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15 La présente invention concerne une méthode pour construire des moyens nécessaires à la production de nouvelles molécules capables d'induire une réponse immuno-protectrice à rencontre d'un virus responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA).

Chez un individu, cette maladie se développe à la suite d'une infection des 20 lymphocytes T-heiper par un rétrovirus HIV (human immunodeficiency virus). Jusqu'à présent on a répertorié ces rétrovirus en deux grand types: le type HIV-1 qui sévit essentiellement en Europe et en Amérique du Nord et le type HIV-2 caractéristique des infections africaines. A l'intérieur d'un même type, les rétrovirus HIV présentent entre eux un cerain degré de variabilité qui se caractérise par exemple par une différence de 25 trophisme cellulaire ou par des protéines virales légèrement différentes les unes des autres. C'est pourquoi, lorsqu'on souhaite se référer à un rétrovirus HIV particulier, on emploie de préférence le terme de "souche virale".

D'une manière générale, les rétrovirus HIV ont la structure suivante : la molécule 30 d'ARN génomique et diverses protéines associées sont encapsulés dans une capside de nature protéique (nucléocapside). L'ensemble est protégé par une membrane d'origine cellulaire ayant incorporé la protéine d'enveloppe d'origine virale.

Cette protéine d'enveloppe, sous des formes diverses, est à ce jour considéré comme 35 un élément thérapeutique potentiel d'un vaccin contre le Sida. r

Dans les conditions naturelles, la protéine d'enveloppe (env) est initialement

Λ synthétisée sous forme d'un précurseur comportant à son extrémité N-terminale une séquence signal qui initie le passage du précurseur dans le réticulum endoplasmique (voie

40 de sécrétion). Ce peptide signal est ensuite éliminé par clivage protéolytique. Le produit

de ce clivage est une protéine appelée gpl60 qui est elle-même par la suite clivée en une petite sous-unité gp40 et une grande sous-unité gpl20. L'extrémité N-terminale de la gρl20 correspond à l'extrémité N-terminale de la gplόO tandis que l'extrémité C-terminale de la gp40 correspond à l'extrémité C-terminale de la gplόO.

Chacune des sous-unités est sécrétée à l'extérieur de la cellule infectée. Toutefois, la gp40 reste ancrée dans la membrane cellulaire par son domaine transmembranaire. Sa partie C-terminale (domaine intra-cytoplasmique) reste en contact avec le cytoplasme tandis que sa partie N-terminale (domaine extra-cytoplasmique) se trouve à la surface de la cellule. La sous-unité gpl20 est relarguée à l'extérieur de la cellule où elle interagit avec le domaine extracellulaire de la sous-unité gp40. Les deux sous-unités de la protéine d'enveloppe restent ainsi associées sous forme de complexe.

La séquence en acides aminés des précurseurs des protéines env de diverses souches virales sont maintenant connues. A titre d'exemple, la Figure 1 présente la séquence des précurseurs des gplόO des souches virales HIV-1 Bru, HIV-1 MN, HIV-1 ELL HIV-1 RF,

HIV-1 SF2C et HIV-1 SC. De même, la Figure 2 présente la séquence du précurseur de la gplόû de la souche virale HIV-2 Rod.

Par la suite et pour faciliter la compréhension, les séquences des gplόO autres que la gpl60 de la souche HIV-1 Bru seront ci-après décrites par référence à la séquence de la gpl60 de la souche HIV-1 Bru (ci-après appelée gpl60-Bru) comme suit :

a) La gpl60-Bru possède 831 acides aminés, ceux-ci numérotés de 1 à 831. En outre la gpl20-Bru correspond à la séquence des 486 premiers acides aminés de la gplόO-

Bru tandis que la gp40-Bru correspond à la séquence commençant avec l'acide aminé en position 487 et finissant avec l'acide aminé en position 831.

b) La séquence d'une gplόO quelconque est alignée avec la séquence de la gpl60-Bru de manière à présenter un maximum d'homologie. A cette fin, des emplacements vacants peuvent être introduits soit dans la séquence de la gpl60-Bru, soit dans la séquence de la gplόO quelconque. Par définition, la position d'un acide aminé dans la gpl60 quelconque sera spécifiée à l'identique par la position de l'acide aminé homologue dans la gpl60-Bru.

c) En conséquence, lorsqu'un emplacement vacant est introduit dans la séquence de la gplόO quelconque, en face de l'acide aminé en position x, il n'existe pas d'acide aminé en position x dans la séquence de la gplόO. Cependant, on considère que cet acide aminé jouit d'une présence virtuelle.

d) Lorsqu'un ou plusieurs emplacements) vacant(s) est (sont) introduits) dans la séquence de la gpl60-Bru entre l'acide aminé en position x et l'acide aminé en position x + 1, on considère que, dans la gplόO quelconque, la position recouvre au moins deux sous-positions x _a , x _b , , x _n , chacune occupée par un acide aminé. Par définition, la position d'aval x _π représente la position x.

e) Lorsqu'un ou plusieurs emplacement(s) vacant(s) est (sont) introduit(s) dans la séquence de la gpl60-Bru en amont de l'acide aminé en position 1, on considère que, dans la gpl60 quelconque, la position 1 recouvre au moins deux sous-positions l _a , l _b , , l _n , chacune occupée par un acide aminé. Par définition, la position d'amont NH ₂ -terminale l _π représente la position 1.

f) Lorsqu'un ou plusieurs emplacement(s) vacant(s) est (sont) introduits) dans la séquence de la gplόO quelconque en face du ou des acide(s) aminé(s) NH ₂ - terminal(aux) de la gpl60-Bru, on indique que, par définition, l'acide aminé en position NH ₂ -terminale dans la gplόO quelconque cumule la position 1 et sa position d'acide aminé homologue.

g) Lorsqu'un ou plusieurs emplacement(s) vacant(s) est (sont) introduits) dans la séquence de la gplόO quelconque en face du ou des acide(s) aminé(s) COOH- terminal(aux) de la gpl60-Bru, on indique que, par définition, l'acide aminé en position COOH-terminale dans la gplόO quelconque cumule la position 841 et sa position d'acide aminé homologue.

A ce jour, dans l'optique d'un vaccin, la protéine d'enveloppe est considérée comme un candidat potentiellement intéressant d'un point de vue thérapeutique. Toutefois, sa structure multichaîne d'origine constitue un handicap en terme de faisabilité. C'est pourquoi, il est apparu préférable d'utiliser une protéine simple chaîne qui conserverait la plupart des épitopes de la gpl20 et ceux de la gp40. Ce type de protéine a déjà été proposé dans la demande de brevet WO 87/6260. Il s'agit plus particulièrement d'un variant gplόO non-clivable et soluble.

Toutes les gplόO des souches virales de type HIV-1 possèdent, en positions 483 -

486, un site de clivage dit majeur, reconnu par une ou des enzymes protéolytiques. Ce site de clivage est le même pour toutes les gpl60 décrites à la Figure 1 et correspond à la séquence Arg-Glu-Lys-Arg (REKR). Les enzymes protéolytiques coupent immédiatement en aval de ce site de clivage pour libérer une gpl20 et une gp40.

Lorsque ce site de clivage n'existe pas, on a démontré que les enzymes protéolytiques reconnaissent avec une efficacité toutefois moindre un site de clivage dit

mineur et d'effectuer une coupure immédiatement en aval de celui-ci. Là aussi, ce site de clivage est le même pour toutes les gpl60 montrées à la Figure 1. Il correspond à la séquence Lys -Arg-Arg (KRR) en positions 477 - 479, selon certains auteurs ou selon d'autres, à la séquence Lys -Ala-Lys -Arg (KAKR) en positions 475 - 478.

En outre, on indique que les gplόO des souches virales de type HIV-2 possèdent uniquement un site de clivage majeur en positions 475 - 478 qui correspond à la séquence Lys-Glu-Arg-Lys (KEKR).

Un variant gpl60 non-clivable est un analogue artificiel d'une gplόO native. Sa séquence en acides aminés correspond à celle d'une gplόO native dans laquelle le site de clivage majeur et/ou le site de clivage mineur a (ont) été supprimé(s).

Une tel variant gplόO peut être synthétisé grâce aux techniques de l'ADN recombinant. II suffit d'isoler un fragment d'ADN codant pour une gplόO native puis de modifier la région codant pour le site de clivage majeur par mutagenèse dirigée, de manière à obtenir un fragment d'ADN codant pour un variant gplόO insensible à une action protéolytique. Par la suite ce dernier fragment d'ADN est exprimé dans des conditions appropriées pour donner ledit variant gpl60. Un tel variant gpl60 qui ne contient plus le site de clivage majeur est appelée ci-après un variant gplόO non-clivable de type A.

De manière préférée, la région codant pour le site de clivage mineur peut être en outre modifiée à des fins identiques. Dans ces conditions, on obtient un variant gplόO non-clivable de type A' qui ne contient ni de site le clivage majeur, ni le site de clivage mineur.

A cette fin, on indique à titre d'exemple que le site de clivage REKR, KEKR ou KAKR et le site de clivage KRR peuvent être respectivement remplacés par les séquences Asn-Glu -His-Gln (NEHQ) et Gln-Asn-His (QNH).

D'autre part, il est aussi nécessaire qu'une gplόO soit obtenue sous forme soluble. Une telle gplόO correspond à une gpl60 native dans laquelle la région transmembranaire de nature hydrophobe a été supprimée. Cette région transmembranaire est située dans la zone correspondant à la gp40, du résidu acide aminé en position 659 au résidu acide aminé en position 680 De manière additionnelle mais superflue, une autre région hydrophobe, allant du résidu acide aminé en position 487 au résidu acide aminé en position 514 pourrait être délétée.

De façon similaire, les moyens nécessaires à la synthèse d'un variant gplόO soluble

- 5 - incluent bien évidemment le fragment d'ADN correspondant qui doit être obtenu par modification du fragment d'ADN original.

La comparaison des séquences des différentes gplόO déjà connues a mis en évidence au moins trois domaines dont la séquence est hypervariable d'une gplόO à l'autre. Ces trois domaines sont couramment appelés les domaines (ou boucles) V _t , V ₂ et V ₃ .

Les deux premiers domaines V _t et V ₂ sont situés entre le résidu cystéine en position 96 et le résidu cystéine en position 171 tandis que le troisième domaine V ₃ est situé du résidu cystéine en position 271 au résidu cystéine en position 306.

Il existe aussi un dernier domaine présentant un certain degré de variabilité, toutefois considéré comme moindre. Il s'agit du site de fixation au récepteur CD4 des lymphocytes T-helper; celui-ci étant situé approximativement du résidu acide aminé en position 340 au résidu acide aminé en position 440.

Quelque soit la gplόO considérée, des expériences de vaccination ont montré que le troisième domaine hypervariable est essentiel pour obtenir une immunité convenable. Toutefois, en raison de la nature hypervariable de ce domaine, la protection développée ne serait efficace qu'à l'encontre de la souche virale dont est issue la gplόO utilisée.

Enfin il semblerait que le premier et le deuxième domaines hypervariables ainsi que le site de fixation au récepteur CD4 influent sur le degré d'immunité que l'on pourrait obtenir.

Un vaccin d'un intérêt général devrait permettre de protéger les individus contre la majorité des souches virales HIV qui sévissent dans le monde. En conséquence, un vaccin à base de gplόO devrait contenir diverses gplόO, chacune dérivée d'une souche virale différente. Afin de mettre en oeuvre un tel vaccin, il convient tout d'abord de construire les moyens destinés à la production du variant gplόO non-clivable et soluble, correspondant à chaque souche virale. En première approche, il s'agirait donc à chaque fois de cloner le fragment d'ADN codant pour la gplόO d'une souche virale déterminée, d'en déterminer sa séquence, de modifier ce fragment d'ADN afin de supprimer par substitution ou délétion des sites de clivage et des régions hydrophobes, puis enfin de placer ce fragment d'ADN ainsi modifié dans des conditions d'expression appropriées. Comme ce type d'opération devrait être renouvelée pour chaque gplόO, la préparation d'un tel vaccin est prévue longue et coûteuse.

De plus, les souches virales peuvent varier au cours du temps e.g. par mutation. Telle souche, cause majeure de l'infection dans telle région du globe à tel moment, peut

régresser en tant qu'agent infectieux et telle autre souche apparaître en remplacement. Il est donc important de pouvoir adapter rapidement un vaccin aux conditions épidémiologiques et, dans le cas présent, de disposer d'un variant gpl60 dans les meilleurs délais.

A cette fin, on a maintenant trouvé une nouvelle méthode pour obtenir un variant gpl60 approprié quelque soit la souche virale considérée. Dans la mesure où l'on dispose d'une cassette d'expression destinée à la production d'un variant gplόO non-clivable et soluble dérivé d'une première souche virale, cette méthode permet d'obtenir un variant similaire dérivé d'une deuxième souche virale en évitant le clonage complet du fragment d'ADN codant pour la gpl60 de la deuxième souche virale et les modifications qui devraient s'en suivre.

En conséquence, l'invention propose une méthode pour construire une cassette d'expression comportant une unité d'ADN codant soit pour un précurseur d'un variant gplόO hybride non-clivable et soluble, soit pour un variant gplόO hybride non-clivable et soluble ; ledit variant ayant une séquence en acides aminés comprenant :

i) une première région dérivée de la gplόO d'une première souche du virus HIV et située dans cette dernière gplόO de l'acide aminé en position X à l'acide aminé en position Y, X étant un nombre de 1 à 271 et Y étant un nombre de 306 à 482 ;

ii) une deuxième région dérivée d'un variant gplόO soluble, non-clivable de type A ayant pour origine une deuxième souche du virus HIV et située dans ce dernier variant gplόO de l'acide aminé en position Y + 1 à l'acide aminé en position C-terminale, Y étant tel que défini ci-dessus ; et

iii) quand X est différent de 1, une troisième région dérivée de la gpl60 de ladite deuxième souche du virus HIV et située dans cette dernière gpl60 de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position X - 1, X étant tel que défini ci-dessus ;

ladite méthode comprenant :

a) l'acte de cloner un fragment d'ADN codant pour ladite première région ; et

b) l'acte d'insérer le fragment d'ADN clone en a) dans un site d'une cassette qui comprend :

m) en amont du site et en séquence :

i) un promoteur,

ii) un codon d'initiation de traduction,

iii) en option, une première région d'ADN codant pour un peptide signal, et

iv) quand X est tel que défini ci-dessus mais différent de 1, une deuxième région d'ADN codant pour ladite troisième région de la séquence en acides aminés dudit variant gplόO hybride ; et

n) en aval du site et en séquence :

i) quand Y est tel que défini ci-dessus, une troisième région d'ADN codant pour ladite deuxième région de la séquence en acides aminés dudit variant gpl60 hybride et

ii) un codon de terminaison de traduction ;

pour obtenir une cassette d'expression comportant ladite unité d'ADN.

Une telle cassette d'expression est l'outil indispensable qui permet de produire un variant gplόO hybride, soluble et non-clivable dans un système d'expression hétérologue.

Dans la méthode selon l'invention, le fragment d'ADN codant pour ladite première région peut être clone selon n'importe quelle méthode en usage. On indique cependant que ce clonage peut être avantageusement effectué par la technique PCR à partir de i'ADN génomique de cellules infectées par ladite deuxième souche du virus HIV. L'insertion du fragment d'ADN clone s'effectue dans des sites de restriction initialement présents dans la cassette ou créés à cet effet, par exemple en utilisant un polylin er de manière appropriée. Une illustration de cette méthode est présentée par la suite dans les exemples.

Par "unité d'ADN codant pour un polypeptide quelconque", on entend un segment d'ADN dont le premier codon en position 5' et le dernier codon en position 3' codent respectivement pour le premier acide aminé en position N-terminale et le dernier acide aminé en position C-terminale du polypeptide.

Selon un mode préféré, la méthode selon l'invention est mise en oeuvre pour

construire une cassette d'expression comportant une unité d'ADN codant pour un précurseur d'un variant gplόO hybride non-clivable et soluble.

Par "précurseur d'un variant gplόO selon l'invention", on signifie un polypeptide comportant un peptide signal et un variant gplόO mature ; l'extrémité N-terminale dudit variant étant associée à l'extrémité C-terminale du peptide signal par liaison peptidique. Ce précurseur est le produit initial de l'expression de l'unité d'ADN. Il est en particulier présent dans le cytoplasme de la cellule hôte, associé en position N-terminale avec un résidu methionine d'initiation de traduction. Le peptide signal permet d'initier le transfert du variant gplόO dans le réticulum endoplasmique. Lors de ce transfert, le peptide signal est abandonné par clivage protéolytique pour donner la forme mature du variant gplόO. Dans la suite du texte, le terme "variant gpl60" fait exclusivement référence à sa forme mature.

Le peptide signal peut être n'importe quel peptide signal en usage. Il doit être cependant choisi en tenant compte de l'organisme-hôte destiné à la production du variant gpl60 selon l'invention. Par exemple, si l'organisme-hôte est une cellule de mammifère, le peptide signal peut être avantageusement sélectionné parmi les peptides signal des précurseurs des gpl60 des différentes souches du virus HIV, indépendamment de l'origine des première, deuxième et troisième régions du variant selon l'invention. De manière alternative, on peut utiliser des peptides signal synthétiques. De tels peptides signal sont par exemple, des peptides signal hybrides dont l'extrémité N-terminale dérive du précurseur de la gpl60 de ladite deuxième souche du virus HIV et dont l'extrémité C- terminale dérive du précurseur de la gpl60 de ladite première souche du virus HIV. A titre indicatif, on mentionne de plus, que le peptide signal du précurseur de la glycoprotéine d'une souche du virus de la rage peut être aussi utilisé. Enfin, l'homme du métier doit comprendre que cette liste est non-limitative.

L'invention propose de même un variant gpl60 hybride, non-clivable et soluble, qui comprend :

i) une première région dérivée de la gplόO d'une première souche du virus HIV et située dans cette dernière gpl60 de l'acide aminé en position X à l'acide aminé en position Y, X étant un nombre de 1 à 271 et Y étant un nombre de 306 à 482 ;

ii) une deuxième région dérivée d'un variant gplόO soluble, non-clivable de type A ayant pour origine une deuxième souche du virus HIV et située dans ce dernier variant gplόO de l'acide aminé en position Y + 1 à l'acide aminé en position C-terminale, Y étant tel que défini ci-dessus ; et

iii) quand X est différent de 1, une troisième région dérivée de la gplόO de ladite deuxième souche du virus HIV et située dans cette dernière gplόO de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position X - 1, X étant tel que défini ci-dessus.

La première, ainsi que la deuxième et troisième régions du variant gplόO selon l'invention peuvent être dérivées de la gplόO de n'importe quelle souche du virus HIV, à condition que la première souche soit différente de la deuxième. De manière préférée, la première région dérive de la gplόO d'une souche virale sélectionnée parmi les souches HIV-2 Rod, HIV-1 Eli, HIV-1 RF, HIV-1 SF2C, HIV-1 SC et HIV-1 MN, cette dernière étant plus particulièrement préférée. De même, la deuxième et troisième régions ont de préférence pour origine la gplόO de la souche HIV-1 Bru.

Par "variant gplόO non-clivable de type A", on entend un variant gplόO : - soit dérivé d'une gplόO d'une souche virale de type HIV-1 et ne contenant plus le site de clivage majeur,

- soit dérivé d'une gplόO d'une souche virale de type HIV-2 et ne contenant plus le site de clivage.

Lorsque le variant gplόO dérive d'une gplόO d'une souche virale de type HIV-1, ce variant est de préférence de type A' ; c'est-à-dire ne contenant ni le site de clivage majeur, ni le site de clivage mineur.

Par "variant gplόO soluble", on entend un variant gplόO dérivé d'une gplόO native qui ne contient plus de région transmembranaire ou dont la région transmembranaire native a été mutée de manière à ne plus pouvoir assurer sa fonction d'ancrage dans la membrane. De plus, un tel variant soluble peut avantageusement ne plus contenir de région hydrophobe.

Par "cassette d'expression", on entend un segment d'ADN comprenant une unité d'ADN à exprimer ainsi que les éléments nécessaires à l'expression de cette dernière. L'expression d'une unité d'ADN est obtenue par transcription de cette unité d'ADN en ARN messager et par traduction de cet ARN messager en protéine. Par conséquent, les éléments indispensables sont un promoteur constitutif ou inductible (initiation de la transcription), un codon d'initiation de traduction (codon ATG) et un codon de fin de traduction (codon TAG, TAA ou TGA). En outre, une cassette d'expression peut aussi contenir d'autres éléments ; par exemple, un terminateur de transcription.

L'homme du métier sait bien évidemment choisir le promoteur et le terminateur appropriés en fonction de l'organisme-hôte dans lequel on souhaite exprimer l'unité d'ADN et en fonction du vecteur dans lequel la cassette d'expression doit être insérée

pour assurer sa replication.

En accord avec ce qui précède, l'invention propose de même, une cassette d'expression comportant une unité d'ADN codant soit pour un précurseur d'un variant gplόO selon l'invention, soit pour un variant gplόO selon l'invention ainsi que les éléments nécessaires à expression de ladite unité d'ADN.

Afin d'assurer sa replication autonome dans un organisme hôte, une cassette d'expression selon l'invention peut être insérée dans différents types de vecteur ayant une origine de replication adaptée à l'organisme hôte ; par exemple un plasmide ou un virus. Les vecteurs de type viral ont en particulier la capacité d'intégrer dans leur génome une quantité substantielle d'ADN étranger sans nuire à leur capacité de replication. Parmi ceux-ci, on compte par exemple, les poxvirus, tels que le virus de la vaccine, le poxvirus du canari et la poxvirus de la variole aviaire ; les baculovirus tels que et les adénovirus tel que l'Adénovirus-2 ou l'Adénovirus-5.

Outre leur utilisation dans un système de production hétérologue, certains de ces vecteurs de type viral peuvent être fonctionnels à titre d'agent de vaccination. Il s'agit en particulier des poxvirus et des adénovirus.

C'est pourquoi, l'invention concerne de même un vecteur viral dans le génome duquel est inséré une cassette d'expression selon l'invention.

Sous un autre aspect de l'invention, on procure aussi une cellule transformée par une cassette d'expression selon l'invention. La cassette d'expression qui transforme la cellule peut être véhiculée par un plasmide ou, de manière alternative, être intégrée dans le génome de la cellule hôte.

L'organisme -hôte destiné à la production du variant gpl60 selon l'invention peut être n'importe quel type de cellule, de préférence eucaryote. Ceci inclut par exemple : des champignons tels que les levures, des cellules d'insectes et des cellules de mammifères.

L'invention propose, en outre, deux procédés alternatifs visant à la production d'un variant gpl60 selon l'invention :

- le premier procédé comprend l'acte de cultiver une cellule selon l'invention et l'acte de récolter ledit variant à partir de la culture,

- le second procédé comprend l'acte d'infecter une culture de cellules avec un vecteur viral selon l'invention et l'acte de récolter ledit variant à partir de la culture.

Un variant gplόO ainsi qu'un vecteur viral selon l'invention possèdent une activité vaccinale à l'encontre d'un virus HIV et, par conséquent, sont utiles à titre de produits pharmaceutiques en particulier destinés au traitement ou à la prévention du Sida.

En conséquence, l'invention propose :

i) une composition pharmaceutique destinée au traitement curatif ou préventif du Sida qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins un variant gplόO ou un vecteur viral selon l'invention,

ii) une méthode de traitement curatif ou préventif du Sida qui comprend l'acte d'administrer une quantité thérapeutiquement effective d'un variant gplόO ou d'un vecteur viral selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.

iii) l'usage d'un variant gplόO ou d'un vecteur viral selon l'invention à titre d'agent thérapeutique destiné au traitement curatif ou préventif du Sida.

De manière préférée, une composition pharmaceutique selon l'invention peut contenir plusieurs variants gplόO selon l'invention ; chaque variant gpl60 possédant au moins un troisième domaine hypervariable (boucle V ₃ ) différent des autres variants présents dans la composition. Une telle composition pharmaceutique devrait donc permettre de protéger correctement un individu vis-à-vis de diverses souches HIV.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut contenir en outre d'autres agents thérapeutiques comme, par exemple, un peptide correspondant essentiellement au troisième domaine hypervariable d'une gplόO (ci-après appelé peptide V ₃ ). De préférence, un tel peptide a une séquence substantiellement identique à la séquence du troisième domaine d'un variant gplόO contenu dans la composition pharmaceutique selon l'invention. De manière similaire, plusieurs peptides V ₃ peuvent être présents dans la composition. En particulier, si la composition pharmaceutique selon l'invention contient différents variants gpl60, on peut bien évidemment y ajouter les peptides V ₃ correspondants.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe un variant gplόO selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Enfin, une composition selon l'invention peut contenir un adjuvant de vaccination tel que l'alun. De manière alternative, cet adjuvant peut être ajouté à une composition selon l'invention juste avant usage.

Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous- cutanée, par exemple sous forme de solution ou de suspension injectable. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration.

De manière alternative, une composition pharmaceutique selon l'invention peut être présentée comme partie d'un kit de traitement. A titre d'exemple, on indique qu'un tel kit peut contenir :

- d'une part, une composition pharmaceutique contenant au moins un variant gplόO selon l'invention et,

- d'autre part, une composition pharmaceutique contenant au moins un peptide V ₃ ,

- ainsi qu'une notice spécifiant les instructions relatives à l'administration séquentielle ou concomitante des compositions pharmaceutiques contenues dans le kit.

L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes:

La Figure 1 présente la séquence des acides aminés des précurseurs des gplόO natives des souches virales HIV-1 Bru (a), HIV-1 MN (b), HIV-1 Eli (c), HIV-1 RF (d), HIV-1 SC (e) et HIV-1 SF2C (f). Les résidus acides aminés des séquences signal sont numérotés de la position -1 à -29. Le résidu méthionine en position -30 correspond au codon d'initiation de traduction. Les résidus acides aminés des gplόO matures sont numérotés de la position 1 à 841. L'astérisque (*) symbolise l'identité des résidus acides aminés à une position donnée tandis que le point ( . ) indique un changement conservatif (acides aminés différents, mais apartenant à une même classe).

La Figure 2 présente la séquence des acides aminés des précurseurs des gplόO natives des souches virales HIV-1 Bru (a) et HIV-2 Rod (b). Les résidus acides aminés des séquences signal sont numérotés de la position -1 à -29. Le résidu méthionine en position -30 correspond au codon d'initiation de traduction. Les résidus acides aminés des gpl60 matures sont numérotés de la position 1 à 841. L'astérisque (*) symbolise l'identité des résidus acides aminés à une position donnée tandis que le point (.) indique un changement conservatif (acides aminés différents, mais apartenant à une même classe).

La Figure 3 présente la séquence nucléotidique du fragment Pstl-PstI du vecteur

pTG1163 qui comporte la séquence codant pour un précurseur d'un variant gpl60-Bru non-clivable soluble (domaine transmembranaire absent) ainsi que la séquence en acides aminés de ce précurseur.

La Figure 4 shématise les étapes de la construction des bactériophages M13TG4168 et M13TG4174.

La Figure 5 présente la séquence nucléotidique codant pour le précurseur de la gpl20-MN ainsi que la séquence en acides aminés de ce précurseur. Les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 destinés à l'amplification d'un fragment d'ADN codant au moins pour le troisième domaine hypervariable de la gpl20-MN sont représentés au dessus de leur région d'hybridation.

La Figure 6 présente la séquence nucléotidique codant pour le précurseur de la gpl20 -Eli ainsi que la séquence en acides aminés de ce précurseur. Les oligonucléotides

OTG2624 et OTG2625 destinés à l'amplification d'un fragment d'ADN codant au moins pour le troisième domaine hypervariable de la gpl20-MN sont représentés au dessus de leur région d'hybridation.

La Figure 7 présente la séquence nucléotidique codant pour le précurseur de la gpl20-RF ainsi que la séquence en acides aminés de ce précurseur. Les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 destinés à l'amplification d'un fragment d'ADN codant au moins pour le troisième domaine hypervariable de la gpl20-RF sont représentés au dessus de leur région d'hybridation.

La Figure 8 présente la séquence nucléotidique codant pour le précurseur de la gpl20-SF2C ainsi que la séquence en acides aminés de ce précurseur. Les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 destinés à l'amplification d'un fragment d'ADN codant au moins pour le troisième domaine hypervariable de la gpl20-SF2C sont représentés au dessus de leur région d'hybridation.

Dans les exemples suivants, pour faciliter l'écriture et la compréhension, on entend par "séquence signal", une séquence signal incluant le résidu méthionine d'initiation de traduction.

Exemple 1 : Construction d'une cassette d'insertion porté par le bactériophage M13TG4168.

Tel que montré à la Figure 3, le fragment d'ADN Pstl-Pstl du plasmide pTGH63 décrit dans la demande de brevet EPA 245 136 comporte une séquence d'ADN codant pour un précurseur d'un variant gpl60-Bru non-clivable et soluble. Ce fragment d'ADN Pstl-Pstl est inséré dans le bactériophage M13mp701 (décrit par M.P. Kieny et al. Gène (1983) 26 : 91) préalablement digéré par PstI pour donner le bactériophage M13TG4137 (Figure 4). La numérotation des nucleotides du fragment Pstl-Pstl telle que indiquée à la Figure 3 sert de référence dans la suite de l'exemple 1.

Le plasmide pTG1163 est coupé par PstI et Kpnl et le fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1 à 138 (Figure 3) est inséré dans le bactériophage M13TG130 (décrit par M.P. Kieny et al. (1983), supra) préalablement digéré par PstI et Kpnl. On obtient ainsi le bactériophage M13TG4147 (Figure 4).

Le bactériophage M13TG4137 est coupé par BgUI, traité par l'enzyme klenow (Boehringer Mannheim) pour obtenir des extrémités franches, puis coupé par EcoRI. Le fragment EcoRI-BglII° issu de cette digestion et comportant la séquence correspondant aux nucleotides 1424 à 2644 (Figure 3) est inséré dans le bactériophage M13TG4147 préalablement digéré par EcoRVet EcoRI. On obtient ainsi le bactériophage M13TG4158 qui comporte :

i) un fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1 à 138,

ii) la séquence restante du polylinker du bactériophage M13TG4147 c'est à dire ATCGCATGCG,

iii) un fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1424 à 2644.

Le bactériophage M13TG4158 simple brin anti-sens, sert de matrice pour une mutation-délétion effectuée en utilisant la trousse Amersham et l'oiigonucléotide OTG2623 dont la séquence est la suivante :

GGGGGTGGAAATGGGGCA GCATGC AT CCCGGG CACAGAATCACGTGGTGC .

Cette mutagénèse permet simultanément de déléter un fragment de 184 paires de

- 15 - bases qui comporte les nucleotides 67 à 138, la séquence ATCGCATGCG et les nucleotides 1424 à 1525 et de créer les sites de coupure pour les enzymes SphI en 5' et Smal en 3' qui sont insérés entre les nucleotides 66 et 1526. On obtient ainsi le bactériophage M13TG4168 qui comprend :

i) un fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1 à 66,

ii) la séquence d'ADN GCATGCATCCCG comportant les sites de clivage des enzymes SphI et Smal, et

iii) un fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1526 à 2644.

Exemple 2 : Construction d'une cassette d'expression destinée à la synthèse d'un variant gplόO hybride Bru-MN.

Tel que montré à la Figure 5, le fragment d'ADN codant pour la majeure partie d'un précurseur de la gpl20-MN est clone par la technique d'amplification génique PCR (Polymérase Chain Reaction) mise en oeuvre à partir de l'ADN génomique de cellules humaines CEM infectées par la souche virale HIVl-MN. Ce clonage est effectué à l'aide des oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 qui introduisent respectivement un site de coupure pour l'enzyme SphI en 5' du fragment d'ADN amplifié et un site de coupure pour l'enzyme Smal en 3' du fragment d'ADN amplifié. Les séquences de ces oligonucléotides sont les suivantes :

-SpJUj

OTG2624 : GGCA GCATGC TCCTTGGGATATTGATGATCTG

_! SmaJj

OTG2625 : CTTTG CCCGGG TGGGTGCTACTCCTAATGGTTC

Le fragment d'ADN Sphl-Smal amplifié correspond aux nucleotides 53 à 1505 représentés à la Figure 5, compte tenu des modifications de séquence apportées par les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625. Ce fragment est inséré dans le bactériophage M13TG4168 coupé par SphI et Smal. On obtient ainsi le bactériophage M13TG4174 qui comporte un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une protéine gplόO hybride Bru-MN. Le fragment PstI du bactériophage M13TG4174 qui code pour le variant gplόO hybride Bru-MN est inséré dans le plasmide de transfeπ pTGl86poly (décrit par M.P. Kieny et al., Biotechnology, (1986) 4 : 790), en aval du promoteur E7.5k et à l'intérieur

du gène du virus de la vaccine codant pour la thymidine kinase. On obtient ainsi le plasmide pTG5156.

Le plasmide pTG5156 est utilisé par la suite pour transférer le bloc d'expression de la protéine gpl60 hybride Bru-MN dans le génome du virus de la vaccine, souche Copenhagen, selon la méthode décrite par M.P. Kieny ét al. Nature (1984), 312. 163-166). On obtient ainsi le vecteur de la vaccine VVTG5156.

Exemple 3 : Construction d'une cassette d'expression destinée à la synthèse d'un variant gpl60 hybride Bru-Eli.

Le plasmide pTG186poly est coupé par BamHI, traité par l'enzyme Klenow, coupé par Smal pour déléter la majeure paπie du polylinker, puis religué sur lui-même pour donner le plasmide pTGl86PE. Le polylinker ne conserve plus que les sites de clivage pour les enzymes PstI, Sali et EcoRI.

Le fragment d'ADN Pstl-Pstl du bactériophage M13TG4168 décrit, ci-dessus, qui comporte :

i) un fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1 à 66 du fragment d'ADN représenté sur la Figure 3,

ii) la séquence d'ADN GCATGCATCCCG comportant les sites de clivage des enzymes SphI et Smal, et

iii) un fragment d'ADN correspondant aux nucleotides 1526 à 2644 du fragment d'ADN représenté à la Figure 3,

est inséré dans le plasmide pTG186PE prélablement coupé par PstI, en aval du promoteur E7.5k et à l'intérieur du gène du virus de la vaccine codant pour la thymidine kinase. On obtient ainsi le plasmide pTG5160.

Tel que montré à la Figure 6, le fragment d'ADN codant pour la majeure partie d'un précurseur de la gpl20-EIi est clone par la technique d'amplification génique PCR mise en oeuvre à partir de l'ADN génomique de cellules humaines CEM infectées par du virus HIVl-EIi. Ce clonage est effectué à l'aide des oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 qui introduisent respectivement un site coupure pour l'enzyme SphI en 5' du fragment d'ADN amplifié et un site de coupure pour l'enzyme Smal en 3' du fragment d'ADN amplifié. Le fragment d'ADN Sphl-Smal amplifié correspond aux nucleotides 53 à 1490 représentés

à la Figure 6, compte tenu des modifications de séquence apportées par les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625. Ce fragment est inséré dans le bactériophage M13TG131 (décrit par M.P. Kieny et al. (1983), supra) préalablement coupé par SphI et Smal pour donner le bactériophage M13TG4197. Puis le fragment Sphl-Smal du bactériophage M13TG4197 est inséré dans le plasmide de transfert pTG5160 (décrit ci- dessus) préalablement coupé par SphI et Smal. On obtient ainsi le pTG5193.

Le plasmide pTG5193 est utilisé par la suite pour transférer le bloc d'expression de la protéine gplόO hybride Bru-Eli dans le génome du virus de la vaccine, souche Copenhagen, selon la méthode décrite par M.P. Kieny et al. (1984) supra. On obtient ainsi le vecteur de la vaccine VVTG5193.

Exemple 4 : Construction d'une cassette d'expression destinée à la synthèse d'un variant gplόO hybride Bru-RF.

Tel que montré à la Figure 7, le fragment d'ADN codant pour la majeure partie d'un précurseur d'une protéine gpl20-RF est clone par la technique d'amplification génique PCR mise en oeuvre à partir de l'ADN génomique de cellules humaines CEM infectées par du virus HIVl-RF. Ce clonage est effectué à l'aide des oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 qui introduisent respectivement un site de coupure pour l'enzyme SphI en 5' du fragment d'ADN amplifié et un site de coupure pour l'enzyme Smal en 3' du fragment d'ADN amplifié. Le fragment d'ADN Sphl-Smal amplifié correspond aux nucleotides 53 à 1523 représentés à la Figure 7, compte tenu des modifications de séquence apportées par les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625. Ce fragment est inséré dans le bactériophage M13TG131 préalablement coupé par SphI et Smal pour donner le bactériophage M13TG4198. Puis le fragment Sphl-Smal du bactériophage M13TG4198 est inséré dans le plasmide de transfert pTG5160 (décrit à l'exemple 3) préalablement coupé par SphI et Smal. On obtient ainsi le pTG5194.

Le plasmide pTG5194 est utilisé par la suite pour transférer le bloc d'expression de la protéine gplόO hybride Bru-RF dans le génome du virus de la vaccine, souche Copenhagen, selon la méthode décrite par M.P. Kieny et al. (1984) supra. On obtient ainsi le vecteur de la vaccine VVTG5194.

Exemple 5 : Construction d'une cassette d'expression destinée à la synthèse d'un variant gplόO hybride Bru-SF2C.

Tel que montré à la Figure 8, le fragment d'ADN codant pour la majeure partie d ^' un

précurseur de la gpl20-SF2C est clone par la technique d'amplification génique PCR mise en oeuver à partir de l'ADN génomique de cellules humaines CEM infectées par du virus

HIV1-SF2C. Ce clonage est effectué à l'aide des oligonucléotides OTG2624 et OTG2625 qui introduisent respectivement un site de coupure pour l'enzyme SphI en 5' du fragment d'ADN amplifié et un site de coupure pour l'enzyme Smal en 3' du fragment d'ADN amplifié. Le fragment d'ADN Sphl-Smal amplifié correspond aux nucleotides 53 à 1493 représentés à la Figure 8, compte tenu des modifications de séquence apportées par les oligonucléotides OTG2624 et OTG2625. Puis ce fragment est inséré dans le bactériophage

M13TG131 préalablement coupé par SphI et Smal pour donner le bactériophage M13TG4199. Le fragment Sphl-Smal du bactériophage M13TG4199 est inséré dans le plasmide de transfert pTG5160 (décrit à l'exemple 3) préalablement coupé par SphI et

Smal. On obtient ainsi le pTG5195.

Le plasmide pTG5195 est utilisé par la suite pour transférer le bloc d'expression de la protéine gpl60 hybride Bru-SF2C dans le génome du virus de la vaccine, souche Copenhagen, selon la méthode décrite par M.P. Kieny ét al. (1984) supra. On obtient ainsi le vecteur de la vaccine VVTG5195.

Exemples 6 à 9 : Production et purification des gplόO hybrides Bru-MN, Bru-Eli,

Bru-RF et Bru SF2C :

Des cellules BHK-21 sont cultivées dans un milieu GMEM (Gibco) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Lorsque les cellules sont à confluence (5,8xl0 ⁶ cellules/ml), le milieu de culture est enlevé et le tapis cellulaire est lavé 2 fois avec 50 ml de PBS (Dubelcco's phosphate buffer sait ; Seromed). Puis du milieu GMEM frais sans SVF est rajouté. On ajoute alors un des virus de la vaccine VVTG5156, VVTG5193, VVTG5194 et VVTG5195 décrits ci-dessus dans les exemples 2 à 5, à une infectivité de 1 ufp/cellule (unité formant plages), et l'infection est poursuivie pendant 72 h. Le lysat est alors centrifugé 20 min. à 10 000 g pour éliminer les débris cellulaires et on récupère le surnageant contenant entre autre une gplόO hybride et des virions.

A 20 ml de surnageant de culture obtenu comme précédemment décrit, on ajoute 1,3 ml d'une solution de chlorure de zinc (ZnCy à 1 M pour avoir une concentration finale en ZnCl ₂ de 60 mM. Le mélange est laissé 1 h dans de la glace ; puis le surnageant de précipitation est récupéré après centrifugation à 3000 t/min. pendant 20 min. dans une centrifugeuse Minifuge RF Heraeus. Cette méthode élimine par précipitation les virions ainsi que la majorité des protéines contaminantes. Dans chaque cas, on obtient ainsi une solution purifiée du variant gplόO hybride.