Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue ß-L-Nucleoside der allgemeinen Formel

worin

B = R Guanin, 2-Aminopurin;

R ¹ = H, Methyl, Halogen, Formyl, Hydroxymethyl, Ethyl, Chlor- ethyl;

R ² = H, OH;

R ³ = F, OH; wenn R ² =H, dann R ³ =F, wenn R ² =0H, dann R ³ =OH

R ⁴ = OH, 0-Acetyl, O-Palmitoyl, Alkoxy-Carbonyl, Phosphonat,

Mono-, Di-, Triphosphat, bzw. eine andere Schutzgruppe, die in einerFolgereaktion in die Hydroxygruppe umgewandelt werden kann, bedeuten, und ihre Verwendung als pharmazeutische Wirkstoffe bzw. Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen, die insbesondere durch das Hepatitis B-Virus (HBV) bzw. das HIV (human immunodeficiency virus)verursacht sind. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Das HBV ist das auslösende Agens für die Hepatitis B, einer Infektionskrankheit, von der weltweit etwa 200 Millionen Menschen betroffen sind und deren chronische Form mit einem erhöhten Risiko für ein primäres Leber-Carcinom verbunden ist,

welches allein in China zu etwa einer Million Tumorneu¬ erkrankungen pro Jahr führt.

Eine wirksame und verträgliche antivirale Therapie fehlt bisher. Der Einsatz von Adeninarabinosidmonophosphat und Acyclovir blieb auf wenige klinische Studien begrenzt, bedingt durch die z.Z. erheblichen Nebenwirkungen und die nur teilweisen und vorübergehenden Behandlungserfolge (Alexander et al. British Medical Journal 292, 915 (1986)). Einzig mit Interferon wurde in letzter Zeit in etwa 50% der behandelten Fälle ein längerdauernder Behandlungserfolg erzielt. Als ähnlich unbefriedigend muß die Therapie von HIV- Infektionen (AIDS) angesehen werden, das als Spätfolge einer Infektion von T-4-Lymphozyten mit dem HIV zum Zusammenbruch der immunologischen Abwehr führt. Die bisherige antivirale Therapie mit Azidothy idin und in letzter Zeit mit dem besser verträglichen Didesoxyinosin haben den tödlichen Ausgang des Immunschwächesyndroms zwar verzögern, jedoch nicht verhindern können.

Neue potentiell wirksame Mittel sind eine Reihe von Nucleosidanaloga, die aus folgenden Schriften bekannt sind:

1. EP 0 277 151 und EP 0 254 268 - 3'-Fluornucleoside von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin.

2. WO 89/01776 - 2'-Fluorarabinofuranosyl-5-ethyluracil.

3. EP 0 302 760 - 2 ' ,3'-Didesoxynucleoside verschiedener Purinderivate.

4. EP 0 322 384 und EP 0 409 227 - Zuckermodifizierte Purin- und Pyrimidinnucleoside.

5. EP 0 330 992 - Cyclopentanderivate von Purinen und Pyrimidinen.

6. EP 0 434 450, EP 0 349 242, US 4 999 428 und WO 91/00282 - Carbozyclische Nucleoside von Purinderivaten.

7. EP 0433 898 - Oxetan-Derivate von Purinen und Pyrimidinen.

8. EP 0 442 757 - 3'-Fluornucleoside .

Alle hier beschriebenen Nucleoside liegen in D-Form vor. L-Nucleoside, die Enantiomeren der natürlich vorkommenden D- Nucleoside, galten lange Zeit als enzymatisch nicht metabolisierbar und damit in biologischen Systemen als

unwirksam. Mit diesem Dogma wurde 1992 durch die Befunde von Spadari et al gebrochen, die gezeigt haben, daß ß-L-Thymidin zwar von der zellulären TdR-Kinase nicht umgesetzt wird, aber ein Substrat des entsprechenden Enzyms des Herpes simplex Virus 1 ist (Spadari et al, J. Med. Chem. 1992, 35, 4214- 4220). In der Folgezeit sind eine Reihe von ß-L- Nucleosidanaloga in reiner Form hergestellt bzw. gereinigt worden, wie z. B. : ß-L-Didesoxycytidin (L-ddC) (M. Mansuri et al, Bioorg. Med. Chem Lett. 1991, 1, 65-68), ß-L-5-Fluor- didesoxycytidin (L-FddC) und ß-L-5-Fluor-didesoxyuridin (L- FddU) (T.-S. Lin et al. J. Med. Chem. 1994, 37, 798-803), ß-L- 3-Thiacytidin (L-3TC) (C. N. Chang et al, J. Biol. Chem. 11992, 267, 22414-22420) und ß-L-5-Fluorthiacytidin (L-FTC) (P. A. Furman et al, Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 36, 2686-2692). Diese Verbindungen sind bezüglich ihrer antiviralen Wirksamkeit gegenüber der HBV- bzw. der HIV- Replikation sowie ihrer antiproliferativen Toxizität mit den entsprechenden Enantiomeren verglichen worden. Weitere Synthesen von L-Nucleosiden sind beschrieben in

- A. Holy, Collect. Czech. Chem. Commun 1972, 37, 4072-4087

- M. J. Robins et al, J. Org. Chem 1970, 35, 636-639

- Y. Abe et al, Chem. Pharm Bull 1980, 28, 1324-1326.

Es sind jedoch keine Verbindungen bekannt, die an der 3'- Position des Zuckerestes mit Fluor modifiziert sind bzw. die einen L-Arabinofuranosylrest enthalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue antiviral wirksame ß-L-Nucleoside zu entwickeln, die gegen Hepatitis B- und HIV-Infektionen wirksam sind und die bei guter Verträglichkeit und geringer Toxizität eine hohe Wirksamkeit gegen diese Infektionen aufweisen.

Überraschenderweise zeigen ß-L-Nucleoside der allgemeinen Formel

worin

B = Guanin, 2-Aminopurin;

R ¹ = H, Methyl, Halogen, Formyl, Hydroxymethyl, Ethyl, Chlor- ethyl; R ² = H, OH;

R ³ = F, OH; wenn R ² =H, dann R ³ =F, wenn R ² =0H, dann R ³ =0H R* = OH, O-Acetyl , O-Palmitoyl, Alkoxy-Carbonyl, Phosphonat,

Mono-, Di-, Triphosphat, bzw. eine andere Schutzgruppe, die in eine Folgereaktion in die Hydroxygruppe umgewandelt werden kann, bedeuten ,eine hohe antivirale Wirksamkeit.

Besonders wirksam sind 3'-fluormodifizierte Verbindungen der Formel I, unter ihnen ß-L-2' ,3'-Didesoxy-3'-fluorcytidin, ß-L- 2 ' ,3'-Didesoxy-3'-fluor-5-methylcytidin, ß-L-2' ,3'-Didesoxy- 3 ' -fluor-5-chlorcytidin und ß-L-2 ' , 3 ' -Didesoxy-3 '- fluorguanosin. Auch ß-L-5-Methylcytosinarabinosid zeigt eine hohe Wirksamkeit.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt nach an sich bekannten Verfahren durch Kondensation von Zuckerteil und Heterocyclus bzw. durch Abwandlung des L- Ribosylrestes.

So wird z. B. L-Ribose acetyliert und mit der heterocyclischen Base kondensiert. Das entstandene L-Ribonukleosid wird deoxygeniert und danach in 3'-Position modifiziert, bei¬ spielsweise fluoriert. Das Ausgangsmaterial L-Ribose kann auf einfache Weise durch Epimerisierung von L-Arabinose gewonnen werden, wodurch die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen auch ökonomisch tragfähig ist.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele:

1. Synthese von ß-L-2' ,3'-Didesoxy-3'-fluor-5-methylcytidin

Eine Lösung von l-(5-0-Acetyl-2,3-didesoxy-3-fluor-ß-L- ribofuranosyl)thymin (788 mg, 2,8 mmol, 1,2,4-Triazol (400 mg, 5,6 mmol) und 4-Chlorphenyldichlorphosphat (0,67 ml, 4,2 mmol) in Pyridin (25 ml) verbleibt für fünf Tage bei Raumtemperatur. Anschließend wird dem dunkelbraunen Reaktionsgemisch konzentrierte Ammoniaklösung (40 ml) hinzugefügt [ (W.L.J.Sung, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1089 (1981)]. Nach 10 Stunden wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wird in 50 ml Wasser gelöst und an Dowex WX 8 (H ⁺ - Form, 50 ml) mit Wasser (1000 ml) und 5%iger Ammoniaklösung (300 ml) als Elutionsmittel säulenchromatographisch gereinigt. Aus dem ammoniakalkalischen Eluat wird die Titelverbindung als Roh-produkt erhalten. Eine säulenchromatographische Trennung des Rohmaterials an Kieselgel 60 (0,063-0,2 mm) (Merck), mit Chloroform (15% Methanol) liefert ß-L-2' ,3'-Didesoxy-3'-fluor- 5-methylcytidin, das aus Methanol mit wenig HCL als Hydrochlorid erhalten wird (314 mg, 41% Ausbeute). MS: m/z 243 (M ⁺ -HCL); UV (H ₂ 0, pH=7): _MX 278 nm( 7430).

2. Bestimmung der antiviralen Aktivität von ß-L-2' ,3'-Didesoxy- 3'-fluor-5-methylcytidin (L-FMetCdR)

Menschliche Hepatoblastomzellen, die mit dem Hepatitis B Virus

(HBV) transfiziert wurden (HepG2 2.2.15 Zellen) und permanent das Virus produzieren [(Seils et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 1005 (1987)] wurden in RPMI 1640 Medium inkubiert, dem 2mM Glutamin und 10% fetales Kälberserum zugesetzt wurde. Nach 5-tägiger Inkubation wurde das Medium erneuert und das L- FMetCdR den Ansätzen in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Alle zwei Tage wurde das Medium gewechselt und dabei auch die Hemmstofflösung ersetzt.

Nach 8-tägiger Inkubation der Zellen mit L-FMetCdR wurde das Medium zentrifugiert und die Viren aus dem Überstand mit 10% Polyethylenglykol gefällt, die HBV-DNA daraus gereinigt und mittels Dot-Blot-Analyse quantifiziert [(E.Matthes et al. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1986 (1990)]. L-FMetCdR ist in der Lage, die Synthese von HBV vollständig zu unterdrücken. Die Konzentration des Hemmstoffes, die die von den Zellen ins Medium abgegebene Menge an HBV-DNA um 50% reduziert, ist kleiner als 0,2 μM. Eine 50%ige Hemmung der Proliferation der HepG2 2.2.15 Zellen (CD _s -,) wird erst bei Konzentrationen größer als 400 μM erreicht.