【발명의 명칭】

생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체， 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오 센서 또는 흡착 장치

【기술분야】

본 발명은 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오 센서 또는 흡착 장치에 관한 것이다. 구체적으로， 본 발명은 생화학물질의 활성을 유지하면서 다량의 생화학물질을 안정적으로 고정시킬 수 있을 뿐만 아니라 제조시간이 단축되고 제조비용이 절감될 수 있는 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오 센서 또는 흡착 장치에 관한 것이다.

【발명의 배경이 되는 기술】

단백질이나 효소와 같은 생화학물질을 고정시키는 기술은 지표물질을 이용해서 질병을 진단하는 키트나 단백질 칩， 바이오센서 (biosensor )의 개발 등에서 광범위하게 이용되고 있으며， 고정시킨 생화학물질을 다시 분리하는 기술은 의약품 산업에서 중요한 위치를 차지하고 있다.

특히， 생화학물질 중 효소는 생체촉매로서 높은 촉매 활성과 선택도를 가지고 있기 때문에 이를 적당한 고체 지지체에 고정시켜 수집한 후 다시 상기 고체 지지체로부터 물뫼적으로나 화학적으로 쉽게 분리하려는 노력이 시도되고 있다.

그러나, 생화학물질이 고체 지지체의 표면에만 고정됨으로써 고정되는 생체분자의 고정량 자체가 적거나， 고체 지지체의 표면에 형성된 다층의 고정용 박막을 통해 생화학물질을 고정시킬 경우， 고정화 과정 중 생화학물질이 변성 및 불활성화되는 문제가 있으며, 생화학물질이 고정된 고체 지지체 자체흩 바이오 센서， 흡착 장치 등으로 사용하는 경우， 상기 고정된 생화학물질과 반웅하는 반웅기질과의 상호작용 및 인식반웅 등을 확인할 수 없다는 등의 단점을 가지고 있다.

종래 상술한 목적으로 생화학물질인 효소나 단백질을 고체표면에 고정시키는 방법으로 아미드결합에 의한 공유결합 방법 (M. Zayats , E. Katz , I . Wi l iner , JACS. , 2002， 124, 14724)， 표면 졸-겔 방법을 이용한 금속산화물과 효소의 복합적증박막 (I . Ichinose, R. Takaki， K. Kuroiwa, T. Kunitake, Langmuir , 2003, 19, 3883) , 삼 (세)차원 세공 구조의 메조포러스 분자체를 이용한 방법 (J .M.Kisler , G.W.Stevens , A.J .O' Connor , Mater .Phys .Mech. 2001, 4， 89) 등을 주로 이용하였다.

그러나， 아미드결합에 의한 공유결합 방식은 공유결합을 통하여 생화학물질을 반웅시켜야 하므로， 공유결합 반웅 중 생화학물질이 활성을 잃을 수 있다는 단점을 안고 있다.

또한, 표면 졸-겔 방법에 의한 적층 박막의 형성은 금속산화물과 생화학물질의 정전기적 상호작용을 이용한 간단한 방법으로 상기 금속산화물의 표면에 균일하게 생화학물질의 고정이 가능하고， 금속산화물과 생화학물질의 교호 적층을 통해서 적층된 다수의 금속산화물 박막에 생화학물질을 다량 고정시킬 수 있지만, 다층의 적층 과정 중 금속산화물에 대한 생화학물질의 흡착과정에서 사용되는 유기용매의 영향으로 고정된 생화학물질의 변성 가능성이 매우 크다는 단점이 있다.

그리고， 삼 (세)차원 세공 구조의 메조포러스 분자체를 이용한 방법은 상기 메조물질에 대한 생화학물질의 흡 /탈착이 가역적으로 진행되지 않기 때문에, 흡착된 생화학물질의 회수 및 재활용의 문제점이 있다.

나아가， 고체 지지체 위에 생화학물질을 안정적으로 다량 고정시키는 방법으로， 생화학물질과 정전기적 상호작용을 하는 전해질 고분자를 이용하여 전해질 고분자와 생화학물질을 교호 적층하는 방법이 이용되고 있지만 (Yuri Lvov _: atsuhiko Ariga, Izumi Ichinose , Toy ok i Kuni take , JACS. 1995, 117, 6117) , 이러한 방법은 생화학물질을 덮고 있는 고분자 층에 의하여 생화학물질이 외부와 차단되어 있기 때문에 생화학물질과 반웅기질의 반웅이 방해 받아 바이오 센서， 흡착 장치 등에 바로 적용할 수 없는 문제점이 있다.

한편， 한국공개특허공보 제 10-2010-0128110 호에는 다량의 생화학물질을 안정적으로 고정시키기 위해 고체 지지체 상에 금속산화물막과 이온성 고분자막이 교호 적층됨으로써 형성된 생화학물질 고정용 나노 복합체가 개시되어 있으나 이러한 나노 복합체는 층분한 함량의 생화학물질을 고정시키기 위해서는 과도하게 다층의 막을 적층시켜야 하고， 이로써 제조시간이 지연되고 제조비용이 증가하는 문제가 있다.

따라서， 생화학물질의 활성을 유지한 채로 충분한 양을 고정시킬 수 있을 뿐만 아니라 제조시간이 단축되고 제조비용이 절감될 수 있는 새로운 생화학물질 고정용 복합체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

【발명의 내용】

【해결하고자 하는 과제】

본 발명은 생화학물질의 활성을 유지한 채로 충분한 양을 고정시킬 수 있는 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체， 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오 센서 또는 홉착 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한， 본 발명은 제조시간이 감축되고 제조비용이 절감될 수 있는 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체， 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오 센서 또는 흡착 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

[과제의 해결 수단]

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은,

고체 지지체; 상기 고체 지지체 위에 형성된 제 1 금속산화물막 및 상기 제 1 금속산화물막 위에 형성된 전해질 고분자막을 포함하고 나노 스케일의 다공질막인 하나 이상의 복합 박막; 및 상기 복합 박막 위에 형성되고 나노 스케일의 다공질막인 제 2 금속산화물막을 포함하고, 상기 전해질 고분자막을 형성하는 고분자의 분자량이 500 이상인, 생화학물질 고정용 나노 복합체를 제공한다.

여기서， 상기 고분자의 분자량이 2,000 이상인 것을 특징으로 하는, 생화학물질 고정용 나노 복합체를 제공한다.

또한， 상기 고체 지지체는 이의 위에 제 1 금속산화물막이 표면 졸-겔 반웅에 의해 형성될 수 있는 것을 특징으로 하는 생화학물질 고정용 나노 복합체를 제공한다.

그리고， 상기 고체 지지체는 이의 표면이 폴라즈마 처리, 오존 처리， 알칼리 또는 산 용액에서의 초음파 처리 및 알칸디올 분자나 카르복실기를 이용한 자기조립박막 형성 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 처리가 수행된 것을 특징으로 하는, 생화학물질 고정용나노복합체를 제공한다.

나아가， 상기 고체 지지체는 이의 표면에 활성수소, 하이드록실기， 카르 복실기， 술폰산기， 인산기， 아민기， 이민기， 암모늄기, 피리딘기 및 전하를 띄는 분자의 작용기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면활성기가 도입된 것을특징으로 하는， 생화학물질 고정용 나노복합체를 제공한다.

또한， 상기 제 1 금속산화물막， 상기 제 2 금속산화물막 또는 이들 모두를 형성하는금속산화물은 티타늄， 지르코늄， 알루미늄， 보론， 실리콘, 인듐, 주석， 바륨 및 바나듐으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 금속의 산화물을 포함하는 것을특징으로 하는， 생화학물질 고정용 나노복합체를 제공한다.

한편， 상기 전해질 고분자막을 형성하는 고분자는 폴리아크릴산， 양이온 또는 음이은 폴리사카라이드, 핵산， 폴리메타아크릴산， 말레산무수물 공중합체， 양이온 아크릴산 에스터， 폴리에틸렌 이민, 폴리아민, 폴리아마이드아민， 폴리다이알릴다이메틸암모니움 클로라이드 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는， 생화학물질 고정용 나노복합체를 제공한다.

그리고， 상기 제 1 금속산화물막, 상기 제 2 금속산화물막， 상기 전해질 고분자막 또는 이들 모두가 단분자막으로 이루어진 것을 특징으로 하는， 생화학물질 고정용 나노복합체를 제공한다.

： 또한， 상기 계 1 금속산화물막과상기 전해질 고분자막의 결합, 상기 전해질 고분자막과 상기 제 2 금속산화물막의 결합， 또는 이들 모두는 정전기적 상호작용에 의한 결합인 것을 특징으로 하는， 생화학물질 고정용 나노 복합체를 제공한다.

한편， 고체 지지체 상에 제 1 금속산화물막을 형성한 후 상기 제 1 금속산화물막 상에 전해질 고분자막을 형성하는 과정을 1 회 이상 반복함으로써 나노 스케일의 다공질막인 하나 이상의 복합 박막을 형성하는 단계; 및 상기 복합 박막의 최상단에 나노 스케일의 다공질막인 제 2 금속산화물막을 형성하는 단계를포함하는， 생화학물질 고정용 나노복합체의 제조방법을 제공한다. 여기서， 상기 제 1 및 제 2 금속산화물막의 형성은 표면 졸-겔 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는， 생화학물질 고정용 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.

한편， 미오글로빈 (Myoglobin) , 리소좀 (Lysozyme) , 페록시다아제 (Peroxidase) , 글로코아밀라아제 (Glucoamylase) , 글로코스옥시다아제 (Gluecose oxidase) , 카탈라아제 (Catalase) 및 시토크롬시 (Cytochrome c , (Cyt . c))로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 생화학물질이 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 생화학물질 고정용 나노 복합체에 고정됨으로써 형성된 바이오 센서를 제공한다.

또한, 미오글로빈 (Myoglobin) , 리소좀 (Lysozyme) , 페록시다아제

(Peroxidase) , 글로코아밀라아제 (Glucoamylase) , 글로코스옥시다아제 (Gluecose oxidase) , 카탈라아제 (Catalase) 및 시토크롬시 (Cytochrome c , (Cyt . c) )로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 생화학물질이 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 생화학물질 고정용 나노 복합체에 고정됨으로써 형성된 흡착 장치를 제공한다.

【발명의 효과]

본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체는 고체 지지체 상에 금속산화물막과 전해질 고분자막의 교호 적층되어 있어 다량의 생화학물질을 안정적으로 고정시킬 수 있는 우수한 효과를 나타낸다.

또한， 본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체는 상기 전해질 고분자막을 형성하는 고분자의 분자량 조절에 의해 상기 전해질 고분자막 내부에도 생화학물질이 고정되도록 함으로써 종래 생화학물질 고정용 나노 복합체의 박막 대비 크게 감축된 두께의 박막으로도 층분한 양의 생화학물질을 고정시킬 수 있어 제조시간이 감축되고 제조비용이 절감될 수 있는 우수한 효과를 나타낸다.

[도면의 간단한 설명]

도 1 은 본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체의 제조방법을 개략적으로 도시한 것이다. 도 2 는 TK0-¾u) ₄ 와 PAA _X 의 순차적 결합에 따른 QCM 의 진동수 변화를 나타낸 것이다.

도 3 은 Cyt.c 를 결합한 (Ti0 ₂ /PAA ₂ ) _3.5 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 4 는 Cyt.c 를 결합한 (Ti0 ₂ /PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 5 는 Cyt.c 를 결합한 (Ti0 ₂ /PAA45o) ₃ . ₅ 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 6 는 Cyt.c 를 결합한 (Ti0 ₂ ) ₄ 금속산화물다층박막 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 7 는 Cyt.c 를 결합한 (Ti0 ₂ ) ₇ 금속산화물다층박막 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 8 은 금속산화물 다층박막과 (Ti0 ₂ /PAA _x ) ₃ . ₅ 복합 박막을 포함하는 나노 복합체의 PM분자량에 따른 Cyt.c결합 진동수 변화를 비교하여 나타낸 것이다. 도 9 는 Zr(0- ⁿ Pr) ₄ 와 PAA ₂₅ 의 순차적 결합에 따른 QCM 의 진동수 변화와

Cyt.c 를 결합한 (Zr0 ₂ /PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 10은 PDDA와 PAA ₂₅ 의 순차적 결합에 따른 QCM의 진동수 변화와 Cyt.c를 결합한 (PDDA/PAA ₂₅ )3.5 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 11은 PEI 와 PAA ₂₅ 의 순차적 결합에 따른 QCM의 진동수 변화와 Cyt.c를 결합한 (PEI/PM ₂₅ )3. ₅ 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 12는 PAH와 PAA ₂₅ 의 순차적 결합에 따론 QCM의 진동수 변화와 Cyt.c를 결합한 (ΡΑΗ/ΡΜ ₂₅ )3. ₅ 나노 복합체 형성 단계에 따른 진동수의 변화를 나타낸 것이다.

도 13 은 Ti(0- ⁿ Bu) ₄ 와 PAA ₂ 의 순차적 결합 및 Cyt.c 의 결합에 따른 (Ti0 ₂ /PM ₂ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 UV-vis spectrometer 변화를 나타낸 것이다. 도 14 는 Ti(0— ⁿ Bu) ₄ 와 PAA ₂₅ 의 순차적 결합 및 Cyt.c 의 결합에 따른 (Ti() ₂ /PAA ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 UV-vis spectrometer 변화를 나타낸 것이다.

도 15 는 TK0- ⁿ Bu) ₄ 와 PM450 의 순차적 결합 및 Cyt.c 의 결합에 따른 (ΤΚνΡΑΑ4 ₅₀ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 UV-vis spectrometer 변화를 나타낸 것이다.

도 16은 Cyt.c를 결합한 (Ti0 ₂ ) ₃ 금속산화물다층박막 형성 단계에 따른 UV- vis spectrometer 변화를 나타낸 것이다.

도 17은 Cyt.c를 결합한 (Ti0 ₂ ) ₆ 금속산화물다층박막 형성 단계에 따른 UV- vis spectrometer 변화를 나타낸 것이다.

도 18 은 금속산화물 다층박막과 (Ti0 ₂ /PAA _X ) ₃ . ₅ 복합 박막을 포함하는 나노 복합체의 PAA 분자량에 따른 Cyt.c 결합에 의한 409nm 에서의 흡광도 변화를 여 나타낸 것이다.

도 19 는 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노 복합 박막으로부터 Cyt.c 의 탈착에 의한 UV-vis spectrometer 변화를 나타낸 것이다.

도 20 은 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PAA _X ) ₃ . ₅ 나노 복합 박막으로부터 Cyt.c 의 탈착에 의한 409nm에서의 흡광도 변화를 나타낸 것이다.

도 21 은 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PM _x ) ₃ . ₅ 나노 복합 박막으로부터 Cyt.c 의 탈착에 의한 409nm에서의 흡광도 변화에 대한 재연성을 나타낸 것이다.

도 22는 Cyt.c 가결합된 금속산화물 다층박막과 (Ti0 ₂ /PM _x ) ₃ . ₅ 복합 박막을 포함하는 나노복합체의 전기 화학적 특성의 차이를 나타낸 것이다.

도 23 은 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PM _x ) ₃ . ₅ 복합 박막의 전기 화학적 특성의 차이를 나타낸 것이다.

도 24 는 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PM _x ) _3.5 복합 박막의 전류적정법 (Amperometric titration)에 의한차이를 나타낸 것이다.

도 25 는 (Ti0 ₂ ) ₃ 금속산화물다층박막의 AFM사진과 root— mean-sequare(RMS) roughness를보여준다.

도 26 은 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ ) ₃ 금속산화물다층박막의 AFM 사진과 root- mean— sequare(RMS) roughness를 보여준다.

도 27 은 (Ti0 ₂ /PM ₄₅₀ ) ₃ . ₅ 복합 박막의 AFM 사진과 root— mean-sequare(RMS) roughness를보여준다 . 도 28 은 Cyt . c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PAA4 ₅₀ ) ₃ . ₅ 복합 박막의 AFM 사진과 root- mean-sequare(RMS) roughness를 보여준다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하, 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 ᅳ설명하기로 한다. 그러나， 본 발명은 여기서 설명된 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록， 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 층분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공 되어지는 것이다.

본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체는 고체 지지처 L 상기 고체 지지체 상에 형성되고 제 1 금속산화물막 및 상기 제 1 금속산화물막 위에 적층된 전해질 고분자막으로 이루어진 하나 이상의 복합 박막， 및 상기 하나 이상의 복합 박막 위에 형성된 제 2금속산화물막을 포함할수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고체 지지체는 통상적인 비금속 기판 또는 금속 기판 등을 별다른 제한 없이 사용할 수 있는데, 예를 들어， 비금속류인 석영, 유리， 실리콘, 테프론 등의 기판을 사용할 수 있고, 금속류인 금， 은， 구리， 알루미늄， 쌕금 등의 기판을 사용할 수 있으며， 나아가 각종 금속이 고겋된 수정결정미소저울 (Quartz crystal mi croba lance , QCM) , 금이 증착된 실리콘 기판 _: 전도성 물질이 코팅된 기판또는 금판 등을 사용할 수도 있다. _:

그리고， 폴리카보네이트 (PC) , 폴리에틸렌테레프탈레이트 (PET) , 아크릴과 같은 고분자 지지체나 금， 은， 백금 등을 증착한 고체 지지체도 사용할 수 있으며, 천연 셀를로스인 종이， 솜， 비단 등도 고체 지지체로 사용 가능하다. 이와에도， 생화학물질의 고정용 나노 복합체에서 사용 가능한 것으로 알려진 다양한 고체 지지체를 별다른 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 고체 지지체는 제 1 금속산화물막의 금속산화물과 정전기적 상호작용 및 /또는 화학적 결합을 통해 상기 제 1 금속산화물과 더욱 안정적으로 결합할 수 있다. 상기 고체 지지체가 상기 제 1 금속산화물막의 금속산화물과 정전기적 상호작용 및 /또는 화학적 결합을 하도록 하는 수단은 특별히 제한되지 않고， 예를 들어， 상기 고체 지지체 상에 표면활성기를 도입할 수 있다. 상기 표면활성기는 활성을 갖는 작용기로서 상기 제 1 금속산화물막의 금속산화물과 결합할 수 있다면 특별히 제한되지 않고， 예를 들어， 활성수소， 하이드록실기, 카르복실기， 술폰산기， 인산기， 아민기, 이민기， 암모늄기， 피리딘기 또는 기타 전하를 띄는 분자의 작용기 등으로부터 선택될 수 있다. 또한， 상기 표면활성기는 상기 고체 지지체 표면에 화학적 /물리적 처리를 통하여 도입될 수 있고， 예를 들어， 상기 고체 지지체는 풀라즈마 처리, 오존 처리， 알카리 또는 산 용액에서의 초음파 처리， 알칸티을 분자나 카르복실기 등을 이용한 자기조립박막 형성의 방법 등을 통해 도입될 수 있다.

본 발명에 있어서， 상기 하나 이상의 복합 박막을 구성하는 제 1 금속산화물막 및 /또는 상기 제 2 금속산화물막은 생화학물질과 결합하여 상기 생화학물질을 고정시키는 기능을 수행한다. 한편， 상기 하나 이상의 복합 박막을 구성하고 상기 제 1 금속산화물막 위에 적층되는 전해질 고분자막은 정전기적 인력, 수소결합， 공유결합 또는 금속산화물과의 착체형성 등을 통해 이의 상부 및 하부에 각각 적층된 상기 계 1 금속산화물막 및 이의 하부에 적충된 상기 제 1 금속산화물막과 이의 상부에 적층된 상기 제 2 금속산화물막을 연결시켜 줄 수 있어서， 상기 나노 복합체가 안정한 구조를 가질 수 있게 한다.

상기 전해질 고분자막은 금속산화물막과 정전기적 상호작용에 의하여 결합되거나， 활성 작용기를 매개로 착체를 형성하여 결합될 수 있다. 상기 금속산화물막은 부분적으로 (-)전하를 갖기 때문에 (+)전하를 갖는 양전하 고분자 전해질 (cat ioni c polyelectrolytes)과 정전기적 상호작용에 의하여 결합할 수 있다. 그리고， 이러한 정전기적 상호작용에 의한 결합 이외에도， 활성수소, 하이드록실기, 카르복실기， 술폰산기， 인산기， 아민기， 이민기， 암모늄기， 피리딘기 또는 기타 전하를 띄는 분자의 작용기 등의 활성작용기를 가지는 천연 또는 합성 고분자와 금속산화물 사이의 착체 형성을 통하여서도 결합할 수 있다.

그리고， 상기 제 1 및 제 2 금속산화물막 및 상기 전해질 고분자막은 나노 스케일의 다공질막으로서 안정한 다층 박막으로 형성될 수 있고， 고정되어야 하는 생화학물질이 본 발명에 따른 나노 복합체의 표면뿐만 아니라 다공질막으로 형성된 상기 제 1 및 제 2 금속산화물막 및 상기 전해질 고분자막의 내부에 존재하는 나노 스케일의 수많은 미세공을 통해 전체 적층막의 내부， 즉 하부에 배치된 금속산화물막에까지 이동하여 고정됨으로써 본 발명에 따른 나노 복합체는 다량의 생화학물질을 고정시킬 수 있는 우수한 효과를 나타낸다.

상기 제 1 및 제 2 금속산화물막， 그리고 상기 전해질 고분자막은 금속산화물 또는 전해질 고분자의 단분자막으로 이루어질 수 있다. 상기 단분자막은 금속산화물 분자 또는 전해질 고분자의 고유한 결합 특성과 활성이 유지되며, 단분자막에서 분자간의 간격과 배향을 적절히 조절할 수 있기 때문에 바이오 센서， 분자소자 등의 제조에 유용하다.

상기 제 1 및 제 2 금속산화물막은 되타늄， 지르코늄, 알루미늄， 보론， 실리콘, 인듐， 주석, 바륨 및 바나듐으로 이루어진 군에서 선택된 금속의 산화물 또는 2 종 이상의 복합 금속 산화물을 포함할 수 있다. 이러한 제 1 및 제 2 금속산화물막은 고체 지지체， 전해질 고분자막 및 생화학물질과 정전기적 결합을 할 수 있다.

상기 전해질 고분자막은 폴리아크릴산과 이의 유도체， 양이온 및 음이온 폴리사카라이드와 이의 유도체, 핵산， 폴리메타아크릴산과 이의 유도체， 말레산 무수물 공중합체， 양이온 아크릴산 에스터와 이의 공중합체, 폴리에틸렌 이민， 폴리아민， 폴리아마이드아민 및 폴리다이알릴다이메틸암모니움 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이외에도 상기 전해질 고분자막은 금속산화물과 상흐작용이 가능한 다양한 고분자 등을 포함할 수 있다.

특히， 본 발명자들은 상기 전해질 고분자막을 형성하는 고분자의 분자량이 약 500 이상， 바람직하게는 약 2 , 000 이상인 경우 상기 전해질 고분자막은 이의 상부 및 하부에 적층되는 상기 금속산화물막을 연결시키는 기능뿐만 아니라 상기 금속산화물막과 같이 이의 내부에 생화학물질을 고정시킬 수 있는 한편， 상기 고분자의 분자량이 약 450 ,000 인 경우 고정되는 생화학물질의 함량이 최대가 됨을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은， 상기 전해질 고분자막이 이의 내부에 생화학물질을 고정시킬 수 있는 것은 상기 전해질 고분자막 역시 이의 내부에 양이온 효소 등의 생화학물질과 결합하여 이를 고정시킬 수 있는 (-)전하를 포함하고 있고, 상기 전해질 고분자막을 형성하는 고분자의 분자량이 증가할수록 상기 고분자 사슬 사이에 생화학물질을 수용할 수 있는 공간이 더 많이 형성되고， 형성되는 공간은 고분자의 분자량이 약 450 , 000 일 때 최대로 형성되기 때문이라고 추측하고 있다. 따라서， 본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체는 상기 전해질 고분자막을 형성하는 고분자의 분자량을 조절함으로써 상기 금속산화물막 뿐만 아니라 상기 전해질 고분자막도 이의 내부에 상기 생화학물질을 고정시킬 수 있어， 동일한 함량의 생화학물질을 고정시키는 것을 전제로 종래 생화학물질 고정용 복합체에 비해 적층되는 박막의 개수를 크게 줄일 수 있기 때문에 상기 나노 복합체의 제조시간을 단축시키고 제조비용을 절감할 수 있는 우수한 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체는 제 1 및 제 2 금속산화물막을 적층하기 위해 유기 용매를 이용하여 상기 금속산화물막 사이에 생화학물질을 적층시킬 필요가 없기 때문에 상기 유기 용매에 의한 생화학물질의 활성이 감소되는 것을 억제하여 안정적으로 상기 생화학물질을 고정시킬 수 있는 우수한 효과를 나타낸다.

본 발명은 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체의 제조 방법에 관한 것이다. 도 1 은 본 발명에 따른 생화학물질 고정용 유기 /무기 나노 복합체의 제조방법을 개략적으로 도시한 것이다.

도 1 에 도시된 바와 같이， 본 발명에 따^나노 복합체의 제조 방법은 고체 지지체 상에 제 1 금속산화물막을 형성한 후 상기 제 1 금속산화물막 상에 전해질 고분자막을 형성하는 과정을 1 회 이상 반복함으로써 하나 이상의 복합 박막을 형성하는 단계， 및 상기 복합 박막의 최상단에 제 2 금속산화물막을 형성하는 단계를 포함할수 있다.

구체적으로， 상기 고체 지지체를 금속산화물 전구체 용액 내에서 표면 졸-겔 방법 등을 통하여 제 1 금속산화물막을 형성 시킨 후， 물리적으로 과량 흡착한 금속산화물을 용매로 제거하고， 증류수를 이용하여 가수분해 시키면, 고체 지지체 위에 활성을 갖는 제 1 금속산화물막이 형성될 수 있다. 그 후 상기 제조된 제 1 금속산화물막을 고분자 전해질 용액에서 반웅시켜 전해질 고분자막 및 금속산화물막을 포함하는 복합 박막을 형성할 수 있다. 상기 형성된 복합 박막을 금속산화물 전구체 용액 내에서 표면 졸-겔 방법 등을 통하여 반옹시켜서 금속산화물막을 형성한 후， 과량의 물리적으로 홉착한 금속산화물을 용매로 제거하고 증류수를 이용하여 가수분해 시키면 제 2금속산화물층이 형성된다. 본 발명의 하나의 실시예에 따른 생화학물질 고정용 나노 복합체 제조방법은 상기 제 1 금속 산화물막의 형성 단계 전에, 상기 고체 지지체 표면에 플라즈마 처리， 오존 처리, 알카리 또는 산 용액에서 초음파 처리 또는 자기조립박막의 형성 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계를 통해서 상기 고체 지지체에 활성수소, 하이드록실기， 카르복실기， 술폰산기， 인산기, 아민기， 이민기, 암모늄기， 피리딘기 또는 기타 전하를 띄는 분자의 작용기 등의 표면 활성기를 도입할 수 있다.

상기 고체 지지체가 비 금속류인 경우는 초음파 세척 후 플라즈마 처리， 오존 처리 등을 하거나 알칼리 또는 산 용액에서 초음파 처리를 하여 활성을 갖는 분자를 도입할 수 있다. 그리고， 상기 고체 지지체가 금속류인 경우는 표면 세척 후 산성 용액으로 표면에 존재하는 불순물을 제거한 후， 한쪽 말단이 수식된 알칸티을 (alkanethiol ) 분자나 카르복실기 등을 포함하는 용액에 침지시켜 자기조립박막 (sel f-assembled monolayer , SAM)을 형성함으로써 표면 활성을 도입할수 있다.

또한， 상기 제 1 또는 제 2 금속산화물을 형성하는 단계는 고체 지지체나 전해질 고분자막이 형성된 결과물을 금속산화물 전구체 용액 내에서 표면 졸-겔 반웅을 시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 표면 졸-겔 반웅을 시키는 단계에서는 상기 고체 지지체나 전해질 고분자막이 형성된 결과물을 금속산화물 전구체가 용해된 용액 내에서 반웅시킨 후， 에탄올 등의 적절한 용매로 과량의 물리적 흡착분을 제거하고 증류수 내에서 가수분해한 뒤 질소 가스로 건조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 제 1 및 제 2금속산화물막의 형성을 위한 전구체로는 Τί (0- ^ι1) ₄ ' ^Zr( °- ^/2Pr) 4'

AKO-flBu) , B(O-nEt ) , Ti (acac) , Si (OMe) , In(0C Η OMe) ， Sn(O-iPr) , InSn(OR) , BaTi (OR) 또는 VO(O-iPr ) 3 3 2 4 2 4 3 4 4 4 4 등의 금속알콕사이드를 사용할 수 있다. 다만， 상기 예 이외에도 생화학물질 또는 고체 지지체의 활성기와 정전기적 결합을 형성할 수 있고， 금속산화물의 형성을 가능케 하는 다양한 물질을 상기 금속산화물 전구체로 사용할 수 있다. 또한， 상기 제 1 금속산화물막 상에 전해질 고분자막을 형성하는 단계는 상기 금속산화물막이 형성된 결과물을 고분자 전해질 용액에서 반웅시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제 1 금속산화물막이 형성된 결과물을 상온에서 전해질 고분자가 녹아 있는 고분자 전해질 용액에서 반응시킨 후， 표면에 불안정하게 흡착되어 있는 고분자를 증류수 등의 적절한 용매로 세척하고 질소가스를 이용하여 건조시키면 제 1 금속산화물 상에 전해질 고분자막이 형성될 수 있다.

상기 고분자 전해질은 폴리아크릴산과 이의 유도체, 양이온 및 음이온 폴리사카라이드와 폴리사카라이드 유도체， 핵산， 폴리메타아크릴산과 이의 유도체， 말레산 무수물 공중합체, 양이은 아크릴산 에스터와 이의 공중합체, 폴리에틸렌 이민， 폴리아민， 폴리아마이드아민 및 폴리다이알릴아다이메틸암모니움 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이외에도 상기 전해질 고분자는 금속산화물과 상호작용이 가능한 다양한 고분자 등을 포함할 수 있다.

또한， 상기 생화학물질 고정용 나노 복합체를 이용해 생화학물질을 고정시킨 후 고정된 생화학물질을 용이하게 다시 탈착시킬 수 있고， 상기 생화학물질이 고정된 나노 복합체를 암모니아 용액 내에서 5 내지 50 ^° C , 바람직하게는 20 내지 45'C에서， 1 내지 60 분 동안， 바람직하게는 10 내지 20 분 동안 반웅시켜 탈착시킬 수 있다. 그리고， 상기 생화학물질이 탈착된 상기 나노 복합체를 다시 생화학물질이 용해되어 있는 완층 용액 내에서 다시 반웅시킬 수 있다.

본 발명은 앞서 기술한 생화학물질 고정용 나노 복합체를 포함하는 바이오 센서 또는 흡착 장치에 관한 것이다. 상기 바이오 센서 또는 흡착 장치는 앞서 기술한 본 발명에 따른 생화학물질 고정용 나노 복합체를 생화학물질과 반웅시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 생화학물질 고정용 나노 복합체는 앞서 기술한 바와 같이 복수의 나노 스케일 다공질막으로 이루어져 있기 때문에 최외곽의 제 2 금속산화물막 뿐만 아니라 나노 복합체의 내부인 제 1 금속산화물막과 전해질 고분자막에도 생화학물질이 결합되어 고정될 수 있다. 이렇게 제조된 바이오 센서 또는 흡착 장치는 상기 생화학물질과 반웅하여 결합하는 물질을 검출 또는 흡착할 수 있게 된다.

상기 생화학물질은 단백질， 효소， 항원, 항체， 리셉터 및 리간드 등이 있고， 보다 구체적으로 전형적인 생화학물질인 미오글로빈 (Myoglobin) , 리소좀 (Lysozyme) , 페록시다아제 _: (Peroxi dase) , 글로코아밀라아제 (Glucoamyl ase)， 글로코스옥시다아제 (Gluecose oxi dase) , 카탈라아제 (Catal ase) 또는 시토크롬 씨 (Cytochrome c, (Cyt . c) ) 등이 있다. 이외에도 다양한 생화학물질들이 상기 나노 복합체에 고정될 수 있다.

구체적으로， 상기 생화학물질을 상기 나노 복합체와 고정시키는 단계는 상기 나노 복합체를 상기 생화학물질이 용해되어 있는 완층 용액 내에서 5 내지 50 ^° C , 바람직하게는 20 내지 45 ^° C에서， 1 내지 60분 동안, 바람직하게는 20내지 40분 동안 서로 반웅시킴으로써 수행될 수 있다. 대부분의 생화학물질은 35 내지 45 ^° C에서 활성이 가장 크게 나타나고， 너무 고은이거나 저은인 경우 활성이 떨어지게 된다. 또한， 상기 완충 용액은 pH 2 내지 10 의 범위 내일 수 있다. 일반적으로 생화학물질은 pH 에 크게 영향을 받게 되기 때문에 완층 용액을 사용하면 생화학물질을 결합하는 단계에서 활성이 유지될 수 있으나, 너무 산성 또는 알카리성 조건에서는 완층 용액으로서 역할을 할 수 없다.

[실시예 : 생화학물질 고정용 나노 복합체의 제조]

<실시예 1 QCM을 고체 지지체로 한 나노 복합체 >

금이 증착된 수정결정 미소저울 (QCM)을 피라하 용액 (pi raha solut ion ： 96% 황산 /30-35.5% 과산화수소， 3/1， v/v)으로 세척 후， 10mM 의 2-머캡토에탄올 (2— mercaptoethanol )/에탄올 용액 내에서 12 시간 동안 반웅시켜 자기조립박막을 제작하고， 이를 고체 지지체로 사용하였다. 이러한 고체 지지체를 티탄부톡사이드 (Ti tani um ( IV)-n-but oxi de ; (Ti (0-nBu)4)/ Acros Chem 사 제품 (미국) )가 lOOmM 의 농도로 용해된 에탄올 /를루엔 ( 1/1， v/v) 용액 내에서 3 분간 반웅시켰다. 그 후， 그 결과물에 과량으로 물리적 흡착한 금속산화물을 에탄올 용액을 이용하여 제거하고， 증류수 내에서 1 분간 가수분해 시켰다. 그리고， 질소 가스로 건조하여 고체 지지체 위에 제 1금속산화물막을 도입하였다. 상기 제 1 금속산화물막이 형성된 결과물을 분자량이 각각 2000(PAA2) , 25000(ΡΑΑ25) , 그리고 450,000(ΡΑΑ450)인 폴리아크릴액시드 (Poly(acryl ic acid) PAA)가 lwt %의 농도로 용해된 증류수 용액에 30 분간 반웅시키고， 표면의 물리적 흡착분을 30 초씩 2 번 증류수로 세척하여 제거하였다. 그 결과물을 질소가스를 이용하여 건조하여 전해질 고분자막 (P 막)을 도입하였다.

상기의 제 1 금속산화물막과 전해질 고분자막 (PM 막)을 형성하는 과정을 1 사이클로 하여 , 분자량이 다른 전해질 고분자막을 형성시킴으로서 본 발명의 생화학물질 고정용 나노 복합 박막의 효소 고정화량을 조절할 수 있었다. 제

1금속산화물막과 전해질 고분자막을 형성하는 과정을 1회 이상 반복하고 난 후， 상기의 제 1 금속산화물막 제조 방법과 동일한 방법을 통하여 제조된 결과물에 제 2금속산화막을 형성하였다.

이때， (Ti02/PMx)N.5 나노 복합체는 제 1 금속산화물막과 X 분자량의 다른 PAA 를 포함하는복합 박막이 N 개 형성되고, 표면에 제 2 금속산화물막을 형성하여 제조된 것을 의미한다.

또한, 동일 조건에서 금속산화물 전구체로 지르코늄프록시사이드 (Zrconium(IV)-nᅳ propoxide ; (Zr(0-nPr)4)/ Aldri ch 사 제품 (미국) )와 PAA25 을 이용하여 고체 지지체 위에 (Zr02/PAA25) .3.5 나노 복합체를 형성하였다.

<실시예 2 ： 효소가 결합된 나노 복합체 >

실시예 1 의 방법으로 제조된 생화학물질 고정용 나노 복합체를 효소인 사이토크롬 씨 (Cyt . c)가 용해된 인산완층용액 (pH 7) 내에서 30 분간 실온에서 반웅 시켰다. 그 후， 불안정하게 고정화된 과량의 효소 흡착 분을 증류수를 이용하여 제거하고 질소가스로 건조시켜 효소가 결합된 나노 복합체를 제조 하였다.

<실시예 3 ： 석영판을 고체 지지체로 한 나노 복합체 >

석영판을 황산 (¾S0 ₄ 96.0%)으로 세척한 후, K0H용액으로 초음파 처리하여 석영판표면에 활성기를 도입하여 고체 지지체로 사용하였다. 상기 고체

지지체를 실시예 1에서와동일한 방법으로 금속산화물막과 PAA 막을 제조하여， Ti0 ₂ /PAA복합 박막을 포함하는 나노 복합체를 제조하였다. 제조된 나노 복합체에 실시예 2의 방법으로 효소를 결합시켰다.

[비교예 : 다층박막의 제조]

<비교예 1 ： 금속산화물 다층박막의 제조 >

PM막을 형성시키는 과정을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로

금속산화물막을 제조하여 , Ti0 ₂ 의 금속산화물막만을 포함하는 금속산화물 다층박막을 제조하였다. 이렇게 제조한 금속산화물 다층박막에 실시예 2의 방법으로 Cyt . c를 결합하였다.

<비교예 2 ： 전해질 고분자 다층박막의 제조 >

고체 지지체를 고분자 전해질인 폴리다이알릴다이메틸암모니움

클로라이드 (poiydial lyldimethyl ammonium chloride, PDDA) ,

폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI ) , 또는 폴리아릴아민하이드로

클로라이드 (Polyal lylamine hydrochloride, PAH)가 lwt %의 농도로 용해된 증류수 용액에 30분간 반웅시키고， 표면의 물리적 흡착분을 30초씩 2번

증류수로 세척하여 제거하였다. 그 결과물을 질소가스를 이용하여 건조하여 PDDA, PEI 또는 PAH의 전해질 고분자막을 도입하였다. 상기 제 1 전해질 고분자막이 형성된 결과물에 실시예 1과 동일한 방법으로 PM막을 도입하여 전해질 고분자 다충박막을 제조하였다. 이렇게 제조한 전해질 고분자 다충박막에 실시예 2의 방법으로 Cyt . c를 결합하였다.

[실험예]

<실험예 1 ： QCM의 진동수 변화측정>

QCM의 진동수를 측정하여 생화학물질 고정용 나노 복합체의 제조 과정에서 각각의 막이 형성되는 모습을 확인하였다.

1. 실험예 1-1

실시예 1의 나노 복합체 제조과정에서， 제 1금속산화물 형성 과정 직전과 직후, 전해질 고분자막 형성 과정 직후에 QCM의 진동수를 측정하여， 각각의 막이 형성될 때의 평균진동수 변화를 구하였다.

도 2에서는 Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 와 다양한 분자량의 PAA _X 의 순차적 형성에 의한

QCM의 진동수 변화를 나타내었다. PAA ₂ 나노복합 박막의 경우， Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 결합에 의한 1 사이클의 평균 진동수 변화 AF= 21±4 Hz이었고, PM ₂ 의 결합에 의한 1 사이클의 평균 진동수 변화 AF= 20土 3 Hz 이었다. PAA ₂₅ 나노복합 박막의 경우， Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 결합에 의한 1 사이클의 평균 진동수 변화 AF= 29±8 Hz이었고, PM ₂₅ 의 결합에 의한 1 사이클의 평균 진동수 변화 ΔΡ= 26士9 Hz 이었다. P/ so 나노복합 박막의 경우, TK으 ¹¹ Bu) ₄ 결합에 의한 1사이클의 평균 진동수 변화

AF= 34土 10 Hz이었고， ? ₄₅₀ 의 결합에 의한 1 사이클의 평균 진동수 변화 ᅀ = 36±10 Hz 이었다. 상기 결과는 USI system사 (일본)에서 제작된 수정 결정 미소저을 (QCM)과 Hewlett Packard사 (미국)의 진동수측정기를 이용하였으며， Ti0 ₂ /PAA _x 복합 박막 제조과정을 1사이클로 하여 10사이클의 평균 진동수 변화를 나타내었다. 수정결정 미소저을 (QCM)은 나노그램 정도의 극미량의 물질이 흡착하여도 그 질량에 비례하여 공명 진동수가 변화하므로， 상기의 결과로 보아 고체 지지체 상에 분자수준의 두께로 복합 박막이 균일하게 형성되었음을 확인할 수 있다.

2. 실험예 1-2

실시예 2에서 제작한 효소가 결합된 나노 복합체의 형성 과정을 QCM 진동수 변화를 이용하여 확인하였다. QCM의 진동수는 실험예 1-1에서와 같은 방법으로 측정하였다.

도 3에는 Cyt.c가 결합한 (Ti0 ₂ /PM ₂ ) ₃ . ₅ 나노 복합체의 진동수 변화를 나타내었다. (Ti0 ₂ /PM ₂ ) ₃ . ₅ 복합 박막의 결합된 Cyt.c의 진동수 변화는 AF= 271±22 Hz였다. 도 4에는 Cyt.c가 결합한 (Ti0 ₂ /PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노 복합체의 진동수 변화를 나타내었다. (Ti0 ₂ /PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 복합 박막의 결합된 Cyt.c의 진동수 변화는 AF= 480土 42 Hz였다. 도 5에는 Cyt.c가 결합한 (Ti0 ₂ /PAA4 ₅₀ ) ₃ . ₅ 나노 복합체의 진동수 변화를 나타내었다. (Ti0 ₂ /PAA45o) ₃ .5복합 박막와 결합된 Cyt.c의 진동수 변화는 AF= 735±100 Hz였다. 도 3, 4와 5에서 보여지듯이， 수정결정

미소저을 (QCM)의 진동수 변화를 통하여 금속산화물막과 PAA _X 막이 균일하고 안정적으로 형성되어 가는 것을 확인할 수 있었다. 또한， Cyt.c의 결합에 의한 진동수 변화로 미루어 나노 복합체에 효소분자가 안정하게 결합된 것을 확인할 수 있었다.

3. 실험예 1-3 비교예 1에서 제작된 금속산화물 다층박막의 형성 과정 및 Cyt . c의 결합을 QCM진흥수 변화를 이용하여 확인하였다. QCM의 진동수는 실험예 1-1에서와 같은 방법으로 측정하였다. 도 6에는 Cyt . c가 결합한 (Ti0 ₂ ) ₄ 금속산화물 다층박막의 진동수 변화를 나타내었다. Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 결합에 의한 평균 진동수 변화는 AF= 13士 2 Hz이었고, 결합된 Cyt . c의 진동수 변화는 AF= 144士18 Hz였다. 도 7에는 Cyt . c가 결합한 (Ti0 ₂ ) ₇ 금속산화물 다층박막의 진동수 변화를 나타내었다. Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 결합에 의한 평균 진동수 변화는 AF= 13士3 Hz이었고， 결합된 Cyt . c의 진동수 변화는 AF= 148± 13 Hz였다. 도 6와 7에서 보여지듯이 수정결정 미소저울 (QCM)의 진동수 변화를 통하여 금속산화물다층 막이 균일하고 안정적으로 형성되어 가는 것을 확인할 수 있었다. 또한， 금속산화물 다층막의 사이클수 (두께)에 상관없이 Cyt . c의 결합에 의한 진동수 변화가 거의 비슷한 것으로 미루어 효소분자가금속산화물 다층막의 표면에만 결합된 것을 확인할수 있었다.

도 8에는 비교예 1의 금속산화물 다층박막과 실시예 1의 나노 복합체에 Cyt . c를 결합함에 따른 진동수 변화의 차이를 나타내었다. 실시예 1의 나노 복합체는 PAA의 분자량이 증가함에 따라 결합되는 효소의 양도 포화곡선을 그리며 증가함을확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 실시예 1의 나노 복합체는 비교예 1의 금속산화물 다층박막과 달리 효소가 전해질 고분자막 내부에까지 이동하여 결합되고 있음을 보여주며， PAA의 분자량이 증가할수록 나노 복합체 박막 내부에 효소가 결합할 수 있는 다공질 공간 (구멍 , 세공)이 더 많이 생성되어 있음을 보여주는 것이다.

4. 실험예 1—4

실시예 1의 나노 복합체 제조과정에서， 제 1금속산화물 형성 과정 직전과 직후， 전해질 고분자막 형성 과정 직후에 QCM의 진동수를 측정하여， 각각의 막이 형성될 때의 평균진동수 변화를 구하였다.

도 9에서는 Zr(0- ⁿ Pr) ₄ 와 PAA ₂₅ 의 순차적 형성에 의한 QCM의 진동수 변화를 나타내었다. Zr(0- ⁿ Pr) ₄ 결합에 의한 1 사이클의 평균 진동수 변화 \F= 39士 9

Hz이었고, PAA ₂₅ 의 결합에 의한 1사이클의 평균 진동수 변화 AF= 42士 10 Hz 이었다. (Zr0 ₂ /PAA ₂₅ )3.5 복합 박막의 결합된 Cyt . c의 진동수 변화는 F= 594±72 Hz였다. 도 9에서 보여지듯이， 수정결정 미소저울 (QCM)의 진동수 변화를 통하여 수정결정 미소저울 (QCM)의 진동수 변화를 통하여

지르코늄산화물막과 PAA ₂₅ 막이 균일하고 안정적으로 형성되어 가는 것을 확인할 수 있었고， Cyt.c의 결합에 의한 진동수 변화로 미루어 나노 복합체에

효소분자가 표면 뿐만 아니라 내부에도 안정하게 결합된 것을 확인할 수 있었다.

5. 실험예 1-5

비교예 2에서 제작된 전해질 고분자 다층박막의 형성 과정 및 Cyt.c의 결합을 QCM진동수 변화를 이용하여 확인하였다. QCM의 진동수는 실험예 1- 1에서와 같은 방법으로 측정하였다. 도 10에는 Cyt.c가 결합한 (PDDA/PM ₂₅ )3. ₅ 전해질 고분자 다층박막의 진동수 변화를 나타내었다. PDDA결합에 의한 평균 진동수 변화는 ΔΙ= 39土 12 Hz이었고， PM ₂₅ 의 결합에 의한 평균 진동수 변화 AF= 28±16Ήζ 이었다. (PDDA/PAA ₂₅ ) ₃ . ₅ 전해질 고분자 다층박막에 결합된

Cyt.c의 진동수 변화는 Δί= 13±8 Hz였다. 도 11에는 Cyt.c가 결합한

(PEI/PAA ₂₅ ) ₃ .5 전해질 고분자 다층박막의 진동수 변화를 나타내었다. PEI결합에 의한 평균 진동수 변화는 ΔΙ^ 31±10 Hz이었고, PM ₂₅ 의 결합에 의한 평균 진동수 변화 AF= 28±27 Hz 이었다. (PDDA/PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 전해질 고분자 다층박막에 결합된 Cyt.c의 진동수 변화는 ᅀ F- 12±7 Hz였다.

도 12에는 Cyt.c가 결합한 (ΡΑΗ/ΡΜ ₂₅ )3. ₅ 전해질 고분자 다층박막의 진동수 변화를 나타내었다. PAH결합에 의한 평균 진동수 변화는 AF= 25土 6 Hz이었고，

PM ₂₅ 의 결합에 의한 평균 진동수 변화 AF= 28士 9 Hz 이었다. (PAH/PAA ₂₅ ) ₃ . ₅ 전해질 고분자 다층박막에 결합된 Cyt.c의 진동수 변화는 AF= 40±18Hz였다. 도 10， 11와 12에서 보여지듯이， 수정결정 미소저을 (QCM)의 진동수 변화를 통하여 수정결정 미소저울 (QCM)의 진동수 변화를 통하여 전해질 고분자와

PM ₂₅ 막이 균일하고 안정적으로 형성되어 가는 것을 확인할 수 있었다. 전해질 고분자 다층박막의 Cyt.c의 결합에 의한 진동수 변화로 미루어 효소분자가 표면에 미세하게 홉착을 하고 있을 뿐 내부에는 침투하여 결합하지 못하고 있음을 확인할 수 있었다. 금속산화물을 이용한 복합 박막과 비교하여 P 의 결합량은 비슷하지만 Cyt.c의 결합에 의한진동수 변화는 10배 이상의 차이를 보여주고 있다. 이러한 결과는 금속산화물의 나노복합 박막의 내부는 효소가 결합할수 있는층분한공간이 존재하지만, 전해질 고분자다층막의 경우에는 효소가결합할수 있는공간이나작용기가거의 존재하지 않음을 확인 할수 있었다.

<실험예 2 ： 흡광도 변화측정 >

6. 실험예 2-1

실시예 3에서 제작된 효소가결합된 나노복합체의 형성은 UV-vi s spectrometer의 흡광도 (효소내의 포르피린 분자에 의한 ( λ _∞χ =409ηιιι) 흡광도 변화) 변화를 이용하여 확인하였다. 흡광도의 변화는 UV-vis spectrometer

(Perk in Elmer사， Lambda 35제품)을 이용하여 확인 하였고， 3회 반복실험 후 평균피크를 나타내었다.

도 13은 Cyt . c가 결합한 (Ti0 ₂ /PAA ₂ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 UV_vis spectrometer 변화를 나타내었다. 도 13에 보이는 바와 같이 , Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 결합에 의한 250nra 부근에서 Ti0 ₂ 에 의한특성 피크가사이클수가증가할수록규칙적으로 증가함을보였지만， PAA의 결합시 Ti¾ 에 의한특성 피크가 약간 감소함을 나타내었다. 이것은 PM의 결합시 불안정하게 결합된 Ti0 ₂ 의 탈착에 의한 것이다. (Ti0 ₂ /PAA ₂ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 경우 250nm부근에서 (Ti0 ₂ /PAA ₂ ) ₃ . ₅ 나노 복합체에 의한특성 피크만존재 하지만， Cyt . c가결합되면 409nm에서

Cyt . c내의 포르피린 분자에 의한특성 피크가나타났다 . 이러한 UV-vi s spectrometer의 흡광도 변화로 보아 (Ti0 ₂ /PM ₂ ) 나노복합체에 효소 분자가 안정하게 결합되어 있음을 확인 할수 있었다. 도 14은 Cyt . c가결합한

(Ti0 ₂ /PAA ₂₅ )3.5나노복합체, 도 15는 Cyt . c가결합한 (Ti¾/PAA4 ₅₀ ) ₃ . ₅ 나노 복합체의 UV-vi s spectrometer 변화를 나타내었다. P 의 분자량이 증가할수톡

Ti0 ₂ 에 의한특성 피크와 Cyt . c의 결합에 의한특성 피크가증가하였다. 이러한 결과는 QCM진동수 변화와 같은 결과로서 나노복합박막에 안정적으로 효소가 결합하고 있음을 확인할수 있다.

도 16은 Cyt . c가결합한 (Ti0 ₂ ) ₃ 금속산화물 다층박막, 도 17는 Cyt . c가 결합한 (Ti0 ₂ ) ₆ 금속산화물 다층박막의 UV-vi s spectrometer 변화를 나타내었다.

Ti (0- ⁿ Bu) ₄ 결합에 의한 250nm부근에서 Ti0 ₂ 에 의한특성 피크가사이클수가 증가할수록규칙적으로 증가함을보였지만， Cyt . c의 결합에 의한 409nra에서의 피크는사이클수에 관계없이 거의 일정하였다. 이러한 결과는 금속산화물의 나노복합박막의 내부는효소가결합할 있는층분한공간이 존재하지만， 금속 산화물 다층막의 경우에는 효소가결합할수 있는 공간이 존재하지 않고 단지 표면에만결합함을 나타내고 있다.

도 18에는실시예 3의 금속산화물 다층박막과나노 복합체에 Cyt . c를 결합함에 따른 UV-vi s spectrometer 변화의 차이를 나타내었다. 나노복합체는 P 의 분자량이 증가함에 따라결합되는 효소의 양도 포화곡선을그리며 증가함을 확인 할수 있었다. 이러한결과는 PAA의 분자량이 증가할수록 나노 복합체 박막 내부에 효소가결합할수 있는 다공질 공간 (구멍， 세공)이 더 많이 생성되어 있음을보여주고 있다.

6. 실험예 2-2

실시예 3에서 제작된 효소가결합된 나노복합체를 1 wt%암모니아수를 이용하여 효소의 제거 및 재결합의 형성을 UV-vis spectrometer의 흡광도

(효소내의 포르피린 분자에 의한 ( _max =409nm) 흡광도 변화) 변화를 이용하여 확인하였다.

도 19에는 효소가결합된 (Ti0 ₂ /PM ₂ ) _3.5 나노복합체를 1 wt%암모니아수에 반웅시켜 결합된 효소를분리하는 과정을 UV_vis spectrometer 변화를 이용하여 확인하였다. 도 19에서 보여지듯이， 암모니아수에 약 5분간 반웅시킴으로써 결합된 효소의 약 94%를 (Ti0 ₂ /PAA ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노복합 박막으로부터 제거 할수 있었다. 약염기인 암모니아수와 반웅에서 (Ti0 ₂ /PM ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노복합박막의 Ti0 ₂ 에 의한특성 피크는 변화가 없음을 확인 함으로써， 성공적으로나노복합체의 손상 없이 결합한효소를 제거 할수 있었다. 도 20에는 Cyt .c 가 결합된

(Ti0 ₂ /PAA _X )3. ₅ 나노복합체들을 1 wt%암모니아수에 반옹시켜 결합된 Cyt . c를 분리하는 과정을 409nm에서의 흡광도 변화토부터 확인하였다. 약 5분 정도에 포화에 도달함을 확인할수 있었다. 20분 암모니아수 와 반웅후， Cyt .c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PM _x ) ₃ . ₅ 나노복합체로부터 Cyt .c의 분리는 (Ti0 ₂ /PAA ₂ ) ₃ .5나노 복합체의 경우, 약 99.7¾， (Ti0 ₂ /PAA ₂₅ ) ₃ . ₅ 나노 복합체의 경우， 약 96%,

(Ti0 ₂ /PAA4 ₅₀ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 경우， 약 86%의 분리 능력을나타냈다. PAA의 분자량이 증가할수록 나노복합박막으로 부터의 효소의 제거율은 감소 함을 나타내었다. 이러한 결과는 P 의 분자량이 증가 할수록 나노복합 박막에 결합한 효소가 표면으로부터 멀리 떨어져 있고， 좀더 안정적으로 결합되어 있음을 나타내는 것으로 판단된다. 도 21 는 Cyt.c 가 결합된 (Ti0 ₂ /PM _x ) ₃ . ₅ 나노 복합체로부터 Cyt.c 의 분리에 의한 409nm에서의 흡광도 변화를 이용한 재연성 결과를 나타낸 것이다 . Cyt.c의 결합은 실시예 3과 동일한 방법으로 Cyt.c의 분리는 1 wt%암모니아수에 20분 반웅시킨 결과， 결합과 분리가 일정하게 반복적으로 진행되고 있음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 나노복합 박막은 매우 안정적으로 재사용이 가능함을 확인 하였다.

<실험예 3 ： 사이클릭볼타메트리 (Cyclic voltammetry; CV) 측정 >

효소가 결합된 나노 복합체의 전기화학적 특성을 확인하기 위하여

사이클릭볼타메트리 (Cyclic voltammetry)를 이용하였다.

실시예 1 의 방법으로 제조한 나노 복합체에 실시예 2의 방법으로 효소를 결합한 QCM 전극을 'IvinumStat'(Ivium Technologies사, 네델란드)를 이용하여 CV변화를 측정하였다.

도 22에는 인산완층용액 (pH 7)에서 (Ti0 ₂ ) ₃ , (Ti0 ₂ ) ₃ .5/Cyt.c,

(Ti0 ₂ /PM _x ) _35/ Cyt.c나노 복합체의 전기화학적 특성 변화를 나타내었다.

3사이클의 금속산화물 다층박막 ((Ti0 ₂ ) ₃ )의 경우, 200~300mV부근에서 전류치 변화가 거의 나타나지 않았지만， 효소가 결합된 금속산화물 다층박막

((Ti0 ₂ ) _3/ Cyt.c)과나노 복합체 ((Ti0 ₂ /PAA _x ) ₃ . _5/ Cyt.c)의 경우， 효소내의 철분자의 산화?환원 피크가 관찰 되었다. 효소가 결합된 금속산화물

다층박막 ((Ti0 ₂ ) ₃ )보다 효소가 결합된 나노 복합체 ((Ti¾/PM _X ) ₃ . _5/ Cyt.c)에서 산화 ·환원 피크의 증가를 확인 하였다. 또한, PAA의 분자량이 증가 할수록 산화 ·환원 피크가 증가 하였다. 이것은 금속산화물 다층박막은 단순히 최외곽의 금속산화물 표면에만효소가 결합되는데 비하여 , Ti0 ₂ /PAA의 나노 복합체에서는 내부에까지 효소가 이동하여 결합되므로 고정화된 효소의 증가 때문에 효소로 부터의 산화 ·환원 피크 (전류치)가 상대적으로 증가되는 것이다. 이상의 결과로부터， 발명의 일 구현예에 따른 생화학물질 고정용 나노 복합체에서는 생화학물질의 활성을 유지한 상태로 나노 복합체 내부에까지 결합시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. <실험예 4 ： 전류적정법 (Amperometric titration) 측정 >

효소가결합된 나노복합체의 바이오센서 특성을 확인하기 위하여

전류적정법 (Amperometric titration)을 이용하였다.

실시예 1 의 방법으로 제조한나노복합체에 실시예 2의 방법으로 효소를 결합한 QCM 전극을 'IvinumStat'Gvium Technologies사, 네델란드)를 이용하여 인산완층용액 (pH 7)에 과산화수소 (¾0 ₂ )의 농도 증가에 의한 전류치 변화를 측정하였다.

도 23에는 ΙμΜ의 과산화수소 용액윷 500mV 인가전압에서 30초 간격으로 첨가하며， (Ti0 ₂ ) ₃ , (Ti0 ₂ ) ₃ .5/Cyt.c, (Ti0 ₂ /PAA _x ) _3.5/ Cyt.c나노복합체의 전류치 변화를측정한 결과를 나타내었다. 3사이클의 금속산화물 다층박막 ((Ti0 ₂ ) ₃ )의 경우, 전류치 변화가나타나지 않았지만， 효소가결합된 금속산화물 다층박막 ((Ti0 ₂ ) _3/ Cyt.c)과나노복합체 ((Ti0 ₂ /PAA _x ) ₃ . _5/ Cyt.c)의 경우, 과산화수소의 농도 증가에 의한 전류치 증가가관찰되었다. 특히， 결합된 효소량이 많을수록 전류치가증가하였다.

<실험예 5: 원자간력 현미경 (Atomic Force Microscope, AFM)을 이용한표면 관찰〉

표면을 에탄올로 세척한운모 (Mica)를 고체 지지체로 자기초립박막과정을 제외하고 비교예 1과동일한방법으로 제조한금속산화물다층박막과실시예 1과 동일한방법으로 제조한나노복합체에 실시예 2의 방법으로 Cyt.c 를

결합하였다. 그후， (Ti0 ₂ ) ₃ , (Ti0 ₂ ) _3/ Cyt.c, (Ti0 ₂ /PAA ₄₅₀ ) ₃ . ₅ 와

(TiO ₂ /PM ₄₅₀ ) ₃ . _5/ Cyt.c박막들을 원자간력 현미경 (JSPM-5200제품， JE0L사)을 이용하여 표면을 관찰하였다. 그 결과， (Ti0 ₂ ) ₃ 금속산화물다층박막의 root-mean- sequare(RMS) roughness는 0.148nm, ((Ti0 ₂ ) _3/ Cyt . c나노복합체의 root-mean- sequare(RMS) roughness는 1.048nm로 효소가 결합된 나노복합체의 RMS roughness가증가하였다. 또한， (TiO ₂ /PM ₄₅₀ ) ₃ . ₅ 나노복합체의 root— mean- sequare(RMS) roughness는 1.148nm, (Ti()2/PAA4 ₅₀ )3.5 /Cyt . c나노복합체의 root- mean-sequare(RMS) roughness는 1.848nm로 효소가 결합된 나노복합체의 RMS roughness 7}증가하였다. 이러한결과는 나노복합체의 표면에 고정된 Cyt.c에 의해 RMS roughness가증가한 것이다. 또한， 약 3nm크기의 Cyt.c가내부에 까지 침투하여 안정하게 고정화되는 점과 하기 원자간력 현미경의 측정결과에서， 나노 복합체의 각각의 막들은 다공질성으로 확인 되었다.

도 25와 26는 각각 (Ti0 ₂ ) ₃ 금속산화물다층박막와 (Ti0 ₂ ) _3/ Cyt . c나노 복합체의 AFM사진과 root-mean-sequare(RMS) roughness를 보여주며， 도 27와 28는 각각 (Ti0 ₂ /PAA4 ₅₀ ) ₃ . ₅ 나노복합 박막과 (Ti0 ₂ /PAA ₄₅ o)3.5/Cyt . c나노 복합체의 AFM사진과 root— mean— sequare(RMS) roughness를 보여주며

본 명세서는 본 발명의 바람직한실시예를 참조하여 설명하였지만， 해당 기술분야의 당업자는 이하에서 서술하는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경 실시할 수 있을 것이다. 그러므로 변형된 실시가 기본적으로 본 발명의

특허청구범위의 구성요소를 포함한다면 모두 본 발명의 기술적 범주에

포함된다고 보아야 한다.