Nanosensor para la detección de escopolamina

La presente invención se encuentra dentro del campo de la nanotecnología y detección analítica. En concreto, la presente invención describe un nanosensor que comprende una nanopartícula porosa y un sistema de puertas moleculares, que reconocen y cambian de disposición en función de si se encuentra o no presente la molécula a detectar, la escopolamina.

ESTADO DE LA TÉCNICA

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el uso de sustancias químicas con el fin de manipular la voluntad de las personas ha cobrado un mayor protagonismo en los últimos años por su asociación con agresiones sexuales, robos y otras prácticas delictivas. Precisamente, la frecuencia con que se asocia a los delitos sexuales le ha valido el acrónimo de ASPD (agresiones sexuales promovidas por drogas) o sumisión química.

La sustancia psicoactiva más comúnmente asociada a la ASPD es el alcohol, sin embargo, el empleo de drogas recreativas se ha incrementado promovido por la expansión del mercado de las drogas de diseño, ofreciendo una amplia variedad de formas más rápidas y baratas de sumisión. Entre las sustancias psicoactivas utilizadas destacan el ácido y-hidroxibutíhco (GHB), la 3,4-metilendioxipirovalerona (MDPV, conocida como "droga caníbal"), la ketamina, el flunitrazepam o la escopolamina (SCP).

Los avances tecnológicos de las últimas décadas han permitido el desarrollo de técnicas analíticas cada vez más precisas y sensibles, imprescindibles para la detección y, en su caso, cuantificación de las sustancias incriminadas en esta práctica. Se han utilizado una amplia variedad de técnicas para su identificación fiable en diferentes muestras adulteradas, como la cromatografía de gases, la cromatografía líquida de alto rendimiento y la electroforesis de zona capilar. La mayoría de estos estudios se han centrado en la determinación en suero, plasma y otras muestras biológicas, como la orina o el cabello.

En este contexto, el desarrollo de procedimientos que eviten el traslado de la muestra a laboratorios especializados que requieran de equipos sofisticados y personal altamente cualificado sigue siendo un gran reto. Además, resulta indispensable la reducción de los tiempos de medida y la simplificación de los métodos de análisis. Por ello, el desarrollo de sensores para detectar estupefacientes es de crítica importancia, ya que los métodos tradicionales no son efectivos para la detección precoz de casos de sumisión química, y es necesario desarrollar técnicas innovadoras, entre las cuales se pueden citar los nanodispositivos con puertas moleculares con capacidad de liberación controlada. Las puertas moleculares pueden ser definidas como dispositivos en los que el transporte de masa puede ser activado por un estímulo externo que puede controlar la apertura de la puerta molecular (C. Coll, et al., Acc Chem Res. 2013, 46, 339-349).

Diferentes sensores y nanodispositivos de detección de sustancias psicoactivas como las mencionadas se encuentran descritos en el estado de la técnica:

El documento de B. Lozano-Torres, et al., “Pseudorotaxane capped mesoporous silica nanoparticles for 3,4-methylenedioxy methamphetamine (MDMA) detection in water ¹ ’, Chem. Common., 2017, 53, 3559-3562, describe un nanosensor para la detección de la droga conocida como éxtasis o MDMA (3,4-metilendioximetanfetamina), formado por nanopartículas de sílice mesoporosa cargadas con fluoresceína, cuya salida está bloqueada con una puerta molecular sensible a la droga MDMA. La presencia de MDMA desplaza al pseudorotaxano y produce la liberación de la fluoresceína, de forma que se detecta de forma selectiva y sensible la presencia de MDMA.

El documento de E, Garrido, et al., “A Sensitive Nanosensor for the In Situ Detection of the Cannibal Drug”, ACS Sensors, 2020, 5, 2966-2972, describe un nanosensor para la detección in situ de la droga psicoactiva MDPV con potentes efectos estimulantes. El nanodispositivo está formado por nanopartículas de sílice mesoporosa cargadas con rodamina B y funcionalizadas exteriormente con un derivado de dopamina que interactúa con el transportador de dopamina (DAT) bloqueando completamente los poros. En presencia de MDPV, DAT se desplaza de la superficie externa de las nanopartículas y ocasiona la liberación de la rodamina B permitiendo la detección de la droga en saliva y plasma sanguíneo.

El documento de E. Garrido, et al., “Nanosensor for Sensitive Detection of the New Psychedelic Drug 251-NBOMe”, Chem. Eur. J. 2020, 26, 2813-2816, describe un nanodispositivo para la detección de la droga psicodélica 25l-NBOMe perteneciente a la familia de las feniletilaminas. El sistema se basa en nanopartículas mesoporosas de sílice cargadas con rodamina B, funcionalizadas con un derivado de serotonina y tapadas con el anticuerpo del receptor 5-HT2A de la serotonina. En presencia de la droga 25l-NBOMe, el anticuerpo se desplaza permitiendo la apertura del poro produciendo la consecuente liberación del colorante rodamina B encapsulado. Otras drogas como cocaína, heroína, mescalina, MDMA y morfina no indujeron la apertura de la puerta molecular, impidiendo la liberación de la rodamina B, demostrando la selectividad del nanodispositivo para la detección de la droga 25l-NBOMe en saliva y golosinas.

El documento de S. El Sayed et al., “Capped Mesoporous Silica Nanoparticles for the Selective and Sensitive Detection of Cyanide", Chem. Asian J. 2017, 12, 2670-2674, describe un método para la detección de cianuro mediante un nanomaterial híbrido orgánico-inorgánico basado en nanopartículas mesoporosas de sílice funcionalizadas con una puerta molecular específica, de forma que la presencia de cianuro permite la liberación del colorante encapsulado de forma selectiva.

Actualmente, la escopolamina ha llegado a ser una sustancia psicotrópica ideal para agresores ya que induce un automatismo en el cerebro de la víctima, provocando un estado de sumisión profunda. Su consumo produce potentes efectos psicotrópicos, entre los que se incluyen estados de delirio caracterizado principalmente por alucinaciones, alteración del estado de ánimo y déficits cognitivos, entre otros. Específicamente, los efectos farmacológicos de la escopolamina y su duración dependen principalmente del formato en el que se consuma la droga, apareciendo en cuestión de minutos en el caso de las soluciones o elixires (con un pico de 15-60 minutos y una duración de 4 horas) y en 20-30 minutos en el caso de las cápsulas (con un pico de 40-90 minutos y una duración de 12 horas).

En el estado de la técnica también se encuentra descrito un sensor de bajo coste, fácil de usar y portátil para la detección de escopolamina por electroquimioluminiscencia (ECL) en concentraciones clínicamente relevantes en matrices biológicas como suero, orina, saliva artificial, o sudor (K. Brown K., “Electrochemiluminescent sensors as a screening strategy for psychoactive substances within biological matrices"', Analyst, 2020, 145, 4295-4304).

A la vista del estado de la técnica, existe la necesidad de desarrollar dispositivos alternativos de detección de sustancias psicoactivas, como la escopolamina, y que permitan dicha detección de forma rápida y selectiva, y sin necesidad de personal y equipamiento especializado.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un nanosensor para la detección de escopolamina (también denominada SCP o burundanga) y/o derivados de la misma, de forma rápida y selectiva, que además pueda llevarse a cabo in situ y at site, sin necesidad de trasladar la muestra a un laboratorio especializado.

El nanosensor desarrollado está basado en nanopartículas porosas las cuáles actúan como un nanocontenedor de un indicador o colorante, que se encapsula en el interior de los poros y cuya salida al medio se encuentra modulada por el receptor muscarínico de acetilcolina M2 (M2-AChR). El receptor muscarínico M2-AChR se encuentra dispuesto en el nanosensor de forma que actúa como parte de una “puerta molecular”: (i) en ausencia de la escopolamina, el receptor muscarínico M2-AChR bloquea la liberación del indicador al interaccionar con un agonista no selectivo del receptor unido a la superficie de la nanopartícula; (¡i) en presencia de la escopolamina, el receptor muscarínico M2-AChR reconoce dicho analito, desbloqueando el poro al dejar de interactuar con el agonista no selectivo anclado a la superficie. Así, en presencia de la escopolamina se desbloquea el poro permitiendo la salida del indicador encapsulado, produciendo una señal indicativa de la presencia de escopolamina y/o derivados de la misma (Figura 1).

El nanosensor de la invención presenta como una de sus principales ventajas una rápida detección del analito de interés, tal y como ¡lustran la Fig. 2a o Fig. 4a, ya que la emisión de la señal mediada por la liberación del indicador, en este caso rodamina B, en presencia de escopolamina se produce en minutos.

Otra de las ventajas reside en su capacidad para llevar a cabo la medida in situ y at site, en medios tamponados y en fluidos reales como la saliva, sin necesidad de trasladar la muestra en la que se llevaría a cabo la detección a un laboratorio especializado.

Además, la detección rápida que permite el nanosensor de la invención es de gran importancia, dado que la metabolización de la escopolamina y/o derivados de la misma se produce en horas, teniendo un margen temporal de detección reducido. Otra importante propiedad de cara a la aplicación del nanosensor en los usos y métodos de detección del analito de interés reside en el límite de detección alcanzado. La dosis oral máxima de escopolamina para fines médicos es de 80 mg en 150 mL de agua (264 pM), mientras que 100 mg (330 pM) pueden producir un estado de sumisión o incluso llegar a ser letal en adultos. Los inventores han calculado, mediante una curva de calibrado, que el límite de detección es de 92 pM, lo que permitiría, por tanto, identificar de forma fiable casos de sumisión química.

Por último, el nanosensor desarrollado por los inventores permite detectar la escopolamina de forma selectiva, discriminando la escopolamina frente a otras drogas psicoactivas, como la morfina, cocaína, MDMA, heroína y MDPV (Fig.3).

Nanosensor de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un nanosensor, de aquí en adelante el “nanosensor de la invención”, que comprende:

-una nanopartícula porosa que comprende, al menos, un poro con acceso al exterior de la nanopartícula porosa;

-un indicador situado en el interior del poro de la nanopartícula porosa;

-un agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M2 (M2-AChR), unido a la superficie de la nanopartícula porosa; y

-un receptor muscarínico M ₂ -AChR, situado en el exterior de la nanopartícula porosa, que reconoce un analito, en donde el analito es escopolamina y/o derivados de la misma, en donde el receptor muscarínico M2-AChR se dispone en una posición tal que:

(i) en ausencia del analito, el receptor muscarínico M2-AChR bloquea el acceso al exterior del poro, impidiendo la salida del indicador, y

(¡i) en presencia del analito, el receptor muscarínico M2-AChR, reconoce y se une a dicho analito, y desbloquea el acceso al exterior del poro, permitiendo la salida del indicador.

Como ya se ha mencionado previamente, el nanosensor de la invención presenta múltiples ventajas para su aplicación en la detección de escopolamina y/o derivados de la misma, y por tanto, para los métodos y usos descritos en el presente documento.

Un nanosensor es un dispositivo analítico que puede ser usado para detectar información química, biológica o mecánica, transformando dicha información en una señal eléctrica, óptica, colohméthca u otro esquema de transducción. Además, los nanosensores son dispositivos capaces de trabajar a escala nanométhca.

El nanosensor de la invención comprende una nanopartícula porosa que comprende, al menos, un poro con acceso al exterior de la nanopartícula porosa.

En la presente invención, se entiende por “nanopartícula” aquella partícula que tiene dimensiones a escala nanométhca. Además, la nanopartícula puede tener forma esférica, aunque no se descarta que pueda tener otras formas, tales como, aunque no de forma limitante, un elipsoide, una varilla, un cono, un cubo, un cuboide (por ejemplo, una caja rectangular), una pirámide, y una forma irregular, etc. En determinados casos, se pueden incluir combinaciones de diferentes formas de nanopartículas. Como se ha indicado anteriormente, la nanopartícula puede tener una forma sustancialmente esférica y, por lo tanto, puede tener dimensiones medidas como un diámetro de la esfera. Técnicas o métodos para determinar el diámetro de nanopartículas son conocidas en el estado de la técnica, incluyendo, sin limitar a, dispersión dinámica de luz (o DLS, por sus siglas en inglés “Dynamic Light Scatterinc/’). En algunas realizaciones preferidas, solas o en combinación con otras realizaciones preferidas, la nanopartícula tiene un diámetro promedio de entre 1.000 nm y 40 nm, entre 750 nm y 40 nm, entre 500 nm y 40 nm, entre 250 nm y 40 nm, entre 200 nm y 40 nm, entre 150 nm y 40 nm.. El término "promedio" tal como se usa en el presente documento pretende ser la media aritmética. En algunas realizaciones más preferidas, la nanopartícula del nanosensor de la invención tiene un diámetro promedio de entre 100 y 120 nm (incluyendo los valores extremos del rango). En otra realización aún más preferida, la nanopartícula es esférica y tiene un diámetro promedio de entre 100 y 120 nm (incluyendo los valores extremos del rango).

En la presente invención, el término nanopartícula porosa se refiere a una nanopartícula que comprende al menos un poro y que tiene una superficie a la cual se pueden unir moléculas. La nanopartícula porosa empleada en la presente invención puede comprender cualquier material de sustrato que comprenda al menos un poro a lo largo de su superficie con acceso al exterior de la nanopartícula. No obstante, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la nanopartícula porosa es una nanopartícula de sílice. El término “sílice”, se refiere en la presente invención a que la nanopartícula comprende dióxido de silicio (óxido de silicio (IV)).

La International Union of Pure and Applied Chemistry (IU PAC) clasifica los poros por su tamaño, midiendo dicho tamaño por el diámetro interno del mismo asumiendo que éste es cilindrico, o por la distancia entre las paredes internas y opuestas de un poro con una configuración diferente. Así, siguiendo el criterio de la IIIPAC, si el diámetro de un poro (o la distancia entre las paredes internas u opuestas de un poro) es de aproximadamente 2 nm o menor de 2 nm, entonces el poro es denominado microporo, si es mayor de 2 nm pero menor de 50 nm se denomina mesoporo (o nanoporo), y si es de aproximadamente 50 nm o mayor de 50 nm, entonces es un macroporo. Teniendo en cuenta esta clasificación, se considera que un material es microporoso cuando el tamaño promedio de los poros de dicho material es de aproximadamente 2 nm o menor de 2 nm, que es mesoporoso (o nanoporoso) cuando el tamaño promedio de los poros de dicho material es mayor de 2 nm pero menor de 50 nm, y que es macroporoso cuando el tamaño promedio de los poros de dicho material es de aproximadamente 50 nm o mayor de 50 nm. En una realización preferida del nanosensor de la invención, la nanopartícula es microporosa, mesoporosa o macroporosa. Preferiblemente, la nanopartícula de la invención es mesoporosa. Más preferiblemente, la nanopartícula es una nanopartícula de sílice mesoporosa.

Ejemplos de tipos de nanopartículas porosas incluyen, sin limitar a, MCM-41 , MCM-48 (tridimensional cúbica), MCM-50 (fase laminar), de la familia SBA (Sania Barbara Amorphous) de diferentes tipos SBA-1 , SBA-2, SBA-3, SBA-6, SBA-8, SBA-11 , SBA- 12, SBA-14 SBA-15, SBA-16; de la familia FSM, como FSM-16, HMS, MSU como MSU- 1 , MSll-2, MSll-3, MSLI-V, o KIT-1. Así, en otra realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la nanopartícula es de una tipología que se selecciona de la lista que consiste en MCM-41 , MCM-48, MCM-50, SBA-1 , SBA-2, SBA-3, SBA-6, SBA-8, SBA-11 , SBA-12, SBA-14 SBA-15, SBA-16, FSM-16, HMS, MSU-1 , MSU-2, MSU-3, MSU-V y KIT-1.

Aún más preferiblemente, la nanopartícula es una nanopartícula de sílice mesoporosa de tipo MCM-41. El término “MCM-41” (por sus siglas en inglés, Mobil Composition of Matter 41) se refiere a un material mesoporoso que forma parte de una familia de sólidos de silicato, que presenta una disposición ordenada de mesoporos cilindricos cuyo diámetro oscila entre 2 nm y 6,5 nm. Estos mesoporos ajustables de forma independiente forman un sistema de poros único y unidimensional que tiene una distribución de poros definida y una gran superficie y volumen de poros.

Los métodos para determinar el tamaño del poro son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Ejemplos de estos métodos incluyen, sin limitar a, experimentos de adsorción-desorción, porosimetría de mercurio, SAS (small-angle scattering), NMR (nuclear magnetic resonance) y STM-AFM (scanning tunneling and atomic force microscopies) entre otros. En una realización preferida del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el tamaño medio del poro es de 1 a 5 nm (incluyendo los valores extremos del rango), preferiblemente el tamaño medio del poro es de 2 a 3 nm (incluyendo los valores extremos del rango).

En relación con la nanopartícula porosa, otro parámetro de la misma a tener en cuenta es su porosidad. La porosidad se define como medida de espacios vacíos en un material, y es una fracción del volumen de huecos sobre el volumen total del material que va desde el 0 al 1 o, si se expresa en porcentaje, desde 0 a 100%. La porosidad de un sistema puede ser medida por diversos métodos. El más simple es el método directo, en el cual el volumen total del sistema es medido y posteriormente la muestra es compactada para remover todo el espacio poroso. Luego la diferencia de estos volúmenes nos da la porosidad total del sistema. Para medir la porosidad accesible el método más ampliamente utilizado es el llamado expansión de gas, pero existen otros como la microscopía óptica de polarización, o la microscopía electrónica de barrido. Respecto a los métodos indirectos de la medida de la porosidad, estas técnicas consisten en la introducción de fluidos (líquidos como el agua o el mercurio, o gases como el nitrógeno o el helio) en los espacios vacíos del material, y determinar el volumen de fluido introducido, lo que indica el volumen de vacíos existente. En la presente invención, la nanopartícula porosa puede comprender cualquier porosidad. No obstante, preferiblemente la nanopartícula porosa comprende un volumen de poro de 1 ,5 cm ³ /g. En otra realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la nanopartícula porosa comprende un área superficial de 1000 a 1700 m ² /g (incluyendo los valores extremos del rango), más preferiblemente de 1200 a 1500 m ² /g (incluyendo los valores extremos del rango). Aún más preferiblemente la nanopartícula porosa comprende un área superficial seleccionado de la lista que consiste en 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 y 1500 m ² /g.

En otra realización aún más preferida, la nanopartícula porosa comprende un volumen de poro de 1 ,5 cm ³ /g y comprende un área superficial de 1200 a 1500 m ² /g (incluyendo los valores extremos del rango).

Como ya se ha mencionado, otra característica de la nanopartícula porosa es que comprende al menos un poro con acceso al exterior de la nanopartícula porosa. Preferiblemente, comprende una pluralidad de poros con acceso al exterior de la nanopartícula porosa.

Dicho acceso al exterior del poro está bloqueado en ausencia de la escopolamina y/o derivados de la misma, tal y como se explica más adelante en mayor detalle, por un receptor muscarínico M2-AChR, lo que impide la salida al medio del indicador. En concreto, el receptor muscarínico M2-AChR bloquea dicho acceso al exterior mediante su interacción con un agonista no selectivo del receptor muscarínico M2-AChR, que a su vez se encuentra unido a la superficie de la nanopartícula porosa. En presencia de la escopolamina y/o derivados de la misma, el acceso al exterior del poro queda desbloqueado, al desplazarse el receptor muscarínico M2-AChR debido al reconocimiento y unión a dicho/s analito/s.

Además, como ya se ha mencionado, el nanosensor de la invención comprende un indicador situado en el interior del poro. En la presente invención, el término “indicador” se refiere a cualquier compuesto o molécula susceptible de ser detectada, visualizada y/o cuantificada. Además, el término indicador, puede ser intercambiado por compuesto o molécula “indicadora”, “señal” o “reportera”.

Ejemplos de indicadores incluyen, sin limitarse a, colorantes, fluoróforos, sustancias con actividad redox, con resonancia plasmónica o biológicamente activas como agentes citotóxicos, proteínas, pequeñas biomoléculas, enzimas o fragmentos de ácidos nucleicos. Así en una realización preferida del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el indicador se selecciona de una lista que consiste en colorantes, fluoróforos, sustancias con actividad redox, con resonancia plasmónica o biológicamente activas como agentes citotóxicos, proteínas, pequeñas biomoléculas, enzimas o fragmentos de ácidos nucleicos.

En una realización más preferida del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el indicador es un colorante, aún más preferiblemente un colorante fluorescente. Incluso aún más preferiblemente, el indicador es rodamina B.

Otro de los componentes del nanosensor de la invención es un agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ unido a la superficie de la nanopartícula porosa.

Dicha unión a la superficie de la nanopartícula porosa puede producirse mediante un enlazador, linker, o grupos funcionales, que facilitan su unión mediante interacciones electrostáticas, supramoleculares o de forma covalente. De hecho, en el nanosensor de la invención, dicho agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M2, puede estar unido a la superficie de la nanopartícula porosa mediante grupos funcionales. Es decir, la nanopartícula porosa puede estar funcionalizada en la superficie externa estando unido el agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ a la superficie de la nanopartícula porosa.

En una realización preferida del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ está unido a la superficie de la nanopartícula porosa mediante un enlace covalente. Más preferiblemente, está unido mediante un enlace covalente formado a través de un trialcoxisilano. Aún más preferiblemente, está unido mediante un formado a través de un trialcoxisilano en presencia de anhídrido benzoico y ZnCI ₂ . Incluso aún más preferiblemente, está unido mediante un enlace covalente formado entre un trialcoxisilano que presenta el grupo funcional COOH con un carbamato del agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ en presencia de anhídrido benzoico y ZnCI2

El término “agonista” referido al receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ , se refiere a un agente que activa la actividad de un receptor muscarínico de acetilcolina. Ejemplos de agonistas no selectivos del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ , incluyen, sin limitar a, betanecol, cloruro de carbamil-p-metilcolina, carbacol, furmetida, oxotremohna-M, Iperoxo, McNA343, N-desmetilclozapina, xanomelina, o Gi-JR-6 y JR-7. En la presente invención, el agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M2 presenta una afinidad por dicho receptor menor que la escopolamina.

En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el agonista no selectivo del receptor muscarínico se selecciona de la lista que consiste en betanecol, cloruro de carbamil-p-metilcolina, carbacol, furmetida, oxotremorina-M, Iperoxo, McNA343, N-desmetilclozapina, xanomelina, o Gi-JR-6 y JR- 7.

En una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el agonista no selectivo del receptor muscarínico es betanecol o sales del mismo, más preferiblemente cloruro de carbamil-p-metilcolina.

El “betanecol” es un agonista muscarínico conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, por su uso generalizado para aumentar el tono del músculo liso o la esofagitis por reflujo, cuya fórmula molecular es C7H17N2O2. El “cloruro de carbamil-p-metilcolina” (número de registro Cas: 590-63-6), también denominado cloruro de betanecol, es una sal del betanecol, cuya fórmula molecular es C7H17N2O2CI, y que químicamente se caracteriza por ser una sal de amonio cuaternario, de naturaleza muy polar y con una alta solubilidad en medios acuosos (hidrofílica).

Por último, el nanosensor de la invención comprende un receptor muscarínico M2-AChR, situado en el exterior de la nanopartícula porosa, que reconoce un analito, en donde el analito es escopolamina y/o derivados de la misma, en donde el receptor muscarínico M ₂ -AChR se dispone en una posición tal que:

(i) en ausencia del analito, el receptor muscarínico M ₂ -AChR bloquea el acceso al exterior del poro, impidiendo la salida del indicador, y

(¡i) en presencia del analito, el receptor muscarínico M2-AChR, reconoce y se une a dicho analito, y desbloquea el acceso al exterior del poro, permitiendo la salida del indicador.

El término “receptor muscarínico M2-AChR”, se refiere a una proteína, en concreto, uno de los cinco subtipos de receptores muscarínicos conocidos en el estado de la técnica para el neurotransmisor acetilcolina. En la presente invención, el receptor muscarínico M2-AChR está situado en el exterior de la nanopartícula porosa. En concreto, el receptor se sitúa en el exterior de la nanopartícula porosa y es un receptor que reconoce escopolamina y/o derivados de la misma de forma específica.

Además, dicho receptor se encuentra dispuesto en una posición tal que:

(i) en ausencia del analito, el receptor muscarínico M ₂ -AChR bloquea el acceso al exterior del poro, impidiendo la salida del indicador, y

(¡i) en presencia del analito, el receptor muscarínico M ₂ -AChR, reconoce y se une a dicho analito, y desbloquea el acceso al exterior del poro, permitiendo la salida del indicador.

Así, en ausencia del analito, el receptor muscarínico M2-AChR bloquea el acceso al exterior del poro, interaccionando de forma no covalente con el agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M2. En esta posición, se impide la salida del indicador. Cuando se menciona que se impide la salida del indicador, se refiere a que la salida del mismo es inexistente o a un nivel basal.

En presencia del analito, el receptor muscarínico M ₂ -AChR, reconoce dicho analito, en la presente invención escopolamina y/o derivados de la misma, desbloqueando el acceso al exterior del poro. El desbloqueo se explica por el reconocimiento del receptor M ₂ -AChR y unión al analito, el cual tiene mayor afinidad por el receptor que por el agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ , de manera que el receptor deja de interactuar con el agonista mencionado y cambia de disposición, preferiblemente desplazándose. Así, en esta posición, el acceso al exterior del poro deja de estar bloqueado, permitiendo la salida del indicador.

La frase “salida del indicador”, se refiere a la salida del indicador al exterior del poro.

En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el receptor muscarínico M ₂ -AChR comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con la SEQ ID NO:1 ,

SEQ ID NO:1

MNNSTNSSNNSLALTSPYKTFEWFIVLVAGSLSLVTIIGNILVMVSIKVNRHLQTVN NY FLFSLACADLIIGVFSMNLYTLYTVIGYWPLGPVVCDLWLALDYWSNASVMNLLIISFD RYFCVTKPLTYPVKRTTKMAGMMIAAAWVLSFILWAPAILFWQFIVGVRTVEDGECYI QFFSNAAVTFGTAIAAFYLPVIIMTVLYWHISRASKSRIKKDKKEPVANQDPVSPSLVQ GRIVKPNNNNMPSSDDGLEHNKIQNGKAPRDPVTENCVQGEEKESSNDSTSVSAVA SNMRDDEITQDENTVSTSLGHSKDENSKQTCIRIGTKTPKSDSCTPTNTTVEWGSSG QNGDEKQN IVARKI VKMTKQPAKKKPPPSREKKVTRTI LAI LLAFI ITWAPYNVMVLI NTF CAPCIPNTVWTIGYWLCYINSTINPACYALCNATFKKTFKHLLMCHYKNIGATR

La SEQ ID NO:1 corresponde a la secuencia de aminoácidos del receptor muscarinico M ₂ -AChR de homo sapiens (NCBI Reference Sequence: NP_001365901.1). En una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el receptor muscarinico M ₂ -AChR comprende, o consiste en, la SEQ ID NO: 1.

En la presente invención se entiende por “identidad de secuencia” al grado de similitud entre dos secuencias aminoácidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos (o aminoácidos) puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST (S. F. Altschul, et al. Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410). Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

Como ya se ha mencionado, en la presente invención, el analito que reconoce el receptor muscarinico M ₂ -AChR es escopolamina y/o derivados de la misma. La escopolamina es un antagonista no selectivo y no competitivo de los receptores muscarínicos del neurotransmisor acetilcolina (Mi-Ms-AChR). En particular, la escopolamina es capaz de bloquear o amortiguar la respuesta biológica del receptor muscarinico M ₂ -AChR debido a su unión al sitio alostérico del mismo, el cual está separado del sitio de reconocimiento activo de la acetilcolina, lo que induce el aumento de los niveles de acetilcolina libre a nivel biológico. Además, el término escopolamina engloba también sales de la misma.

El término “derivados de la misma”, referido a escopolamina, se refiere a moléculas estructuralmente similares a la escopolamina y que tienen un efecto biológico equivalente a la escopolamina. Ejemplos de derivados de escopolamina incluyen sin limitar a, hioscina, hidrobromuro de O-acetilescopolamina, metobromuro de O- acetilescopolamina, O-metilescopolamina, clorosulfonil-escopolamina, N-óxido de escopolamina, escopolina, aposcopolamine, desoxiescopolamina, fenilciclopentiloacetato de escopolina, hidrobromuro (III) de 6-hidroxitropina tropato, metobromuro (IV), O-trimetilacetilescopolamina, hidrobromuro de O-a-etilbutiril- escopolamina, hidrobromuro de O-(2-etil-3-metilbutiril)-escopolamina, o metobromuro de O-(P-ciclopentilpropionil)-escopolamina.

Así, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el derivado de la escopolamina se selecciona de la lista que consiste en hioscina, hidrobromuro de O-acetilescopolamina, metobromuro de O- acetilescopolamina, O-metilescopolamina, clorosulfonil-escopolamina, N-óxido de escopolamina, escopolina, aposcopolamine, desoxiescopolamina, fenilciclopentiloacetato de escopolina, hidrobromuro (III) de 6-hidroxitropina tropato, metobromuro (IV), O-trimetilacetilescopolamina, hidrobromuro de O-a-etilbutiril- escopolamina, hidrobromuro de O-(2-etil-3-metilbutiril)-escopolamina, metobromuro de O-(P-ciclopentilpropionil)-escopolamina y combinaciones de los mismos.

Uso del nanosensor de la invención

El nanosensor de la invención, cuyos componentes y funcionamiento han sido descritos previamente, tiene aplicación en la detección de analitos de interés, en particular, en la detección de escopolamina y/o derivados de la misma.

Así, otro aspecto de la invención, de aquí en adelante “el uso del nanosensor de la invención”, se refiere al uso del nanosensor de la invención para la detección de escopolamina y/o derivados de la misma en una muestra.

El término “detectar” o “detección” se refiere a identificar o reportar el analito de interés, en la presente invención, escopolamina y/o derivados de la misma, en una muestra. Además, dicha detección incluye también en la presente invención la posibilidad de cuantificar el analito de interés.

En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el derivado de la escopolamina se selecciona de la lista que consiste en hioscina, hidrobromuro de O-acetilescopolamina, metobromuro de O- acetilescopolamina, O-metilescopolamina, clorosulfonil-escopolamina, N-óxido de escopolamina, escopolina, aposcopolamine, desoxiescopolamina, fenilciclopentiloacetato de escopolina, hidrobromuro (III) de 6-hidroxitropina tropato, metobromuro (IV), O-trimetilacetilescopolamina, hidrobromuro de O-a-etilbutiril- escopolamina, hidrobromuro de O-(2-etil-3-metilbutiril)-escopolamina, metobromuro de O-(P-ciclopentilpropionil)-escopolamina y combinaciones de los mismos.

En la presente invención se entiende por “muestra” a una parte o cantidad pequeña de una cosa que se considera representativa del total y que se toma o se separa de ella para someterla a estudio, análisis o experimentación. En la presente invención, dicho estudio, análisis o experimentación hace referencia a la presencia/ausencia de un analito, en concreto escopolamina y/o derivados de la misma. Ejemplos de muestras adecuadas para este uso de la invención incluyen, sin limitar a, muestras biológicas, muestras alimentarias y muestras ambientales.

En una realización preferida del uso del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra se selecciona de una lista que consiste en: muestra alimentaria, muestra ambiental y muestra biológica.

En la presente invención, se entiende por “muestra alimentaria” a aquella muestra aislada de un alimento, tanto sólido como líquidos, procesados o crudos.

En la presente invención, se entiende por “muestra ambiental” aquella muestra que procede del entorno o del medio ambiente, tal como aguas residuales industriales o caseras, soluciones laboratoriales como soluciones tampón, líquidos de cultivo, soluciones de reacción, lavados y similares.

El término “muestra biológica” en la presente invención se refiere a cualquier muestra aislada de un sujeto a partir de la cual se realiza la detección e incluye, pero sin limitarnos a, fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin.

Ejemplos de muestras biológicas incluyen, sin limitarse a, saliva, suero, plasma, orina sudor, lágrimas, mucosa nasal o cabello. En una realización preferida del uso del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra es una muestra biológica aislada de un sujeto seleccionada de la lista que consiste en saliva, suero, plasma, orina, sudor, lágrimas, mucosa nasal y cabello. Más preferiblemente, la muestra biológica aislada del sujeto es de saliva.

Además, en la presente invención, la saliva puede encontrarse diluida, por ejemplo, sin limitación, con tampón Tris-HCI (Tris es el nombre abreviado de tris(hidroximetil)aminometano). Por tanto, en una realización preferida del uso del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la saliva está diluida entre el 1 y el 60% (incluyendo los valores extremos del rango), más preferiblemente entre el 15 y 50% (incluyendo los valores extremos del rango), aún más preferiblemente, diluida al 30%.

El término “sujeto”, tal como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a cualquier animal, preferiblemente un mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates, y humanos. En una realización preferida del uso del nanosensor de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano. Así, preferiblemente, la muestra biológica es aislada de un ser humano. Más preferiblemente, la muestra biológica aislada es saliva de un ser humano.

En la presente invención, la muestra puede ser tratada comprendiendo algún tampón o buffer conocido en el estado de la técnica. En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas del uso del nanosensor de la invención, la muestra comprende tampón Tris-HCI. Más preferiblemente, la muestra comprende tampón Tris-HCI a pH 8,0.

Método de detección de la invención

De manera análoga al uso del nanosensor descrito en párrafos anteriores, en la presente invención también se contempla un método de detección in vitro de escopolamina y/o derivados de la misma.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método de detección in vitro de escopolamina y/o derivados de la misma, de aquí en adelante el “método de detección de la invención”, que comprende: a) poner en contacto el nanosensor de la invención con una muestra, y b) detectar el indicador en el medio, en donde la presencia del indicador en el medio es indicativa de la presencia de la escopolamina y/o derivados de la misma en la muestra.

Los términos “detectar”, “muestra”, “sujeto”, “indicador”, y “escopolamina y/o derivados de la misma” han sido definidos o explicados en párrafos anteriores, y dichas definiciones y realizaciones preferidas son aplicables al presente aspecto de la invención. Así, en una realización preferida del método de detección de la invención, la muestra se selecciona de una lista que consiste en: muestra alimentaria, muestra ambiental y muestra biológica. En una realización más preferida, la muestra es una muestra biológica aislada de un sujeto seleccionada de la lista que consiste en saliva, suero, plasma, orina, sudor, lágrimas, mucosa nasal y cabello. Aún más preferiblemente, la muestra es de saliva.

Además, en la presente invención, la saliva puede encontrarse diluida. Por tanto, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la saliva está diluida entre el 15 y 50%, preferiblemente, diluida al 30%.

En otra realización preferida del método de detección de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano. Así, preferiblemente, la muestra biológica es aislada de un ser humano. Más preferiblemente, la muestra biológica aislada es saliva de un ser humano.

En una primera etapa del método de detección de la invención, la etapa a), comprende poner en contacto el nanosensor de la invención con una muestra. Dicha muestra ha podido ser tratada previamente a ser puesta en contacto con el nanosensor de la invención. Técnicas de manipulación o preparación de muestras para su análisis, en la presente invención, para la detección de escopolamina y/o derivados de la misma, son ampliamente conocidas en el estado de la técnica. Así, la muestra puede ser tratada comprendiendo algún tampón o buffer conocido en el estado de la técnica. En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra comprende una solución tampón de ths (tris(hidroximetil)aminometano), más preferiblemente tampón Tris-HCI. Aún más preferiblemente, la muestra comprende tampón Tris-HCI a pH 8,0.

En una segunda etapa, etapa b) del método de detección, comprende detectar el indicador en el medio. Los medios y técnicas necesarias para detectar y/o cuantificar el indicador en el medio son determinados por el indicador utilizado, y tales medios y técnicas son conocidos en el estado de la técnica. Ejemplos de métodos o técnicas incluyen, sin limitarse a, observación visual, espectroscopia de fluorescencia y espectrofotometría ultravioleta- visible. En una realización preferida del método de detección de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la detección y/o la cuantificación se realiza por medición de la intensidad de fluorescencia del medio, más preferiblemente, la medición de la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de 572 nm del medio.

En el método de detección de la invención, la presencia del indicador en el medio es indicativa de la presencia de la escopolamina y/o derivados de la misma en la muestra. Esto se explica por el funcionamiento del nanosensor de la invención, de forma que la presencia de escopolamina y/o derivados de la misma provoca su unión a, o reconocimiento por parte de, el receptor muscarínico IVh-AChR, desbloqueando el acceso al exterior del poro, permitiendo la salida del indicador. Así, la detección del indicador indica la presencia de la escopolamina y/o derivados de la misma en la muestra con la que se pone en contacto el nanosensor de la invención.

Kit de la invención y sus usos

La puesta en práctica del uso y método de detección de la invención, anteriormente descritos, comprende el empleo del nanosensor de la invención, el cual puede estar formando parte de un kit.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit, de ahora en adelante el “kit de la invención”, que comprende el nanosensor de la invención. Además del nanosensor de la invención, el kit puede comprender otros componentes útiles en la puesta en práctica de la presente invención, tales como, buffers, vehículos de entrega, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Además de los componentes mencionados, el kit puede incluir también instrucciones para practicar el objecto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en el kit mencionado en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en el kit.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para la detección de escopolamina y/o derivados de la misma en una muestra, de aquí en adelante el “uso del kit de la invención”.

En una realización preferida, la muestra se selecciona de una lista que consiste en: muestra alimentaria, muestra ambiental y muestra biológica. Más preferiblemente, la muestra es una muestra biológica aislada de un sujeto seleccionada de la lista que consiste en saliva, suero, plasma, orina, sudor, lágrimas, mucosa nasal y cabello.

En una realización preferida del uso del kit de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano. Así, preferiblemente, la muestra biológica es aislada de un ser humano. Más preferiblemente, la muestra biológica aislada es saliva de un ser humano.

Los términos empleados para definir el kit de la invención y su uso, han sido definidos y explicados previamente en otros aspectos de la presente invención, y son aplicables al kit de la invención y al uso del kit de la invención.

Método de preparación del nanosensor de la invención

Otro aspecto de la presente invención es un método para preparar el nanosensor de la invención, de aquí en adelante el “método de preparación de la invención”, que comprende:

-introducción de un indicador en el interior del poro de una nanopartícula porosa, -funcionalización de la nanopartícula porosa con un agonista no selectivo del receptor muscarínico M2-AchR, y

-adición de un receptor muscarínico M2-AchR que reconoce escopolamina y/o derivados de la misma.

Una etapa del método de preparación de la invención, comprende la introducción de un indicador en el interior del poro de una nanopartícula porosa.

En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el indicador se selecciona de una lista que consiste en colorantes, fluoróforos, sustancias con actividad redox, con resonancia plasmónica o biológicamente activas como agentes citotóxicos, proteínas, pequeñas biomoléculas, enzimas o fragmentos de ácidos nucleicos. En una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el indicador es un colorante, aún más preferiblemente un colorante fluorescente. Incluso aún más preferiblemente, el indicador es rodamina B.

Una segunda etapa del método de preparación de la invención comprende la funcionalización de la nanopartícula porosa con un agonista no selectivo del receptor muscarínico M ₂ -AchR. En la presente invención, el término “funcionalizar” o “funcionalización” hace referencia la modificación química con grupos funcionales de la nanopartícula porosa, en particular, a la modificación química de su superficie.

En una realización preferida del método de preparación de la invención, la funcionalización se hace a través de un trialcoxisilano. Más preferiblemente, a través de un trialcoxisilano en presencia de anhídrido benzoico y ZnCI ₂ . Incluso aún más preferiblemente, la funcionalización se hace a través de un trialcoxisilano que presenta el grupo funcional COOH con un carbamato del agonista no selectivo del receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ en presencia de anhídrido benzoico y ZnCI ₂ .

Una tercera etapa del método de preparación de la invención, comprende la adición de un receptor muscarínico M ₂ -AchR que reconoce escopolamina y/o derivados de la misma.

En una realización preferida del método de preparación de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el receptor muscarínico M ₂ -AChR comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con la SEQ ID NO:1 , La SEQ ID NO:1 corresponde a la secuencia de aminoácidos del receptor muscarínico M2-AChR de homo sapiens (NCBI Reference Sequence: NP_001365901.1). En una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el receptor muscarínico M2-AChR comprende, o consiste en, la SEQ ID NO: 1.

En una realización preferida del método de preparación de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el agonista no selectivo del receptor muscarínico IVh-AchR se selecciona de la lista que consiste en betanecol, cloruro de carbamil-p-metilcolina, carbacol, furmetida, oxotremorina-M, Iperoxo, McNA343, N-desmetilclozapina, xanomelina, Gi-JR-6 y JR-7.

En otra realización más preferida del método de preparación de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el agonista no selectivo del receptor muscarínico IVh-AchR es betanecol o sales del mismo, preferiblemente cloruro de carbamil-p-metilcolina.

En otra realización preferida del método de preparación de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la nanopartícula porosa es una nanopartícula de sílice. Más preferiblemente, la nanopartícula de sílice es mesoporosa. En algunas realizaciones preferidas, solas o en combinación con otras realizaciones preferidas, la nanopartícula porosa tiene un diámetro promedio de entre 1.000 nm y 40 nm, entre 750 nm y 40 nm, entre 500 nm y 40 nm, entre 250 nm y 40 nm, entre 200 nm y 40 nm, entre 150 nm y 40 nm. En algunas realizaciones más preferidas, la nanopartícula porosa tiene un diámetro promedio de entre 100 y 120 nm (incluyendo los valores extremos del rango). En otra realización aún más preferida, la nanopartícula porosa es esférica y tiene un diámetro promedio de entre 100 y 120 nm (incluyendo los valores extremos del rango).

Aún más preferiblemente, la nanopartícula es una nanopartícula de sílice mesoporosa de tipo MCM-41.

En otra realización preferida del método de preparación de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el tamaño medio del poro de la nanopartícula es de 1 a 5 nm (incluyendo los valores extremos del rango), más preferiblemente el tamaño medio del poro es de 2 a 3 nm (incluyendo los valores extremos del rango).

Además, como ya se ha comentado en un aspecto de la invención anterior, la nanopartícula porosa puede comprender cualquier porosidad. No obstante, preferiblemente la nanopartícula porosa comprende un volumen de poro de 1 ,5 cm ³ /g. En otra realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la nanopartícula porosa comprende un área superficial de 1000 a 1700 m ² /g (incluyendo los valores extremos del rango), más preferiblemente de 1200 a 1500 m ² /g (incluyendo los valores extremos del rango). Aún más preferiblemente la nanopartícula porosa comprende un área superficial seleccionado de la lista que consiste en 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 y 1500 m ² /g.

En otra realización aún más preferida, la nanopartícula porosa comprende un volumen de poro de 1 ,5 cm ³ /g y comprende un área superficial de 1200 a 1500 m ² /g (incluyendo los valores extremos del rango).

Algunos términos empleados para definir el método de preparación de la invención, han sido definidos y explicados previamente en otros aspectos de la presente invención, y son aplicables el presente aspecto de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Representación esquemática del nanosensor, y mecanismo de liberación de rodamina B del nanosensor en presencia de escopolamina. En ausencia de escopolamina, el receptor muscarínico de acetilcolina M ₂ (M ₂ -AchR) se dispone bloqueando el acceso al exterior de los poros al interactuar con el derivado de betanecol. En presencia de la escopolamina, el receptor muscarínico M ₂ -AchR se dispone de forma que desbloquea el acceso al exterior de los poros al reconocer la escopolamina y dejar de interaccionar con el derivado de betanecol, permitiendo la salida del indicador. La rodamina B.

Fig. 2. (a) Perfiles de liberación de rodamina B desde la nanopartícula porosa en tampón Tris-HCI a pH 8,0 en ausencia (línea más oscura inferior) y en presencia (línea más clara superior) de escopolamina (2,7 mM). (b) Intensidad de fluorescencia de la rodamina B liberada desde el interior del poro de la nanopartícula porosa en presencia de diferentes cantidades de escopolamina en tampón Tris-HCI a pH 8,0 tras 10 min de adición. Las barras de error se expresan como 3o para tres experimentos independientes. C SCP: Concentración de escopolamina.

Fig. 3. Emisión de rodamina B a una longitud de onda (A) de 572 nm (A _e xc = 565 nm) a partir de una suspensión tamponada de Tris-HCI en presencia de sustancias psicotrópicas comunes (345 pM) después de 2 min tras la adición. Las barras de error se expresan como 3o para tres experimentos independientes (***p < 0,0001). SCP: escopolamina; MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona; MDMA: 3,4- metilendioximetanfetamina; B: Blanco

Fig. 4. (a) Perfiles de liberación de rodamina B desde la nanopartícula porosa en saliva al 30% en ausencia (línea más oscura inferior) y en presencia (línea más clara superior) de escopolamina (2,7 mM). (b) Intensidad de fluorescencia de la rodamina B liberada desde el interior del poro de la nanopartícula porosa en presencia de diferentes cantidades de escopolamina en saliva extraída al 30% tras 10 min de adición. Las barras de error se expresan como 3o para tres experimentos independientes. C SCP: Concentración de escopolamina.

EJEMPLOS

A continuación, se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores:

1. Materiales y métodos

Técnicas generales: Se emplearon la difracción de rayos X en polvo (PXRD), el análisis termogravimétrico (TGA), el análisis elemental, la microscopía electrónica de transmisión (TEM), el infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR), la dispersión de luz dinámica (DLS) y las isotermas de adsorción-desorción de N2 para caracterizar los materiales sintetizados del nanosensor. Las mediciones de PXRD se realizaron en un difractómetro D8 Advance utilizando radiación Cu Ka (Bruker, Billerica, MA, USA).

Los análisis termogravimétricos se realizaron en una balanza TGA/SDTA 851 e (Mettler Toledo, Columbus, OH, EE.UU.) en una atmósfera oxidante (aire, 80 mL min' ¹ ) con un programa de velocidad de calentamiento entre 393-1273 °C a 10 °C min' ¹ , seguido de un paso de calentamiento isotérmico a 1273 °C durante 30 min. Las imágenes TEM se tomaron con un microscopio CM10 de 100 kV (Philips, Amsterdam, NL). Las mediciones FTIR se realizaron en un Tensor 27 (Bruker, Billerica, MA, USA). Los experimentos DLS se realizaron con un ZetaSizer Nano ZS (Malvern). Las isotermas de adsorción- desorción de N2 se registraron con un analizador automático Tristar II Plus (Micromeritics, Norcross, GA, EE.UU.). Las muestras se desgasificaron a 90 °C o 120 °C en vacío durante la noche.

Las áreas superficiales específicas se calcularon a partir de los datos de adsorción en el rango de baja presión utilizando el modelo Brunauer-Emmett-Teller (BET). El tamaño de los poros se determinó siguiendo el método Barrett-Joyner-Halenda (BJH). Las mediciones de espectroscopia de fluorescencia se realizaron en un Fluoromax4 de HORIBA Scientific. Se empleó una impresora de cera ColorQube8580 (Xerox) para generar las características del canal en las tiras de ensayo. Para el enfoque basado en el smartphone, se imprimió una caja 3D con PLA negro utilizando una impresora Ultimaker 3. Los LED y los filtros ópticos se compraron en Thorlabs. Se tomaron fotografías con un Samsung Galaxy S7 y se recuperaron los valores de las imágenes mediante la densidad integrada con el software ImageJ, es decir, el producto del valor medio de gris G, G = (rojo + verde + azul)/3, y el área seleccionada (en píxeles cuadrados).

Disolventes: Todos los disolventes eran de grado reactivo ACS o de mejor calidad y se utilizaron sin ninguna otra purificación. El etanol y el 1 ,4-dioxano se compraron a Scharlab S.L.

Reactivos químicos: Ortosilicato de tetraetilo (TEOS), bromuro de n-cetilthmetilamonio (CTABr), hidróxido de sodio, (3-aminopropil) trietoxisilano, anhídrido succínico, anhídrido benzoico, cloruro de zinc (ZnCh), cloruro de carbamil-p-metilcolina (cloruro de betanecol), rodamina B, ths(hidroximetil)aminometano (TRIS), clorhidrato de 3,4- metilendioxipirovalerona (MDPV) e hidrobromuro de escopolamina (SCP) se adquirieron en Sigma Aldrich (Madrid, España). El cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2-6H2O) y el ácido trifluoroacético (TFA) se compraron a Acros Organics. La proteína recombinante del receptor de acetilcolina muscarínico humano M2-AChR, (la secuencia del receptor de acetilcolina muscarínico humano corresponde a la SEQ ID NO: 1), se adquirió de Abeam PLC. Las tiras de fibra de vidrio (grado C) se obtuvieron de WhatmanTM y la almohadilla adsorbente se obtuvo de Ahlstrom. Las demás drogas analizadas, es decir, la morfina, la cocaína, la heroína y la MDMA, fueron facilitadas amablemente por la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS).

1.1. Desarrollo del nanosensor

1.1.1. Síntesis nanopartículas cargadas con rodamina:

En una síntesis típica, se suspendió una mezcla de las nanopartículas MCM-41 calcinadas (100 mg) y el colorante, rodamina B (38,32 mg, 0,8 mmol) en etanol (3,5 mL). La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 24 h para llevar a cabo el cargado de los poros del nanosensor.

1.1.2. Síntesis de sólido funcionalizado con betanecol

A continuación, se añade el derivado de tñalcoxisilano con el grupo funcional COOH (1 ,52 g, 4,73 mmol) y la suspensión final se agitó a temperatura ambiente durante 5,5 h. Finalmente, el sólido resultante se filtró y se secó al vacío durante toda la noche, dando lugar al sólido cargado y funcionalizado (164 mg).

El sólido anterior (164 mg) se suspendió en etanol (40 mL). Se añadieron sucesivamente a la solución anhídrido benzoico (1 ,07 g, 4,73 mmol) y ZnCh (26,86 mg, 4,73 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de añadir el cloruro de betanecol (930 mg, 4,73 mmol). La reacción se dejó a temperatura ambiente durante 2,5 h. Después, el sólido se aisló por centrifugación (12.000 rpm durante 5 min). El sólido final se secó durante toda la noche a 37 °C.

1.1.3. Adición de un receptor muscarínico M2-AChR

1 mg del nanosensor sin el receptor de acetilcolina muscarínico M2 (M2-AChR), se suspendió en 300 pL de tampón Tris-HCI (20 mM de Tris-HCI y MgCI2-6H2O, pH 8,0) antes de añadir la proteína recombinante del receptor de acetilcolina muscarínico M2- AChR humano (71 ,43 pL, 0,07 pg/pL). La mezcla se agitó en un termoagitador a 4 °C durante toda la noche. Después, la suspensión se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 minutos. El nanosensor final se obtuvo tras la eliminación del colorante no encapsulado mediante lavados con 1 mL de Tris-HCI a pH 8,0. 1.2. Cinética de la liberación del indicador

Se suspendió 1 mg del nanosensor en 800 pl de tampón Tris-HCI a pH 8,0 y este volumen se dividió en dos alícuotas de 400 pl. Ambas muestras se centrifugaron durante 5 min a 12.000 rpm y se midió la fluorescencia (A _exc = 565 nm, A _e mis¡ón = 572 nm) del sobrenadante (150 pL) para obtener el punto inicial. Este volumen se devolvió a la alícuota correspondiente. A continuación, se añadieron 54 pL de una solución de 20 mM de SCP en tampón Tris-HCI a una de las alícuotas (concentración final de 2,7 mM), y 54 pL de tampón Tris-HCI a la segunda alícuota, que constituía el control en blanco (denominado "alícuota en blanco" en lo sucesivo). Ambas suspensiones se agitaron a 25 °C durante un intervalo de tiempo determinado antes de tomar 150 pl de sobrenadante de ambas suspensiones, tratarlas y medirlas como se ha indicado anteriormente. Este procedimiento se repitió hasta que permitió construir la cinética de liberación del material sin tapar tanto en ausencia como en presencia del analito.

2. Resultados

2.1. Detección de en medio

Una vez confirmada la correcta síntesis y funcionalización de las nanopartículas, se corroboró el papel crucial que juega el receptor muscarínico M2 de acetilcolina (M2- AchR) mediante el estudio de la cinética de liberación del fluoróforo, rodamina B, de los poros de la nanopartícula en tampón Tris-HCI a pH 8,0 en ausencia y en presencia de escopolamina.

Tal y como se muestra en la Fig. 2a, la presencia de escopolamina provoca una liberación casi total del indicador, rodamina B, situado en el interior de los poros de la nanopartícula del nanosensor en tan solo 15 minutos, debido a la interacción preferencial del receptor M2 con la escopolamina que por la molécula de betanecol de la superficie. Sin embargo, en ausencia de escopolamina la liberación de la rodamina B es muy baja. Esto demuestra el buen funcionamiento del nanosensor para promover la liberación controlada de la rodamina B en presencia de escopolamina, permaneciendo en el interior del poro en ausencia de escopolamina.

Posteriormente, se evaluó la liberación de rodamina B del nanosensor en presencia de cantidades crecientes de escopolamina (de 2,24 a 3150 pM) en una solución tampón Tris-HCI a pH 8,0 (Fig. 2b). Los resultados obtenidos muestran un aumento de la emisión de rodamina B a medida que aumenta la concentración de escopolamina. A partir de la curva de calibrado se calculó un límite de detección (LOD) de 92 pM. La dosis oral máxima de escopolamina para fines médicos es de 80 mg en 150 mL de agua (264 pM), mientras que 100 mg (330 pM) pueden producir un estado de sumisión o incluso pueden llegar a ser letales en adultos. Por lo tanto, el límite de detección alcanzado permite identificar de forma fiable la escopolamina con el nanosensor desarrollado, permitiendo la identificación de casos de sumisión química.

2.2. Evaluación de la selectividad del nanosensor

Posteriormente, se evaluó la selectividad del nanosensor en solución tampón conteniendo otras drogas psicoactivas comunes cuyo consumo está ampliamente extendido, como son la morfina, cocaína, MDMA, heroína y MDPV. Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 3, donde se puede ver que sólo la presencia de escopolamina induce una notable liberación de la carga mientras que, para el resto de las drogas ensayadas, la liberación de rodamina B es mucho menos representativa (menor del 30%).

Por tanto, los resultados indican que el nanosensor muestra una alta selectividad hacia la escopolamina debido a la escasa interacción de los estupefacientes ensayados con el receptor M2-AchR.

2.3. Detección de escopolamina en muestra de saliva

Finalmente, el nanosensor desarrollado se validó en un medio competitivo complejo como la saliva para la detección de escopolamina. En este estudio, se llevaron a cabo ensayos de liberación similares a los llevados a cabo en tampón, pero en saliva diluida al 30%, con o sin escopolamina. Como se ¡lustra en la Fig. 4a, se produce un aumento significativo de la emisión de fluorescencia de la rodamina B liberada del poro de la nanopartícula en presencia de escopolamina. Además, se midió la sensibilidad del nanosensor en muestra de saliva, mostrando un límite de detección para escopolamina de 103 pM (Fig. 4b).