技术领域

本发明涉及化学生物技术领域， 具体地， 涉及一种核酸纳米颗粒， 一种核酸纳米 颗粒的制备方法， 该制备方法得到的核酸纳米颗粒， 所述核酸纳米颗粒的应用和一种三 头核酸单链单元。 背景技术

R A干扰（ RNA interference， R Ai )是由双链 R A ( double-stranded R A， dsRNA ) 分子在 mR A水平关闭相应基因的表达或使该基因沉默的� �程。 R A干扰技术又被形 象地称为基因敲低（knock-down)或基因沉默（gene silencing) , 是一种典型的转录后基 因调控方法， 又称转录后基因沉默 （post-transcriptional gene silencing, PTGS)。 其最早 是由 Fire禾口 Mello在 Caenorhabditis elegans中阐明的（A. Fire, S. Xu, M. K. Montgomery, S. A. Kostas, S. E. Driver, C. C. Mello, Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature. 391 (1998) 806-811. )两位因此重 要发现于 2006年被授予诺贝尔奖。 这一系列的 siRNA具有极好的药物前景。 人类疾病 可能通过 R A干扰技术， 来靶向和抑制表达的致病基因的表达， 从而达到药物的效果。

但由于结构的限制， siRNA成为药物还需要克服： 稳定性， 定向给药， 脱靶效应， 应激反应免疫反应等难题。 其中 siRNA的给药 （delivery) 问题是最大难点， 也是目前 的研究热点。 R A的化学结构决定了天然 siRNA在穿透细胞膜和定向给药方面具有缺 陷， 研究者们利用多种修饰的方法对此进行了改善 ： 1 ) 通过小分子和多肽等的共轭结 合 ( Muratovska, A. & Eccles, M. R. Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells. FEBS Lett. 558, 63-68 (2004).； Oishi, M.， Nagasaki, Y.， Itaka, K.， Nishiyama, N. & Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile β-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. J. Am. Chem. Soc. 127, 1624-1625 (2005).； Soutschek, J. et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siR As. Nature 432, 173-178 (2004). )； 2 )利用各种表 面正电性的纳米颗粒辅助携带 siRNA 穿透细胞膜后释放 （Torchilin, V. P. et al. Cell transfection in vitro and in vivo with nontoxic TAT peptide— liposome— DNA complexes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 1972-1977 (2003).； Auguste, D. T. et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. J. Control. Release 130, 266-274 (2008).； Martina, M.-S. et al. The in vitro kinetics of the interactions between PEG-ylated magnetic-fluid-loaded liposomes and macrophages. Biomaterials 28, 4143-4153 (2007).)； 3 )脂质体或类脂质体的两性分子将 siRNA进行包裹形成稳定颗粒辅助进行给 药， 如 SNALP 等 ( Feigner, P. L. et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84， 7413-7417 (1987).； Malone, R. W., Feigner, P. L. & Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86， 6077-6081 (1989).； Li, W. & Szoka, F. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharm. Res. 24, 438-449 (2007). )

目前报道的技术中，为了辅助给药所构建的 siRNA复合分子中，具有药效的 siR A 所占的比重很小， 辅助介质占有极大的质量比， 而这些介质的毒性等安全指标不能被完 全信任。 另一方面， 利用其它介质辅助给药在保持核酸稳定性和便 于具有药效的核酸释 放之间难以找到合适的中间点， 以实现既能保持核酸的稳定性， 又能在进入细胞后有效 迅速地释放核酸的目的。

因此， 亟需发展一种具有高比重 siRNA且便于 siRNA药物释放的复合分子作为 siRNA的递送系统。 发明内容

本发明的目的是提供一种核酸纳米颗粒， 该核酸纳米颗粒具有高的载核酸量和较 高的稳定性。此外， 本发明还提供所述核酸纳米颗粒的制备方法以 及它们在制备小干扰 核酸药物中的应用。

为了实现上述目的， 本发明一方面提供一种核酸纳米颗粒， 该核酸纳米颗粒由多 个核酸单链单元构建而成， 所述核酸单链单元包括三头核酸单链单元， 可选地还包括二 头核酸单链单元和一头核酸单链单元；所述三 头核酸单链单元由三条核酸单链通过共价 键直接和 /或间接相连而成， 所述二头核酸单链单元由两条核酸单链通过共 价键直接和 / 或间接相连而成， 所述一头核酸单链单元具有一条核酸单链； 二头核酸单链单元和一头 核酸单链单元的含量之和与三头核酸单链单元 的摩尔比为 (0-20): (80-100)； 每个核酸单 链单元的至少一条核酸单链通过核酸单链之间 的碱基互补配对与相邻核酸单链单元的 核酸单链结合， 核酸单链的骨架为磷酸核糖骨架、 磷酸脱氧核糖骨架和肽骨架中的至少 一种。

另一方面， 本发明还提供了一种核酸纳米颗粒的制备方法 ， 该方法包括： 将核酸 单链单元混合物进行核酸变性和退火，所述核 酸单链单元混合物包括第一核酸单链单元 与第二核酸单链单元，所述第一核酸单链单元 中的第一核酸单链与所述第二核酸单链单 元中的第二核酸单链具有碱基互补配对的能力 ；其中，核酸单链的骨架为磷酸核糖骨架、 磷酸脱氧核糖骨架和肽骨架中的至少一种；所 述第一核酸单链单元和第二核酸单链单元 均包括三头核酸单链单元， 可选地还包括二头核酸单链单元和一头核酸单 链单元； 所述 三头核酸单链单元由三条核酸单链通过共价键 直接和 /或间接相连而成，所述二头核酸单 链单元由两条核酸单链通过共价键直接和 /或间接相连而成，所述一头核酸单链单元具� � 一条核酸单链； 所述第一核酸单链单元中， 二头核酸单链单元和一头核酸单链单元的含 量之和与三头核酸单链单元的摩尔比为 (0-20): (80-100)； 所述第二核酸单链单元中， 二 头核酸单链单元和一头核酸单链单元的含量之 和与三头核酸单链单元的摩尔比为 (0-20)： (80-100)。

另一方面， 本发明还提供了一种三头核酸单链单元， 其中， 所述三头核酸单链单 元中， 三条核酸单链分别直接或通过连接基团连接在 一个中心基团上， 所述中心基团允 许与核酸单链和 /或连接基团分别形成三个以上的共价键，且� �述中心基团的分子量至多 为 5000Da; 所述中心基团具有三个未成对电子用于形成所 述共价键； 所述未成对电子 为脱去氢的羟基的氧原子上的未成对电子、 脱去氢的氨基的氮原子上的未成对电子、 脱 去氢的亚氨基的氮原子上的未成对电子和脱去 氢的羧基的氧原子上的未成对电子中的 至少一种。

另一方面， 本发明还提供了上述制备方法制备得到的核酸 纳米颗粒。

再一方面， 本发明还提供了所述的核酸纳米颗粒在制备小 干扰核酸药物中的应用。 本发明的核酸纳米颗粒具有以下优势：

( 1 )通过选择核酸纳米颗粒中的三头核酸单链单� �的结构， 能够控制核酸纳米颗 粒的空间拓扑形式， 如形成 6面体、 14面体、 26面体或 62面体等任意正多面体或半正 多面体 （如图 1所示）。 而且， 由于该空间拓扑形式的大小由与化合物连接的 核酸的长 度以及两个三头核酸单链单元中的用于配对的 核酸的匹配部分 （即形成的茎 (stem)) 的 长度决定， 因此， 还可以通过控制核酸以及核酸匹配部分的长度 来控制核酸纳米颗粒的 大小。 如， 实施例 4中通过电镜观察到根据本发明的方法制得的 TD-1的大小均一， 且 均形成为直径约为 28 nm的纳米颗粒。

(2)通过新型的空间拓扑形式来形成具有辅助穿 透细胞膜性质的小核酸药物的纳 米颗粒 （核酸纳米颗粒）， 并证明了其稳定性较小核酸药物增强， 这种核酸纳米颗粒中 辅助介质占的比重低， 而 "药效团 "即小核酸药物为主要组成部分， 因此， 更加安全可 靠且具有经济优势， 实验证明， 在同样重量条件下， 本发明的核酸纳米颗粒的载药量为 现有技术的 10-20倍。 由于提高了载药量， 可以大大降低核酸纳米颗粒的给药量， 从而 降低其毒性。

而且， 由实施例的结果可以看出， 本发明的核酸纳米颗粒具有与常规方法转染单 独 siRNA相当的 R A干扰活性， 说明本发明的核酸纳米颗粒便于 siR A药物释放。

( 3 ) 由于本发明的核酸纳米颗粒中可以连接有靶向 性基团， 因此， 该靶向性基团 可以引导核酸纳米颗粒进入不同的靶细胞中， 因此， 本发明的核酸纳米颗粒具有很好的 组织特异性。

(4) 由于本发明的核酸纳米颗粒形成了笼状的空间 拓扑结构， 因此， 其还可作为 其他小分子药物的载体， 通过其上带有的靶向性基团， 将小分子药物代入不同的靶细胞 中。 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施 方式部分予以详细说明。 附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明， 但并不构成对本发明的限制。 在附图中：

图 1 是本发明一种实施方式中的核酸单链单元的示 意图和本发明的核酸纳米颗粒 的空间拓扑结构示意图；

图 2a是本发明一种实施方式中制得的化合物的核� ��氢谱图， 图 2b是该化合物的 核磁碳谱图；

图 3a是本发明一种实施方式中制备的核酸单链单� ��的聚丙烯酰胺凝胶电泳图， 图

3b是本发明一种实施方式中制备的核酸单链� ��元的另一张聚丙烯酰胺凝胶电泳图； 图 4是本发明一种实施方式中制备的核酸单链单� �的质谱图；

图 5是本发明另一种实施方式中制备的核酸单链� �元的质谱图；

图 6a和图 6b是本发明一种实施方式中制备的核酸纳米颗� ��的原子力显微镜的谱 图；

图 7是本发明一种实施方式中制备的核酸纳米颗� �的 RNA干扰实验的结果图； 图 8是本发明一种实施方式中制备的核酸纳米颗� �辅助穿透细胞膜的结果图。 具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本发明。

本发明中， 术语 "烷基" 的定义与本领域中通常的定义相同， 可以为直链或支链 烷基。 所述任选取代的 C1-C20的烷基优选为任选取代的 C1-C 10的烷基， 包括但不限 于甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 正戊基、 异戊基、 新戊基 或正己基。 优选地， 所述任选取代的 C1-C20的烷基为甲基或乙基。

术语 "烃基" 的定义与本领域中通常的定义相同， 可以为直链或直链烃基。 所述 任选取代 C1-C20的烃基可包括 C1-C20的烷基、 C1-C20的烯基或 C1-C20的块基， 优 选为 C1-C 10的烷基、 C2-C10的烯基或 C2-C10的块基； 具体地， 包括但不限于甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 正戊基、 异戊基、 新戊基、 正己基、 乙烯基、 丙烯基、 正丁烯基或丙块基。

所述 "亚烷基" 的定义与本领域中通常的定义相同， 可以为直链或支链亚烷基， 包括但不限于亚甲基、 亚乙基、 亚丙基、 亚丁基、 亚戊基、 亚己基、 亚庚基、 亚辛基、 亚壬基或正癸基。

本发明中， 所述靶向性基团指能够对靶标进行识别， 并使与其连接的分子在靶标 附近大量聚集的基团。 所述靶向性基团包括但不限于叶酸、 甘露糖、 半乳糖、 脂肪酸、 脂类、 抗体、 功能性短肽和适配子形成的基团中的至少一种 。 所述靶向性基团的选择为 本领域技术人员公知， 如需要特异性靶向肝脏时可选择半乳糖基团。

术语 "脂类"是指一般不溶于水而溶于脂溶性溶剂的� ��合物。 优选地， 本发明的 所述脂类为功能性脂类， 包括但不限于胆固醇、 甘油三酯或磷脂。

本发明中， 所述功能性短肽可以为本领域中常用的各种功 能性短肽， 优选为 TAT 肽或富 Arg肽。

核酸为本领域公知的概念， 所述核酸单链例如可以为： 寡聚核糖核苷酸、 多聚核 糖核苷酸、 寡聚脱氧核糖核苷酸或多聚脱氧核苷酸， 优选地， 所述核酸单链为非编码 R A分子， 包括但不限于： siR A、 microR A、 shR A或 dsR A。

所述核酸单链可以为天然碱基组成的核酸单链 ， 也可以为修饰的核酸单链。 本发 明中， 对核酸进行修饰的方式为本领域技术人员所公 知。 例如， 本发明对核酸进行的化 学修饰为以下的至少一种的化学修饰的组合：

( 1 ) 对核酸的骨架结构中连接核苷酸的磷酸二酯键 的修饰；

(2) 对核酸的骨架结构中核糖的修饰；

(3 ) 对核酸的核苷酸残基中碱基的修饰。

所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的 氧进行修饰， 包括硫代磷酸修饰 (Phosphorthioate) 和硼烷化磷酸盐修饰 （Boranophosphate)。 如下式所示分别用硫和硼 烷置换磷酸二酯键中的氧。 两种修饰都能稳定核糖核酸单链的结构， 保持碱基配对的高 特异性和高亲和

硫代磷酸修饰 硼烷化磷酸盐修饰 所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中 2'-羟基 (2'-0H)的修饰。对核苷酸戊糖中 2'-羟基 的修饰包括 2'-氟修饰、 2'-氧甲基 C2'-0ME)修饰、 2'-甲氧乙基 C2'-M0E)修饰、 2'-2，4-二硝 基苯酚 (2'-DNP)修饰、 锁核酸 (LNA)修饰、 2'-氨基修饰、 2'-脱氧修饰等。

'-甲氧乙基 '-2，4-二硝基苯酚修饰

锁核酸修饰 2'-氨基修饰 2'-脱氧修饰

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰， 如在尿嘧啶的 5'位引入溴或碘的 5'- 溴尿嘧啶和 5'-碘尿嘧啶修饰是常使用的碱基修饰方法， 其他还有 Ν3-甲基脲嘧啶修饰、 2，6-二氨基嘌呤修饰

；' -溴尿嘧啶 5'-碘尿嘧啶

Ν3-甲基脲嘧啶 2， 6-二氨基嘌呤

术语 "Tm值"被定义为 50%的靶序列与完全互补的核酸单链杂交的温度 (在一定 的离子强度和 pH情况下)。 Tm由核苷酸碱基的长度和组成确定， 其计算方法为本领域 技术人员公知。

术语 "核酸单链单元"用于指代构成所述核酸纳米颗� ��的基本重复单位。

本发明提供了一种核酸纳米颗粒， 该核酸纳米颗粒由多个核酸单链单元构建而成 ， 所述核酸单链单元包括三头核酸单链单元，可 选地还包括二头核酸单链单元和一头核酸 单链单元； 所述三头核酸单链单元由三条核酸单链通过共 价键直接和 /或间接相连而成， 所述二头核酸单链单元由两条核酸单链通过共 价键直接和 /或间接相连而成，所述一头核 酸单链单元具有一条核酸单链； 二头核酸单链单元和一头核酸单链单元的含量 之和与三 头核酸单链单元的摩尔比为 (0-20): (80-100)； 每个核酸单链单元的至少一条核酸单链通 过核酸单链之间的碱基互补配对与相邻核酸单 链单元的核酸单链结合，核酸单链的骨架 为磷酸核糖骨架、磷酸脱氧核糖骨架和肽骨架 中的至少一种。 所述核酸单链可以为核糖 核酸、 脱氧核糖核酸和肽核酸中的至少一种。

其中， 优选情况下， 所述核酸单链单元中， 二头核酸单链单元和一头核酸单链单 元的含量之和与三头核酸单链单元的摩尔比为 (0-10): (90-100)。

其中， 二头核酸单链单元和一头核酸单链单元的摩尔 比没有特别的要求， 可以在 任意范围内变动，所述核酸单链单元中，可以 不含有二头核酸单链单元和 /或一头核酸单 链单元， 优选情况下， 二头核酸单链单元和一头核酸单链单元的摩尔 比为 1 : 0.01-100, 优选为 1： 0.1-10。

其中， 所述核酸单链的长度可以为 5-50个碱基， 优选为 10-40个碱基， 更优选为 15-30个碱基， 更进一步优选为 18-22个碱基。

其中，所述核酸单链中参与碱基配对的碱基数 量可以为 5-50个碱基，优选为 10-40 个碱基， 更优选为 15-30个碱基， 更进一步优选为 18-22个碱基。

其中， 优选情况下， 所述核酸单链为核糖核酸单链， 更优选为具有 siR A的核糖 核酸单链。

其中， 所述核酸纳米颗粒的粒径可以为 l-1000nm， 优选为 10-200nm， 更优选为

20-100nm, 更进一步优选为 25-40nm。

其中， 所述三头核酸单链单元中， 三条核酸单链可以分别直接或通过连接基团连 接在一个中心基团上，所述中心基团能够与核 酸单链和 /或连接基团形成三个以上的共价 键， 且所述中心基团的分子量可以至多为 5000Da， 优选至多为 4000Da， 更优选至多为 2000Da, 进一步优选至多为 1000Da。

其中，根据本发明的一种实施方式，所述中 心基团可以选自 和 I 中的至少一种； ¾ Η、 任选取代的 C1-C20的烃基和靶向性 基团中的至少一种； 为11、 任选取代的 C1-C20的烃基和靶向性基团中的至少一种。

其中， 根据本发明的另一种实施方式， 所述中心基团也可以具有三个未成对电子 用于形成所述共价键； 所述未成对电子为脱去氢的羟基的氧原子上的 未成对电子、 脱去 氢的氨基的氮原子上的未成对电子、脱去氢的 亚氨基的氮原子上的未成对电子和脱去氢 的羧基的氧原子上的未成对电子中的至少一种 。

其中， 优选情况下， 所述具有三个未成对电子的中心基团为生物内 源性化合物及 它的药学上可接受的衍生物形成的基团。

其中， 生物内源性化合物通过它们的羟基、 氨基、 亚氨基或羧基脱去氢得到的未 成对电子所形成的共价键在体内容易被水解酶 水解， 从而得到生物内源性化合物， 可以 提高所述核酸纳米颗粒的生物相容性。

其中， 优选情况下， 所述生物内源性化合物为丙三醇、 肌醇、 糖、 糖醇、 糖胺、 鸟嘌呤、 黄嘌呤、 尿酸、 叶酸、 胆酸、 甲状腺素、 多巴胺、 前列腺素 Flct或雌三醇， 进 一步优选情况下， 所述生物内源性化合物为丙三醇或肌醇， 更进一步优选情况下， 所述 生物内源性化合物为丙三醇。

其中， 优选情况下， 所述中心基团还具有靶向性基团。 其中， 所述中心基团上在 连接核酸单链和 /或所述连接基团的位点以外的其它位点上可� �连接有靶向性基团。

其中， 所述中心基团上在连接核酸单链和 /或所述连接基团的位点以外的其它位点 上可以连接有靶向性基团。

本发明中， 所述靶向性基团指能够对靶标进行识别， 并使与其连接的分子在靶标 附近大量聚集的基团。因此，所述靶向性基团 可以为组织特异性的靶向性基团，如叶酸、 甘露糖、半乳糖、脂肪酸、脂类、抗体、功能 性短肽和适配子形成的基团中的至少一种。 所述靶向性基团的选择为本领域技术人员公知 ，如需要特异性靶向肝脏时可选择半乳糖 所述靶向性基团也可以为便利所述核酸纳米颗 粒进入癌症细胞的基团， 例如， 带 有多正电荷的基团。

本发明中， 所述靶向性基团可以连接在核酸单链单元的中 心原子上， 也可以在形 成纳米颗粒之后， 通过化学反应修饰在纳米颗粒的表面。 所 述 中 心 基 团 为

-R ₇ 各自独立地为 H、任选取代的 C1-C20的烃基 或靶向性基团； R ₈ -R ₁₃ 中任选的 3个为键， 其余 3个为 H、 任选取代的 C1-C20的烃基 或靶向性基团。

其中， 优选情况下， 所述连接基团为 ， 其中， R ₁₄ -R ₁₇ 各自独立地为 H、 卤素或任选取代的

C1-C20的烷基， R ₁₈ 为 H或任选取代的 C1-C20的烷基； 和 Y ₂ 各自独立地为任选取 选取代的 C1-C20 的亚烷基、 ； 其中， R ₁₉ 和 R _2Q 为键或任选取 代的 C1-C14的亚烷基； m为 2-8的整数； 并且， 或 X ₂ 与中心基团相连， ¥ ₁ 或¥ ₂ 与 核酸单链连接。

根据本发明的核酸纳米颗粒的制备方法， 该方法包括： 将核酸单链单元混合物进 行核酸变性和退火，所述核酸单链单元混合物 包括第一核酸单链单元与第二核酸单链单 元，所述第一核酸单链单元中的第一核酸单链 与所述第二核酸单链单元中的第二核酸单 链具有碱基互补配对的能力。

其中， 核酸单链的骨架为磷酸核糖骨架、 磷酸脱氧核糖骨架和肽骨架中的至少一 种； 所述第一核酸单链单元和第二核酸单链单元均 包括三头核酸单链单元， 可选地还包 括二头核酸单链单元和一头核酸单链单元。所 述核酸单链可以为核糖核酸、 脱氧核糖核 酸和肽核酸中的至少一种。

所述三头核酸单链单元由三条核酸单链通过共 价键直接和 /或间接相连而成， 所述 二头核酸单链单元由两条核酸单链通过共价键 直接和 /或间接相连而成，所述一头核酸单 链单元具有一条核酸单链。

所述第一核酸单链单元中， 二头核酸单链单元和一头核酸单链单元的含量 之和与 三头核酸单链单元的摩尔比为 (0-20): (80-100)； 所述第二核酸单链单元中， 二头核酸单 链单元和一头核酸单链单元的含量之和与三头 核酸单链单元的摩尔比为 (0-20) : (80-100)。

其中， 优选情况下， 所述第一核酸单链单元中的第一核酸单链与所 述第二核酸单 链单元中的第二核酸单链形成的互补配对结构 的 Tm值至少为 25 °C， 优选超过 37°C， 进一步优选超过 50°C ;所述变性的温度为 25-90°C，优选为 37-90°C，进一步优选为 60-90 °C ; 所述退火的终止温度为 0-75 °C， 优选为 10-60°C， 进一步优选为 20-45 °C ; 所述退火 的降温速率为 0.1-4.5 °C/s， 优选为 0.2-3 °C/s， 进一步优选为 0.5-1.5 °C/s。

其中， 优选情况下， 所述第一核酸单链单元中， 二头核酸单链单元和一头核酸单 链单元的含量之和与三头核酸单链单元的摩尔 比为 (0-10): (90-100)； 所述第二核酸单链 单元中，二头核酸单链单元和一头核酸单链单 元的含量之和与三头核酸单链单元的摩尔 比为 (0-10): (90-100)。

其中， 所述第一核酸单链单元中， 二头核酸单链单元和一头核酸单链单元的摩尔 比可以为 1 : 0.01-100, 优选为 1 : 0.1-10； 所述第二核酸单链单元中， 二头核酸单链单 元和一头核酸单链单元的摩尔比可以为 1 : 0.01-100， 优选为 1 : 0.1-10。

其中， 所述核酸单链的长度没有特别的限定， 例如所述核酸单链的长度为 5-50个 碱基， 优选为 10-40个碱基， 更优选为 15-30个碱基， 更进一步优选为 18-22个碱基。

其中， 所述核酸单链的定义如上所述， 优选情况下， 所述核酸单链为核糖核酸单 链， 更优选为具有 siRNA的核糖核酸单链。

其中， 相对于每摩尔所述第一核酸单链单元， 所述第二核酸单链单元的用量可以 在 1摩尔左右， 例如为 0.9-1.1摩尔。 其中， 所述三头核酸单链单元中， 三条核酸单链可以分别直接或通过连接基团连 接在一个中心基团上，所述中心基团能够与核 酸单链和 /或连接基团形成三个以上的共价 键， 且所述中心基团的分子量至多为 5000Da， 优选至多为 4000Da， 更优选至多为 2000Da, 进一步优选至多为 1000Da。

一种实施方式， 所述中心基团选自

中的至少一种； 为11、 任选取代的 C1-C20的烃基和靶向性 基团中的至少一种； 为11、 任选取代的 C1-C20的烃基和靶向性基团中的至少一种。

其中， 根据本发明的另一种实施方式， 所述中心基团具有三个未成对电子用于形 成所述共价键； 所述未成对电子为脱去氢的羟基的氧原子上的 未成对电子、 脱去氢的氨 基的氮原子上的未成对电子、脱去氢的亚氨基 的氮原子上的未成对电子和脱去氢的羧基 的氧原子上的未成对电子中的至少一种。

其中， 优选情况下， 所述具有三个未成对电子的中心基团为生物内 源性化合物及 它的药学上可接受的衍生物形成的基团。

其中， 生物内源性化合物通过它们的羟基、 氨基、 亚氨基或羧基脱去氢得到的未 成对电子所形成的共价键在体内容易被水解酶 水解， 从而得到生物内源性化合物， 可以 提高所述核酸纳米颗粒的生物相容性。

其中， 所述生物内源性化合物为丙三醇、 肌醇、 糖、 糖醇、 糖胺、 鸟嘌呤、 黄嘌 呤、 尿酸、 叶酸、 胆酸、 甲状腺素、 多巴胺、 前列腺素 Flct或雌三醇。

其中， 所述中心基团还具有靶向性基团。 其中， 所述中心基团上在连接核酸单链 和 /或所述连接基团的位点以外的其它位点上可� �连接有靶向性基团。

本发明中， 所述靶向性基团指能够对靶标进行识别， 并使与其连接的分子在靶标 附近大量聚集的基团。因此，所述靶向性基团 可以为组织特异性的靶向性基团，如叶酸、 甘露糖、半乳糖、脂肪酸、脂类、抗体、功能 性短肽和适配子形成的基团中的至少一种。 所述靶向性基团的选择为本领域技术人员公知 ，如需要特异性靶向肝脏时可选择半乳糖 基团。

所述靶向性基团也可以为便利所述核酸纳米颗 粒进入癌症细胞的基团， 例如， 带 有多正电荷的基团。

本发明中， 所述靶向性基团可以连接在核酸单链单元的中 心原子上， 也可以在形 成纳米颗粒之后， 通过化学反应修饰在纳米颗粒的表面。 所 述 中 心 基 团 为

-R ₇ 各自独立地为 H、任选取代的 C1-C20的烃基 或靶向性基团； R ₈ -R ₁₃ 中任选的 3个为键， 其余 3个为 H、 任选取代的 C1-C20的烃基 或靶向性基团。

述连接基团为 ， 其中， R ₁₄ -R ₁₇ 各自独立地为 H、 卤素或任选取代的

C1-C20的烷基， R ₁₈ 为 H或任选取代的 C1-C20的烷基； 和 Y ₂ 各自独立地为任选取 选取代的 C1-C20 的亚烷基、 ； 其中， R ₁₉ 和 R ₂ 。为键或任选取 代的 C1-C14的亚烷基； m为 2-8的整数； 并且， 或 X ₂ 与中心基团相连， ¥ ₁ 或¥ ₂ 与 核酸单链连接。

根据本发明的三头核酸单链单元， 其中， 所述三头核酸单链单元中， 三条核酸单 链分别直接或通过连接基团连接在一个中心基 团上， 所述中心基团允许与核酸单链和 / 或连接基团分别形成三个以上的共价键， 且所述中心基团的分子量至多为 5000Da， 优 选至多为 4000Da， 更优选至多为 2000Da， 进一步优选至多为 lOOODa; 其中， 所述中心 基团具有三个未成对电子用于形成所述共价键 ；所述未成对电子为脱去氢的羟基的氧原 子上的未成对电子、 脱去氢的氨基的氮原子上的未成对电子、 脱去氢的亚氨基的氮原子 上的未成对电子和脱去氢的羧基的氧原子上的 未成对电子中的至少一种。

其中， 优选情况下， 所述具有三个未成对电子的中心基团为生物内 源性化合物及 它的药学上可接受的衍生物形成的基团。

其中， 优选情况下， 所述生物内源性化合物为丙三醇、 肌醇、 糖、 糖醇、 糖胺、 鸟嘌呤、 黄嘌呤、 尿酸、 叶酸、 胆酸、 甲状腺素、 多巴胺、 前列腺素 Flct或雌三醇。

其中， 所述中心基团还具有靶向性基团。 其中， 所述中心基团上在连接核酸单链 和 /或所述连接基团的位点以外的其它位点上可� �连接有靶向性基团。

本发明中， 所述靶向性基团指能够对靶标进行识别， 并使与其连接的分子在靶标 附近大量聚集的基团。因此，所述靶向性基团 可以为组织特异性的靶向性基团，如叶酸、 甘露糖、半乳糖、脂肪酸、脂类、抗体、功能 性短肽和适配子形成的基团中的至少一种。 所述靶向性基团的选择为本领域技术人员公知 ，如需要特异性靶向肝脏时可选择半乳糖 基团。

所述靶向性基团也可以为便利所述核酸纳米颗 粒进入癌症细胞的基团， 例如， 带 有多正电荷的基团。

本发明中， 所述靶向性基团可以连接在核酸单链单元的中 心原子上， 也可以在形 成纳米颗粒之后， 通过化学

其中， 所述中心基团为 ， 其中， R ₃ -R ₇ 各自独立地为 任选取代的 C1-C20 的烃基或靶向性基团； R ₈ -R: 中任选的 3个为键， 其余 3个为 H、 任选取代的 C1-C20的烃基或靶向性基团。

C1-C20的烷基， R ₁₈ 为 H或任选取代的 C1-C20的烷基； 和 Y ₂ 各自独立地为任选取

代的 C1-C14的亚烷基； m为 2-8的整数； 并且， 或 X ₂ 与中心基团相连， ¥ ₁ 或¥ ₂ 与 核酸单链连接。

本发明还提供了如上所述的制备方法制备得到 的核酸纳米颗粒。

本发明还提供了如上所述的核酸纳米颗粒在制 备小干扰核酸药物中的应用。

优选地如图 1所示， 当第一核酸单链单元与第二核酸单链单元接触 并进行退火后， 会形成具有特定空间拓扑结构的核酸纳米颗粒 ，该结构可以为任意正多面体或半正多面 体， 图 1仅是示例性的列举出了一些结构， 本发明的核酸纳米颗粒不限于图 1中所示的 结构。

需要特别说明的是， 所述核酸单链的具体序列对本发明的实现没有 影响， 即， 本 发明可适用于任何序列的核酸单链， 特别适用于含有小干扰 R A的正义链的核酸单链 和含有小干扰 R A的反义链的核酸单链。

本发明中所述核酸单链可以为一条小干扰 RNA的正义链或反义链， 也可以为一条 小干扰 R A的正义链或反义链的重复核酸链， 此时， 由于同一核酸纳米颗粒中带有多 条功能性小干扰 R A的序列， 因此， 可以进一步地提高核酸纳米颗粒的载药量。

其中， 相对于每摩尔所述第一核酸单链单元， 所述第二核酸单链单元的用量为 0.9-1.1摩尔， 优选地， 所述第一核酸单链单元与第二核酸单链单元以 等摩尔混合接触， 且终浓度均为 0.1-10μΜ。

根据本发明， 所述第一核酸单链单元与第二核酸单链单元的 接触优选在阳离子存 在下进行， 且进一步优选地， 所述阳离子为二价镁离子。 所述退火的具体条件可以为本 领域的常规条件。

通过以下实施例对本发明做更详细的说明。

本发明中， 两条末端巯基修饰的 siR A单链 R1和 R2委托苏州瑞博生物技术有限 公司合成， 反义链的序列为 5'-SH-C6-AAG GGC GAA GAA GAAUAG GGU U-3' (Rl， 如 SEQ ID NO: 1所示）；正义链的序列为 5'-UUC CCG CUU CCUAUC CCAA-C6-SH-3' (R2， 如 SEQ ID NO: 2所示）， 其中， 巯基通过 C6亚烷基链与核酸链 5'端的磷酸连接； 所用化学试剂均为分析纯； 用于对照的 siRNA 867-885 (反义链的序列为 5'-AAG GGC GAA GAA GAAUAG GGU U-3' ，如 SEQ ID NO: 3所示；正义链的序列为 5'-UUC CCG CUU CCUAUC CCAA-3' ， 如 SEQ ID NO: 4所示）委托苏州瑞博生物技术有限公司合 成；所用核磁为 Bruker Avance 400 型核磁共振谱仪；所用质谱为 Waters LCT Premier XE ESI-TOF质谱仪； 所用原子力显微镜的型号为 NanoScope lV; 常规分子生物学实验步骤 参考 《分子克隆》 （第三版， 冷泉港实验室）。 实施例 1

本实施例用于说明三头核酸单链单元中的中心 基团的化合物的合成

( 1 )化合物 (2Ζ，2'Ζ，2"Ζ)-4，4'，4"-(2，2'，2''-次氮基 <三价氮基>三 (乙烷 -2,1-二基)三 (氮烷 二基》 ( ⁴ -羰基丁 - ² -烯酸)的合成

在干燥的 500 mL圆底烧瓶中加入化合物 (1) ( 13.38 mmol, 2.016 g)， 然后加入 200 mL无水二氯甲烷， 电磁搅拌均匀。 再将马来酸酐 （45.16 mmol, 4.435 g)加入该圆底烧 瓶中， 加快搅拌速度， 并且在 50°C下加热回流 2 h。 旋蒸去除溶剂二氯甲烷， 得到 4.984 g化合物 (4)， 为黄色固体， 产率为 83%。

( 2 ) 化合物 1， Γ， 1 "-(2，2'，2"-次氮基 <三价氮基>三 (乙烷 -2， 1 -二基》三 (1 H-吡咯 -2,5-二 酮)的合成

(5)

在干燥的 100 mL圆底烧瓶中分别加入化合物 (4) ( 5 mmol, 2.204 g)、三乙胺（4.158 mmol，420 mg)、 醋酸钠 （4.085 mmol, 335 mg)， 然后加入 10 mL丙酮， 电磁搅拌均匀。 再将醋酸酐（31.53 mmol, 3.294 g )加入烧瓶中， 并在 70°C加热回流 3 h。旋蒸去除溶剂， 进行柱色谱分离 （展开体系： 纯石油醚至石油醚： 乙酸乙酯为 5 : 1、 3 : 1、 1 : 1 (体积比）， 进行梯度淋洗， 在石油醚： 乙酸乙酯为 1 : 1的条件下完成分离）， 得到黄色固体 694 mg， 产率为 36%。 Rf: 0.4 (石油醚： 乙酸乙酯为 1 :2的条件下）。

黄色固体的核磁氢谱和核磁碳谱分别如图 2a和图 2b所示， 1H NMR (400 M, CDC1 ₃ ) _: δ ppm 6.67 (s， CHx6, J = 6.4 Hz, 6 H)， 3.52 (t， CH ₂ x3, 6 H)， 2.71 (t， CH ₂ x3, J = 6.4 Hz, 6 H); ¹³ C NMR (CDCls, 101 MHz): 5 = 35.7 (CH ₂ ), 51.7 (CH ₂ ), 134.1 (C=C), 170.6 (C=0); 验证该黄色固体为化合物 (5)。 实施例 2

本实施例用于说明本发明的三头核酸单链单元 Nl-3、二头核酸单链单元 N1-2和一 头核酸单链单元 N1-1的制备

将末端巯基修饰的寡核苷酸 R1用 100微升无 R A酶水溶解， 加入 Tri-HCl buffer (pH=8.0， 终浓度为 20 mM)， R1的终浓度为 lmM， 混合均匀； 加入终浓度为 0.11 mM 的化合物 (5)，在流动高纯氩气气氛中放置 5 min， 45 °C孵育 2 h。重复上述加入化合物 (5) 及氩气保护和反应 2 h步骤两次。之后进行聚丙烯酰胺（6 %，7M尿素）电泳并切胶纯化， 切取与 90 nt的天然寡核苷酸相当位置的单带， 进行胶洗脱， 2 h后利用 0.3 M醋酸钠及 75%乙醇沉淀处理洗脱液 lh。在 4°C， 13000 rpm离心 15min， 弃去上清得到三头核酸单 链单元 N1-3 ; 切取与 60nt的天然寡核苷酸相当位置的单带， 进行胶洗脱， 2 h后利用 0.3 M醋酸钠及 75%乙醇沉淀处理洗脱液 lh。 在 4°C， 13000 rpm离心 15min， 弃去上清 得到二头核酸单链单元 N1-2; 切取与 25nt的天然寡核苷酸相当位置的单带， 进行胶洗 脱， 2 h后利用 0.3 M醋酸钠及 75%乙醇沉淀处理洗脱液 lh。 在 4°C， 13000 rpm离心 15min, 弃去上清得到一头核酸单链单元 Nl-1。

分别用 6%和 15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳对 N1-3进行检测，结果分别如图 3a和图 3b所示。图 3a和图 3b中，泳道 1为 N1-3的条带，泳道 2为 R1的条带，泳道 3为 R A marker (各条带表示的分子量已在图中示出）。 由图 3a和图 3b看出， Nl-3的纯度很高， 且在不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中 具有不同的凝胶电泳迁移率。

对 N1-3进行质谱检测， 结果如图 4a所示， N1-3的测量值为 25768.0， 计算的理论 分子量为 25721.5， 说明 N1-3合成成功。

对 N1-2进行质谱检测， N1-2的测量值为 17312.0， 计算的理论分子量为 17309.2， 说明 N1-2合成成功。

对 N1-1进行质谱检测， N1-1的测量值为 8851.3， 计算的理论分子量为 8850.7， 说 明 N1-1合成成功。 实施例 3

根据实施例 2的方法利用 R2合成三头核酸单链单元 N2-3、二头核酸单链单元 N2-2 和一头核酸单链单元 N2-l。

对 N2-3进行质谱检测， 结果如图 5a所示， N2-3的测量值为 24041.8， 计算的理论 分子量为 24038.9， 说明 N2-3合成成功。

对 N2-2进行质谱检测， N2-2的测量值为 15769.3， 计算的理论分子量为 15766.1， 说明 N2-2合成成功。

对 N2-1进行质谱检测， N2-1的测量值为 8276.0， 计算的理论分子量为 8275.3， 说 明 N2-1合成成功。 实施例 4

本实施例用于说明本发明的核酸纳米颗粒 TD-1的制备

将 N1-3和 N2-3等浓度混合（浓度均为 1μΜ)， 加入终浓度为 2 mM的 Mg(OAc) ₂ ， 加热至 90°C， 30min内冷却至 45°C， 维持 30min。 得到核酸纳米颗粒 TD-1。

将 40nM的 TD-1 (根据 Nl-3的浓度计算）在云母片上制样， 之后真空干燥， 采用 原子力显微镜观测， 可以看到大至 33nm左右直径的纳米颗粒， 如图 6a和 6b所示， 其 中， 图 6b为图 6a的局部放大图。 实施例 5

本实施例用于说明本发明的核酸纳米颗粒 TD-1的 R A干扰活性， 利用双荧光素 酶检测体系。

1、 细胞传代：

观察复苏五天的细胞， 贴壁良好， 形态饱满。 丰度达到 80%〜90%以上， 基本符合 传代条件， 即可传代。

(1) 将 DMEM培养液， PBS， 胰酶 （1.5ml分装） 于 37°C预热；

(2) 将已经酸化的培养液倒掉 （不要沿着细胞贴壁的一侧， 防止将细胞冲掉）； (3) 加入 7ml PBS缓冲液冲洗细胞层表面，洗去细胞表层粘附 的杂质和死去的细胞，（轻 轻震荡均匀） 倾出；

(4) 加入胰酶进行消化， 使贴壁细胞层脱落。 肉眼可以观察到大面积的细胞剥落现象。

多次震荡使细胞与胰酶充分接触， 可以手掌轻拍， 以使细胞充分消化。 观察到胰酶 溶液渐渐浑浊， 有许多悬浮小颗粒， 即是消化下来的细胞。消化过程时间不可过长 ， 一般消化时间为 1分钟， 以防造成细胞损伤。

(5) 迅速加入 10ml DMEM培养液终止消化过程。 以吸管反复吹打直至细胞悬液混合分 散均匀。

(6) 将上述的细胞悬液转移至 15ml离心管中， lOOOrmp, 5min离心， 可观察到白色细胞 体沉淀于离心管底。 弃去上层培养液， 以 10ml DMEM培养液重新悬起细胞， 作为 传代的细胞液。

(7) 准备 75cm ² 培养瓶一个， 装入 18ml DMEM培养液待用。 向其中加入细胞悬液 3ml， 以吸管吹打均匀并且摇匀。 每次吸取细胞悬液时要重悬均匀， 以防细胞沉积。

(8) 显微镜下观察细胞分散状况，（注意防止出现 细胞团）培养之前再次摇匀。拧松瓶口， 于 37°C， 5% C0 ₂ 条件下培养。

24h后观察传代后细胞的生长状态。

2、 细胞铺板

在传代的过程中， 将细胞铺入 24孔板。 将传代过程中的细胞悬液， 吸取 1.5 ml于 12ml DMEM培养液中制备铺板细胞悬液。 反复吹打使细胞分散均匀， 以 500 μΐ/孔的量 铺入 24孔板中。 每次吸取细胞悬液之前都要反复吹打， 以保证吸取相同的细胞数量。 记录铺板时间。

显微镜下观察铺板效果， 若出现细胞聚集现象应轻轻摇动细胞板使其分 散开来。 于 37°C， 5 % C0 ₂ 条件下培养 24小时待转染使用。

3、 细胞转染

(1) 向 50μ1的 Opti-MEM中加入 0.5μ1的 pRL-TK质粒溶液 （海肾荧光素酶表达质粒、 浓度为 100 η _§ /μ1)、 0.5μ1 pGL3-Rosa质粒溶液 （萤火虫荧光素酶表达质粒、 浓度为 200 ng/μΐ), 震荡， 13000 rpm离心；

(2) 加入 siR A 867-885 (阳性对照， 终浓度为 16.7 nM， lOpmol); 震荡混匀， 室温孵 育 5 min;

(3) 加入 50 μΐ的 lipo-opti混合液 ( lipofectamine 2000与 Opti-MEM的体积比为 1： 49) 得到转染混合液， 震荡， 13000 rpm离心， 孵育 15分钟；

(4) 取出 24孔板， （培养 24小时， 细胞丰度达到 50 %-70 %， 即可转染）， 用枪头沿孔 壁的一侧轻轻吸出 DMEM培养液。 同时迅速在每孔中加入 500 μΐ Opti-MEM; (5) 每孔加入 97 μΐ转染混合液， 轻轻摇匀， 于 37°C， 5 % C0 ₂ 条件下培养 4小时；

(6) 转染 4小时后， 每孔加入 lml， 37 °C预热的 DMEM培养液。 于 37°C， 5 % C0 ₂ 条件 下培养。 其中， 以相同体积的双蒸水代替 siR A 867-885加入空白组作为阴性对照。 另夕卜， 以相同的步骤测试 TD-1和 TD-2, 其中， TD-1加入的量分别为 0.125pmol、 0.25pmol、 0.5pmol、 lpmol和 lOpmol, 以 Nl的摩尔数计； TD-2加入的终浓度为 lOpmol, 同样以

N2的摩尔数计。 4、 细胞裂解液的制备和化学发光检测

44小时后将细胞板取出， 准备裂解细胞收集待测组分。

(1) 准备 I X PLB裂解液待用；

(2) 以微量真空泵吸净每孔中的培养液， 再以 PBS清洗细胞表面， 500 μΐ/孔， 轻柔震荡， 1 min后吸出；

(3) 加入 1 X PLB溶液， ΙΟΟμΙ/孔， 于水平摇床上 200 rpm， 震荡 20 min。 此时可以观察 到孔内出现白色絮状沉淀；

(4) 20 min后， 吸取 24孔中的溶液于 24个 EP管中；

在 13000 rpm离心 l min， 吸取上清液到新的离心管中保存， 待化学发光检测。 将 预先浸泡在 75 %酒精中的 96孔板取出， 用蒸馏水反复冲洗干净， 空干水待用， 将各孔 中的细胞裂解液加入 96孔板的各孔内。 预先避光融化两种检测液： Fassy Reagent I和 Rassy Reagent II。 检测时， 首先迅速加入避光融化的 Fassay Reagent I， 每孔 100 μ1， 检 测化学发光值， 得到 firefly luciferase发光数值； 再迅速加入 Rassay Reagent II每孔 100 μ1， 淬灭 firefly luciferase发光的同时得到 Renilla luciferase的发光数据。 对所得数据进 行处理就能够得到靶向 firefly luciferase的特定 siRNA的干扰活性。每组数据重复三次。

结果如图 7所示，图 7中 N(16.7nM)表示浓度为 16.7nM的 siRNA 867-885的结果，

TD表示 TD-1的结果， 同样地，括号里为检测的浓度。由图 7可以看出，在相同浓度下， TD-1的 RNA干扰活性和与用常规试剂 Lipo2000转染 siRNA 867-885的 R A干扰活性 相当， 同时也说明， TD-1便于 siRNA药物的释放。 实施例 6

本实施例用于说明本发明的核酸纳米颗粒 TD-1的辅助穿透细胞膜的效果。

用 16.7nM的 siRNA 867-885作为不加转染试剂的 R Ai效果验证。 本实施例与实 施例 5的双荧光素酶检测体系有所区别： 在第一次转染时不加入 siRNA 867-885， 只加 入 pRL-TK质粒溶液与 pGL3-Rosa质粒溶液，转染 4小时之后吸出含有 lipo的转染试剂， 并重复转染操作， 直接加入溶解于 opti-MEM 的 siRNA 867-885 或 TD-1 (终浓度为 16.7nM) o 4小时之后补加 DMEM培养基， 44小时之后收细胞， 并进行发光检测。 检测结果如图 8所示， 其中， N(lipo+)表示对 siR A 867-885的检测， 且重复转染 操作时再次加入 lipofectamine, Ν(Ηρο-)表示对 siRNA 867-885的检测， 且重复转染操作 时不再加入 lipofectamine, TD(lipo-)表示对 TD-1 的检测， 且重复转染操作时不再加入 lipofectamine。

由图 8可以看出，与天然的 siRNA 867-885相比，在不再加转染试剂的情况下， TD-1 仍能够有效辅助将小干扰核酸传递到细胞内， 并通过 dicer切割，起到 R A干扰的效果， 即 TD-1比 siRNA 867-885具有更强的稳定性。 实施例 Ί

本实施例用于说明本发明的核酸纳米颗粒 TD-2的制备

将浓度均为 ΙμΜ的 N1-3、N2-3、N1-2、N2-2、N1-1和 N2-1按照 95:95:2.5:2.5:2.5:2.5 的摩尔比混合， 加入终浓度为 2 mM的 Mg(OAc) ₂ ， 加热至 90°C， 30min内冷却至 45°C， 维持 30min。 得到核酸纳米颗粒 TD-2。

将 40nM的 TD-2 (根据 Nl-3、 N1-2禾 B N1-1的总浓度计算） 在云母片上制样， 之 后真空干燥， 采用原子力显微镜观测， 可以看到大至 120nm左右直径的纳米颗粒。 实施例 8

本实施例用于说明本发明的核酸纳米颗粒 TD-3的制备

将浓度均为 ΙμΜ的 Ν1-3、Ν2-3、Ν1-2、Ν2-2、Ν1-1和 N2-1按照 85:85:7.5:7.5:7.5:7.5 的摩尔比混合， 加入终浓度为 2 mM的 Mg(OAc) ₂ ， 加热至 90°C， 30min内冷却至 45°C， 维持 30min。 得到核酸纳米颗粒 TD-3。

将 40nM的 TD-3 (根据 Nl-3、 N1-2和 N1-1的总浓度计算） 在云母片上制样， 之 后真空干燥， 采用原子力显微镜观测， 可以看到大至 370nm左右直径的纳米颗粒， 如图 6e和 6f所示， 其中， 图 6e为图 6f的局部放大图。 对比例 1

将浓度均为 ΙμΜ的 Nl-3、 N2-3、 Nl-2、 N2-2、 Nl-1和 N2-1按照 20:20:55:55:25:25 的摩尔比混合， 加入终浓度为 2 mM的 Mg(OAc) ₂ ， 加热至 90°C， 30min内冷却至 45°C， 维持 30min。 得到核酸凝胶 TD-X。

将 40nM的核酸凝胶 TD-X (根据 Nl-3、 N1-2禾 B N1-1的总浓度计算）在云母片上 制样， 之后真空干燥， 采用原子力显微镜观测， 可以看到大至 2微米左右直径的颗粒， 如图 6g和 6h所示， 其中， 图 6h为图 6g的局部放大图。 测试实施例 1 根据实施例 5的方法对核酸纳米颗粒 TD-2、 TD-3和 TD-X的 RNA干扰活性进行 检测， 以 siRNA 867-885为对照组。

测量结果为： 16.7nM的 TD-1的 R A干扰活性为 84.7%， 而 16.7nM的 TD-2的 R A干扰活性为 76.2%， 16.7nM的 TD-3的 R A干扰活性为 74.6%， 16.7nM的 TD-X 的 R A干扰活性为 32.1%。说明 TD-2和 TD-3具有与 siRNA 867-885相当的干扰活性， 同时也说明， TD-2和 TD-3便于 siRNA药物的释放。 但是， TD-X的 R A干扰活性仅 相当于 siRNA 867-885 siRNA 的 37%， 不便于 siRNA药物的释放。

根据实施例 6的方法测定核酸纳米颗粒 TD-2、 TD-3和 TD-X辅助穿透细胞膜的效 果， 以 siRNA 867-885为对照组。 实施例 9

本实施例用于说明肌醇作为中心分子的化合物 （9) 的合成。

将 2.62克 6-氨基己酸溶于二氧六环 /水中， 加入 20mL l M 的氢氧化钠溶液， 加入 4.8克二碳酸二叔丁酯， 室温搅拌， 反应完全后， 调节 pH=l， 乙酸乙酯萃取， 无水硫酸 钠干燥，抽滤，旋干，得到白色固体 3.6克，产率 78%。 1H NMRC400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 4.57 (br s， 1 H)， 3.12-3.10 (m， 2 H)， 2.34 (t， / = 6.8 Hz, 2 H)， 1.68-1.60 (m， 2 H)， 1.51-1.32 (m， 13 H)。

(2) 2，5-二羰基吡咯烷 -1-基 6

S1 S2

将 2.676克 S1和 1.465克 S2溶于 35mL二氯甲烷中， 冰水浴条件下， 滴加二环己 基碳二亚胺的 10mL二氯甲烷溶液， 搅拌 1小时后， 冻于冰箱中过夜， 抽滤， 乙醚重结 晶， 得到白色固体 3.687克， 产率 97% 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 4.60 (br s, 1 H)， 3.1 = 12 Hz, 2 H), 1.77-1.46 (m, 4 H), 1.43 (s, 9 H)。

氮气保护， 向 250 mL的两口瓶中加入 180 mL干燥的 DMF， 18 g (100 mmol) myo 构型肌醇， 30 mL (180 mmol) 原甲酸三乙酯， 5.2 g (26.3 mmol) 对甲苯磺酸， 加热至 110 V， 28 h后停止加热， 冷却至室温后加入 25 mL饱和碳酸氢钠淬灭， 溶液由茶黄色转变 成黄黑色， 减压蒸馏除去 DMF， 甲醇重结晶得到黄色固体 5.83 g， 产率 83 % (R _f = 0.7， CH ₂ C1 ₂ ： MeOH = 6 : 1)。 1H NMR (300 MHz, D ₂ 0) δ 4.08-4.06 (m， 3 Η)， 4.16-4.15 (m， 1 Η)， 4.41-4.39 (m， 2 Η)， 5.42 (s， 1 H); ¹³ C NMR (75.5 MHz, D ₂ 0) δ 102.13, 73.82, 69.28, 66.74, 59.56; HRMS (ESI) m/z 189.0407 [M-H]— (calcd for C ₇ H ₉ 0 ₆ ， 189.0405)。

氮气保护，将 4 g (21 mmol)三羟基化合物溶于 80 mL的 DMF中，随后加入 2.77 g (69.3 mmol) 氢化钠， 待氢气放完后加入 8.5 mL (69.3 mmol) 苄溴， 室温反应过夜， 18 h 后加水终止反应， 减压蒸馏除去溶剂， 二氯甲烷萃取， 合并有机相， 饱和食盐水洗三次， 无水硫酸钠干燥， 柱层析分离 （石油醚 ： 乙酸乙酯 = 5 : 1)， 得白色固体 7.93 g， 产率 82 % (R _f = 0.5, 石油醚 ： 乙酸乙酯 = 5 : 1)。 1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ ) δ 7.40-7.21 (m， 15 H)， 5.55 (s, 1 H)， 4.65 (s, 2 H)， 4.55 (dd， / = 15.6 Hz, 72.0 Hz, 4 H)， 4.45 (m， 1 H)， 4.35 (t, J = 4.8 Hz, 2 H)， 4.31 (m， 2 H)， 4.06 (m， 1 H); ¹³ C NMR (75.5 MHz, CDC1 ₃ ) δ 137.71, 137.48, 128.26, 128.21, 127.93, 127.62, 127.40, 103.10, 73.98, 71.37, 71.31, 70.40, 67.98, 67.09。

将 0.46 g (1 mmol) 上一步产品溶于 50 mL的 0.1M的盐酸甲醇中回流 30 min, 冷 却， 浓氨水调 pH = 8， 旋干， 乙酸乙酯萃取， 无水硫酸镁干燥， 旋干得油状物， 将其溶 于少量热的乙醚， 滴加石油醚诱发结晶， 过滤得产物 0.41 g， 产率 90 %。 iH NMR pOO MHz, CDCI3) δ 7.38-7.31 (m， 15 H)， 4.87 (s, 4 H)， 4.84 (s, 2 H)， 4.02 (t, J = 2.6 Hz, 1 H)， 3.67-3.51 (m， 5 H)， 2.49 (s, 1 H)， 2.37 (s, 1 H)， 2.35 (s, 1 H); HRMS (ESI) m/z 473.1939 [M+Na]+ (calcd for C ₂₇ H ₃₀ O ₆ ， 473.1935)。

S.

将 328mg (lmmol) SI溶于 15mL干燥的二氯甲烷中，加入 450mg (lmmol) S2， 0.06 mL S3, 反应 4小时后， 加入 10 %柠檬酸溶液， 二氯甲烷萃取， 饱和食盐水洗涤， 无水 硫酸钠干燥， 抽滤， 旋干， 柱层析分离， 得到淡黄色固体 480 mg。

将 240毫克上一步粗产品溶于 20mL干燥的二氯甲烷中， 加入 0.88 mL三氟乙酸， 反应 2小时后， 加入 12 mL l M氢氧化钠溶液， 二氯甲烷萃取， 饱和食盐水洗涤， 无水 硫酸钠干燥， 抽滤， 旋干， 进行下一步反应。

根据与实施例 1 相同的方法合成了化合物 （9)， 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.38-7.31 (m， 15 H)， 4.87 (s， 6 H)， 4.55 (s， 3 H)， 3.97 (s， 3 H)， 3.97 - 3.82 (t， J = 2.6 Hz, 6 H)， 2.65 - 2.48 (t， J = 2.4 Hz, 6 H)， 2.32 - 2.19 (t， J = 2.6 Hz, 6 H)， 3.65-1.29 (m， 18 H). 13C NMR (CDC13, 101 MHz): δ = 24.72), 26.1 (CH2), 29.9 (CH2), 34.2 (CH2), 41.7 (CH2), 61.6(CH), 72.7 (CH2), 75.3 (CH), 137.4(Ar), 137.8 (Ar),138.6(C=C), 135.8(C=C), 137.5 (Ar) _: 170.5 ( C=0 )，173.1 (C=0)。 实施例 10

根据实施例 2的方法， 用化合物 (9)与 R1制备得到三头核酸单链单元 N3， 对 N3 进行质谱检测， N3的测量值为 26168.1， 计算的理论分子量为 26154.8， 说明 N3合成成 功。 实施例 11

根据实施例 3的方法， 用化合物 (9)与 R2制备得到三头核酸单链单元 N4， 对 N4 进行质谱检测， N4的测量值为 24481.3， 计算的理论分子量为 24472.2， 说明 N4合成成 功。 实施例 12

根据实施例 4的方法， 利用 N3和 N4制得核酸纳米颗粒 TD-4。 并根据实施例 5 的方法对 TD-4的 RNA干扰活性进行检测， 以 siRNA 867-885为对照组。

测量结果为： 16.7nM的 siRNA 867-885的 R A干扰活性为 84.7%， 而 16.7nM的 TD-4的 RNA干扰活性为 80.9%。 说明 TD-4具有与 siRNA 867-885相当的干扰活性， 同时也说明， TD-4便于 siRNA药物的释放。 根据实施例 6的方法测定 TD-4辅助穿透细胞膜的效果， 以 siRNA 867-885为对照 组。

测量结果为： 在不加转染试剂的情况下， TD-4仍具有 24.5%的干扰活性， 而不加 转染试剂的 siRNA 867-885几乎不具备干扰活性。 这说明 TD-4能够有效辅助小干扰核 酸传递至细胞， 即 TD-4比 siRNA 867-885具有更强的稳定性。 实施例 13

本实施例用于说明甘油作为中心分子的化合物 （10) 的合成 _;

将 6.93克 SI和 920毫克 S2溶于 250mL的 DMF中，冰水浴条件下， 滴加二环己基 碳二亚胺的 10mL二氯甲烷溶液， 室温搅拌 12小时后， 冻于冰箱中过夜， 抽滤， 乙醚 重结晶，得到白色固体 5.687克，产率 77.6%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 5.51 (dd, 1 Η), 4.32 ( Η)。

将 730毫克上一步粗产品溶于 lOOmL干燥的二氯甲烷中， 加入 8 mL三氟乙酸， 反应 2 小时后， 加入 12 mL l M氢氧化钠溶液， 二氯甲烷萃取， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠 干燥，抽滤，旋干，得 290 mg产率 67%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 5.15 (dd, 1 Η), 4.32 (d， 2 Η)， 2.65 (t， 6 Η)， 2.32 (t， 6 Η)， 1.64-1.52 (m， 12 Η)， 1.38 (s, 27 Η)， 1.29 (s, 6 Η)。根据与 实施例 1相同的方法合成了化合物（10)。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 6.94 (s, 6 Η), 5.15 (dd, 1 Η)， 4.40-4.32 (d， 10 Η)， 2.32 (t， 6 Η)， 1.63 (m， 12 Η)， 1.29 (s, 6 Η)。 实施例 14

根据实施例 2的方法， 用化合物 (10)与 R1制备得到三头核酸单链单元 N5， 对 N5 进行质谱检测， N5的测量值为 25811， 计算的理论分子量为 25807， 说明 N5合成成功。 实施例 15

根据实施例 3的方法， 用化合物 (10)与 R2制备得到三头核酸单链单元 N6， 对 N6 进行质谱检测， N6的测量值为 24080， 计算的理论分子量为 24078， 说明 N6合成成功。 实施例 16

根据实施例 4的方法， 利用 N5和 N6制得核酸纳米颗粒 TD-5。 并根据实施例 5 的方法对 TD-5的 RNA干扰活性进行检测， 以 siRNA 867-885为对照组。

测量结果为： 16.7nM的 siRNA 867-885的 R A干扰活性为 84.7%， 而 16.7nM的 TD-5的 RNA干扰活性为 80.9%。 说明 TD-5具有与 siRNA 867-885相当的干扰活性， 同时也说明， TD-5便于 siRNA药物的释放。

根据实施例 6的方法测定 TD-5辅助穿透细胞膜的效果， 以 siRNA 867-885为对照 组。

测量结果为： 在不加转染试剂的情况下， TD-5仍具有 24.5%的干扰活性， 而不加 转染试剂的 siRNA 867-885几乎不具备干扰活性。 这说明 TD-5能够有效辅助小干扰核 酸传递至细胞， 即 TD-5比 siRNA 867-885具有更强的稳定性。 实施例 17

。

(1 1 )

将 4.73克 SI和 4.1克 S2溶于 250mL DMF中，冰水浴条件下，滴加二环己基碳二 亚胺的 10mL二氯甲烷溶液， 室温搅拌 12小时后， 冻于冰箱中过夜， 抽滤， 乙醚重结 晶， 得到白色固体 4.97克， 产率 61%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 9.03 (s, 1 Η)， 7.56 (d， 2 Η)， 6.78 (d， 2 Η)， 4.51 (d， 2 Η)， 4.39 (s， 1 Η)， 4.13-4.08 (m， 4 Η)， 3.18 (t， 4 Η)， 2.35-2.33 (m， 4 Η)，

将 811mg SI和 920mgS2溶于 250mL二氯甲烷中，冰水浴条件下，滴加二环己� ��碳二亚 胺的 100 mL二氯甲烷溶液，室温搅拌 12小时后，冻于冰箱中过夜，抽滤， 以二氯甲烷: 甲醇 =20:1柱层析，得到白色固体 612mg，产率 85%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 9.03 (s, 1 Η)， 7.56 (d， 2 Η)， 6.78 (d， 2 Η)， 4.51 (d， 2 Η)， 4.39 (s， 1 Η)， 4.13-4.08 (m， 4 Η)， 3.18 (t， 6 Η) 2.35-2.33 (m， 6 Η)， 1.62-1.53 (m， 12 Η)， 1.38 (s, 27 Η)， 1.29 (s, 6 Η)。

将 1024毫克上一步粗产品溶于 lOOmL干燥的二氯甲烷中，加入 8 mL三氟乙酸，反应 2 小时后， 加入 12 mL l M氢氧化钠溶液， 二氯甲烷萃取， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠 干燥， 抽滤， 旋干， 得 980 mg产率 96%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 9.03 (s, 1 Η), 7.56 (d， 2 Η)， 6.78 (d， 2 Η)， 4.51 (d， 2 Η)， 4.39 (s, 1 Η)， 4.13-4.08 (m， 4 Η)， 3.18 (t， 6 Η)， 2.35-2.33 (m， 6 Η)， 1.62-1.53 (m， 12 Η)， 1.29 (s， 6 Η)。。

根据与实施例 1相同的方法合成了化合物（ 11 )。1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 9.03 (s, 1 Η)， 7.56 (d， 2 Η)， 6.94 (s， 6 Η)， 6.78 (d， 2 Η)， 4.51 (d， 2 Η)， 4.39 (s， 1 Η)， 4.13-4.08 (m， 4 Η)， 3.18 (t， 6 Η)， 2.35-2.33 (m， 6 Η)， 1.63-1.62 (m， 12 Η)， 1.29 (s， 6 Η)。 实施例 18

根据实施例 2的方法， 用化合物 (11)与 R1制备得到三头核酸单链单元 Ν7， 对 Ν7 进行质谱检测， Ν7的测量值为 26301， 计算的理论分子量为 26299， 说明 Ν7合成成功。 实施例 19

根据实施例 3的方法， 用化合物 (11)与 R2制备得到三头核酸单链单元 Ν8， 对 Ν8 进行质谱检测， Ν8的测量值为 24624， 计算的理论分子量为 24617， 说明 Ν8合成成功。 实施例 20

根据实施例 4的方法， 利用 Ν7和 Ν8制得核酸纳米颗粒 TD-6。 并根据实施例 5 的方法对 TD-6的 RNA干扰活性进行检测， 以 siRNA 867-885为对照组。

测量结果为： 16.7nM的 siRNA 867-885的 R A干扰活性为 84.7%， 而 16.7nM的

TD-6的 RNA干扰活性为 78.9%。 说明 TD-6具有与 siRNA 867-885相当的干扰活性， 同时也说明， TD-6便于 siRNA药物的释放。

根据实施例 6的方法测定 TD-6辅助穿透细胞膜的效果， 以 siRNA 867-885为对照 组。

测量结果为： 在不加转染试剂的情况下， TD-6仍具有 55.6%的干扰活性， 而不加 转染试剂的 siRNA 867-885几乎不具备干扰活性。 这说明 TD-6能够有效辅助小干扰核 酸传递至细胞， 即 TD-6比 siRNA 867-885具有更强的稳定性。 实施例 21

;

将 2.88g SI和 6.2g S2溶于 250mL DMF中， 冰水浴条件下， 滴加二环己基碳二亚胺 的 lOO mL二氯甲烷溶液， 室温搅拌 12小时后， 冻于冰箱中过夜， 抽滤， 以石油醚： 乙 酸乙酯 =8:1柱层析， 得到白色固体 655mg， 产率 74%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ ) δ 7.07 (s, 1 Η)， 6.89 (d, 1 Η)， 6.74 (d, 1 Η)， 4.55-4.57 (m， 2 Η)， 3.18 (t， 6 Η)， 2.90-2.80 (m， 3 Η)， 2.35-2.30 (m, 6 Η), 1.86-1.38 (m, 46 Η), 1.04 (s, 3 Η)。

将 885毫克上一步粗产品溶于 50mL干燥的二氯甲烷中， 加入 3 mL三氟乙酸， 反 应 2小时后， 加入 6 mL l M氢氧化钠溶液， 二氯甲烷萃取， 饱和食盐水洗涤， 无水硫 酸钠干燥， 抽滤， 旋干， 得 490 mg产率 84%。 1H NMR(400 MHz, CDC1 ₃ )5 7.07 (s, 1 H), 6.89 (d， 1 H)， 6.74 (d, 1 H)， 4.55-4.57 (m， 2 H)， 2.90-2.80 (m， 3 H)， 2.65 (t， 6 H)， 2.35-2.30 (m， 6 H)， 1.86-1.38 (m， 19 H)， 1.04 (s， 3 H)。

根据与实施例 1相同的方法合成了化合物（12)。 ¹ H NMR(；400 MHz, CDC1 ₃ )5 7.07 (s, 1 H)， 6.94 (s， 6 H)， 6.89 (d， 1 H)， 6.74 (d， 1 H)， 4.55-4.57 (m， 2 H)， 4.40 (m 6H)， 2.90-2.80 (m， 3 H)， 2.35-2.30 (m， 6 H)， 1.86-1.38 (m， 19 H)， 1.04 (s， 3 H)。 实施例 22

根据实施例 2的方法， 用化合物 (12)与 R1制备得到三头核酸单链单元 N9， 对 N9 进行质谱检测， N9的测量值为 26164， 计算的理论分子量为 26160， 说明 N9合成成功。 实施例 23

根据实施例 3的方法，用化合物 (12)与 R2制备得到三头核酸单链单元 N10,对 N10 进行质谱检测， N10的测量值为 24479， 计算的理论分子量为 24478， 说明 N10合成成 功。 实施例 24

根据实施例 4的方法， 利用 N9和 N10制得核酸纳米颗粒 TD-7。 并根据实施例 5 的方法对 TD-7的 RNA干扰活性进行检测， 以 siRNA 867-885为对照组。

测量结果为： 16.7nM的 siRNA 867-885的 R A干扰活性为 84.7%， 而 16.7nM的

TD-7的 RNA干扰活性为 86.2%。 说明 TD-7具有与 siRNA 867-885相当的干扰活性， 同时也说明， TD-7便于 siRNA药物的释放。

根据实施例 6的方法测定 TD-7辅助穿透细胞膜的效果， 以 siRNA 867-885为对照 组。

测量结果为： 在不加转染试剂的情况下， TD-7仍具有 26.5%的干扰活性， 而不加 转染试剂的 siRNA 867-885几乎不具备干扰活性。 这说明 TD-7能够有效辅助小干扰核 酸传递至细胞， 即 TD-7比 siRNA 867-885具有更强的稳定性。 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行 任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。