SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LE RECEPTEUR β3- ADRENERGIQUE (RAβ3) BOVIN ET LEURS APPLICATIONS.

La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques codant pour le récepteur β3- adrénergique (RAβ3) bovin, à l'utilisation desdites séquences comme sondes et pour l'expression de peptides et/ou de fragments de ceux-ci ayant une activité de Raβ3 bovin, au vecteur utile pour ladite expression ainsi qu'aux hôtes cellulaires contenant ledit vecteur. La présente invention est également relative à un procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des peptides d'origine bovine ayant une activité de récepteur β3-adrénergique.

Il est connu que les catécholamines telles que l'adrénaline et la noradrénaline, les agonistes synthé¬ tiques de ces catécholamines, qui miment leurs fonctions biologiques et les antagonistes, qui bloquent ces fonc¬ tions biologiques, exercent leurs effets en se liant à des sites de reconnaissance (récepteurs membranaires) spéci- fiques, situés sur les membranes cellulaires.

Deux classes principales de récepteurs adrénergiques ont été définies, les récepteurs adréner- giques α et les récepteurs adrénergiques β.

Dans l'ensemble de ces deux classes, on dis- tingue, maintenant, cinq sous-types de récepteurs aux catécholamines (αl, α2 , βl, β2 et β3-RA) . Leurs gènes ont été récemment isolés et identifiés (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163 ; B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238. 650-656 ; T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA £4., 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, £4* 6995-6999 ; L.J. EMORINE et al., 1989, Science, 245. 1118-1121) . L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récep- teurs membranaires intégraux présentant certaines homolo- gies (R.A.F. DIXON et al., 1988, Annual Reports in Médi¬ cinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988,

Proc. NATO Adv. Res. orkshop) , notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des pro¬ téines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP) . Ces récepteurs membranaires, lorsqu'ils ont fixé le ligand approprié (agoniste ou antagoniste) , subis¬ sent un changement de conformation, qui induit un signal intracellulaire, qui modifie le comportement de la cellule cible. Dans le cas des récepteurs β-adrénergiques, lorsqu'ils se lient avec des agonistes des catécholamines, ils catalysent l'activation d'une classe de protéines G, qui stimule à son tour l'activité de l'adénylate cyclase, alors que les antagonistes des RAβ agissent en compétition avec les agonistes pour la liaison au récepteur et empê¬ chent l'activation de l'adénylate cyclase.

Lorsque l'adénylate cyclase est activée, elle catalyse la production d'un médiateur intracellulaire ou second messager, notamment l'AMP cyclique. Les Inventeurs ont récemment mis en évidence de nouveaux récepteurs β-adrénergiques chez l'Homme, dénommés RA-Huβ3, et chez la souris (Demande Internatio¬ nale WO 92/12246), dénommés RA-Muβ3, et caractérisés par des propriétés différentes de celles des récepteurs βl et β2, notamment en ce qu'ils se comportent de façon diffé¬ rente vis-à-vis de substances respectivement antagonistes et agonistes des récepteurs βl et β2 (Demande Internatio¬ nale WO 90/08775) .

En particulier, le récepteur RA-Huβ3 est plus particulièrement constitué par une séquence de 408 amino- acides et est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra- et extra-cellulaires et le récepteur RA-Muβ3 est constitué par une séquence de 400 amino-acides et comporte également 7 régions transmembranaires.

Les travaux antérieurs concernant le RA-Huβ3 et le RA-Muβ3 ont particulièrement montré que le récepteur β3-adrénergique intervient dans les maladies telles que le diabète et/ou l'obésité, dans la mesure où il est exprimé dans des tissus qui jouent un rôle important dans le méta¬ bolisme (tissus adipeux, muscles squelettiques notamment) . Poursuivant ses travaux dans cette voie, l'un des Inventeurs a cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrénergique β3 chez les bovins (RA-Boβ3), afin de pouvoir disposer d'un outil de régulation de la quan¬ tité de graisses chez ces animaux, notamment dans un but d'amélioration de la qualité de la viande.

La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle cor- respond à 1 ΑDNc du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique β3 bovin.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence nucléotidique, elle comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en aminoacides de formule (I) (SEQ ID n° 1) suivante :

CCCAGGCCAG GGAAATCGCT CCCACGCCCC GATGCCCCCG CCGCTGAGCA GGGTGAGCTG 60

GGAGACCCTT TCCCTCATTC CTTCCCGCCC CACGCGCGAC GCGGGG ATG GCT CCG 115

Met Ala Pro 1

TGG CCT CCT GGG AAC AGC TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC 163 Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr 5 10 15

CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG 211

Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp

20 25 30 35 GCG GTG GCG CTG GCG GGG GCG CTG TTG GCG CTA GCG GTG CTG GCC ACC 259

Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr 40 45 50

GTG GGA GGC AAC CTG CTG GTA ATC GTG GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA 307 Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg

55 60 65

CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTC GTG ACT TCG CTG GCC ACA GCC GAC 355

Leu Gin Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala Thr Ala Asp 70 75 80

CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG GCC ACG TTG GCG CTG 403 Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr Leu Ala Leu 85 90 95 ACC GGC CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG CTG TGG ACC TCA 451 Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu Trp Thr Ser 100 105 110 115

GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG TGC GCC CTG 499 Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Ala Leu

120 125 130

GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC GGC GCG 547 Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg Tyr Gly Ala 135 140 145

CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG GTG 595

Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp Val

150 155 160

GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC 643

Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys Trp Trp Arg

165 170 175 ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG CGT TGC CAC TCC AAC CCG CGC TGC 691

Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gin Arg Cys His Ser Asn Pro Arg Cys 180 185 190 195

TGC ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TCG GTC 739 Cys Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val

200 205 210

TCG TTC TAT CTT CCG CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT 787 Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val 215 220 225

TTC GTG GTG GCC ACG CGC CAG CTG CGC TTG CTG CGC CGG GAG CTG GGT 835 Phe Val Val Ala Thr Arg Gin Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly 230 235 240

CGC TTC CCG CCA GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC 883 Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser 245 250 255 CCT GGC CTG GCG GGG CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC 931

Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr

260 265 270 275

GGC CGG CGG CCG GCG CGC CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG 97 Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu

280 285 290

CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT 1027

Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro 295 300 305

TTC TTT GTG GTC AAC GTG GTG CGC GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG 1075

Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val 310 315 320

TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT 1123 Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser 325 330 335

GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC CCG GAC TTT CGG AGC GCC 1171 Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ser Ala 340 345 350 355 TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGG CCG GAG GAG CAC CTC GCC GCT 1219 Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His Leu Ala Ala 360 365 370

GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG GCC CTG ACC AGC 1267 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala Leu Thr Ser 375 380 385

CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT TCC TGC GGA 1315 Pro Ala Gly Pro Met Gin Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala Ser Cys Gly 390 395 400

CTT TCT TAGGCCTTGA AGAAACAACT CCATTGATCC GGAACCTTTG GAAAGCCTCT 1371 Leu Ser 405

GGCCGGCCTC GGTTCAGAAT GAGCCCCGTG GAGTTTCCCA GCTGGAAAAC TCTGCCCTCC 1431

CCAGCCTGAC GACTGGGTCC TGGGAGGAGG CGCGGGGGCT GACTGGGGAG GGGAAATCCT 1491 TACCAAGTGG GTTTTCGCfC TCTTTCTGAG AGAAGTTTTC TACACCCCAG CCCTGAACTT 1551

CACCGCTGCC TCAGCAGCTC CCGCGTCTGG TTTCCCATGC CCAGGTGCCC GGGCAGGAGC 1611

TGGGCTGCGT TTAGCCCCGG GACCCGCACC TGTCCCACTC GGGTGCTGTG TGCGCAGGGG 1671

CAAGGCGGGC ACCTTCATTC TGTTCCTTCT GCCGCCCAGA CCCTGAGGAA CCCACCGGGG 1731

TGCTGGAGGC CCAGGCTGAG AAGAGGAAGG TGGGGAAGGT CACGGTTTGG GCTTCTGTCC 1791 CTGGCTTCCT CACTGTAGAC ACACCTACCT CACAGCATTT TCAGGACTTT ACTTTAGCCT 1851

TTGGGGTGGG GGTGGGGGGG CGCTCCTGGT TTCCTGGGAA GGTGAACCAT TAGAATGGGT 1911

CCCTTTTCCT TTTGAAATCA AATTAATAAA TGTTACTGAA TGCAGTTTAA AAAAAAAAAA 1971

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2000

(I)

Dans cette séquence, l'ATG souligné qui se trouve en position 107, correspond probablement au codon d'initiation de la synthèse protéique.

Il existe 85 % d'homologie entre les séquences nucleotidiques bovine et humaine codant pour le récepteur adrénergique β3 et il existe 76 % d'homologie entre les séquences nucleotidiques bovine et murine codant pour le récepteur adrénergique β3.

Ladite séquence comprend notamment les sites de restriction uniques suivants :

Bpull02 I, Fok I, EcoR V, Bcg I, Nhe I,

BspM I, Afl III, Age I, BstE II, BspH I, Bsg I, Nsp I,

Nsp7524 I, NspC I, Sap I, BamH I, BstY I, Asc I, Sty I, Hinc II, Apa I, Bspl20 I, Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I, Ecll36 I, Sac I, Stu I, Fse I, Drd I, Tthlll I, Srf I, Bsu36 I, Sfc I, BstX I, Ase I, Bsm I, Dra I. L'invention a également pour objet les frag¬ ments de ladite séquence, utiles pour l'expression du peptide correspondant et/ou la détection du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique β3 bovin.

Parmi lesdits fragments, on peut citer : - le fragment de 78 paires de bases, qui cor¬ respond aux nucleotides 218-295 de la séquence de for¬ mule I, et qui code pour la région transmembranaire TM1,

- le fragment de 72 paires de bases, qui cor¬ respond aux nucleotides 332-403 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM2,

- le fragment de 66 paires de bases, qui cor¬ respond aux nucleotides 434-499 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM3,

- le fragment de 69 paires de bases, qui cor- respond aux nucleotides 572-640 de la séquence de formule

I, et qui code pour la région transmembranaire TM4,

- le fragment de 72 paires de bases, qui cor¬ respond aux nucleotides 713-784 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM5, - le fragment de 66 paires de bases, qui cor¬ respond aux nucleotides 983-1048 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM6,

- le fragment de 78 paires de bases, qui cor¬ respond aux nucleotides 1070-1147 de la séquence de for- mule I, et qui code pour la région transmembranaire TM7.

La présente invention a également pour objet des clones d'ADNc, caractérisés en ce qu'ils comprennent un fragment de séquence codant pour le récepteur β3 bovin

(RA-Boβ3) . Conformément à l'invention, le clone dénommé

M13-6.6 comprend 2979 paires de bases, inclut la séquence

de formule I et comprend les sites de restriction uniques suivants : EcoR V, Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I, Sap I, BamH I, Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I, Sfc I, Ase I, Bsm I, Dra I, Bspl407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I, Dra III, Bgl II, Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I, EcoN I, BsaB I, Pvu I.

La présente invention a également pour objet des sondes nucleotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.

Lesdites sondes nucleotidiques sont caractéri¬ sées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucleotidiques telles que définies ci-dessus mais ne s'hybrident pas avec les gènes codant pour les récepteurs βl et β2 adrénergiques, ni avec l'ARN messager desdits récepteurs βl et β2 adrénergiques .

Selon un mode de réalisation avantageux de la- dite sonde, sa séquence est homologue ou complémentaire de celle d'un segment d'au moins 10 pb de la séquence I.

Au sens de la présence invention, "séquence homologue" englobe non seulement les séquences identiques à la séquence I, ou à un fragment de celle-ci, mais éga- lement celles n'en différant que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de nucleotides, à condition que les séquences ainsi modifiées aient une spé¬ cificité d'hybridation équivalente à celle de la séquence (I) ou du segment non modifié considéré. De même, on entend par "séquence complémen¬ taire", non seulement les séquences strictement complé¬ mentaires de la séquence (I) ou de ses segments, mais éga¬ lement des séquences modifiées, comme indiqué précé¬ demment, possédant une spécificité d'hybridation équiva- lente à celle desdites séquences strictement complémen¬ taires .

Les conditions d'hybridation sont définies comme suit :

Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucleotides, les conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes :

750 mM de NaCl, 75 M de Tris-sodium citrate, 50 μg/ l d'ADN de sperme de saumon, 50 mM de phosphate de sodium, 1 mM de pyrophosphate de sodium, 100 μM d'ATP, 10 à 25 % de formamide, 1 % Ficoll ("PHARMACIA" poids moléculaire moyen de 400,00), 1 % de polyvinylpyrrolidone, 1 % de sé¬ rum albumine bovine, pendant 14 à 16 h à 42 ^* C.

Pour les sondes les plus longues, c'est-à-dire présentant plus d'environ 100 nucleotides, des conditions d'hybridation appropriées sont celles indiquées précédem- ment pour les sondes les plus courtes, mais dans les¬ quelles le milieu sus-défini contient 40 % de formamide au lieu de 10 à 25 % de formamide.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite sonde peut être avantageusement définie par l'une quelconque des séquences nucleotidiques ci-dessus et notamment par le fragment de 2 kbases, qui correspond à la totalité de la séquence de formule I.

La présente invention a également pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus et en ce qu'il présente une activité de récepteur β3-adrénergique.

Une activité de récepteur β3-adrénergique est celle définie dans la Demande de Brevet français n' 89 00918, à savoir que, lorsque le fragment est exposé à la surface d'une cellule, il est capable de participer à l'activation de l'adénylate cyclase en présence d'un des agonistes suivants : BRL 28410, BRL 37344, CGP 12177A, (1) -isoprotérénol et carazolol ; soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur adrénergique βl, ni le récepteur adrénergique

β2 ; soit il est susceptible de générer des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur βl, ni le récepteur β2.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il comprend 405 ammo-acides et présente la sé- quence en amino-acides de formule II (SEQ ID n° 2) sui¬ vante :

Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp 1 5 10 15 Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly 20 25 30

Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val 35 → TM1 40 45

Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg

50 55 60 TM1 <-

Thr Pro Arg Leu Gin Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala 65 70 75 → TM2 80

Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr

85 90 95 Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu TM2 •* ^* - 100 105 110

→ T 3 Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu

115 120 125

Cys Ala Leu Ala Val Asp Ara Tvr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg 130 TM3**- ^" 13 ^~ 5 ^" 140

Tyr Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu 145 150 155 → TM-4 160

Val Trp Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys

165 170 175 Trp Trp Arg Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gin Arg Cys His Ser Asn TM4 <- 180 185 190

Pro Arg Cvs Cvs Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser

195 ^" 200 →TM5 205

Ser Ser Val Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr

210 215 220

Ala Arg Val Phe Val Val Ala Thr Arg Gin Leu Arg Leu Leu Arg Arg 225 TM5-^- 230 235 240

Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg 245 250 255 Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cvs Ala Ser Pro Ala Gly Val 260 265 270

Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His 275 280 285

Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys 290 →TM6 295 300 Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro 305 310 TM6<- 315 320

Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr

→TM7 325 330 335

Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe

340 345 TM7<- 350

Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His 355 360 365

Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala 370 375 380 Leu Thr Ser Pro Ala Gly Pro Met Gin Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala

385 390 395 400

Ser Cys Gly Leu Ser 405 (II)

Ce peptide est dénommé ci-après récepteur β3- adrénergique bovin (RA-Boβ3).

L'invention comprend également les peptides variants de ceux définis ci-dessus, qui comportent cer- taines mutations, sans que les peptides ne perdent les propriétés de récepteur β3-adrénergique.

Parmi ces variants, on peut mentionner ceux qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions transmembranaires, ainsi que ceux qui sont recon- nus par des anticorps reconnaissant les régions autres que les régions transmembranaires.

La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments du RA-Boβ3, conforme à l'invention, et notamment : - un fragment de 26 amino-acides, correspon¬ dant au segment 38-63 de la formule II et constituant la région transmembranaire TMl,

- un fragment de 24 amino-acides, correspon¬ dant au segment 76-99 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM2,

- un fragment de 22 amino-acides, correspon¬ dant au segment 110-131 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM3,

- un fragment de 23 amino-acides, correspon- dant au segment 156-178 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM4,

- un fragment de 24 amino-acides, correspon¬ dant au segment 203-226 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM5, - un fragment de 22 amino-acides, correspon¬ dant au segment 293-314 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM6,

- un fragment de 26 amino-acides, correspon¬ dant au segment 322-347 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM7.

Lesdits fragments peuvent avantageusement être obtenus par synthèse, notamment par la méthode de Merri- field.

La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, ca¬ ractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.

On entend, au sens de la présente invention, par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cos- mide, qu'un phage.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant ap¬ proprié, comprenant en particulier une origine de répli- cation dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promo¬ teur permettant l'expression des gènes dans lesdites bac- téries ou cellules eucaryoteε, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence tels

que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptide ayant une acti¬ vité de récepteur β3 adrénergique bovin. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un vecteur d'expression pRc/CMV dans lequel est inséré, au niveau du lieur multisite, au moins le fragment codant pour le récepteur β3-adrénergique bovin ; un tel plasmide a été dénommé pRc/CMV-Boβ3-ADR, et a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par 1 'INSTITUT PASTEUR, en date du 15 avril 1993 sous le n° 1-1297.

La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention.

Une telle cellule est capable d'exprimer un peptide, d'origine bovine, ayant une activité de récepteur β3-adrénergique.

Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment constituée par les cellules de la lignée CHO (Chinese Hamster Ovary) .

Un autre des microorganismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia coli .

Il n'était pas évident que les bovins aient des récepteurs β3-adrénergiques, dont l'activation permet, de manière inattendue, de réguler la quantité et la qua- lité des graisses, ce qui permet d'améliorer la qualité de la viande bovine.

De manière avantageuse, les récepteurs β3- adrénergiques bovins conformes à l'invention constituent un outil pour la sélection de ligands intervenant dans l'activation de ces récepteurs et permettent d'identifier et de sélectionner des ligands β-adrénergiques spécifiques

des récepteurs β3-adrénergiques et en particulier des ligands plus affins et plus sélectifs pour le récepteur β3-adrénergique bovin que pour le récepteur β3-adréner¬ gique humain. Conformément à l'invention, le procédé de sélection et d'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un peptide (récepteur β3-adrénergique bovin) conforme à l'invention comprend : - la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, laquelle cellule hôte exprime ledit peptide bovin (récepteur adrénergique β3 bovin) , le cas échéant après induction physique ou chi- mique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite sub¬ stance s'il y a lieu, et

- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-peptide.

Un tel procédé permet la sélection, soit de ligands spécifiques du récepteur β3-adrénergique, soit de ligands spécifiques du récepteur β3-adrénergique bovin exclusivement . Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :

- la figure la représente la carte de restric- tion du fragment codant de 2 000 pb, qui correspond à la formule I ;

- la figure lb représente la carte de restric¬ tion du clone 6.6 qui contient le gène β3-adrénergique bovin et comprend 3 kb, en tout ; - la figure 2 est une comparaison des récep¬ teurs β3 humain, murin (souris et rat) et bovin ;

- la figure 3 représente une comparaison des séquences codantes pour le RA-Huβ3 et le RA-β3 bovin ;

- la figure 4 représente le vecteur d'expres¬ sion pRc/CMV-Bθβ3-ADR ; - la figure 5 représente le vecteur d'expres¬ sion pRc/CMV incluant un lieur multisite comprenant les sites uniques de restriction suivants : Hind III, BstX I, Not I, Xba I et Apa I.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Isolement et identifica ion du gène β3- adrénergique bovin. - Préparation d'ARN :

Le gène β3-adrénergique bovin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de veau, construite dans le bactériophage λgtll.

Pour ce faire, les ARN totaux sont extraits de tissu adipeux brun de veau, par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidinium, puis on purifie les ARN messa¬ gers poly A+ à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf. : 27-9258-01) .

Les ARN totaux et les ARN messagers ont été analysés en Northern blot pour vérifier la présence et la taille des messagers du gène recherché. Après électropho- rèse, l'ARN a été transféré sur une membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybond® N+ réf. RPN 203B) . Cette membrane est ensuite hybridée avec une sonde radio- marquée (radiomarquage voir criblage des phages recombi¬ nants, ci-après), constituée par un fragment d'ADN de 2900 paires de bases contenant la totalité du gène β3- adrénergique murin précédemment isolé dans le laboratoire (NAHMIAS et al., 1991, EMBO J., 1&, 3721-3727 ; Demande Internationale WO 92/12246) . Après hybridation avec la sonde radiomarquée, les filtres sont lavés et exposés pen-

dant plusieurs jours sur film d'autoradiographie (KODAK X- OMAT AR) , on observe un fragment d'environ 2,0 kilobases, aussi bien dans la fraction d'ARN totaux que dans la frac¬ tion des ARN messagers purifiés. Ceci confirme que le gène correspondant au récepteur β3-adrénergique est exprimé dans le tissu adipeux brun de veau et que l'on peut construire la banque d'ADNc à partir de ces ARN messagers poly A+ purifiés.

Pour vérifier que la source d'ARN est bien du tissu adipeux brun, le Northern blot obtenu ci-dessus a été hybride avec une sonde radiomarquée correspondant au gène de la protéine découplante humaine (hUCP) . Cette pro¬ téine est seulement présente dans ce type de tissu adi¬ peux, et peut être considérée comme une sorte de "marqueur" du tissu adipeux brun. Avec cette sonde, un signal fortement positif est décelé. - Synthèse d'ADNc :

On synthétise ensuite 1 ΑDNc correspondant, en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo (dT) -*_ provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis System" (Promega réf. C 2100) . La synthèse du premier brin d'ADNc se fait en présence d'AMV réverse transcriptase, et la synthèse du deuxième brin est réalisée à l'aide de deux enzymes agissant simultanément { E. coli polymerase I et E. coli RNase H) . Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymerase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C 2100 est utilisé pour l'ensemble de ces réactions . Ensuite, des adaptateurs comportant des sites

EcoRI sont ajoutés, afin de pouvoir insérer l'ADNc obtenu dans le bactériophage λgtll, dans les conditions sui¬ vantes, décrites dans le kit EcoR I Adaptor Ligation Sys¬ tem I (Promega, réf.: C 1900) : l'ADNc est centrifugé à travers une matrice

Sephacryl® S-400 (kit) pour éliminer les molécules de pe-

tite taille ; puis les adaptateurs sont ajoutés à l'ADNc par ligature, en présence de T4 ADN ligase, pendant une nuit et une deuxième centrifugation est effectuée à tra¬ vers une colonne Sephacryl® S-400, de manière à éliminer les adaptateurs non fixés .

Avant d'insérer l'ADNc ainsi traité dans le vecteur λgtll, on phosphoryle les adaptateurs, en présence de T4 polynucléotide kinase.

- Insertion de l'ADNc dans le bactériophaσe λσtll :

Le bactériophage λgtll, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gtll System" (Promega réf. T 301/0-2) . L'ADN du phage est digéré par EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.

On effectue plusieurs ligations avec des quan¬ tités variables de l'ADNc obtenu, avec 0,5 μg d'ADN de vecteur, dans les conditions suivantes, pour chaque liga- tion : pendant 3 heures à température ambiante, en pré- sence de T4 ADN ligase (kit Promega CI900) .

On procède ensuite à une encapsidation in vi tro, à l'aide des extraits "Packagene" présents dans le kit Promega T301/0-2.

Après une incubation à 22 "C, durant 2 heures, les particules de phages reconstituées sont utilisées pour infecter des bactéries, notamment la souche Y1090(r-)

(Génotype : Δ(lacU169), proA+, Δ(lon), araD139, strA, supF, (trpC22: :Tnl0) , (pMC9), hsd(r-, m+) ) , dans les conditions suivantes : on dilue très fortement (1/1 000 ou 1/10 000) les phages encapεidés ; chaque dilution de phages est incubée avec des cellules Y1090(r-) à 37 ^* C, durant 30 minutes, et ensuite, ces bactéries infectées sont étalées sur un milieu nutritif (LB agar) contenu dans des boîtes de Pétri. Les boîtes sont incubées une nuit à 37 'C, et le lendemain, on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant . En comp-

tant les nombres de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, le titre de la banque d'ADNc est déterminé et est d'environ 4 millions de phages recom¬ binants. Le bruit de fond du vecteur seul sans insert est de 3,5 %, ce qui est tout à fait acceptable.

- Criblaσe des ohaσes recombinants :

En se basant sur les résultats obtenus, envi¬ ron 200 000 phages ont été étalés sur boîte de Pétri (milieu LB agar) , afin de pouvoir les cribler avec une sonde radiomarquée, dans les conditions suivantes : souche bactérienne utilisée : LE 392 (Génotype : F-, hsdR 574 (r-, m+) , supE44, supF58, lacYl or Δ(laclZY) 6, galk2, galT22, metBl, trpR55, λ-) .

- sonde : fragment d'ADN de 2900 paires de bases (gène β3-adrénergique murin) , tel que précisé ci- dessus pour le Northern Blot, radiomarqué par Random pri- ming (Kit Boehringer réf. 1004 760) , en incorporant 50 μCi de dATP (α ³² P) et 50 μCi de dCTP (α ² P) (références A ersham : PB 10204 et PB 10205) . Après transfert de 1 'ADN des plages de lyse sur des membranes Hybond® N+ (Amersham réf. RPN 132B) , ces dernières sont hybridées avec la sonde radiomarquée, puis lavées et exposées une nuit sur film d'autoradiogra¬ phie. 17 signaux d'hybridation ont été observés, dont 11 se sont, par la suite, révélés être des faux posi¬ tifs. Les 6 clones restant (1, 3, 5, 6, 8 et 9) ont été purifiés par quatre isolements successifs, suivis d'une hybridation avec la sonde β3-adrénergique murine décrite ci-dessus.

- Analyse des clones positifs :

Pour identifier le(s) clone(s) contenant lé gène β3-adrénergique bovin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, 2 méthodes ont été utilisées : l'amplification par PCR et la coupure par une endonucléase de restriction, avec le

but de trouver parmi les clones positifs celui qui com¬ porte 1 'insert le plus grand.

1) L'amplification par PCR a été faite sur lysat de phages (particules de phages encapsidées) à l'aide des deux amorces suivantes :

1218 : amorce λgtll (brin sens) de 24 mers, de formule : 5' d(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3 ' , et

1222 : amorce λgtll (brin anti-sens) de 24 mers également, de formule : 5' d(TTGACACCAGACCAACTGGTAATG)3 ' (New England Biolabs).

Etant donné que ces amorces s'hybrident de part et d'autre du site d'insertion de l'ADNc dans le phage, il a été possible de connaître ainsi la taille des fragments insérés dans les différents clones positifs. 2) L'ADN des 6 phages intéressants a été pré¬ paré et coupé par l'enzyme de restriction EcoRI, afin de vérifier la taille des inserts ; l'hybridation avec la sonde β3-adrénergique murine a permis de déceler le clone comportant le plus grand insert positif. Issu de ces deux approches, le clone n' 6 a été choisi pour une analyse plus poussée étant donnée qu'il comporte le plus grand insert d'ADNc recherché (3 kilobases) .

Après coupure du phage λ par l'enzyme de res- triction EcoR I, le fragment comportant l'ADNc a été inséré dans le bactériophage Ml3 tg 131 afin de pouvoir séquencer le gène. EXEMPLE 2 : Séquençage du gène β3-adrénergique bovin.

On a séquence le fragment d'ADN d'environ 3 kb délimité par les sites de l'enzyme EcoR I.

Ce fragment d'ADN a été purifié à partir de 1'ADN du clone 6 et sous-cloné dans le site EcoR I du vec¬ teur M13tgl31. Les clones M13 ayant intégrés le fragment d'ADN dans les 2 orientations opposées (6.3 et 6.6) ont été identifiés et séquences.

Pour effectuer les réactions de séquençage, le kit USB Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical réf.: 70770) a été utilisé.

La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens

(clone M13-6.6) ou sur ^* le brin anti-sens (clone M13-6.3) , conformément à la méthode de Sanger (MANIATIS et al.,

Molecular Cloning, 2ème édition, pages 13.3-13.10) .

Les résultats obtenus, à partir de la séquence du fragment EcoR I de 3 kilobases, montrent la séquence nucléotidique du RAβ3 bovin (1215 pb) et des régions non codantes (106 pb en 5' et 638 pb en 3') (formule I) . Les sites de restriction contenus dans le fragment de 2 000 pb sont positionnéε εur la figure la (bov 6.6 court (pA) ) . La figure lb montre leε sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 3 kb qui a été sé¬ quence.

La comparaison des régions codantes des gènes β3 humain et bovin (figure 3), indique une forte homologie (85 % au niveau des séquences nucleotidiques entre RA bovin et humain) ; la comparaison deε régions codants des gènes β3 bovin et murin montre également une forte homo¬ logie (76 % au niveau des séquences nucleotidiques entre RA bovin et RA murin) . Le gène β3 bovin code pour le peptide de

405 aminoacides, qui présente une très grande homologie avec le peptide β3 humain ou le peptide β3 murin (figure 2 ) , comme indiqué plus haut . EXEMPLE 3 : Construction d'un vecteur pour l'expression du RA-β3 bovin.

La carte de restriction du fragment de 2 kb qui a été séquence (figure la) indique la présence d'un site de coupure par l'enzyme Srf I à la position 1598, soit 270 nucleotides en aval de la région codante du gène β3 de boeuf. L'ADN du clone M13-6.6 a été digéré avec les enzymes EcoR I et Srf I pour libérer le fragment de

1598 paires de bases contenant la région codante du gène β3 bovin et une partie de la région 3' non traduite. Ce fragment d'ADN a été purifié, puis inséré dans le vecteur d'expression pRc/CMV, aux sites de coupure Hind III et Xba I (figure 5) .

Comme les extrémités générées par les enzymes Hind III et Xba I d'une part et EcoR I et Srf I d'autre part, ne sont pas compatibles, on a pris soin de traiter les extrémités EcoR I et Srf I de l'insert d'une part avec le fragment Klenow de la polymerase I, et les extrémités Hind III et Xba I du vecteur d'autre part, avec le frag¬ ment Klenow de la polymerase I, de façon à obtenir des bouts francs (MANIATIS et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40-5.42) . On a ainsi obtenu le plasmide recombinant pRc/CMV-Boβ3-ADR, représenté sur la figure 4. EXEMPLE 4 : Propriétés pharmacologiques du produit d'expression du gène β3 bovin. a) Transfection de cellules CHO-Kl Pour mieux caractériser le récepteur adréner¬ gique β3 bovin, on exprime le gène β3 bovin à la surface de cellules eucaryotes, qui possèdent tous les éléments nécessaires à la transduction du signal.

Le plasmide recombinant pRc/CMV de l'exemple 3 a été transfecte dans des cellules CHO-Kl par une méthode de transfection à la lypofectine ; les cellules transfec- tées sont sélectionnées avec de la généticine (G418) (dérivé de la néomycine) .

De manière plus précise, ladite méthode de transfection est réalisée comme suit :

Les cellules CHO-Kl (ATCC CCL 61) sont culti¬ vées à confluence dans un milieu de culture contenant : du milieu DMEM à 45 %, du milieu F12-Ham à 45 %, du sérum de veau foetal inactivé à la chaleur à 10 %, de la glutamine 2 mM, de la pénicilline 100 U/ml et de la streptomycine 100 μg/ml.

1 μg d'ADN du plasmide pRc/CMV β3 bovin est mélangé avec 5 μl de lipofectine (GIBCO) et 1 000 μl du milieu de culture précité, dépourvu de sérum.

On ajoute ce mélange à des cellules en cul- ture, que l'on laisse incuber à 37 'C, pendant 5 heures.

Le milieu est remplacé avec un milieu de cul¬ ture précité, contenant du sérum et les cellules sont à nouveau incubées à 37°C, pendant 48 heures. Les cellules sont alors réparties dans 96 puits selon des dilutions variables et incubées en présence de généticine (G418, Gibco) à 400 μg/ml, dans un milieu complet, pendant envi¬ ron 10 jours, le milieu étant changé tous les deux jours.

Les différentes colonies obtenues sont ensuite sous-clonées, d'abord dans 48 puits, puis dans 6 puits, avant le criblage.

Les colonies stables sont criblées pour leur capacité à lier de manière spécifique ^** _ ^« [125 ] -cyanopindolol et également pour leur capacité à stimuler l'adénylate cyclase, en présence d' isoprotérénol, conformément au protocole décrit dans TATE et al., Eur. J.

Biochem., 1991, 1££, 357-361.

Les cellules transfectéeε et exprimant de façon εtable le RAβ3 , lient le [ ^** -* ^2* ^I] -cyanopindolol, avec une affinité équivalente à celle des RAβ3 correspondants chez l'Homme ou chez la Souris, également obtenus par clonage.

On a sélectionné, à partir des clones stables, un ensemble de sous-clones ; l'un d'entre eux, dénommé 62- 26, a été utilisé pour l'évaluation pharmacologique du RAβ3 bovin. b) Caractéristiques pharmacologiques du récep¬ teur RAβ3 bovin

La caractérisation pharmacologique du récep¬ teur RAβ3 bovin a été réalisée en utilisant le clone stable 62-26. Les propriétés pharmacologiques de 10 ligands β3-adrénergiques ont été déterminées par des

études de stimulation de l'adénylate cyclase et de liaison du [ ---- --I ] -cyanopindolol.

Les expériences d'activation de l'adénylate cyclase ont été réalisées suivant le protocole détaillé dans BLIN et al., Mol. Pharmacol. , 1991, 44./ 1094-1104.

Brièvement, les cellules préconfluentes en plaques six puits (0,6 x 10 ⁶ cellules/puits) sont mises en présence, ou non, de doses croissantes de ligands pendant 30 minutes à 37"C. La réaction est arrêtée par lavage en PBS à 4 ^* C et addition de 500 μl de NaOH IN. Après centri- fugation et neutralisation avec de l'acide acétique IN, les lysats cellulaires sont récupérés et la quantité totale d'AMPc accumulé est déterminée à l'aide d'un kit de dosage commercial. L'étude de la liaison des ligands en compéti¬ tion a été réalisée sur cellules intactes suivant le pro¬ tocole détaillé dans BLIN et al., Mol. Pharmacol., 1991, 44, 1094-1104. Brièvement, 10^ cellules sont incubées avec 0,5 nM d' [ ^** - ^2* ^I] -cyanopindolol en présence ou en absence de concentrations croissantes de compétiteurs, pendant 30 minutes à 37'C. La réaction est stoppée par dilution avec du PBS glacé, les cellules sont filtrées et la radio¬ activité est mesurée dans un compteur gamma. Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel Graph-Pad®. Parmi les ligands testés, quatre sont décrits comme agonistes des récepteurs βl, β2, β3-RA :

(-) isoprotérénol, (-)épinéphrine, (-)norépinéphrine, BRL

37344 ; trois sont décrits comme spécifiques du récepteur

RAβ3 (βl-, β2-RA antagonistes) : CGP12177A, ICI201651, bucindolol. Le bupranolol a été également testé car décrit comme antagoniste des trois sous types de récepteur (BLIN et al., Br. J. Pharmacol., 1994, sous presse). Enfin, on a testé le (-)propranolol décrit comme agoniste partiel du récepteur RAβ3 humain et antagoniste du récepteur RAβ3 de souris (NAHMIAS et al., EMBO J. , 1991, ! , 3721-3727).

Les valeurs des constantes d'activation de l'adénylate cyclase (Kact) , des constantes d'inhibition

(Ki) et de l'activité intrinsèque (AI) correspondant au rapport effet du ligand à 10 ^-4 M/effet de 1 ' isoprotérénol à 10 ^~ 4 M, obtenus pour les différents ligands sont présentés dans le Tableau ci-après. Les quatres ligands agonistes des trois sous types de récepteurs (βl, β2, β3-

RA) ont des valeurs de Kact et de Ki voisines de celles obtenues pour le récepteur RAβ3 humain (BLIN et al., Br. J. Pharmacol., 1994, sous presse), de souris (NAHMIAS et al., EMBO J., 1991, 1£, 3721-3727), et de rat (GRANNEMAN et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., 1991, / 895-899 ;

MUZZIN et al., J. Biol . Chem. , 1991, 2£ώ., 24053-24058) .

Les ligands spécifiques du récepteur RAβ3 ont tous une valeur de Kact plus faible pour le récepteur RAβ3 bovin comparée aux récepteurs RAβ3 humain, de souris, et donc une meilleure efficacité à stimuler l'adénylate cyclase. Le (-)propranoloi est agoniste partiel sur RAβ3 bovin comme pour le récepteur RAβ3 humain. Par contre, le bupranolol, qui est décrit comme un antagoniste puissant pour les récepteurs RAβ3 humain et murin, est agoniste partiel sur le récepteur RAβ3 bovin.

t to en o en o un LΠ

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise e oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: VE IGEN

(B) RUE: 66 rue de Javel

(C) VILLE: PARIS

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75015

(A) NOM: VIRBAC

(B) RUE: 1ère Avenue - 2065 M - L.I.D.

(C) VILLE: CARROS

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 06516

(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LE RECEPTEUR BETA3-ADRENERGIQUE BOVIN ET LEURS APPLICATIONS.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2

(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk

(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)

(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:

(A) NUMERO DE DEPOT: FR 93 04670 •

(B) DATE DE DEPOT: 21-APR-1993

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 2000 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT: 107..1324

(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "Bovin beta-3 receptor" /product≈ "Adrenergic, Beta Receptor"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

CCCAGGCCAG GGAAATCGCT CCCACGCCCC GATGCCCCCG CCGCTGAGCA GGGTGAGCTG 60

GGAGACCCTT TCCCTCATTC CTTCCCGCCC CACGCGCGAC GCGGGG ATG GCT CCG 115

Met Ala Pro 1

TGG CCT CCT GGG AAC AGC TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC 163 Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr 5 10 15

CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG 211 Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp 20 25 30 35

GCG GTG GCG CTG GCG GGG GCG CTG TTG GCG CTA GCG GTG CTG GCC ACC 259 Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr

40 45 50

GTG GGA GGC AAC CTG CTG GTA ATC GTG GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA 307 Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg 55 60 65

CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTC GTG ACT TCG CTG GCC ACA GCC GAC 355 Leu Gin Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala Thr Ala Asp 70 75 80

CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG GCC ACG TTG GCG CTG 403 Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr Leu Ala Leu 85 90 95

ACC GGC CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG CTG TGG ACC TCA 451 Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu Trp Thr Ser 100 105 110 115

GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG TGC GCC CTG 499 Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Ala Leu 120 125 130

GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC GGC GCG 547 Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg Tyr Gly Ala 135 140 145

CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG GTG 595 Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp Val 150 155 160

GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC 643 Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lvs Trp Trp Arg 165 170 175

ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG C3T TGC CAC TCC AAC CCG CGC TGC 691 Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gin Ara Cvs His Ser Asn Pro Arg Cys 180 135 190 195

TGC ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TCG GTC 739 Cys Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val 200 205 210

TCG TTC TAT CTT CCG CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT 787 Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val 215 220 225

TTC GTG GTG GCC ACG CGC CAG CTG CGC TTG CTG CGC CGG GAG CTG GGT 835 Phe Val Val Ala Thr Arσ Gin Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly 230 235 240

CGC TTC CCG CCA GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC 883 Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser 245 250 255

CCT GGC CTG GCG GGG CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC 931 Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr 260 265 270 275

GGC CGG CGG CCG GCG CGC CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG 979 Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu 280 285 290

CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT 1027 Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro 295 300 305

TTC TTT GTG GTC AAC GTG GTG CGC GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG 1075 Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val 310 315 320

TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT 1123 Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser 325 330 335

GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC CCG GAC TTT CGG AGC GCC 1171 Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ser Ala 340 345 350 355

TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGG CCG GAG GAG CAC CTC GCC GCT 1219 Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His Leu Ala Ala 360 365 370

GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG GCC CTG ACC AGC 1267 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala Leu Thr Ser 375 380 385

CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT TCC TGC GGA 1315 Pro Ala Gly Pro Met Gin Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala Ser Cys Gly 390 395 400

CTT TCT TAGGCCTTGA AGAAACAACT CCATTGATCC GGAACCTTTG GAAAGCCTCT 1371 Leu Ser 405

GGCCGGCCTC GGTTCAGAAT GAGCCCCGTG GAGTTTCCCA GCTGGAAAAC TCTGCCCTCC 1431

CCAGCCTGAC GACTGGGTCC TGGGAGGAGG CGCGGGGGCT GACTGGGGAG GGGAAATCCT 1491

TACCAAGTGG GTTTTCGCTC TCTTTCTGAG AGAAGTTTTC TACACCCCAG CCCTGAACTT 1551

CACCGCTGCC TCAGCAGCTC CCGCGTCTGG TTTCCCATGC CCAGGTGCCC GGGCAGGAGC 1611

TGGGCTGCGT TTAGCCCCGG GACCCGCACC TGTCCCACTC GGGTGCTGTG TGCGCAGGGG 1671

CAAGGCGGGC ACCTTCATTC TGTTCCTTCT GCCGCCCAGA CCCTGAGGAA CCCACCGGGG 1731

TGCTGGAGGC CCAGGCTGAG AAGAGGAAGG TGGGGAAGGT CACGGTTTGG GCTTCTGTCC 1791

CTGGCTTCCT CACTGTAGAC ACACCTACCT CACAGCATTT TCAGGACTTT ACTTTAGCCT 1851

TTGGGGTGGG GGTGGGGGGG CGCTCCTGGT TTCCTGGGAA GGTGAACCAT TAGAATGGGT 1911

CCCTTTTCCT TTTGAAATCA AATTAATAAA TGTTACTGAA TGCAGTTTAA AAAAAAAAAA 1971

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2000

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 405 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp 1 5 10 15

Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly 20 25 30

Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val 35 40 45

Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg 50 55 60

Thr Pro Arg Leu Gin Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala 65 70 75 80

Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr 85 90 95

Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu 100 105 110

Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu 115 120 125

Cys Ala Leu Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg 130 135 140

Tyr Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu 145 150 155 160

Val Trp Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys 165 170 175

Trp Trp Arg Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gin Arg Cys His Ser Asn 180 185 190

Pro Arg Cys Cvs Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser 195 ^" 200 205

Ser Ser Val Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr 210 ^" 215 220

Ala Arg Val Phe Val Val Ala Thr Arg Gin Leu Arg Leu Leu Arg Arg 225 230 235 240

Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg

245 250 255

Ser Glv Ser Pro Glv Leu Ala Gly ?ro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val 260 ^" 265 270

Pro Ser Tyr Gly Ara Arg Pro Ala Ara Leu Leu Pro Leu Arg Glu His 275 ^" 280 ^' 285

Arg Ala Leu Arg Thr Leu Glv Leu Ile Met Glv Thr Phe Thr Leu Cys 290 295 300

Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Ara Ala Leu Gly Gly Pro 305 310 315 320

Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr 325 330 335

Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tvr Cys Arg Ser Pro Asp Phe 340 345 350

Arg Ser Ala Phe Arg A.rg Leu Leu Cvs Ara Cys Arg Pro Glu Glu His 355 360 365

Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Ara Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala 370 375 380

Leu Thr Ser Pro Ala Glv Pro Met Gin Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala 385 390 395 400

Ser Cys Gly Leu Ser 405

No de la demande internationale: PCT/

MICRO-ORGANISMES i *-**

FauiK-a tacurtaDfa m»nι<> au micra-wβaniama manuonn-a an aaf« — . . . . t*»ιt» 1 2 ^— 1 3 *a la d«*κnpβa***ι ι

A. lOINTiπCATtON ou •

O'aulraa u -dantlflaa aur una touilla tuppMmontw* > f

Nom rinaotuMA «a a aM «

Collection Nationale de Culture s de Microorganismes

Adraaaa da πnttltutlon et αtpβt (r cβmpπa ιa coda potin * la para) •

28 rue du Docteur Roux , 75724 PARIS CEDEX 1 5

Data du d*p«l • ! ' «'orara •

15 avril 1 993 ! 1-1297

B. INDICATIONS 3UPPKMI TAIMI8 ' (i n. rampilr qua ιι na »»aaιraι. Un» Itullla aparaa aal loinla pour la aurta da CM ranaaignamanta (~ 1

"En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un ^b revet européen est demandé, un échantillon du micro _¬ organisme dépose ne sera accessible^ jusqu'à la publication ^d e la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à laquelle ia demande sera rejetée, re _t irée eu réputée retirée, que par la remise d'un éc _h antillon à un expert désigné par le requérant, (règle 28.4) _d e la CBE) "

C. fTATS Of SlβNlS POU* USOUILS US INDICATIONS SONT DON CIB > (al laa indlcatlona n* aont paa ^β ennAaa pour loua laa Etala daaignaa)

AUSTRALIE

CANADA

ETATS-UNIS D'AMERIOUE

EUROPE

JAPON

NOUVELLE-ZELANDE

O. INDICATIONS FOURNI! S 3(PA*f MINT • (t r» itmς t «ua al

Laa indication! énumartat e-.ιprtι taront aeumiaaa ultarlauramaπt au βuraau international * (apoclflar la nalura ganarata daa mai* cationa p. ai., i No d'orαr» au otpOl »)

_; Li D'tianti Kuiiit « •(• *«u _»« la oaπaπda *nt»rnatιonala lortαva caιla-cι a été dapoaaa (i «enflai par l'offica ra«aplaur)

(Fonetlonnaira autorlaa) | j Oala da '«caption (an protananca du dépoaanl) par lo Buraau IniarnaβoΛal >•

(FonnlonnaJra aulortaé)

Formulaire PCT,RO/1 ^* M (Janmar 1MI)