например, в виде таблеток, пастилок, лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. композиции, предназначенные для перорального применения, можно получить согласно любому способу, известному в технике для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или несколько веществ, таких как подслащивающие вещества, корригенты, ароматизаторы, красители и консерванты, для того, чтобы получить привлекательные внешне и приятные при приеме внутрь препараты.

пероральные препараты содержат от 0,1 до 99% соединения изобретения и, как правило, по меньшей мере, примерно 20% (мacc.%) соединения настоящего изобретения. некоторые воплощения содержат от примерно 25% до примерно 50% или от 5% до 75% соединения изобретения.

жидкие препараты

соединения изобретения можно включить в пероральные жидкие препараты, такие как водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы или эликсиры, например. кроме того, препараты, содержащие такие соединения, можно представить в виде сухого продукта для получения состава с водой или другой подходящей средой перед применением. такие жидкие препараты могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие вещества (например, сорбитный сироп, метилцеллюлозу, глюкозу/сахар, сироп, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия и гидрированные съедобные жиры), эмульгаторы (например, лецитин, моностеарат сорбитана или аравийскую

камедь), неводные среды, которые могут включать съедобные масла (например, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, силиловые эфиры, пропиленгликоль и этиловый спирт), и консерванты (например, метил- или н-пропил- п-гидроксибензоат и сорбиновую кислоту).

вводимые перорально композиции также включают жидкие растворы, эмульсии, суспензии, порошки, гранулы, эликсиры, тинктуры, сиропы и подобные формы. фармацевтически приемлемые носители, подходящие для получения таких композиций, хорошо известны в технике. пероральные композиции могут содержать консерванты, корригенты, подслащивающие вещества, такие как сахароза или сахарин, вещества, скрывающие вкус, и красители.

типичными компонентами носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий являются этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, раствор сахара, сорбит и вода. сиропы и эликсиры могут содержать подслащивающие вещества, например, глицерин, пропиленгликоль, сорбит или сахарозу. такие композиции также могут содержать средство, уменьшающее раздражение.

суспензии

в случае суспензии типичными суспендирующими веществами являются метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, авицел RC-591, трагакант и альгинат натрия; типичными смачивающими веществами являются лецитин и полисорбат 80; и типичными консервантами являются метилпарабен и бензоат натрия.

водные суспензии содержат aктивнoe(ыe) вeщecтвo(a) в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. такими эксципиентами являются суспендирующие вещества, например, натрий карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидропропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие вещества; встречающиеся в природе фосфатиды, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как замещенный полиоксиэтиленсорбит, или продукты конденсации этиленоксида с

неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, замещенный полиоксиэтиленсорбитан. водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например, этил- или н-пропил-п- гидроксибензоат.

масляные суспензии можно получить суспендированием активных ингредиентов в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, сезамовом масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. можно добавлять подслащивающие вещества, такие, какие указаны выше, и корригенты для получения приятных пероральных препаратов. такие композиции могут сохраняться за счет добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

эмульсии

фармацевтические композиции изобретения также могут находиться в форме эмульсий масла в воде. масляная фаза может представлять собой растительное масло, например, оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например, жидкий парафин, или их смеси. подходящими эмульгаторами могут являться встречающиеся в природе камеди, например, аравийская камедь или трагакантовая камедь, встречающиеся в природе фосфатиды, например, соевый лецитин, и эфиры или неполные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гексита, например, моноолеат сорбитана, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана.

диспергируемые порошки

диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, предоставляют активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим веществом, суспендирующим веществом и одним или несколькими консервантами. подходящими диспергирующими или смачивающими веществами и суспендирующими веществами являются вещества, уже указанные выше в качестве примеров.

таблетки и капсулы

таблетки типично содержат обычные фармацевтически совместимые вспомогательные вещества, такие как инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, маннит, лактоза и целлюлоза; связующие вещества, такие

как крахмал, желатин и сахароза; вещества, способствующие рассыпанию, такие как крахмал, альгиновая кислота и кроскармелоза; смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота и тальк. можно использовать глиданты, такие как диоксид кремния, для улучшения характеристик текучести порошковой смеси. для внешнего вида можно добавлять красители, такие как красители FD&с. подслащивающие вещества и корригенты, такие как аспартам, сахарин, ментол, перечная мята и фруктовые отдушки, применимы в качестве адъювантов для жевательных таблеток. капсулы (включая препараты пролонгированного действия и с отсроченным высвобождением) типично содержат один или несколько твердых разбавителей, описанных выше. выбор компонентов носителя часто зависит от вторичных обстоятельств, таких как вкус, цена и устойчивость при хранении.

на такие композиции также можно нанести покрытие обычными способами, типично, рн-зависимое покрытие, так что целевое соединение высвобождается в желудочно-кишечном тракте вблизи нужного места применения или в разное время с продлением нужного действия. такие лекарственные формы типично включают один или несколько компонентов из числа ацетатфталата целлюлозы, поливинилацетатфталата, фталата гидроксипропилметилцеллюллозы, этилцеллюлозы, покрытий еudrаgit, восков и шеллака и других материалов.

препараты для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

инъецируемые и парентеральные композиции

фармацевтические композиции могут находиться в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. такую суспензию можно получить согласно известному уровню техники с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ, указанных выше. стерильный препарат для инъекций также может представлять собой стерильный раствор для инъекций или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бyтaндиoлe. к числу приемлемых сред и растворителей, которые можно использовать, относятся вода,

раствор рингера и изотонический раствор хлорида натрия. кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. для такой цели можно использовать любую смесь нелетучих масел, в том числе, моно- и диглицериды. кроме того, при получении препаратов для инъекций применимы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

соединения формулы 1 можно вводить парентерально в стерильной среде. парентеральное введение включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные и интратекальные инъекции или методы инфузии. лекарственное средство, в зависимости от используемых среды и концентрации, можно или суспендировать или растворить в среде. может быть выгодным растворение в среде адъювантов, таких как местные анестетики, консерванты и буферирующие вещества. в композициях для парентерального введения носитель составляет, по меньшей мере, примерно 90 мacc.% от всей композиции.

суппозитории

соединения настоящего изобретения также можно вводить в форме суппозиториев для ректального или вагинального введения лекарственного средства. такие композиции можно получить смешиванием лекарственного средства с подходящим не вызывающим раздражения эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре и будет, следовательно, плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. такими веществами являются масло какао и полиэтиленгликоли.

препараты для местного применения

соединения изобретения можно ввести в композиции для локального или местного применения, например, для местного применения на коже и слизистых оболочках, таких как глаза, в форме гелей, кремов и лосьонов для применения к глазам или для интрацистернального или интраспинального применения. местные композиции настоящего изобретения могут находиться в любой форме, в том числе, например, в форме растворов, кремов, мазей, гелей, лосьонов, молочка, очищающих средств, увлажняющих средств, спреев, кожных пэтчей и т.п..

такие растворы можно получить в виде 0,01% - 10% изотонических растворов, рн примерно 5-7, с соответствующими солями. соединения изобретения также можно ввести в состав для трансдермального введения в виде трансдермальных пластырей.

композиции для местного применения, содержащие активное соединение, можно смешивать с различными материалами носителей, хорошо известными в технике, такими как, например, вода, спирты, гель алоэ вера, аллантоин, глицерин, масла с витаминами а и E, минеральное масло, пропиленгликоль PPG-2, миристилпропионат и т.п..

другими материалами для применения в носителях для местных композиций, являются, например, смягчающие вещества, растворители, увлажняющие вещества, загустители и порошки. примерами каждого из указанных типов материалов, которые можно использовать по отдельности или в смесях с одним или несколькими материалами, являются следующие вещества: смягчающие вещества — стеариловый спирт, монорицинолеат глицерина, глицерилмоностерат, пpoпaн-l,2-диoл, бyтaн-1,3- диол, норковый жир, цетиловый спирт, изопропилизостеарат, стеариновая кислота, изобутилпальмитат, изоцетилстеарат, олеиловый спирт, изопропиллаурат, гексиллаурат, децилолеат, oктaдeкaн-2-oл, изоцетиловый спирт, цетилпальмитат, диметилполисилоксан, ди-н-бутилсебацинат, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, изпопропилстеарат, бутилстеарат, полиэтиленгликоль, триэтиленгликоль, ланолин, сезамовое масло, кокосовое масло, арахисовое масло, касторовое масло, ацетилированные ланолиновые спирты, вазелин, минеральное масло, бутилмиристат, изостеариновая кислота, пальмитиновая кислота, изопропиллинолеат, лауриллактат, миристиллактат, децилолеат и миристилмиристат; пропелленты - пропан, бутан, изобутан, диметиловый эфир, диоксид углерода и оксид азота; растворители - этиловый спирт, метиленхлорид, изопропанол, касторовое масло, моноэтиловый эфир этиленгликоля, монобутиловый эфир диэтиленгликоля, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, диметилсульфоксид, диметилформамид, тетрагидрофуран; увлажняющие вещества - глицерин, сорбит, 1- пиppoлидoн-5-кapбoкcилaт натрия, растворимый коллаген, дибутилфталат и желатин; и порошки, такие как мел, тальк, фуллерова земля, каолин, крахмал, камеди, коллоидный диоксид кремния, полиакрилат натрия, тетраалкиламмониевые смектиты, триалкилариламмониевые смектиты, химически модифицированный алюмосиликат магния, модифицированная органически монтмориллонитовая глина, гидратированный алюмосиликат, высокодисперсный диоксид кремния, карбоксивиниловый полимер, натрий карбоксиметилцеллюлоза и моностеарат этиленгликоля.

соединения изобретения также можно вводить местно в форме липосомных систем доставки, таких как мелкие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. липосомы можно получить из ряда фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламина или фосфатидилхолинов.

другие препараты

другие композиции, применимые для достижения системной доставки целевых соединений, включают подъязычные и назальные лекарственные формы. такие композиции типично содержат одно или несколько веществ-наполнителей, таких как сахароза, сорбит и маннит, и связующие вещества, такие как аравийская камедь, микрокристаллическая целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза. также можно включать глиданты, смазывающие вещества, подслащивающие вещества, красители, антиоксиданты и корригенты, описанные выше.

композиции для ингаляции типично могут быть представлены в форме раствора, суспензии или эмульсии, которые можно вводить в виде сухого порошка или в форме аэрозоля с использованием обычного пропеллента (например, дихлордифторметана или трихлорфторметана).

дополнительные компоненты

композиции настоящего изобретения также могут, необязательно, содержать дополнительные активные ингредиенты, обладающие противовирусной и/или иммуностимулирующей активностью.

далее изобретение иллюстрируется примерами, которые предназначены для лучшего пояснения сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие его.

пример 1. получение з-oкco-лyпaн-28-oвoй (дигидробетулоновой) кислоты 10 из природной смеси тритерпенов.

смесь тритерпеноидов, полученных экстракцией коры берёзы повислой (веtulа pendula L), содержащая 85-90% бетулина и 8-10% лупеола, в количестве 50 г суспендировали в 1 л этанола, помещали в автоклав и после внесения скелетного никеля, полученного выщелачиванием 20 г 40% сплава Ni-Al проводили гидрирование при 100 0 C и давлении 100 атм.

смесь выгружали, нагревали до кипения и отфильтровывали осадок катализатора. раствор упаривали в вакууме досуха. кристаллический остаток, содержащий дигидробетулин 15 и лупанол 16, использовали далее без дополнительной очистки.

K lO r суспензии тритерпенов после гидрирования в 300 мл ацетона добавляли в течение 30 мин 25 мл реактива джонса (135 г CrO 3 , 100 мл конц. H 2 SO 4 , вода до 1 л), перемешивали 5 часов при O 0 C, добавляли изопропанол до устойчивой зелёной окраски раствора и выливали в 1,5 л воды со льдом, к которой добавляли конц. HCl до рн 2. осадок отсасывали, промывали подкисленной (HCl) водой, затем водой, высушивали и растворяли при нагревании в толуоле или метил-трет-бутиловом эфире (мтбэ).

раствор фильтровали горячим и к охлажденному фильтрату приливали 5% раствор NaOH до рн водного слоя 11. после перемешивания в течение получаса смесь оставляли стоять на 1 час, фильтровали натриевую соль дигидробетулоновой кислоты промывали толуолом (мтбэ) и высушивали. органический слой упаривали досуха, остаток лупанона кристаллизовали из смеси метано л-CHCl 3 ., выход 0,6-0,8г, т.пл. 208-210 0 C.

натриевую соль растворяли при нагревании в водном спирте, раствор фильтровали горячим и выливали в избыток 5% HCl. осадок дигидробетулоновой кислоты, выпавший при стоянии, отсасывали и высушивали, выход б,0-6,5г, т.пл.250- 252 0 C

пример 2. синтез дигидробетулоновой кислоты (10) из бетулина.

бетулин (юг), 300 мл этанола загружали в автоклав, вносили 1 г 10% палладия на угле и гидрировали при 100 0 C и 100 атм. водорода. дигидробетулин 15, выделенный обычным образом из реакционной смеси, суспендировали в 400 мл ацетона и добавляли в течение 30 мин 26 мл реактива джонса в 100 мл ацетона, после чего перемешивали при O 0 C 7 часов. к смеси приливали спирт до перехода желтой окраски раствора в зелёную, затем выливали в 1,5 л холодной воды и сильно подкисляли HCl. осадок сырой дигидробетулоновой кислоты отсасывали, промывали водой и высушивали. для очистки растворяли при нагревании в толуоле или мтбэ, фильтровали горячим и к охлажденному фильтрату приливали 5% раствор KOH для образования соли (водный слой должен иметь рн 11). соль

отфильтровывали, промывали толуолом или мтбэ и сушили в вакууме. калиевую соль растворяли при нагревании в спирте, нерастворимую часть отфильтровывали, фильтрат выливали в избыток разбавленной HCl. осадок дигидробетулоновой кислоты промывали и кристаллизовали из спирта, т.пл. 253-254 0 C.

пример 3. синтез N'-{N-[3-oкco-лyпaн-28-oил-9-aминoнoнaнoил}-3- aминo-3- фенил-пропионовой кислоты 1.

A) к раствору 5,0 г дигидробетулоновой кислоты 10 в 200 мл безводного хлористого метилена приливали 2,0 мл хлористого оксалила, перемешивали при 20 0 C 5-6 часов и упаривали досуха в вакууме при t < 35 0 C. к остатку приливали 50 мл сухого хлористого метилена и упаривали досуха. после троекратного повторения этой операции получено 4,8 г хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты IL

в ик-спектре продукта имеются полосы с частотами 1705 см "1 и 1802 см "1 , характерные для 3-oкcoгpyппы и группировки COCl.

б) раствор (1,05 мм) гидрохлорида аминононановой кислоты, 1,5 мл (10 мм) перегнанного триметилхлорсилана в 150 мл безводного хлористого метилена кипятили 4 часа в атмосфере аргона, охлаждали до 0 0 C, добавляли 2,0 г (4,5 мм) хлорангидрида (и) и 1,05 мл перегнанного триэтиламина и выдерживали 24 часа при перемешивании и 20 0 C. к смеси приливали 100 мл хлористого метилена, промывали 10% HCl, затем водой и 5% NaHCO 3 , снова водой и после высушивания раствора Na 2 SO 4 упаривали досуха. остаток хроматографировали на силикагеле и элюировали смесью CHCl 3 - CH 3 CN = 95:5.

получено 2,1 г N-(3-oкcoлyпaн-28-oил)-9-aминoнoнaнoвoй кислоты 12, т. пл. 100-102 0 C.

масс-спектрометрически найдено: мол. масса 611, C 39 H 6S NO 4

вычислено: 611,

в спектре пмр отсутствуют сигналы винильных протонов при 4,57 и 4,67 м.д.

B) к раствору 1,21 г (2 мм) амида 12 в 150 мл безводного хлористого метилена в инертной атмосфере при O 0 C добавляли 0,29 г 1-гидpoкcибeнзoтpиaзoлa и 5,1 г N,N- дициклогексилкарбодиимида и перемешивали полчаса при O 0 C и 5 часов при 20 0 C.

к охлажденной до O 0 C смеси добавляли 0,55 г гидрохлорида метилового эфира з-aминo-3-фeнилпpoпиoнoвoй кислоты и 0,38 мл триэтиламина, после чего перемешивали сутки при 20 0 C.

выпавший после охлаждения смеси до O 0 C осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали и промывали холодным хлористым метиленом. объединённые фильтраты промывали 10% HCl, водой, 5% NaHCO 3 , водой и выпаривали досуха. остаток хроматографировали на Al 2 O 3 с элюированием хлороформом. получено 1,3- 1,4 г метилового эфира дипептида 13 , , который растворяли в 25 мл смеси метанол- тетрагидрофуран 1 :2 и после добавления 2 мл 4M раствора NaOH выдерживали сутки при 20 0 C. смесь выливали на смесь льда с разбавленной HCl, осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили под P 2 O 5 .

получено 1,2 г дипептида 1, т.пл. 140-143 0 C; [α] D +10,5°

масс-спектрометрически найдено: мм 758. C 48 H 74 N 2 O 5 .

вычислено: 758.

в спектре пмр отсутствуют сигналы винильных протонов при 4,57 и 4,67 м.д.

в ик-спектре нет полосы при 1650 см "1 , характерной для изопропилиденовой группы.

пример 4. получение солей дипептида 1

к раствору дипептида 1 в необходимом объеме метанола или этанола приливали эквивалентное количество NH 4 OH, LiOH, NaOH, KOH или Ca(OH) 2 в растворе метанола.

после упаривания досуха и выдерживания в вакууме получали соответствующие соли с количественным выходом.

аммонийная соль : бесцветный порошок , C 47 H 73 N 2 O 4 CO 2 NH 4

литиевая соль : бесцветный порошок , C 47 H 73 N 2 O 4 CO 2 Li

натриевая соль : кремовый порошок , C 47 H 73 N 2 O 4 CO 2 Na

калиевая соль: желтоватый порошок, C 47 H 73 N 2 O 4 CO 2 K.

кальциевая соль: бесцветный порошок C 47 H 73 N 2 O 4 CO 2 Ca y г

пример 5. оценка цитотоксичности дипептида I- на клетках MT-4 цитотоксичность соединения 1 оценивали на культуре клеток перевиваемых T- лимфоцитов человека (линия MT-4). навеску агента (I) растворяли в

диметилсульфоксиде (дмсо) до концентрации 10 мг/мл и готовили последовательные разведения в ростовой среде, затем вносили аликвоты соответствующих разведений в лунки 96-лyнoчныx планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток до конечных концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл. посевная концентрация составляла 0,5x10 6 клеток/мл. экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки культивировали в 96-лyнoчныx планшетах для культур клеток фирмы "соstаr" (сша) на ростовой питательной среде RPMI- 1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (сша), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, и 5% CO 2 в течение 4 суток при 37 0 C. по окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего. строили дозозависимую кривую, из которой определяли цитотоксическую дозу (CD 50 ), соответствующую концентрации соединения, на 50% снижающей долю жизнеспособных клеток по сравнению с контролем. CD 50 для соединения l_cocтaвляeт 6,8 мкм (табл. 1). препаратами сравнения служили азидотимидин (азт) и ранее описанный дипептид 9.

таблица 1. цитотоксичность соединения 1 настоящего изобретения в сравнении с известными п отивови сными п епа атами.

пример 6. оценка анти-вич активности дипептида 1 при внесении препарата после адсорбции вируса.

анти-вич- 1 активность дипептида 1. изучали на высокочувствительной к вич культуре клеток MT-4. клетки MT-4 заражали стоком вируса (штамм Bич-1/эBK [карамов э.B., богомолов б.п., жданов в.м. // обзор центров, сотрудничающих с воз по вирусным инфекциям, 1986, 4 с.]) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубировали при 37 0 C в течение 1 ч ( адсорбция вируса). суспензию инфицированных клеток разводили ростовой питательной средой RPMI- 1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (сша), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина до посевной концентрации 0,5x10 б клеток/мл и вносили в лунки 96-лyнoчнoгo культурального

планшета. затем вносили в лунки аликвоты последовательных разведений дипептида 1 в дмсо до конечных концентраций от од нг/мл до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию). экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки инфицированные клетки (без препарата культивировали при 37 0 C и 5% CO 2 в течение 4 суток. по окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролировали уровень накопления вирусспецифического белка p24 иммуноферментным методом, как описано [федюк H.B., коновалов E.E., локтев B.б., урываев л.B., куляндин C.A., покровский а.г. // вопросы вирусологии, 1992. т.з, с.135]. на основе полученных в эксперименте количественных данных строили дозозависимую кривую, из которой определяли ингибирующую дозу (ш 50 ), соответствующую концентрации дипептида 1, на 50% снижающей накопление вирусного антигена p24 по сравнению с контролем, которая для дипептида 1_ составляет 0,4 мкм. также определяли дозу соединения, защищающую клетки от гибели (PD 50 ). терапевтический индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к ингибирующей дозе (CD 5 o/пэ 5 o), составляет для дипептида 1 , 34. дополнительно определяли индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение токсичной дозы дипептида I- к его защищающей дозе PD 50 (CD 50 / PD 50 ). количественные данные ингабирования репродукции вируса соединением 1 настоящего изобретения и известными противовирусными соединениями представлены в табл. 2.

таким образом, дипептид 1 не только активно ингибирует Bич-1, но и защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия (таблица 2).

таблица 2. анти-вич активность дипептида 1 при введении после адсорбции вир са

пример 7. оценка анти-вич активности дипептида 1. при внесении препарата одновременно с вирусом.

анти-вич- 1 активность дипептида 1 изучали на высокочувствительной к вич культуре клеток MT-4. клетки MT-4 вносили лунки 96-лyнoчнoгo культурального планшета заражали стоком вируса (штамм Bич-1/эBK) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку, затем вносили исследуемое вещество в суспензию клеток одновременно с вирусом до конечной концентрации 0,00001 до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и инкубировали при 37 0 C в течение 1 ч (адсорбция вируса). по окончании инкубации суспензию инфицированных клеток разводили полной ростовой средой со всеми добавками, как описано выше, содержащей препараты в тех же концентрациях. до посевной концентрации 0,5x10 6 клеток/мл.

экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37 0 C и 5% CO 2 в течение 4 суток. по окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролировали уровень накопления вирусспецифического белка p24 иммуноферментным методом, как описано [федюк H.B., коновалов E.E., локтев B.б., урываев л.B., куляндин C.A., покровский а.г. // вопросы вирусологии, 1992. т.з, c.135]. на основе полученных в эксперименте количественных данных строили дозозависимую кривую, из которой определяли ингибирующую дозу (ID 5O )- концентрацию дипептида 1, на 50% снижающую накопление вирусного антигена p24 по сравнению с контролем, которая для дипептида 1, составляет 0,0012 мкм. терапевтический индекс, или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к ингибирующей дозе (CD 5O 5 o), составляет для дипептида 1 5667.

кроме того, определяли ингибирующую дозу шgо, которая соответствует концентрации дипептида I 5 подавляющей продукцию вируса на 90%, которая для изучаемого соединения составляет 0,10 мкм, а также PD 50 - концентрацию дипептида 1, на 50% защищающую инфицированные клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия, рассчитанную, как ранее описано нами [Sviпаrсhuk P.P., копеvеtz D.A., рliаsuпоvа O.A., роkrоvskу A.G., Vlаssоv V.V.// вiосhimiе, 1993,Bd.75,S.243], которая для дипептида 1 составляет 0,015 мкм. дополнительно

определяли индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение токсичной дозы дипептида 1 к его защищающей дозе PD 5O (CD 50 / PD 50 ), составляет 460. количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл. 3. согласно данным табл. 3, при одновременном внесении с вирусом дипептид 1 обеспечивает 50% ингибирование репродукции вируса при концентрации 0,0012 мкм с индексом селективности 5667. важной характеристикой противовирусной активности служит сравнение концентраций, вызывающих 50 и 90% ингибирование накопления вируса. из данных табл. 3 следует, что концентрация заявляемого дипептида 1., приводящая к 90% ингибированию вируса, составляет 0,10 мкм, что существенно ниже соответствующей концентрации азт и описанного ранее дипептида 9. кроме того, индекс селективности (IS) заявленного дипептида 1 оказался существенно выше по сравнению с еще одним известным противовирусным средством - соединением 4 j являющимся структурным аналогом соединения настоящего изобретения. в зависимости от используемого штамма Bич-1 соединение 4 показало ш 5 o в культуре клеток MT-4 в пределах 0,045-0,75 мкм (Y.Kashiwada, наshimоtо F., соsепtiпо L.M., Chen C-H., Gаrrеtt P.E., Lее к.-н., J.Med.Chem., 1996, V. 39, 1016).

таблица 3. анти-вич активность дипептида I при одновременном внесении с вирусом в культуре клеток MT-4.

как следует из представленных выше экспериментальных данных, несомненным достоинством соединения настоящего изобретения является возможность его применения в качестве перорального лекарственного средства, что определяется низкими значениями ингибирующих концентраций в отношении вич.

пример 8. влияние дипептида 1 на т-клеточный иммунитет при иммунизации сильным антигеном.

влияние на стимуляцию т-клеточного иммунитета при введении сильного антигена эритроцитов барана (эб) исследовали методом розеток. в качестве препаратов сравнения использовали неполный адъювант фрейнда (еаф) и глицирризиновую кислоту (гк), являющуюся известным иммуностимулятором.

в работе использовали нелинейных мышей-самцов массой 20-22 г. животным вводили подкожно взвесь эритроцитов барана (эб, 10 7 клеток на мышь) с 200 мкг (10 мг/кг) исследуемого дипептида l_в 0,5 мл физиологического раствора. контрольным животным вводили эб без дипептида 1 (отрицательный контроль) или эб с наф или с гк (положительный контроль); ещё одна контрольная группа - неиммунные мыши. на 6 день после иммунизации готовили суспензию спленоцитов с концентрацией 10 живых клеток в 1 миллилитре. 0,9 мл суспензии спленоцитов и 0,1 мл суспензии эритроцитов (10 9 клеток в миллилитре) помещали в стеклянные флаконы, перемешивали и инкубировали 16 ч при 4 0 C. после инкубации в стеклянные флаконы вносили по 4 мл холодной среды, осторожно перемешивали; пипеткой с широким носиком отбирали 100 мкл суспензию клеток, окрашивали 0,4%-ным раствором трипанового синего и считали количество розеток в камере горяева [фримель X. иммунологические методы /пер. с нем., под ред.м.а.фроловой.- M. мир, 1979, 518 с]. результаты представляют как число розеток на 10 клеток. индекс стимуляции рассчитывали как соотношение числа розеток в эксперименте (иммунизация эб в смеси с исследуемым соединением) и числа розеток в контроле (иммунизация только эб).

данные представлены в табл. 4. как видно из табл. 4, дипептид X стимулирует образование розеток при индексе стимуляции, соответствующем таковому для гк.

таблица 4. влияние дипептида I на клеточный иммунный ответ при иммунизации эритроцитами барана (эб)

пример 9. влияние дипептида 1. на в-клеточный иммунитет при иммунизации слабым антигеном.

влияние дипептида .1 на стимуляцию в-клеточного ответа определяли по увеличению титра специфических антител после иммунизации слабым антигеном - бычьим сывороточным альбумином (бса). препаратом сравнения служила гидроокись алюминия, традиционно используемая в вакцинах в качестве адъюванта.

животным вводили подкожно 400 мкг бса в 0,5 мл 0,9% NaCl. дипептид I 1 вводили подкожно в дозе 200 мкг/кг. в работе использовали 3 группы контрольных животных. одну группу иммунизировали бса с наф (1 :1 по объему), вторую — бса с 1%-ным Al(OH) 3 , третью — бса без препарата. дополнительно в качестве известного иммуномодулятора использовали глицирризиновую кислоту (гк). контроль — неимунные мыши. на 21 день аналогично проводили вторую иммунизацию (инъекционный раствор содержал 100 мкг бса и 200 мкг исследуемого соединения). на 10-й день после второй иммунизации получали сыворотки крови. титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по описанной методике [иммуноферментный анализ // под. ред. т.-т иго, г.лeнxoффaю-M:Mиp,1988]. количественные данные приведены в табл. 5.

таблица 5. влияние дипептида I на специфический гуморальный иммунный ответ после имм низации бса

как видно из данных табл. 5, при иммунизации слабым антигеном (бса) дипептид X обнаружил выраженную иммуностимулирующую активность: титр специфических антител увеличился в 512 раз по сравнению с иммунизацией без препаратов и сравним с иммуностимулирующим эффектом Al(OH) 3 и наф. пример 10. определение острой токсичности дипептида 1 для дипептида I 1 определена острая токсичность на белых беспородных мышах обоего пола. соединение вводили в/брюпшнно по 0,5 мл мышам массой 20 г, в

группе было по 4 животных. контрольным мышам ввели 0,5 мл стерильного подсолнечного масла. LD 50 дипептида 1 настоящего изобретения составила более 2500 мг/кг, что соответствует 3 классу умеренно-опасных веществ.

все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.

конкретные реагенты, условия проведения реакций, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. при изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.