SECTOR DE LA TÉCNICA

Aplicaciones bactericidas y fungicidas en el sector de los implantes quirúrgicos, instalaciones de uso público (sanitarias y hospitalarias, transporte,

I O etc.), equipos de aire acondicionado, alimentación, dental, pinturas, prendas de vestir, embalajes (alimentos, domésticos, farmacéuticos, dispositivos médicos, etc.).

5 ESTADO DE LA TÉCNICA

Son bien conocidas las propiedades antibacterianas de Ia plata en bajas concentraciones frente a una amplia gama de patógenos, incluidas las cepas de bacterias comunes causantes de las infecciones asociadas a implantes, así 0 como su no toxicidad para células de mamíferos. La mayor parte de los biomateriales que contienen plata como sustancia antimicrobiana consisten en Ia forma elemental o catiónica del metal soportada tanto por matrices orgánicas como inorgánicas. Está estudiada Ia actividad antimicrobiana en los casos de polímeros y biovidrios que contienen plata, pero no es así en el caso de 5 materiales compuestos nanoestructurados fosfato de calcio-plata.

Recientemente, se han publicado estudios sobre Ia obtención de compuestos de hidroxiapatita (HA) con Ag mediante métodos de intercambio iónico (sol-gel o coprecipitación) [Han l-H,Lee I-S, Song J-H, Lee M-H, Park J-0 C, Lee G-H, Sun X-D, Chung S-M. Characterization of a silver-incorporated calcium phosphate film by RBS and ¡ts antimicrobial effects. Biomed. Mater. 2007; 2(3): S91-4; Chen W, Oh S, Ong A P, Oh N, Liu Y, Courtney H S, Appleford M and Ong J L 2007 J. Biomed. Mater. Res. A 82 899; Cheng R J, Hsieh M F, Huang K C, Perng L H, Chou F I and Chin T S 2005 Journal of Solid Science and Technology 33 229; Rameshbabu N, Sampath Kumar T S, Prabhakar T G, Sastry V S, Murty K V G K and Prasad Rao K 2007 J. Biomed. Mater. Res. A 80 581]. Esas rutas implican Ia sustitución de calcio por plata, obteniéndose hidroxiapatita deficiente en calcio. La respuesta antimicrobiana ante estos materiales es buena, pero se ha observado que presentan dos desventajas principales: i) Ia deficiencia en calcio puede tener efectos negativos sobre Ia estabilidad estructural de las nanopartículas de HA, además de en su capacidad osteoconductora de Ia HA, y ii) dependiendo del pH, se puede producir una liberación de Ia plata más rápida de Io deseable. Esto último ha provocado un aumento del interés en las nanopartículas de plata como una fuente bactericida gracias a su baja solubilidad en medios acuosos.

La actividad biocida de las nanopartículas de plata está influenciada por el tamaño de las mismas: a menor tamaño, mayor actividad antimicrobiana, por Io que Ia aglomeración de las nanopartículas presenta un problema. Una solución para evitar esa desventaja es trabajar con las nanopartículas soportadas sobre Ia superficie de distintos sustratos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Descripción Breve

Un objeto de Ia invención Io constituye un polvo nanocompuesto o nanoestructurado, en adelante polvo nanocompuesto de Ia invención, constituido por un fosfato calcico, preferentemente con tamaño de partícula inferior a 150 nm y que tiene adherida en su superficie nanopartículas de Ag, preferentemente inferiores a 50 nm. Un objeto particular de Ia invención Io constituye el polvo nanocompuesto en el que el fosfato calcico pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: hidroxiapatita, α-TCP, β-TCP y/o mezclas de ellos, preferentemente hidroxiapatita (HA).

Otro objeto de Ia invención Io constituye un procedimiento de obtención del polvo nanocompuesto de Ia invención, en adelante procedimiento de Ia invención, que comprende las siguientes etapas: a. Preparación del fosfato calcico nanométrico a partir de una ruta de procesamiento sol-gel, y b. Deposición de nanopartículas de plata en Ia superficie del fosfato calcico.

Otro objeto de Ia invención Io constituye el uso del polvo nanocompuesto de Ia invención en Ia elaboración de una composición bactericida y/o fungicida útil como desinfectante universal para aplicaciones pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, al siguiente grupo: implantes quirúrgicos, instalaciones de uso público -sanitarias y hospitalarias, transporte, etc.-, alimentación, dental, pinturas, prendas de vestir y embalajes - alimentos, farmacéuticos, dispositivos médicos.

Descripción Detallada

En esta invención se describe un polvo nanoestructurado constituido por nanopartículas de HA, de tamaño inferior a 140 nm, con nanopartículas metálicas de Ag adheridas a Ia superficie y homogéneamente dispersas, con tamaño de partícula inferior a 50 nm (Figuras 1 y 2), con actividad bactericida y fungicida basado en fosfatos de calcio como sustrato con nanopartículas de plata en su superficie. Asimismo, se presenta un procedimiento alternativo, sencillo y de bajo coste para Ia obtención de dicho material compuesto nanoestructurado, más concretamente a través de dos métodos diferentes (Ejemplo 1).

La primera ventaja que aporta Ia presente invención respecto al estado de Ia técnica actual Io constituye el hecho de que se evita Ia aglomeración de las nanopartículas por encontrarse adheridas a Ia superficie de un sustrato. La segunda ventaja es su eficiencia bactericida y fungicida, similar a Ia de productos comerciales (Ejemplo 2). La tercera ventaja es su baja toxicidad, puesta de manifiesto al comprobar que este material lixivia 2 órdenes de magnitud menos de plata en el caso de HA/Ag (<5 ppm) que en el caso de Vitelinato (aprox., 800-1300 ppm), Io que implica una toxicidad muy inferior a Ia del producto comercial y muy por debajo del nivel tóxico (La cantidad de plata utilizada es del orden de 1% en peso), y con una eficacia similar (Ejemplo 2). Además, Ia liberación de Ia plata es mucho más lenta y controlada que en el caso de los materiales en los que el Ca se ha sustituido por Ag, como se ha podido comprobar por análisis cuantitativo de Ia plata lixiviada. Por tanto, dado el efecto sinérgico del calcio y Ia plata en el comportamiento bactericida y fungicida, este nuevo material puede ser utilizado como desinfectante universal.

Así, un objeto de Ia invención Io constituye un polvo nanocompuesto o nanoestructurado, en adelante polvo nanocompuesto de Ia invención, constituido por un fosfato calcico, preferentemente con tamaño de partícula inferior a 150 nm y que tiene adherida en su superficie nanopartículas de Ag, preferentemente inferiores a 50 nm.

Un objeto particular de Ia invención Io constituye el polvo nanocompuesto en el que el fosfato calcico pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: hidroxiapatita, α-TCP, β-TCP y/o mezclas de ellos, preferentemente hidroxiapatita (HA).

Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el polvo nanocompuesto en el que el contenido en partículas metálicas de plata está comprendido entre 0.01 % y 8% en peso, siendo el porcentaje óptimo el 1% en peso de plata.

Otro objeto de Ia invención Io constituye un procedimiento de obtención del polvo nanocompuesto de Ia invención, en adelante procedimiento de Ia invención, que comprende las siguientes etapas: a. Preparación del fosfato calcico nanométrico a partir de una ruta de procesamiento sol-gel, y b. Deposición de nanopartículas de plata en Ia superficie del fosfato calcico.

Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de Ia invención en el que en Ia etapa a) el fosfato calcico se ha preparado mediante un procedimiento sol-gel, que comprende las siguientes etapas: a) Preparación de las correspondientes disoluciones acuosas con Ia cantidad necesaria de trietil fosfito y nitrato calcico para obtener en Ia mezcla final Ia relación molar Ca/P deseada, preferentemente 1.67 en el caso de Ia hidroxiapatita, b) Goteo de Ia disolución con fósforo sobre Ia de calcio mientras se agita fuertemente, manteniendo condiciones controladas de temperatura y pH, c) Agitación de Ia suspensión coloidal resultante y posterior envejecimiento a temperatura ambiente, preferentemente durante 24 horas, para formar un gel, y d) Secado del gel en estufa de vacío hasta Ia eliminación completa del disolvente y calcinación a temperaturas comprendidas entre 500°C y 1000°C, preferentemente 550°C, para obtener el polvo de tamaño nanométrico y bien cristalizado. Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de Ia invención en el que en Ia etapa b) comprende los siguientes pasos (Método 1): a) Preparación de una suspensión acuosa con el polvo obtenido en 6, ajustando el pH a 5 y a Ia que se Ie añade un surfactante aniónico en baja concentración, b) Adición, en ausencia de luz, de una disolución acuosa de Ia sal de plata precursora con Ia concentración necesaria para que el contenido de plata elemental esté comprendida entre el 0.01 y el 8% peso en el compuesto final, referido al contenido en sólidos de fosfato calcico, preferentemente al 1% en peso de plata, c) Agitación fuerte de Ia suspensión, ajustando el pH a 9, de modo que se precipitan cationes Ag ⁺ como óxido, Ag ₂ O, d) Filtrado, lavado con agua destilada y secado del polvo resultante, y e) Reducción en atmósfera de H ₂ /Ar en el intervalo de temperaturas comprendido entre 150 y 50O ⁰ C ₁ preferentemente 350 ⁰ C.

Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de Ia invención en el que en Ia etapa b) comprende los siguientes pasos (Método 2): a) Preparación de una suspensión acuosa con el polvo de hidroxiapatita obtenido en 6 a Ia que se Ie añade un surfactante aniónico en baja concentración, b) Ajuste del pH a 7 con una disolución acuosa de NaOH 0.1 N, c) Aplicación de una sonda de ultrasonidos durante 1-10 minutos y completa homogeneización y disgregación en molino de bolas, d) Adición gota a gota de Ia cantidad necesaria de Ia disolución del precursor de plata, AgNOβ, para obtener en el producto final una concentración de Ag ⁰ comprendida entre el 0.01 y el 8% peso en el compuesto final, manteniendo fuerte agitación durante 10 minutos, preferentemente al 1% en peso de plata, e) Reducción química in situ de Ia plata, utilizando cualquier agente reductor, preferentemente NaBH ₄ , que se adiciona gota a gota a Ia dispersión manteniendo Ia agitación fuerte, y f) Filtrado, lavado con agua destilada y secado en estufa a 60°C.

Por último, otro objeto de Ia invención Io constituye el uso del polvo nanocompuesto de Ia invención en Ia elaboración de una composición bactericida y/o fungicida útil como desinfectante universal para aplicaciones pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, al siguiente grupo: implantes quirúrgicos, instalaciones de uso público -sanitarias y hospitalarias, transporte, etc.-, alimentación, dental, pinturas, prendas de vestir y embalajes - alimentos, farmacéuticos, dispositivos médicos.

DESCRIPCIÓN DE FIGURAS

Figura 1.- Micrografía obtenida por Microscopía Electrónica de Transmisión en Ia que se muestra Ia distribución homogénea de nanopartículas de plata menores de 20 nm adheridas a Ia superficie de una nanopartícula de hidroxiapatita de tamaño 140 nm, aproximadamente obtenidas mediante el método 1.

Figura 2.- Micrografía obtenida por Microscopía Electrónica de Transmisión en Ia que se muestra un polvo nanocompuesto obtenido por el método 2, donde se observa que las nanopartículas de Ag son menores de 15 nm.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1.- Procedimiento de obtención de los polvos nanocompuesto de Ia invención A continuación se describe el procedimiento de obtención del polvo nanocompuesto de Ia invención que comprende dos etapas principales de preparación del fosfato calcico nanométrico a partir de una ruta de procesamiento sol-gel, y de una deposición de nanopartículas de plata en Ia superficie del fosfato calcico, y que a continuación se detallan.

1.1.- Síntesis de hidroxiapatita (HA) como fosfato de calcio

Los precursores utilizados para Ia síntesis de HA utilizados fueron trietilfosfito (98%, Aldrich) y nitrato calcico tetrahidratado (>99%, Fluka). El procedimiento seguido es el que se detalla a continuación:

1.- Se preparan las correspondientes disoluciones acuosas con Ia cantidad necesaria de estos precursores para obtener en Ia mezcla final una relación molar Ca/P de 1.67, 2.- La disolución de trietilfosfito se añade gota a gota sobre Ia de calcio mientras se agita fuertemente, manteniendo condiciones controladas de temperatura y pH,

3.- La suspensión coloidal resultante se mantiene en agitación y, después de un envejecimiento a temperatura ambiente de 24 h, forma un gel, y 4.- El gel resultante se seca en estufa a vacío hasta Ia eliminación completa del disolvente. Se calcina a 55O ⁰ C, obteniendo un polvo de hidroxiapatita de tamaño nanométrico y bien cristalizado con un tamaño menor de 150 nm.

1.2.- Procedimiento de deposición de plata sobre las nanopartículas de HA.

A partir de este punto, los polvos nanoestructurados de Ia invención se obtuvieron a través de dos métodos diferentes.

Método 1. Tras Ia síntesis de nanopartículas de HA por el método sol-gel y posterior calcinación, se produce Ia deposición de óxido de plata a partir de un precursor

(por ejemplo, nitrato de plata) sobre HA dispersado en agua con Ia cantidad óptima de surfactante. A continuación, se procede a Ia reducción del catión Ag ⁺ a Ag ⁰ en horno en atmósfera de Ar /H ₂ , tal y como se detalla a continuación: a) Se prepara una suspensión acuosa con el polvo de hidroxiapatita obtenido en 1.1.. Se ajusta el pH a 5 en agitación. Para conseguir una mejor dispersión de Ia hidroxiapatita se introduce un surfactante aniónico en baja concentración como dispersante (1% en peso respecto a Ia concentración en sólidos de hidroxiapatita); b) Se añade, protegiendo de Ia luz, una disolución acuosa de Ia sal de plata precursora con Ia concentración necesaria para que el contenido de plata elemental esté comprendida entre el 0.01 y el 8% peso en el compuesto final HA-Ag (referido al contenido en sólidos de HA); c) Mientras se agita fuertemente Ia suspensión, se ajusta el pH a 9, de modo que se precipitan cationes Ag ⁺ como óxido, Ag ₂ O, y d) Tras filtrado y lavado, se seca y reduce en atmósfera de Ar/10%H ₂ en el intervalo de temperaturas comprendido entre 150 y 500°C.

Se obtuvo así un polvo nanocompuesto con nanopartículas de plata menores de 20 nm adheridas a Ia superficie de una nanopartícula de hidroxiapatita de tamaño 140 nm, aproximadamente, con una distribución homogénea.

Método 2.

Tras Ia síntesis de nanopartículas de HA por el método sol-gel y posterior calcinación, se produce Ia deposición de nanopartículas de plata, Ag ⁰ , sobre hidroxiapatita a partir de un precursor de plata dispersado en agua en condiciones de pH y dispersante óptimas. La reducción se realiza in situ con un agente reductor a temperatura ambiente. a) Se prepara una suspensión acuosa con el polvo de hidroxiapatita obtenido. Para conseguir una mejor dispersión de Ia hidroxiapatita se introduce un surfactante aniónico en baja concentración como dispersante (Dolapix); b) Se ajusta el pH a 7 con una disolución acuosa de NaOH 0.1 N para 5 conseguir un buena dispersión de las partículas de HA y evitar, al mismo tiempo, Ia precipitación de los iones Ag ⁺ como Ag ₂ O, que se produce a valores de pH por encima de 8; c) Sonda de ultrasonidos de 1-10 minutos. Homogeneización y disgregación en molino de bolas;

I O d) Para obtener en el producto final una concentración de Ag ⁰ comprendida entre el 0.01 y el 8% peso en el compuesto final HA-Ag, se añade Ia cantidad necesaria de precursor, AgNθ ₃ . Una vez añadido gota a gota sobre Ia dispersión de HA, se deja agitando fuertemente 10 min antes de iniciar el siguiente paso. Este proceso es necesario hacerlo protegiendo de Ia luz Ia

15 disolución con el precursor y Ia dispersión una vez añadido el precursor; e) La reducción de Ia plata se realiza químicamente in sitυ, usando como agente reductor, por ejemplo, NaBH ₄ , que reacciona con Ia plata en Ia relación molar 1 :8 (NaBH ₄ :Ag ⁺ ), según las reacciones:

8 (Ag ⁺ + le » Ag ⁰ ) 0 BH; +3H,O <-> B(OH) ₃ + 7H ⁺ +8e ^"

8 Ag ⁺ + BH¡ +3H ₂ O <-> Ag ⁰ + B(OH) ₃ + 7H ⁺

f) Se procede a Ia deposición gota a gota de Ia disolución de NaBH ₄ sobre Ia dispersión; y g) Se agita fuertemente, se procede a su filtrado, lavado con agua 5 destilada y, por último, secado en estufa a 6O ⁰ C.

Se obtuvo así un polvo nanocompuesto de Ia invención, donde se observa que las nanopartículas de Ag son menores de 15 nm. EJEMPLO 2.- Ensayos de actividad biocida y lixiviado de los polvos nanocompuestos de Ia invención

Se realizaron tests bactericidas para investigar el efecto de las muestras

5 que contenían plata sobre diferentes organismos: Escheríchia coli JM 110 (Gram-negative bacteria), Micrococcus luteus (Gram-positive bacteria) e Issatchenkia oríentalis (levadura). Los microorganismos se sembraron en medio sólido, placas Petri, de Luria Bertani (LB) (conteniendo: triptona 1 %, extracto de levadura 0.5%, CINa 1 %, agar 1.5%) para E. coli JM110 y M. luteus

I O ó Yeast Extract Destrosa (YEPD) (conteniendo: Extracto de levadura 1 %, peptona 2%, glucosa 2%). Las placas se incubaron 24 horas a 37°C. A continuación, colonias aisladas de las placas anteriores de cada microorganismo se inocularon en 5 mL de LB (bacterias) ó YEPD (levadura) y se cultivaron a 37°C durante 5 horas para obtener los pre-cultivos.

15 Paralelamente se prepararon suspensiones de 200 mg/ml (peso/peso) en agua de las preparaciones M1 y M2, conteniendo 1% de plata. Finalmente 10 μL de cada uno de los precultivos de los microorganismos se inocularon a 1 mL de LB o YEPD, según el microorganismo. A los cultivos se añadieron 150 μL de las muestras de HA/nAg (M 1 y M2) resultando en una concentración final de 0.13%

20 en peso de Ag. Asimismo, se prepararon como control muestras sin plata, consistentes en una mezcla de agua más el correspondiente nutriente. Los cultivos se incubaron a 37°C en agitación y se tomaron alícuotas de los distintos cultivos para el contaje de viables tras diluciones seriadas de los distintos cultivos.

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2.1.- Test biocida realizado con Micrococcus luteus

Se preparó una suspensión acuosa (9% peso de sólidos) con el polvo de

HA obtenido por el método 1 (se utilizó como precursor de plata AgNC> ₃ , siendo

30 el contenido en plata en el compuesto final, HA-Ag, de 1% peso (referido al contenido en sólidos de HA)). El test realizado con Micrococcus luteus muestra un título a las 24 horas <1.0-10 ⁴ , mientras que el control es 3.0-10 ⁹ .

Al cabo de 72 horas, Ia concentración de calcio lixiviado en el medio de cultivo se encontró en el rango 15-30 ppm. La concentración de plata fue <5 ppm. Igualmente, se probó a inocular Ia misma concentración de plata de partida a partir de Vitelinato de plata nanoestructurada comercial (Argenol, tamaño de partícula menor de 20 nm); observándose que se lixiviaron 1300 ppm de plata, aproximadamente.

2.2.- Test biocida realizado con Escherichia coli

Se preparó una suspensión acuosa (9% peso de sólidos) con el polvo de

HA obtenido por el método 1 (se utilizó como precursor de plata AgNθ ₃ , siendo el contenido en plata en el compuesto final, HA-Ag, de 1% peso (referido al contenido en sólidos de HA)). El test realizado con Escherichia coli JM 110 muestra un título a las 24 horas <1.0-10 ⁴ , mientras que el control es 1.4-10 ¹¹ .

Al cabo de 72 horas, Ia concentración de calcio lixiviado en el medio de cultivo se encontró en el rango 15-30 ppm. La concentración de plata fue <5 ppm. Igualmente, se probó a inocular Ia misma concentración de plata de partida a partir de Vitelinato de plata nanoestructurada comercial (Argenol, tamaño de partícula menor de 20 nm); observándose que se lixiviaron 900 ppm, aproximadamente.

2.3.- Test biocida realizado con Issatchenkia oríentalis

Se preparó una suspensión acuosa (9% peso de sólidos) con el polvo de

HA obtenido por el método 2 (se utilizó como precursor de plata AgNθ ₃ , siendo el contenido en plata en el compuesto final, HA-Ag, de 1% peso (referido al contenido en sólidos de HA)). El test bactericida realizado con Issatchenkia oríentalis mostró un título a las 24 horas de 1.0-10 ⁴ , mientras que el control es 1.2-10 ¹¹ .

Al cabo de 72 horas, Ia concentración de calcio lixiviado en el medio de cultivo se encontró en el rango 15-30 ppm. La concentración de plata fue <5 ppm. En paralelo, se inoculó Ia misma concentración de plata de partida a partir de Vitelinato de plata nanoestructurada comercial (Argenol, tamaño de partícula menor de 20 nm); observándose que lixiviaron 800 ppm de plata, aproximadamente.

2.4.- Test biocida realizado con Micrococcus luteus

Se preparó una suspensión acuosa (9% peso de sólidos) con el polvo de

HA obtenido por el método 2 (se utilizó como precursor de plata AgNOβ, siendo el contenido en plata en el compuesto final, HA-Ag, de 1% peso (referido al contenido en sólidos de HA)). El test realizado con Micrococcus luteus muestra un título a las 24 horas 4.0-10 ⁴ , mientras que el control es 3.0-10 ⁹ .

Al cabo de 72 horas, Ia concentración de calcio lixiviado en el medio de cultivo se encontró en el rango 15-30 ppm. La concentración de plata fue <5 ppm. Igualmente, se probó a inocular Ia misma concentración de plata de partida a partir de Vitelinato de plata nanoestructurada comercial {Argenol. tamaño de partícula menor de 20 nm); observándose que se lixiviaron 900 ppm, aproximadamente.

2.5.- Test biocida realizado con Escherichia coli JM 110

Se preparó una suspensión acuosa (9% peso de sólidos) con el polvo de

HA obtenido por el método 2 (se utilizó como precursor de plata AgNO ₃ , siendo el contenido en plata en el compuesto final, HA-Ag, de 1% peso (referido al contenido en sólidos de HA)). El test realizado con Escherichia coli JM 110 muestra un título a las 24 horas <1.0-10 ⁴ , mientras que el control es 1.4-10 ¹¹ . Al cabo de 72 horas, Ia concentración de calcio lixiviado en el medio de cultivo se encontró en el rango 15-30 ppm. La concentración de plata fue <5 ppm. Igualmente, se probó a inocular Ia misma concentración de plata de partida a partir de Vitelinato de plata nanoestructurada comercial (Argenol, tamaño de partícula menor de 20 nm); observándose que se lixiviaron 1300 ppm, aproximadamente.