серебряная соль N-(6-мeтил-2,4-диoкco-l,2,3,4- тeтpaгидpo-5H-пиpимидинcyльфoн)-N'-изoн� �кoтинoилгидpaзидa.

область техники

изобретение относится к медицине, а именно к созданию лекарственных средств на основе новых биологически активных веществ, в частности к сереб- ряной соли N-(6-мeтил-2,4-диoкco-l,2,3,4-тeтpaгидpo-5H-пи pимидинcyльфoн)- N"-изoникoтинoилгидpaзидa, проявляющей иммунотропную, противомикроб- ную, противогрибковую (противомикотическую) активность, способу ее получения и лекарственному средству на ее основе.

предшествующий уровень техники

по данным воз в настоящее время первой особенностью состояния здоровья населения в мире является снижение иммунореактивности: по разным источникам до 50-70 % людей имеют нарушения иммунитета. и второй осо- бенностью, вытекающей из первой, является повышение частоты заболеваний, вызываемых условно-патогенной микробиотой. в связи с этим в последнее время препараты, обладающие двойственным действием - иммуномодули- рующим и противомикробным приобретают особую актуальность.

известен иммуномодулятор N-(6-мeтил-2,4-диoкco-l ,2,3,4-тeтpaгидpo- 5H-пиpимидинcyльфoн)-N ^' -изoникoтинoилгидpaзид гидрат (изофон) (патент рф N° 2141322), обладающий антимикобактериальнми свойствами не только в отношении микобактерий лепры, но и туберкулеза, а также других заболеваний, протекающих на фоне иммунодефицита. изофон получают кипячением эквимолекулярных количеств гидразида изоникотиновой кислоты и 6- мeтилypaцил-5-cyльфoxлopидa в безводном ацетонитриле. недостатком имму- номодулятора изофон с антимикобактериальной активностью является невысокая биологическая активность, обусловленная плохой растворимостью в воде, что подтверждается экспериментом на животных (кроликах), в котором пока-

зано, что около 50% изофона в неизменном виде обнаруживается в продуктах жизнедеятельности. наряду с названием «изOфOH» иммуномодулятор имеет широко распространенное торговое название «KPиCTAфOH».

отечественные иммуномодулируюшие препараты с антимикобактери- альной активностью кристафон и изофон нормализуют иммунный статус больных лепрой, туберкулёзом, хроническим неспецифическим воспалением лёгких и хламидиозом, включая организм в борьбу с заболеванием, а также, проникая внутрь клетки, стимулируют её функцию и доносят действующее начало до возбудителя, уничтожают его. оказывают воздействие на возбудителей, лере- дающихся половым путем, хламидии, трихомонады, уреаплазменные инфекции. хорошо переносятся и не обнаруживают побочных действий. обычно эти препараты вводятся в организм человека в таблетированной форме в достаточно большой дозе. при местном введении субстанций необходимо усилить эффективность действия лекарственного средства либо за счет введения других лекарственных веществ, оказывающих синергетический эффект, либо модифицируя субстанцию изофон и кристафон.

наиболее близкой к изобретению является модификация изофона - ди- натриевая соль изофона (изодинафон, патент рф N° 2191015), проявляющая антимикробную и иммунотропную активность. изодинафон получают путем взаимодействия эквимолярных количеств изофона и едкого натра в воде с последующим осаждением продукта реакции этанолом. лекарственное средство в качестве активного вещества содержит изодинафон в количестве 0,01-2 г и может быть использовано в виде капсул, таблеток, инъекций и мазей. использование изодинафона в качестве лекарственного препарата позволяет сократить дозу применяемого лекарственного средства, снизив тем самым стоимость лечения. однако, соединение такого рода, несмотря на преимущества в растворимости препарата в воде, легко разлагается на две части по гидразиновому фрагменту: производное сульфопиримидина

производное изоникотиновои кислоты

и другие соединения.

соответственно следует ожидать снижения активности препарата изодинафон и проявление биологической активности продуктов его распада. кроме того, указанная модификация изофона имеет достаточно узкий спектр бактерицидного действия. так, изодинафон показал в случае с в.сеrеus бактерицидную антимикробную активность, в случае с St. аurеus - бактериостатическую антимикробную активность.

раскрытие изобретения

задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в по- лучении нового соединения на основе производных пиримидона и гидразида изоникотиновои кислоты, проявляющего усиленную иммунотропную, проти- вомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность в сравнении с кристафоном и изофоном, и создании на его основе лекарственного средства. поставленная задача решается группой изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно: разработкой нового соединения - серебряной соли кристафона, способом получения этого соединения и созданием лекарственного средства на его основе.

получено новое соединение - серебряная соль N-(6-мeтил-2,4-диoкco- l,2,3,4-тeтpaгидpo-5H-пиpимидинcyльфoн)-N'- изоникотиноилгидразида (кристафона) путем его взаимодействия с нитратом серебра при диспергировании их смеси в молярном соотношении от 50:50 мoльн% до 20:80 мoльн% в воде, с последующей промывкой, фильтрацией и высушиванием, проявляющая иммунотропную, противомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность.

согласно изобретению, серебряная соль кристафона может представлять собой соединение формулы I

или соединение формулы (II)

или смесь соединений (I) и (II). поставленная задача достигается способом получения серебряной соли кристафона, заключающемся в том, что в водную суспензию кристафона, интенсивно перемешанную до однородного состояния, добавляют нитрат серебра при мольном соотношении кристафона к нитрату серебра от 1 : 1 до 1 :4, затем без доступа света реакционную смесь перемешивают до получения объем- ного гомогенного осадка, полученный осадок фильтруют, многократно промывают бидистиллированной водой и высушивают при температуре 50-80 ⁰ C. для приготовления водной суспензии, согласно изобретению, используют криста- фон в мелко дисперсном состоянии.

поставленная задача решается также созданием лекарственного средства, обладающего иммунотропной, противомикробной, противогрибковой (противомикотической) активностью, содержащего активное вещество, которое, согласно изобретению, в качестве активного вещества содержит серебря-

ную соль кристафона либо смесь кристафона и его серебряной соли в соотношении от 1 : 1 до 4: 1. лекарственное средство может быть выполнено в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев.

сущность предложенного изобретения заключается в том, что для уси- ления иммунотропной, противомикробной, противогрибковой (противомико- тической) активности за счет дополнительного действия серебра предложено использовать субстанцию, представляющую собой серебряную соль кристафона.

серебро обладает мощным бактерицидным, иммуномодулирующим, вяжущим, анальгезирующим свойствами и оказывает стимулирующее действие на кроветворные органы. наиболее широко в медицине применяется способность серебра оказывать бактерицидный эффект в малых дозах, причем активностью обладают только ионы серебра. бактерицидность проявляется уже в концентрации 0,0001%. спектр действия препаратов серебра значительно шире многих антибиотиков и сульфаниламидов. он включает как грамположитель- ные, так и грамотрицательные бактерии (в том числе антибиотикорезистентные штаммы), вирусы и грибы. таким образом, исходя из вышеназванных свойств, серебро проявляет олигодинамическое действие.

ввести серебро в организм сложно, т.к. его ионы непосредственно в месте введения образуют труднорастворимые комплексы с отрицательно заряженными белками и рядом функциональных групп ферментов, в связи с чем, остро встает проблема выбора эффективной лекарственной формы.

для кристафона в водном растворе характерна лактим-лактамная (про- тотропная) таутомерия, и, по сути дела, кристафон при переходе в раствор су- ществует в двух таутомерных формах - лактамная (кето-форма) и лактимная (енольная форма).

лактимная енольная форма приобретает ароматический характер, и гид- роксильная группа в пиримидиновом цикле приобретает свойства фенольного гидроксила. при взаимодействии суспензии кристафона в воде с нитратом се- ребра AgNO ₃ образуется серебряная соль (изомеры).

лактимная (енольная-форма) серебряная соль кристафона кристафона

наиболее вероятно, образование следующих структур серебряной соли кристафона (I), (II) или их смеси.

(и)

в молекуле серебряной соли кристафона присутствует ион серебра, способный крайне медленно диссоциировать в липофильной среде, высвобождая ионы серебра, что обеспечивает пролонгированное действие препаратов. критическим фактором для бактерицидного действия в ране является требуемая локальная концентрация и возможность достижения этого уровня системным введением или местным применением. если локальное кровоснабжение скомпрометировано, например при ишемии конечностей, отеке ткани, или термической коагуляции, а также при наличии струпа и /или липодермосклероза, шансы системной терапии для достижения терапевтических концентраций значи- тельно снижаются, тогда как серебряные соли способны обеспечить необходимую концентрацию за счет длительного сохранения в липидных тканях ( беликов в. г. «Coвpeмeнныe синтетические и природные лекарственные средства)), пятигорск, 2003г.), (применение препаратов серебра в медицине, новосибирск, 1994 г, с. 106) кроме того, известно бактерицидное действие, как ионов серебра, так и нано-кластеров серебра, способных образовываться из серебряной соли кристафона в организме человека. известно, что нано-кластеры серебра представляют собой специфические нано-реакторы, действующие аналогично некоторым ферментам. вероятно, за счет этой функции происходит повышение им- мунотропной активности.

с другой стороны, хотя механизм бактерицидного действия пока точно не известен, полагают, что ионы серебра, высвобождаемые из липофильного соединения в липофильную среду, угнетают специфический фермент, который участвует в процессах метаболизма многих видов бактерий, вирусов и грибков. полученное соединение - серебряные соли кристафона может использоваться как самостоятельное лекарственное средство, так и в различных соотношениях с кристафоном для усиления действия последнего.

примеры осуществления изобретения

пример 1. способ получения серебряной соли N-(6-мeтил-2,4-диoкco- l,2,3,4-тeтpaгидpo-5-пиpимидинcyльфoн)-N'-� �зoникoтинoилгидpaзидa (кри- стафона).

в водную суспензию, содержащую 2 г (0,0061 моль) кристафона, предвари- тельно обрабатывают ультразвуком при частоте 22-44 кгц до однородной дисперсии, добавляют серебра нитрат 4,2 г (0,0244мoль). затем без доступа света реакционную смесь обрабатывают ультразвуком до получения объемного гомогенного осадка. полученный осадок фильтруют, многократно промывают бидистиллированной водой и сушат в вакуумном сушильном шкафу (100- 200мм рт. ст.) при температуре 50-80 ⁰ C. получают порошок белого или белого с сероватым оттенком цвета.

в полученной смеси обнаруживается 24,88 мае. % серебра, что соответствует 99,8 чистоты серебряной соли. количество серебра определяли титрованием роданида аммония (метод фольгарда) в среде разбавленной HNO ₃ (гф X). в качестве индикатора применяют раствор железо-аммонийных квасцов. титрование прекращают после появления неисчезающей при энергичном взбалтывании раствора окраски роданидного комплекса железа.

в пмр спектре серебряной соли кристафона после обработки в растворе AgNO ₃ отмечается сдвиг протонов δ пиридинового кольца с 7,65 (кристафон) до 7,8 (серебряная соль кристафона) миллионных долей (далее м. д.), сдвиг триплетов CH ₃ группы с 2,3-2,5 (кристафон) до 2,0 (серебряная соль кристафона) м. д., отсутствие изменений химических сдвигов протонов в гидразидной группе, принципиальные изменения части спектра пиримидинового фрагмента: интенсивность поглощения в серебряной соли кристафона уменьшилась в двое по сравнению с кристафоном, в пмр спектре серебряной соли кристафона отмечается новый дуплет с δ - 10,7; 10,8 м.д., и появляется новый синглет в области фенольной группы δ = 5,2 м.д.

структура серебряной соли кристафона была определена на основании сравнения ик- спектров кристафона и его серебряной соли. анализ ик- спектров проводился по двум реперным полосам в области 3307 см ^" ' и 1743 см ^" ' (со в положении 2), характеризующим карбонильную группу в пиримидиновом цикле кето- формы кристафона, а также группы интенсивных полос в области 3200-3000 см ^"1 (NH в положении 3). в ик- спектре серебряной соли кристафо-

на исчезает полоса 1743 см ^"1 , а интенсивность поглощения группы полос 3200-

3000 см ^"1 резко уменьшается, что свидетельствует об образовании серебряной соли кристафона.

пример 2. способ получения серебряной соли кристафона. водную суспензию, содержащую 1 г (0,003мoль) кристафона, предварительно тщательно перемешивают на механической мешалке 3000 об/мин до однородной дисперсии, добавляют серебра нитрат 1,03 г (0,006мoль). затем без доступа света реакционную смесь перемешивают на механической мешалке до получения объемного гомогенного осадка. полученный осадок фильтруют, много- кратно промывают бидистиллированной водой и сушат в вакуумном сушильном шкафу (100-200мм рт. ст.) при температуре 50-80 ⁰ C. получают порошок белого или белого с сероватым оттенком цвета.

в полученной смеси обнаруживается 24,78 мае. % серебра, что соответствует 99,4 чистоты серебряной соли. анализ пмр и ик- спектров продуктов реакции в примере 1 и 2 показал идентичность обоих продуктов и их соответствие серебряной соли кристафона.

пример 3. способ получения серебряной соли кристафона. водную суспензию, содержащую 1 г (0,003мoль) кристафона, предварительно тщательно перемешивают на механической мешалке 1000 - 3000 об/мин до од- нородной дисперсии, добавляют серебра нитрат 0,516 г (0,003мoль). затем без доступа света реакционную смесь перемешивают на механической мешалке до получения объемного гомогенного осадка. полученный осадок фильтруют, многократно промывают бидистиллированной водой и сушат в вакуумном сушильном шкафу (100-200мм рт. ст.) при температуре 50-80 ⁰ C. получают по- рошок белого или белого с сероватым оттенком цвета.

в полученной смеси обнаруживается 24,73 мае. % серебра, что соответствует 99,2 чистоты серебряной соли.

анализ пмр и ик- спектров продуктов реакции в примере 1, 2 и 3 показал идентичность всех продуктов и их соответствие серебряной соли кристафона. примеры 4-5. получение смесей кристафона и его серебряной соли.

для доклинических исследований были использованы смеси чистого кристафона и серебряной соли кристафона с чистотой 98,3 - 99,5 при массовых соотношениях 50:50(мacc.%) (пример 4), 80:20 (мacc.%) (пример 5).

пример 6. изготовление суппозиториев с серебряной солью кристафона, кристафоном и их смесями.

из кристафона, серебряной соли кристафона (примеры 1-3) и их смесей, взятых в соотношении, указанном в примерах 4-5, были изготовлены суппозито- рии на полиэтиленоксидной основе и основе витепсол массой по 1,5 г. каждый суппозиторий содержит по 0,2 г субстанции (кристафона, его серебряной соли или их смеси).

для изготовления суппозиториев в разогретую на водяной бане основу (до 60-70 ⁰ C для полиэтиленоксидной основы и до 40-60 ⁰ C для основы витепсол) в количестве 13 г вводят предварительно растертый в ступке кристафон (или его серебряную соль, или их смесь) в количестве 2 г. полученную смесь тщательно и интенсивно перемешивают до получения гомогенной суспензии. полученную суспензию разливают по гнездам формы для изготовления суппозиториев, после застывания суппозитории извлекают из формы и упаковывают. пример 7. результаты доклинических испытаний препаратов, содержащих кристафон, серебряную соль кристафона и их смесь на наличие антимикробной и противогрибковой активности в опытах iп vitrо.

определение антимикробного и противогрибкового действия предлагаемых по изобретению субстанций и их комбинаций проводилось по стандартной мето- дике, утвержденной мз государственной фармакопеей, M., «Meдицинa», 1990г., вып.2, «Oбщиe методы анализа. лекарственное растительное cыpьe». испытания проведены в отношении:

S.аurеus - музейный (контрольный штамм) номер 906, полученный из гиск им.тарасевича; е.соli M- 17 - музейный (контрольный штамм) номер B-8208, полученный из гиск им.тарасевича;

рs.аеrugiпоsае - изолят, выделенный от больного; с.аlbiсапs - изолят, выделенный от больного.

данные результатов испытания iп-vitrо на S.аurеus, е.соli, рs.аеrugiпоsае, сапdidа аlbiсаms определения противомикробной, противогрибковой (проти- вомикотической) активности серебряной соли кристафона и ее смеси с кристафоном сведены в таблицу 1.

как видно из таблицы 1 серебряная соль кристафона обладает ярко выраженным антимикробным действием в отношении всех испытуемых культур и небольшим противогрибковым действием в отличие от кристафона, который проявляет активность только в отношении S.аurеus. пример 8. результаты доклинических исследований по изучению эффективности препаратов, содержащих серебряную соль кристафона при лечении бактериальных вагинитов у крыс в сравнении с известным препаратом бета- дин, суппозитории вагинальные.

в качестве патогенов для инфицирования были выбраны S. аиrеиs (ти- повой штамм 7M (нниэм, н.новгород)) и E. соli (штамм 782-2), как одни из наиболее частых возбудителей бактериальных вагинитов. изучение микробиоцидной активности препаратов осуществляли методом серийных разведений согласно ранее описанным рекомендациям (медицинская микробиология, 1999; энциклопедия клинических лабораторных тестов, 1997; лабора- торные методы исследования в клинике, 1987).

в таблице 2 представлены результаты изменения цитологической картины влагалищных мазков крыс в баллах. при цитологическом исследовании придерживались следующих критериев при выставлении баллов: 1 - единичные бактериальные клетки; 2 - мало клеток; 3- умеренное число клеток; 4- много клеток.

из полученных результатов видно, что для всех препаратов, содержащих серебряную соль кристафона эффект больше, чем при отсутствии лечения или при лечении препаратом бетадин.

в таблице 3 представлены результаты микробиологических исследований при лечении бактериальных вагинитов у крыс в сравнении с известным препаратом бетадин.

из полученных результатов видно, что при микробиологических исследованиях наиболее выраженное стабильное снижение количества S.аurеus и е.соli в вагинальной полоти крыс после инвагинального применения препаратов, на- блюдали при использовании серебряной соли кристафона, смеси серебряной соли кристафона и кристафона в соотношении 1 :1 и контрольного препарата бетадин.

в ходе эксперимента у крыс контрольной (без лечения) группы наблюдались усиленные влагалищные выделения на 3-7 дни эксперимента. за период наблюдения животные опытных групп оставались подвижными, внешне выглядели здоровыми. данные клинического осмотра свидетельствуют об отсут- ствии генерализованной септической системной реакции организма при инва- гинальном инфицировании. что касается рн влагалищной среды при вагинитах, а нормальная кислотность влагалищной среды у крыс близка к нейтральной pH=7 [Lаrsеп еt аl., 1977], то в контрольной группе при развитии бактериального вагинита отмечено закисление среды (pH=6). в опытных же группах наблюдалось достоверное возвращение величины рн к нормальным значениям. в контрольной серии экспериментов без лечения слизистая оболочка влагалища представлена рыхлой соединительной тканью, покрытой неороговевающим плоским эпителием, имеющим неровную базальную мембрану за счет неглубокого акантоза. в слизистой оболочке отмечался умеренно выраженный воспа- лительный инфильтрат, распределяющийся диффузно в собственной пластинке. при лечении животных препаратами, содержащими серебряную соль кри- стафона и ее смесь с кристафоном не отмечалось каких-либо патологических изменений в структуре влагалища, явлений отека подлежащей соединительной ткани не обнаружено. серебряная соль кристафона в виде порошка или в виде порошка в кап- сулированной форме, где вспомогательным веществом является лактоза (результаты iп-vitrо) и вагинальных суппозиториев (результаты доклинических испытаний), обладает близкой иммуномодулирующей, противомикробной, противогрибковой (противомикотической) активностью. данные свойства так- же проявляются в препаратах в форме вагинальных и наружных мазей, а также проявляется общее иммуномодулирующее и противомикробное действие при пероральном применении в форме твердых желатиновых капсул и таблеток, по аналогии с кристафоном и изофоном, дополнительно усиленное за счет наличия в молекуле атома серебра (в том числе по отношению к микобактериям ту- беркулёза и лепры).

примеры рецептур других форм лекарственного средства представлены ниже.

капсулы: активное начало кристафон, его серебряная соль и их смеси, взятые в соотношении, указанном в примерах 4-5 - 100 мг, 200 мг, 500 мг, в первых двух случаях в качестве наполнителя использовалась лактоза.

таблетки: активное начало кристафон, серебряная соль кристафона и их смеси, взятые в соотношении, указанном в примерах 4-5 - 200 мг, наполнители: крахмал- 30 мг, тальк - 5 мг, лактоза - 15 мг.

мазь: активное начало кристафон, его серебряная соль и их смеси, взятые в соотношении, указанном в примерах 4-5 - 3 г, основа: воск эмульсионный - 20 г, вазелиновое масло - 20 г, вазелин - 10 г, поэ 400 - 10 г, вода дистилли- рованная - 37 г.

учитывая широкий спектр противомикробной активности серебряной соли кристафона и его иммунотропные свойства можно рекомендовать его для применения в медицинской практике специалистами - гинекологами, венерологами и урологами для лечения заболеваний, передающихся половым путем, для лечения вагинитов, вагинозов различной природы, кожных заболеваний, обусловленных снижением иммунитета и развитием патогенной микрофлоры, а также для лечения грибковых заболеваний различной локализации.

таблица 1

таблица 2

таблица 3