Die vorliegende Patentanmeldung betrifft Nanopartikel, die Verwendung von Nanopartikeln für die Herstellung von Medikamenten sowie ein Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln.

Nanopartikel als Trägersysteme für Arzneistoffe sind seit den 70er Jahren be¬ kannt. Sie ermöglichen einen gezielten Transport der Wirkstoffe in einen ge¬ wünschten Bereich des Körpers, wobei die Freisetzung erst am Zielort erfolgt (sogenannte drug-delivery-Systeme). Gleichzeitig wird der noch nicht freige¬ setzte Wirkstoff effektiv gegenüber metabolischen Einflüssen des Körpers ab¬ geschirmt. So können Nebenwirkungen minimiert werden, indem die Wirkstoff¬ moleküle vorwiegend und gezielt an ihrem eigentlichen Wirkort ankommen und den Gesamtorganismus weniger belasten.

Für die Herstellung von Nanopartikeln werden in der Literatur zahlreiche syn¬ thetische Ausgangsmaterialien wie z.B. Polyacrylate, Polyamide, Polystyrole und Cyanoacrylate beschrieben. Der entscheidende Nachteil dieser Makromo¬ leküle liegt allerdings in ihrer schlechten oder fehlenden Bioabbaubarkeit.

Als natürliche, im Körper abbaubare Trägermaterialien sind unter anderem Fi- bronektin, verschiedene Polysaccharide, Albumin, Collagen und Gelatine be¬ kannt. Eine weitere Schwierigkeit bei den bekannten Nanopartikeln besteht in der z.T. weiten Größenverteilung, die im Hinblick auf ein einheitliches Freisetzungs¬ und Transportverhalten nachteilig ist. Durch aufwendige Zentrifugations- und andere Trennungsverfahren kann die Größenverteilung solcher Nanopartikel zwar in gewissem Umfang enger gemacht werden, was aber zu keinem befrie¬ digenden Ergebnis führt.

Die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe besteht somit da¬ rin, bioabbaubare Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die einen einheitli¬ chen und definierbaren Wirkstofftransport gewährleisten. Gleichzeitig besteht die Aufgabe darin, ein geeignetes Verfahren zur Herstellung dieser Nanoparti- kei anzugeben.

Diese Aufgabe wird bei den Nanopartikeln der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, dass sie im Wesentlichen aus einem wässrigen Gelatinegel bestehen, wobei der mittlere Durchmesser der Nanopartikel maximal 350 nm beträgt und der Polydispersitätsindex der Nanopartikel kleiner oder gleich 0,15 ist.

Gelatine weist als Ausgangsmateria! für Nanopartikel eine Reihe von Vorteilen auf. Sie ist in definierter Zusammensetzung und Reinheit verfügbar und hat ein relativ geringes antigenes Potenzial. Gelatine ist zudem für die parenterale Anwendung zugelassen, unter anderem als Plasmaexpander.

Darüber hinaus bieten die Aminosäureseitenketten der Gelatine die einfache Möglichkeit, die Oberfläche der Nanopartikel chemisch zu modifizieren, die Ge¬ latine zu vernetzen oder Wirkstoff molekü Ie kovalent an die Partikel zu binden.

Der Begriff "wässriges Gelatinegel" ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung dahingehend zu verstehen, dass die in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine in hydratisierter Form, d.h. als Hydrokolloid, vorliegt. Da die Nanopartikel wäh¬ rend ihrer Herstellung und Verwendung stets von einer wässrigen Lösung um¬ geben sind, beziehen sich sämtliche Angaben zur Größe und Polydispersität der Nanopartikel auf diese hydratisierte Form. Die Bestimmung dieser Parame¬ ter erfolgt mit der Standardmethode der Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), die weiter unten näher beschrieben wird.

Die Formulierung "im Wesentlichen bestehend aus" ist im Sinne der Erfindung so zu verstehen, dass die Nanopartikel zu 95 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 97 Gew.-% oder mehr, noch mehr bevorzugt zu 98 Gew.-% oder mehr und am meisten bevorzugt zu 99 Gew.-% oder mehr aus dem wässrigen Gelatine¬ gel bestehen.

Der Polydispersitätsindex ist ein Maß für die Größenverteilung der Nanoparti¬ kel, wobei theoretisch Werte zwischen 1 (maximale Streuung) und 0 (identi¬ sche Größe aller Partikel) möglich sind. Der niedrige Polydispersitätsindex der erfindungsgemäßen Nanopartikel von maximal 0,15 gewährleistet einen geziel¬ ten und kontrollierbaren Wirkstofftransport sowie die Freisetzung des Wirkstof¬ fes am gewünschten Zielort, insbesondere bei der Aufnahme der Nanopartikel durch Körperzellen.

Besonders bevorzugt sind Nanopartikel mit einem Polydispersitätsindex kleiner oder gleich 0,1.

Die Größe der Nanopartikel ist ein entscheidender Faktor für deren Verwend¬ barkeit und kann je nach Anwendungsgebiet variieren. In vielen Fällen sind Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser von maximal 200 nm bevor¬ zugt. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser von maximal 150 nm, vorzugsweise von 80 bis 150 nm. Diese können unter Ausnutzung des sogenannten EPR-Effekts (enhanced permeability and retention) eingesetzt werden. Dieser Effekt er¬ möglicht die gezielte Behandlung von Tumorzellen, die gegenüber Nanoparti- keln des genannten Größenbereiches eine höhere Aufnahmerate aufweisen als gesunde Zellen.

Ein weiterer Parameter für die Größenverteilung der Nanopartikel ist die Band¬ breite des Durchmessers, die vorzugsweise bei maximal 20 nm ober- und un¬ terhalb des Mittelwertes liegt. Die Bandbreite kann ebenfalls mittels PCS be¬ stimmt werden.

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch durch die Molekulargewichtsverteilung der enthaltenen Gelatine beeinflusst werden. Wichtig ist in diesem Zusammenhang der Anteil an niedermolekularer Gelatine, insbesondere der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine. Dieser Anteil liegt bevorzugt unterhalb von 40 Gew.-%. Besonders vorteilhaft ist ein Anteil von weniger als 30 Gew.-%, vorzugsweise 20 Gew.-% und weni¬ ger.

Im Stand der Technik sind im Zusammenhang mit Gelatine meist Nanopartikel beschrieben, die darüber hinaus noch weitere Strukturpolymere enthalten (z.B. nach dem Koazervationsverfahren hergestellte Nanopartikel, wie sie in der WO 01/47501 Al beschrieben werden). Die bisher hergestellten Nanopar¬ tikel aus reiner Gelatine sind entweder instabil oder weisen die oben beschrie¬ benen, für den selektiven Wirkstofftransport vorteilhaften Parameter in Bezug auf Partikeldurchmesser und Größenverteilung nicht auf. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die in den Nanopartikeln enthaltene Gelatine vernetzt. Durch eine Vernetzung wird die Stabilität der Na- nopartike! wesentlich erhöht, zudem kann durch den gewählten Vernetzungs¬ grad das Abbauverhalten der Nanopartikel gezielt eingestellt werden. Dies ist von Vorteil, da unterschiedliche Anwendungsbereiche in der Regel definierte Abbauzeiten der Nanopartikel erfordern.

Insbesondere bei der Vernetzung ist es von Bedeutung, dass der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa weniger als 20 Gew.-% beträgt.

Unvernetzte Nanopartikel sind geeignet für extracorporale, insbesondere dia¬ gnostische Anwendungen, bei denen unterhalb des Schmelzpunktes von Gela¬ tine, z.B. bei Raumtemperatur gearbeitet werden kann.

Demgegenüber sind insbesondere für therapeutische Anwendungen die oben beschriebenen vernetzten Nanopartikel geeignet.

Die Gelatine kann chemisch vernetzt sein, z.B. durch Formaldehyd, Dialdehy- de, Isocyanate, Diisocyanate, Carbodiimide oder Alkyldihaiogenide.

Alternativ kann eine enzymatische Vernetzung, z.B. durch Transglutaminase oder Laccase, erfolgen.

Bei einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Nanopar¬ tikel getrocknet, vorzugsweise bis zu einem Wassergehalt von maximal 15 Gew.-%. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Nanopartikel, an deren Oberfläche ein pharmazeutischer Wirkstoff gebunden ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird vor der Bindung des Wirkstoffes die Oberfläche der Nanopartikel chemisch modifiziert, z.B. durch die Reaktion freier Amino- oder Carboxylgruppen der Gelatine, wodurch geladene Seiten¬ ketten oder Seitenketten mit einer neuen chemischen Funktionalität entste¬ hen.

Die Bindung des pharmazeutischen Wirkstoffes an die Nanopartikel oder an die chemisch modifizierten Nanopartikel kann durch Adsorptionskräfte, durch ko- valente Bindungen oder durch ionische Bindungen erfolgen. Beispielsweise können an Nanopartikel, deren Oberflächen durch eine entsprechende chemi¬ sche Modifikation positiv geladen sind, DNA- oder RNA-Fragmente ionisch ge¬ bunden werden.

Bei einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bindung des Wirkstoffes an die Nanopartikel über einen Spacer.

Vorstehend beschriebenen Nanopartikel können, sofern sie vernetzt sind, er¬ findungsgemäß für die Herstellung von Medikamenten verwendet werden.

Besonders vorteilhaft ist die Verwendung der Nanopartikel für intrazelluläre drug-delivery-Systeme, insbesondere als Trägerstoff für Nucleinsäuren oder Peptide.

Medikamente mit erfindungsgemäßen Nanopartikeln können bevorzugt in der Gentherapie eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Na- nopartikeln der eingangs beschriebenen Art.

Die der Erfindung hinsichtlich des Verfahrens zugrunde liegende Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass als Ausgangsmaterial für das Herstel¬ lungsverfahren eine Gelatine verwendet wird, deren Anteil an Gelatine mit ei¬ nem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, bezogen auf die gesamte Gela¬ tine, maximal 40 Gew.-% beträgt.

Durch Verwendung einer solchen Gelatine können auf einfache Weise Nano- partikel mit einer geringen Polydispersität und Bandbreite des Partikeldurch¬ messers hergestellt werden, insbesondere die erfindungsgemäßen Nanoparti- kel mit einem Polydispersitätsindex kleiner oder gleich 0,15.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird aus einer solchen Gelatine zu¬ nächst eine wässrige Lösung hergestellt, deren pH-Wert dann auf einen Wert unterhalb von 7,0 eingestellt wird. Durch Zugabe eines geeigneten Fällungs¬ mittels zu dieser Lösung erfolgt eine Desolvatation der gelösten Gelatine in Form von Nanopartikeln, die anschließend durch eine einfache Zentrifugation aus der Lösung abgetrennt werden. Eine Fraktionierung der Nanopartikel, z.B. durch eine Gradientenzentrifugation, ist nicht erforderlich, da deren Polydis¬ persität als Ergebnis des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens bereits in einem ausreichend niedrigen Bereich liegt.

Ein Zusatz von Hilfsstoffen zu der wässrigen Gelatinelösung, insbesondere von Salzen oder oberflächenaktiven Substanzen wie Detergenzien, ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht erforderlich. Erfindungsgemäße Na¬ nopartikel sind daher bevorzugt im Wesentlichen frei von den genannten Zu¬ sätzen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Herstellung von Nanopartikeln, die im Wesentlichen nur aus einem wässrigen Gelatinegel be¬ stehen.

Durch die Verwendung von Gelatine mit der vorstehend beschriebenen Mole¬ kulargewichtsverteilung wird die Entstehung stabiler Nanopartikel gewährlei¬ stet. Gelatinen mit einem höheren niedermolekularen Anteil führen bei diesem Verfahren vermehrt zur Bildung von größeren Aggregaten oder instabilen Par¬ tikeln.

Vorzugsweise liegt der Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unter¬ halb von 65 kDa bei maximal 30 Gew.-%, am meisten bevorzugt bei maximal 20 Gew.-%.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der eingestellte pH-Wert der Gelatinelösung kleiner oder gleich 3,0, vorzugsweise liegt er im Bereich von 1,5 bis 3,0. Innerhalb dieses Intervalls kann über den pH-Wert z.T. ein Einfluss auf die mittlere Partikelgröße ausgeübt werden, wobei ein niedrigerer pH-Wert tendenziell zu kleineren Nanopartikeln führt.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Fällungsmittel Aceton, Alkohole, wie z.B. Ethanol, oder Mischungen dieser Fällungsmittel un¬ tereinander oder mit Wasser verwendet, wobei Aceton als Fällungsmittel be¬ vorzugt ist.

Durch die Verwendung derartiger flüchtiger Fällungsmittel wird weitestgehend vermieden, dass Anteile des Fällungsmittels in die Nanopartikel inkorporiert werden und/oder bleiben, so dass diese im Wesentlichen nur aus dem wässri¬ gen Gelatinegel bestehen. Für die Herstellung von vernetzten Nanopartikeln erfolgt nach Zugabe des Fäl¬ lungsmittels und vor dem Zentrifugieren die Zugabe eines Vernetzungsmittels. Bei dieser Ausführungsform beträgt der Anteil an Gelatine mit einem Moleku¬ largewicht unterhalb von 65 kDa bevorzugt 20 Gew.-% oder weniger, um einer Agglomeration der Partikel beim Vernetzen entgegenzuwirken. Mit diesem Ver¬ fahren können sehr einheitliche Nanopartikel mit einer Bandbreite von maximal ±20 nm und einem Polydispersitätsindex von maximal 0,1 hergestellt werden.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf die Zeichnung noch näher erläutert. Es zeigen im Einzelnen:

Figur 1: die Gelpermeationschromatogramme zweier Gelatinen (Fig. IA bzw. IB), die die Molekulargewichtsverteilung der jeweiligen Gela¬ tine wiedergeben;

Figur 2: eine elektronenmikroskopische Aufnahme von erfindungsgemäßen Nanopartikeln; und

Figur 3: eine Größenverteilung erfindungsgemäß hergestellter Nanoparti¬ kel.

Bestimmung der Molekularqewichtsverteilung

Über die Molekulargewichtsverteilung der Gelatine kann, wie oben beschrie¬ ben, Einfluss auf die Eigenschaften der daraus hergestellten Nanopartikel ge¬ nommen werden. Die Molekulargewichtsverteilung kann mittels Gelpermeati- onschromatografie (GPC) ermittelt werden. Die Bestimmung wird auf einem HPLC-System mit den folgenden Komponen¬ ten durchgeführt:

HPLC-Pumpe: Pharmacia 2249 UV-Detektor: LKW 2151 Trennsäule: TFK 400 SWXL mit Vorsäule (Fa. Tosoh Biosep GmbH) Fließmittel: 1 Gew.-% SDS, 100 mmol/l Na2SO4, 10 mmol/l NaH2PO4 / NaOH pH 5,3

Es wird eine 1 Gew.-%ige Gelatinelösung in Wasser durch 30minütiges Quellen der Gelatine und anschließendes Lösen bei ca. 60 0C hergestellt. Nach Filtra¬ tion durch ein 0,2 μl Einmalfilter werden 30 μl der Gelatinelösung mit 600 μl Fließmittel und 30 μl einer 0,01 Gew.-%igen Benzoesäurelösung gemischt. Die GPC wird mit 20 μl dieser Mischung bei einer Flussrate von 0,5 ml/min und UV- Detektion bei 214 nm durchgeführt.

Die Zuordnung zwischen Elutionsvolumen und Molekulargewicht erfolgt durch Kalibration des Systems mit einer Standardgelatine mit bekannter Molekular¬ gewichtsverteilung. Durch Unterteilung des Chromatogramms in definierte Be¬ reiche und Integration des UV-Detektor-Signals kann der Anteil an Gelatine berechnet werden, der in dem jeweiligen Moiekulargewichtsbereich liegt.

In Figur 1 sind beispielhaft die Gelpermeationschromatogramme zweier unter¬ schiedlicher Gelatinen dargestellt:

Figur IA zeigt das GPC einer handelsüblichen Schweineschwartengelatine (Gelatine Typ A) mit einem Bloom-Wert von 175. Auf Grund des hohen Anteils an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa, der bei über 45 Gew.-% liegt, ist diese Gelatine für das erfindungsgemäße Herstellungsver- fahren für Nanopartikel nicht geeignet und führt zu Partikeln mit einer zu ho¬ hen Polydispersität oder zu einer Agglomeration der Partikel.

Figur IB zeigt das GPC einer Schweineschwartengelatine mit einem Bloom- Wert von 310 und einem Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unter¬ halb von 65 kDa von ca. 15 Gew.-%. Diese Gelatine eignet sich sehr gut für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren.

Bestimmung des mittleren Partikeldurchmessers und des Polydispersitätsindex

Die Photonenkorrelationsspektroskopie erlaubt die Bestimmung des mittleren Partikeldurchmessers der Nanopartikel, des Polydispersitätsindex und der Bandbreite des Partikeldurchmessers ober- und unterhalb des Mittelwertes.

Die Messungen wurden mit einem BI-200 SM Goniometer Version 2 (Brook- haven Instruments Corp., Holtsville, NY, USA) durchgeführt. Hierfür wurden Nanopartikel-Suspensionen mit einer Konzentration von 10 bis 50 μg/ml in de- mineralisiertem Wasser eingesetzt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von vernetzten Nanopartikeln aus der Gelatine, deren GPC in Fig. IB dargestellt ist (mit einem Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa von ca. 15 Gew.-%).

300 mg der besagten Gelatine werden in Wasser bei 50 0C gelöst. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 2,5 mit Salzsäure wird die Desoivatation der Ge¬ latine durch die tropfenweise Zugabe von 45 ml Aceton durchgeführt. Nach 10-minütigem Rühren werden 40 μl einer 8%igen wässrigen Glutaraldehydlö- sung zugegeben und anschließend weitere 30 min gerührt. Die so vernetzten Nanopartikel werden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 g von der Lösung abgetrennt und durch dreimaliges Redispergieren in Aceton/Wasser (30/70) gereinigt. Nach dem letzten Redispergieren wird das Aceton bei 50 0C abgedampft.

Dieses einfache Verfahren führt ohne zusätzliche Trennungsschritte zu erfin¬ dungsgemäßen Nanopartikeln, für die mit dem oben beschriebenen PCS-Ver- fahren ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 160 nm bei einem Polydisper- sitätsindex von ca. 0,08 ermittelt wurde. Die Verteilung der Nanopartikel nach Größenklassen ist in Figur 3 grafisch dargestellt.

Vergleichsversuche an nicht vernetzten Nanopartikeln haben ergeben, dass der Anteil an niedermolekularer Gelatine in den hergestellten Nanopartikeln dem Anteil im Ausgangsmaterial weitgehend entspricht.

Beispiel 2

Es werden vernetzte Nanopartikel wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei als Ausgangsmaterial eine Schweineschwartengelatine mit einem Bloom-Wert von 270, deren Anteil an Gelatine mit einem Molekulargewicht unterhalb von 65 kDa bei ca. 19 Gew.-% liegt, eingesetzt wird.

Für die unmittelbar erhaltenen, erfindungsgemäßen Nanopartikel wurde mit dem oben beschriebenen PCS-Verfahren ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 173 nm bei einem Polydispersitätsindex von ca. 0,08 ermittelt. Die Größen¬ verteilung war vergleichbar mit den gemäß Beispiel 1 hergestellten Nanoparti¬ keln.