COMPOSICIóN NATURAL ANTIOXID ANTE PARA PRODUCTOS CáRNEOS ELABORADA A PARTIR DE EXTRACTOS FENóLICOS DE MIELES MONOFLORALES Y PROCESO DE OBTENCIóN

MEMORIA DESCRIPTIVA

La presente solicitud se dirige a extracto de compuestos fenólicos puros a partir0 de Ia miel. Específicamente, se describe un método para generar un extracto, sin Ia utilización de éter etílico, y resuspendiendo el extracto final en etanol, de manera de evitar Ia participación de solventes perjudiciales para el ser humano

(éter y metanol). El etanol es un alcohol metabolizable por el hígado de los mamíferos, por Io que este nuevo extracto podría agregarse directamente en5 productos alimenticios o farmacéuticos de consumo humano.

Arte Previo

Actualmente existe una demanda creciente por alimentos que sean sanos, de0 origen natural, y que además hagan algún aporte a Ia mantención o mejora de Ia salud de quien los consume. Los alimentos que cumplen con estos requisitos son conocidos como alimentos funcionales.

Los antioxidantes son de las sustancias más requeridas en los alimentos5 funcionales. éstos son moléculas que actúan como donantes de electrones, y así pueden estabilizar e inactivar a otras moléculas conocidas como radicales libres, que se caracterizan por carecer de un electrón en su estructura, siendo por ello sumamente reactivas con cualquier molécula que pueda donarles- ese electrón. En el organismo humano, producto del metabolismo, se generan0 constantemente radicales libres, por Io que se necesitan antioxidantes que los estabilicen e inactiven, evitando así el daño que éstos causan al reaccionar con moléculas biológicamente importantes, tales como ácidos nucleicos (ADN y

ARN), ácidos grasos constituyentes de las membranas y proteínas. Al entregar un electrón, los antioxidantes se convierten a su vez en radicales libres débiles o de muy baja reactividad dado que, gracias a su estructura, sus electrones pueden moverse fácilmente entre los orbitales moleculares, Io que hace que Ia molécula resultante sea mucho más estable.

Podemos clasificar los antioxidantes en dos grupos principales: los enzimáticos y los no enzimáticos. Dentro del primer grupo se encuentran las enzimas antioxidantes, las que son producidas por las células, actúan a nivel iníracςlular y no se consumen al reaccionar con radicales libres. Las más importantes son Ia catalasa, Ia glutatión peroxidasa y Ia superóxido dismutasa. éstas operan ya sea evitando Ia formación de radicales libres a partir de otras moléculas, o bien convirtiendo los radicales ya existentes en moléculas menos dañinas para el organismo, antes que reaccionen con moléculas importantes. Su eficiencia depende de Ia presencia de algunos metales, como Fe, Cu, Mg, Zn o Se, y por su importancia en Ia función de éstas enzimas son denominados metales antioxidantes.

Los antioxidantes no enzimáticos, por su parte, pueden ser de origen endógeno, como el glutatión, el urato, el ubiquinol y algunas proteínas plasmáticas, o de origen exógeno, y entre éstos se encuentran todos aquellos compuestos con capacidad antioxidante que se obtienen de los alimentos, tales como pigmentos carotenoides, vitaminas A, C y E, compuestos fenólicos, y los químicos sintéticos. éstos actúan tanto a nivel intracelular como extracelular, y al contrario de las enzimas antioxidantes, se consumen al reaccionar con los radicales libres y deben ser repuestos constantemente. Los de origen endógeno son sintetizados nuevamente por las células, mientras que los exógenos deben ser ingeridos con Ia dieta.

Los antioxidantes dietarios son sustancias presentes en los alimentos* que disminuyen significativamente los efectos de los radicales libres (especies reactivas de oxígeno o de nitrógeno) sobre las funciones fisiológicas normales

en humanos (Food and Nutrition Board, 1998). Los principales antioxidantes dietarios son los pigmentos carotenoides, vitaminas A, C y E, compuestos fenólicos, y los químicos sintéticos. Excluyendo los antioxidantes químicos sintéticos por razones obvias, los antioxidantes dietarios provienen fundamentalmente de los alimentos de origen vegetal, como frutas, hortalizas, cereales, semillas, aceites vegetales, jugos, bebidas como el té y el vino, y productos apícolas como miel y polen.

Las defensas antioxidantes de nuestro organismo son fundamentales para conservar una buena salud. El consumo de alimentos de origen vegetal se ha asociado con una menor incidencia y mortalidad de diversas enfermedades

(Jacob y Burri, 1996; Hughes y Ong, 1998). La protección que éstos otorgan contra enfermedades cardiovasculares o degenerativas como el cáncer ha sido atribuida a su alto contenido de antioxidantes (Hertog et al, 1993a). Actualmente, existe numerosa evidencia científica que demuestra que el origen de enfermedades como arterieesclerosis y cáncer, complicaciones de patologías como artritis, diabetes y demencias, y el proceso biológico de envejecimiento, se asocia a daño oxidativo, y se están comprendiendo cada vez mejor los mecanismos que llevan al desarrollo de enfermedades a partir del daño oxidativo causado a las moléculas biológicas por los radicales libres.

A pesar de esta denominación común, existen diferencias entre los diversos antioxidantes dietarios, tanto en términos de su comportamiento químico como en sus propiedades biológicas. Algunos de estos antioxidantes, como las vitaminas C y E, los carotenoides y el Se, son bien conocidos, en tanto otros son novedosos y sus propiedades han comenzado a estudiarse sólo en las últimas 2 décadas, como es el caso de los compuestos fenólicos o polifenoles. Sin embargo, aun no se sabe a ciencia cierta cuál o cuáles de los constituyentes antioxidantes de los alimentos de origen vegetal de Ia dieta es o son responsables del efecto protectivo contra el daño oxidativo, aunque se supone que esta tarea no radica en una o unas pocas sustancias, sino que en Ia acción conjunta de varias de ellas.

Los compuestos fenólicos o polifenoles son una gran familia de compuestos elaborados por las plantas como defensa al stress oxidativo causado por factores abióticos, como Ia radiación UV, y que por ende se encuentran en muchos alimentos de origen vegetal, como los berries, el té, el vino y los productos apícolas (Ferreres et al., 1991 ; Hertog et al., 1993b; Tomás-Barberán et al., 1993; Simonetti et al, 1997; Sánchez-Moreno et al., 1999a, b; Kahkonen et al., 2001 ; Miranda-Rottmann et al, 2002). Los principales polifenoles presentes en nuestra dieta son los ácidos fenólicos, flavonoides, y pigmentos como antocianinas y taninos. Un grupo especialmente interesante Io constituyen los flavonoides, de los que ya hay más de 4000 descritos, teniendo muchos de ellos una capacidad antioxidante incluso más alta que las vitaminas A y E (Kinsella et al, 1993; Dugas et al., 2000).

Numerosos efectos beneficiosos para Ia salud son atribuidos a los polifenoles (Diplock, 1991). Además de las conocidas capacidades antioxidantes, se ha reportado que los polifenoles dietarios retardan el envejecimiento y muerte celular; reducen Ia generación del radical superóxido en las células; evitan el daño sobre el material genético y proteínas, contribuyendo así a su estabilidad; aumentan Ia actividad de enzimas detoxificadoras de toxinas o drogas del hígado; y reducen el riesgo de desarrollar enfermedades cardíacas y cáncer (Reddy y Lokesh, 1992; Middleton et al, 2000; Ferguson 2001 ; Lu et al, 2001 ; Fahey y Stephenson, 2002; Ha et al., 2003; Schwarz y Roots 2003; Ueda et al, 2003; Pfeffer et al, 2003). Particularmente, se ha descrito que, entre otros, varios de los compuestos fenólicos y flavonoides encontrados en Ia miel presentan importantes actividades biológicas con un potencial uso farmacéutico o farmacológico (Jeffrey & Echazarreta, 1996; Wahdan, 1998). También se ha propuesto su posible uso como marcadores del origen floral de Ia miel. Así, por ejemplo, las mieles cuyo origen botánico proviene de especies del genero Citrus presentan Ia flavanona hesperetina (Ferreres et al, 1993), que podría ser un muy buen indicador del origen de dicha miel. El flavonol kaempferol está siempre presente en las mieles de romero (Gil et al, 1995; Ferreres et al, 1998),

y los ácidos abscísico y elágico en mieles provenientes de néctares de plantas del género Erica (Ferreres et al, 1996). Los flavonoides miricetina, tricetina y luteolina han sido sugeridos como marcadores de mieles monoflorales de plantas del género Eucalyptυs (Marios et al, 2000a, b) en Australia, y el ácido homogenístico ha sido propuesto como marcador para las mieles monoflorales del Arbutus unedo en Italia (Cabras et al., 1999).

Por Io tanto, los compuestos fenólicos y flavonoides presentan potencialidades que han hecho interesante investigar, cualitativa y cuantitativamente, su presencia en las mieles chilenas. Por ejemplo, se han aislado fracciones fenólicas de mieles monoflorales neozelandesas, originadas a partir de especies de Ia familia Myrtaceae, que han mostrado actividades antibacteriales (Russell et al, 1990; Weston et al, 2000), debiendo destacarse aquí que las especies de Ia familia Myrtaceae se encuentran entre las fuentes de néctar más importantes para Ia elaboración de miel en Chile, siendo Ia mayoría de "¿Has nativas o endémicas (Montenegro, 1992; Montenegro, 2000; Montenegro et al., 2003; Ramírez y Montenegro, 2004; Montenegro et al., 2005; Pizarra y Montenegro, 2006).

La composición y concentración de flavonoides y otros compuestos fenólicos en mieles han mostrado ser muy variable, desde niveles muy bajos hasta concentraciones de 2400 mg/100gr (Marios et al., 1997), siguiendo en algunos casos perfiles similares a aquellos encontrados en propóleos de las mismas colmenas. En mieles y propóleos de Túnez un nuevo flavonoide, Ia miricetina 3,7,4',5'-étertetrametilico, fue detectado (Martos et al., 1997). En Chile, trabajos sobre Ia composición química de flavonoides presentes en los propóleos han permitido estudiar sus perfiles químicos y encontrar compuestos nuevos del tipo lignanos, entre otros (Valcic et al, 1998, 1999; Montenegro et al. 2000, 2001 ; Muñoz et al, 2001a, b), sin embargo no se han establecido correlaciones con flavonoides presentes en Ia miel.

Las mieles pueden ser de 3 tipos según su origen botánico: monoflorales, biflorales o poliflorales. Las mieles monoflorales son aquellas en que al menos un 45% y mas de los granos de polen encontrados en ella pertenecen a una misma especie; las biflorales son aquellas en las que los pólenes de dos especies dominan dentro del total de granos de polen, de manera tal que, en conjunto, ambas abarcan más del 50% del total de granos de polen, y entre ellas no hay una diferencia mayor a un 5%; y finalmente las poliflorales son aquellas en las que no se cumple ninguno de los requisitos expuestos para las mieles mono y biflorales, es decir, aquellas en las que ninguna especie alcanza al menos el 45% del total de granos de polen, ni tampoco hay dos que en su conjunto abarquen más del 50% de dicho total. Esta solicitud de patente contempla el uso de extractos fenólicos obtenidos de mieles monoflorales de quillay, pues son este tipo de mieles las que muestran mayor estabilidad en sus propiedades entre temporadas, es decir, a Io largo del tiempo.

Dentro de Io que es posible visualizar en el arte previo es importante mencionar que se aprecia Ia existencia de extractos de origen vegetal, como por ejemplo el divulgado en las solicitudes de patente de invención 2886-2001 y 2377-2004, tanto como insecticidas y acaricidas, como agentes de las sustancias activas Hederacocido y Alfa-Hederina. Igualmente se observa Ia solicitud de patente 67- 1999 que comprende miel en combinación con otros ingredientes útil como cosmético y desinfecciones sanitarias. No obstante, en ninguna de estas publicaciones es posible inferir un método como el propuesto ni el producto obtenido por el mismo

A nivel internacional no se aprecian documentos que aborden el mismo problema planteado en el objeto de Ia invención. No obstante, se distingve el resumen de Ia solicitud de patente de Rusia RU2236248 de fecha 27 de diciembre de 2001 y publicada el 20 de septiembre de 2004, Ia cual divulga una preparación inmunotrópíca de uso medicinal y farmacológico, en que se provee una preparación en base a miel obtenida de Ia alimentación de las abejas a partir de una composición que comprende miel obtenida de una sola flor

extraída de Ia familia de plantas Asteraceae, y que comprende flavonoides específicos para inducir Ia síntesis de interferona Alfa y Beta que presenta alta efectividad en el tratamiento de profilaxis viral y bacterial. En las solicitudes rusas RU2236247, RU2236244 y RU2241476 se describen composiciones, sin embargo, no se describen método y producto como el del objeto de esta invención.

Los resultados obtenidos en pruebas efectuadas al aplicar el objeto ήe Ia invención muestran que extractos fenólicos obtenidos a partir de muestras de miel monofioral de quillay (Quíllaja saponaria), especie endémica de Chile, presentan una alta actividad antioxidante. Ensayos para medir Ia capacidad antioxidante realizados con estos extractos, usando Ia técnica espectrofotométrica con DPPH, han arrojado como resultado niveles de actividad antioxidante similares a los de soluciones de Trolox® (un potente antioxidante usado en la industria) en concentraciones de 0,6 a 1 ,0 mg/ml. Adicionalmente, Ia invención plantea un producto útil como una materia prima rica en antioxidantes naturales, de origen nacional y orgánico, para ser utilizada en las industrias de alimentos y/o farmacéutica.

Descripción Detallada de Ia Invención

La invención consiste en un extracto etanólico concentrado de compuestos fenólicos de miel monofioral de quillay, especie vegetal endémica de Chile y el método de obtención asociado. Existen otras especies productoras de mieles monoflorales en Ia zona central de Chile donde se distribuye el Quillay, tales como el maqui (Aristotelia chilensis), cuyos extractos fenólicos han mostrado menor capacidad antioxidante. Mieles monoflorales de otras especies, como el corontillo (Escallonia pulverulenta) y el tevo (Retanilla trinervia), han sido identificadas, pero sólo de manera muy eventual y en menor cantidad *si Ia comparamos con Ia miel de quillay, razón por Ia cual no se ha realizado el análisis de actividad antioxidante en extractos fenólicos de estas mieles.

La invención consiste en Ia modificación de un método creado por el grupo de Fitoquímica del CEBAS-CSIC en Murcia, España, para elaborar un extracto de compuestos fenólicos puros a partir de Ia miel. La técnica desarrollada por dicho grupo da como resultado un extracto de polifenoles totales en metanol, un alcohol que es tóxico para los mamíferos, pues no puede ser metabolizado por el hígado. La presente invención consiste en generar un extracto etanólico concentrado de compuestos fenólicos de miel monofloral de quillay, usando básicamente Ia misma técnica de extracción, pero eliminando los pasos donde se utiliza éter etílico, y resuspendiendo el extracto final en etanol, de manera de evitar Ia participación de solventes perjudiciales para el ser humano (éter y metanol). El etanol es un alcohol metabolizable por el hígado de los mamíferos, por Io que este nuevo extracto podría agregarse directamente en productos alimenticios o farmacéuticos de consumo humano. Ensayos realizados han mostrado que, si bien Ia actividad antioxidante del extracto etanólico es levemente inferior a Ia del metanólico, las diferencias no son significativas, y comparado con Ia actividad de otros antioxidantes usados comúnmente como estándares de referencia para medir capacidad antioxidante, como el Trolox®, el extracto etanólico propuesto mantiene una considerable capacidad antioxidante.

Para llevar a cabo Ia obtención del extracto etanólico concentrado de compuestos fenólicos de miel monofloral de quillay, y solo a modo ilustrativo dado que un técnico de nivel medio versado en Ia materia podrá claramente extrapolar las cantidades a continuación señaladas, se lleva a cabo un proceso que contempla las siguientes etapas:

1. Pesar 50 gr de miel en un vaso de precipitados de 100 mi.

2. Diluir con 100 mi de agua destilada acidificada con HCI (pH=2).

3. Colocar Ia solución en un matraz de aforado de 250 mi, y se enrasa a dicho volumen con agua acida.

4. Filtrar Ia solución con algodón y pasar por una columna de resina Amberlita XAD-2 (250 mm de alto por 20 mm de diámetro), a una

velocidad de goteo de 2 ml/min, quedando retenidos en Ia columna los compuestos fenólicos.

5. Lavar Ia columna con 100 mi de agua acida. El líquido se desecha.

6. Lavar por segunda vez con 200 mi de agua destilada neutra. El líquido se desecha.

7. Lavar por tercera vez con 300 mi de metanol puro. El metanol eluirá los compuestos fenólicos de Ia columna. El metanol se colecta en un vaso o matraz limpio, y se traspasa a un balón para rotoevaporador de 500 mi.

8. Concentrar Ia solución metanólica hasta sequedad en rotoevaporador, a 45° C (tiempo aprox.: 12 hrs a alta velocidad de rotación).

9. Resuspender el residuo en 2 mi de etanol 85°, quedando listo para ser analizado o para ser usado como aditivo antioxidante.

Hasta Ia fecha no se ha formulado o desarrollado ninguna composición que utilice el extracto fenólico con capacidad antioxidante obtenido de miel de quillay. Sin embargo, si se han realizado pruebas con formulaciones piloto elaboradas con extracto fenólico obtenido de miel de ulmo, el que exhibe una menor capacidad antioxidante que el del quillay, pero posee una mayor actividad antibiótica, y que se encuentra bajo Ia solicitud de patente Chilena N ⁰ 1069-06).

La solicitud chilena 1069-2006 se obtiene por un procedimiento de extracción similar al descrito más arriba, variando desde Ia etapa de resuspensiórí del residuo obtenido el cual Io realiza en agua y se agrega éter etílico y Ia presente solicitud resuspende el residuo obtenido en etanol 85°.

Este extracto se obtiene siguiendo el mismo procedimiento descrito mas arriba y ha mostrado conservar su actividad biológica en solucionas acuosas, por Io que consideramos que el extracto con actividad antioxidante obtenido de Ia miel de quillay también podrá incorporarse en otras formulaciones, conservando dicha actividad. Se ha mostrado que el extracto conserva su actividad antioxidante a Io largo del tiempo, pues se han hecho estudios

comparativos entre Ia actividad que muestra recién elaborado y luego de un año almacenado en refrigerador (4 ^o - 6 ^o C), los que no mostraron diferencias significativas entre si. No se han elaborado algún tipo de formulación piloto donde se haya comprobado Ia conservación de Ia capacidad antioxidante del extracto, pero si se ha comprobado que mantiene Ia actividad antibiótica (atribuida a los mismos compuestos fenólicos que Ie otorgan Ia actividad antioxidante al extracto), ya que una formulación piloto asperjada sobre hortalizas en pruebas de reducción del desarrollo de Ia pudrición de hortalizas en condiciones de bodega, Ia que incluye el mismo tipo de extracto (pero obtenido de miel de ulmo), muestra conservación de dicha propiedad luego de pasar casi un año almacenada en nuestro laboratorio. Por Io tanto, como esta propiedad se conserva, podemos suponer que Ia actividad antibiótica también se conservará pues depende de los mismos compuestos fenólicos. Por supuesto, todo esto puede comprobarse mediante las mismas pruebas y análisis usados para determinar Ia capacidad antioxidante del extracto.

Determinación de la capacidad Antioxidante.

Método: Espectrofotometría con DPPH (1 ,1-Diphenyl-2-2picrylhydrazyl). Formula: C ₁₈ H ₁₂ N ₅ O ₆ .

Peso molecular DPPH: 394.3 gr/mol (1 mmol = 0.3943 gr = 394.3 mg)

Fundamento del Método:

El DPPH es un compuesto que es considerado un radical libre, y en solución presenta una marcada coloración violeta. Cuando se encuentra con un compuesto antioxidante, se estabiliza y pierde su coloración, por Io que Ia disminución de Ia absorbancia de una solución de DPPH al añadirle un compuesto oxidante indicará Ia capacidad antioxidante de dicho compuesto, Ia que será mayor mientras mayor y más rápida sea Ia pérdida de coloración de Ia solución de DPPH.

Para medir Ia capacidad antioxidante del extracto de miel con este método, se debe seguir el siguiente protocolo:

1. Preparar una solución de DPPH en metanol, que tenga una absorbancia (DO) de entre 0,6 y 0,7 a 517 nm.

2. Establecer una línea base a 517 nm, haciendo "autocero" contra un blanco de metanol.

3. Colocar en una cubeta de cuarzo o vidrio de 1 mi de capacidad 950 μl de Ia solución de DPPH, y medir su absorbancia (ésta debe encontrarse entre 0,6 y 0,7).

4. Programar el espectrofotómetro para que mida Ia absorbancia cada 5 seg., con el fin de hacer una curva de cinética.

5. Sacar Ia cubeta y agregar 50 μl del extracto de miel cuya capacidad antioxidante se quiere averiguar. 6. Mezclar y devolver al espectrofotómetro tan rápido como sea posible.

7. Graficar Ia absorbancia v/s tiempo, para así obtener Ia curva de cinética de Ia reacción, pasados 3 min., se considera finalizada Ia reacción. Si el espectrofotómetro no tiene capacidad de almacenamiento de datos, se debe anotar cada nueva medición. Los equipos modernos constan con memoria interna y pantalla donde pueden almacenarse los datos y dibujar

Ia curva, respectivamente.

El descenso en Ia absorbancia de Ia solución (decoloración) indica estabilización del DPPH, y Ia magnitud y Ia velocidad de dicha caída estarán directamente relacionadas con Ia capacidad antioxidante del extracto.

EJEMPLOS

Hasta Ia fecha se ha realizado una prueba de aplicabilidad del extracto en experimentos in situ en carne de pollo, probando ser efectivo para prolongar Ia vida útil de Ia carne en bandeja. Detalles de Ia prueba y del análisis del extracto se entregan más adelante, en Ia sección "Ensayos de Actividad Antioxidante de

Extractos de Miel Monofloral de Quillay (RM-012005-M337) sobre Carne de Ave".

Por otra parte, en conversaciones con Ia empresa CRAMER S.A., hemos recibido importantes sugerencias acerca de Ia posibilidad de usar este extracto como aditivo antioxidante en alimentos tales como yogurt, leche cultivada, galletas, salsas, transformando estos alimentos en alimentos funcionales. Como ya se indicó, el mismo tipo de extracto obtenido de miel de ulmo se ha incorporado a formulaciones piloto, mostrando que se conservan sus propiedades biológicas, Io que hace pensar en que puede ser utilizado como un antioxidante natural, incorporándolo en alimentos o bebidas. A Ia fecha no hemos encontrado en el mercado ejemplos de productos que incluyan miel o extractos fenólicos de ellas como suplemento antioxidante.

Ensayos de Actividad Antioxidante de Extractos de Miel Monofloral de Quillay (RM-012005-M337) sobre Carne de Ave

A continuación se describe los resultados del análisis de Ia capacidad de reducir o evitar Ia oxidación de Ia grasa de pollos broiler por parte de un extracto de flavonoides obtenido a partir de una miel monofloral de quillay, mediante el ensayo FRAP. Estos resultados forman parte de los ensayos realizados por Ia Profesora María Angélica Fellenberg, en Ia Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal.

Este ensayo consiste en Ia medición de Ia capacidad antioxidante de un fluido (plasma sanguíneo, jugo de fruta, extractos vegetales o bebidas como té o vino), a través de Ia medición del contenido de ion ferroso (Fe ⁺³ ) en el medio. Brevemente, en un ambiente oxidante (que ocurre cuando hay presencia de radicales libres u otros agentes oxidantes en él) el ion Fe ⁺³ que se encuentre en el medio se reducirá a ion férrico (Fe ⁺² ). La cantidad de ion Fe ⁺³ que aun quede en el tubo o cubeta donde se lleve a cabo Ia reacción puede ser evaluada mediante espectrofotometría (medición de absorbancia de Ia solución

a una longitud de onda determinada) directa o indirecta. La capacidad antioxidante de Ia muestra se expresa en equivalentes de Trolox®, es decir, Ia cantidad de Trolox® necesaria para mostrar Ia misma actividad antioxidante que Ia muestra que está siendo evaluada. Este compuesto es un potente antioxidante, análogo hidrosoluble de Ia Vitamina E, comúnmente utilizado como estándar, contra el cual se compara Ia actividad antioxidante del compuesto o muestra analizada.

El ensayo se realizó probando 3 tipos de extractos, obtenidos a partir de una miel monofloral de Quillaja saponaria (quillay), producida en el sector Río

Clarillo, comuna de Pirque, Región Metropolitana, y cosechada en enero de

2005 (Muestra código RM-012005-M337). La metodología para Ia obtención de dichos extractos ya ha sido previamente descrita. La composición de compuestos fenólicos del extracto, arrojada por el análisis vía HPLC, muestra Ia presencia de los siguientes compuestos:

El cromatograma para este extracto se observa en Ia Figura 1. Nótess Ia presencia de numerosos picks correspondientes a compuestos sin identificar.

Resultados

Tabla 1- Curva de Calibración

Se indican las absorbancias exhibidas por soluciones de FeSO ₄ en distintas concentraciones.

Estos valores quedan representados en forma de gráfico en Ia Figura 2.

Estos resultados indican que a mayor concentración de FeSO ₄ , mayor será Ia absorbancia de Ia solución a 593 nm.

Tabla 2 - Actividad antioxidante de los extractos, expresada en equivalentes de FeSO ₄

Luego se realizó el mismo procedimiento, usando Trolox®. De esta manera se tendrá una idea más directa de Ia capacidad antioxidante de los extractos analizados.

Tabla 3 - Curva de Calibración

Se indican las absorbancias exhibidas por soluciones de Trolox® en distintas concentraciones

Estas figuras pueden observarse en forma de gráfico en Ia Figura 3.

Al agregar Trolox® a Ia solución, se puede apreciar un descenso en Ia absorbancia, el cual se asocia a Ia capacidad de evitar Ia reducción del ion Fe ⁺³ a Fe ⁺² .

Tabla 4 - Actividad antioxidante de los extractos, expresada en equivalentes de Trolox®

Los resultados de Ia Tabla 4 indican que el extracto de miel monofloral de Quillay que presenta Ia mayor capacidad antioxidante es el extracto etanólico 2, seguido, en orden decreciente, por el extracto etanólico 1 y el metanólico. Estos resultados indican que los extractos provenientes de esta miel muestran un gran potencial para disminuir o evitar Ia oxidación de las grasas presentes en las carnes de aves para consumo humano.

Tabla 5 - E uivalencias entre volumen de extracto de miel Trclox®

La Tabla 5 muestra las equivalencias entre 1 μg (microgramo) de Trolox® y el volumen correspondiente de extracto de miel, en términos del potencial antioxidante. En otras palabras, 2,73 μl (microlitro) de extracto metanólico de esta miel presentan Ia misma capacidad antioxidante que 1 μg de Trolox®, en el mismo volumen de solución.

El extracto debe usarse diluido en el líquido de marinado, en el caso de Ia carne de pollos, o bien dando un baño, rociando o pulverizando sobre otros tipos de carne, de forma que el corte quede cubierto por todos lados con una película del extracto. La dilución recomendada es de entre 2% y 0,5%, dependiendo dei tipo de carne donde será aplicado (mientras mayor sea el porcentaje de grasa en Ia carne, mayor será Ia concentración a usar, pues Io que se evita o reduce con Ia aplicación del extracto es Ia lipooxidación u oxidación de los ácidos grasos. También dependerá de Ia proporción de άYasa insaturada en comparación con Ia grasa saturada en el tejido, y de si el

músculo de donde se obtuvo el corte es glicolítico u oxidativo, por Io que se requerirá de otras pruebas cuando se desee aplicar).

Referencias:

1 . Cabras P., Angioni A., Tuberoso C, Floris I., Reniero F., Guillou C. & Ghelli S. 1999. Homogentisic acid: A phenolic acid as a marker of strawberry-tree (Arbutus unedo) honey. J. Agricultural and Food Chemistry 47(10): 4064-4067.

2. Diplock A. T. 1991 . Antioxidant Nutrients and Disease Prevention - An Overview. American J. of Clinical Nutrition 53(1): S189-S193 Suppl.

3. Dugas A. J. Jr., Castañeda-Acosta J., Bonin G. C, Price K. L., Fischer N. H. & Winston G. W. 2000. Evaluation of the total peroxyl radical- scavenging capacity of flavonoids: Structure-activity relationships. J.

Natural Products 63(3): 327-331.

4. Fahey J. F. & Stephenson K. K. 2002. Pinostrobin from honey and Thai ginger (Boesenbergia pandurata): A potent flavonoid inducer of mammalian phase 2 chemoprotective and antioxidant enzymes. J. Agricultural and Food Chemistry 50 (25): 7472-7476

5. Ferguson L. R. 2001. Role of plant polyphenolics in genomic stability. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 475(1-2): 89-11 1 Sp. Iss.

6. Ferreres F., Tomás-Barberán F. A., Gil M. I. & Tomás-Lorente F. 1991. An HPLC technique for flavonoid analysis in honey. J. of the Science of

Food and Agriculture 56(1 ): 49-56.

7. Ferreres F., García-Viguera C ₁ Tomás-Lorente F. & Tomás-Barberán F. A. 1993. Hesperetin - a marker of the floral origin of citrus honey. J. of the Science of Food and Agriculture 61 (1 ): 121-123. 8. Ferreres F., Andrade P., Gil M. I., Tomás-Barberán F. A. 1996. Floral néctar phenolics as biochemical markers for the botanical origfn of

heather honey. Zeitschriñ fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung 202(1): 40-44.

9. Ferreres F., Juan T., Perez-Arquillue C, Herrera-Marteache A., García Viguera C. & Tomás-Barberán F. A. 1998. Evaluation of pollen as a source of kaempferol ¡n rosemary honey. J. of the Science of Food and

Agriculture 77(4): 506-510.

10. Food and Nutrition Board. 1998. Dietary reference intakes: proposed definition and plan for review of dietary antioxidants and related compounds. Institute of Medicine, National Academy of Sciences, National Academy Press, Washington D. C, USA. 24 pp.

H . Gheldof N., Wang X. H. & Engeseth N. J. 2002. Identification and quantification of antioxidant components of honeys from various floral sources. J. Agήcultural and Food Chemistry 50: 5870-5877. 12. Ghosh S. & Playford R. 2003. Bioactive natural compounds for the treatmentof gastrointestinal disorders. Clinical Science 104: 547-556.

13. GiI M. I., Ferreres F., Ortiz A., Subra E. & Tomás-Barberán F. A. 1995. Plant phenolic metabolites and floral origin of rosemary honef. J. Agricultural and Food Chemistry 43(11 ): 2833-2838.

14. Ha H. J., Kwon Y. S., Park S. M., Shin T., Park J. H., Kim H. C ₁ Kwon M. S. & Wie M. B. 2003. Quercetin attenuates oxygen-glucose deprivation- and excitotoxin-induced neurotoxicity in primary cortical cell cultures. Biological & Pharmaceutical Bulletin 26(4): 544-546

15. Hertog M. G., Hollinan P. C, Kattan M. B. & Kromhout D. 1993a. Intake of potentially anticarcinogenic flavonoids and their determinants in adults in The Netherlands. Nutrition and Cáncer 20(1): 21-29.

16. Hertog M. G., Hollman P. C. & Kattan M. B. 1993b. Contení of potentially anticarcinogenic flavonoids of tea infusions, wines and fruit juicef . J. Agricultural and Food Chemistry 41 : 1242- 1246.

17. Hughes K. & Ong C. N. 1998. Vitamins, selenium, ¡ron, and coronary heart disease risk in Indians, Malays and Chínese in Singapore. J.

Epidemielogy and Community Health 52: 181-185.

18. Kahkonen M. P., Hopia A. I. & Heinonen M. 2001. Antioxidant berry phenolics and their antioxidant activity. J. Agricultura! and Food

Chemistry 49: 4076-4082.

19. Jacob R. A & Burri B. J. 1996. Oxidative damage and defense. American J. of Clinical Nutrítion 63: 985S-990S.

2O.Jeffrey A. E. & Echazarreta C. M. 1996. Medical uses of honey. Revista

Biomedica 7: 43-49. 21. Kinsella J. E., Frankel E., Germán B. & Kanner J. 1993. Possible mechanismsfor the protective role of antioxidants in wine and plant foods. Food Technology 47: 85-89.

22. Lu H. W., Sugahara K., Sagara Y., Masuoka N., Asaka Y., Manabe M. &

Kodama H. 2001. Effect of three flavonoids, 5,7,3 ',4 '-tetrahydroxy-3- methoxy flavone, luteolin, and quercetin, on the stimulus-induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in human neutrophil. Archives of Biochemistry and Biophysics 393(1 ): 73-77.

23. Martos I., Cossentini M., Ferreres F. & Tomás-Barberán F. A. 1997.

Flavonoid composition of Tunisian honeys and propolis. J. Agrícultural and Food Chemistry 45(8): 2824-2829.

24. Martos I., Ferreres F., Tomás-Barberán F. A. 2000a. Identmcation of flavonoid markers for the botanical origin of Eucalyptus honey. J.

Agrícultural and Food Chemistry 48(5): 1498-1502. 25. Martos I., Ferreres F., Yao L. H., D'Arcy B., Caffin N. & Tomás-Barberán

F. A. 2000b. Flavonoids in monospecific Eucalyptus honeys from

Australia. J. Agrícultural and Food Chemistry 48(10): 4744-4748. 26. Middleton E., Kandaswami C & Theoharides T. C. 2000. The effect of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease and cáncer. Pharmacological Review 52: 673-751. 27. Miranda-Rottmann S., Aspillaga A. A., Pérez D. D., Vasquez L., Martínez

A. L. & Leighton F. 2002. Juice and phenolic fractions of the '(?erry Arístotelia chilensis inhibit LDL oxidation in vitro and protect human endothelial cells against oxidative stress. J. Agricultura! and Food

Chemistry 50: 7542-7547.

28. Montenegro G. (Ed.). 1992. Flora de interés apícola en Chile. Publicación para ser difundida en el III Encuentro Nacional de Ciencia y Tecnología Apícola, 12 al 14 de Agosto., Chillan, Chile.

29. Montenegro G. 2000. Chile, nuestra flora útil. Ediciones Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. 267 pp.

30. Montenegro G., Timmermann B. N., Pena R. C, Mujica A. M. & ávila G. 2000. Pollen grains and vegetative structures in propolis as indicators of potential drugs in Chilean plants. Phyton - International J. Experimental Botany 66: 15-23. 31. Montenegro G., Pena R. C ₁ Mujica A. M. & Pizarra R. 2001. 3otajiical resources for propolis in an apiary network ¡n central Chile. Phyton -

International J. Experimental Botany Sp. Iss.: 191 -201.

32. Montenegro G., Pizarra R., ávila G., Castro R., Ríos C ₁ Muñoz O., Bas

F. y Gómez M. 2003. Origen botánico y propiedades químicas de las mieles de Ia Región Mediterránea árida de Chile. Ciencia e Investigación

Agraria 30 (3): 161-174.

33. Montenegro G., Pizarra R., ávila G., Muñoz O., Mujica A. M. y Bas F. 2005. Determination of the botanical origin and some chemical properties of honeys from the central zone of Chile. Phyton - International J. Experimental Botany Sp. Iss.: 213-223.

34. Muñoz O., Pena R. C, Ureta E., Montenegro G. & Timmermann B. N. 2001a. Propolis from Chilean matorral hives. Zeitschrift fur Naturíorschung c - A J. Biosciences 56(3-4): 269-272. 35. Muñoz O., Pena R. C ₁ Ureta E., Montenegro G., Caldwell C. & Timmermann B. N. 2001b. Phenolic compounds of propolis from central

Chilean matorral. Zeitschrift fur Naturíorschung c - A J. Biosciences 56(3- 4): 273-277.

36. Pfeffer U., Ferrari N., Morini M., Benelli R., Noonan D. M. & Albini A. 2003. Antiangiogenic activity of chemopreventive drugs. International J. Biological Markers 18 ( 1 ) : 70-74.

37. Pizarra R. y Montenegro G. 2006. Flora Nativa utilizada como fuenfe de néctar para Ia elaboración de miel en Chile. XVII Reunión Anual de Ia

Sociedad de Botánica de Chile. Universidad de Talca, Talca, Chile. 19-

23 de Enero. 38. Ramírez R. y Monteengro G. 2004. Certificación del origen botánico de miel y polen corbicular pertenecientes a Ia comuna de Litueche, Vl Región de Chile. Ciencia e Investigación Agraria 31 (3): 197-211.

39. Reddy A. C. & Lokesh B. R. 1992. Studies on spice principies as antioxidants in the inhibition of lipid peroxidation of rat liver microsomes.

Molecular and Cellular Biochemistry 1 1 1 : 1 17-124.

40. Russell K., Molan P., Wilkins A. L. & Holland P. T. 1990. Identification of some antibacterial constituents of New Zealand manuka honey. J.

Agricultural and Food Chemistry 38: 10-13. 41. Sánchez-Moreno C, Larrauri J. A., Saura-Calixto F. 1991 a. Free radical scavenging capacity of selected red, rose and white wines. J. of the

Science ofFood and Agrículture 79(10): 1301-1304 42. Sánchez-Moreno C ₁ Larrauri J. A., Saura-Calixto F. 1999b. Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines, grape juices and related polyphenolic constituents. Food Research

International 32(6): 407-412.

43. Schwarz D. & Roots I. 2003. In vitro assessment of inhibition by natural polyphenols of metabolic activation of procarcinogens by human

CYP 1A1 . Biochemical and Biophysical Research Communications 303

(3): 902-907 44. Simonetti P., Pietta P. & Testolin G. 1997. Polyphenol contení and total antioxidant potential of selected italian wines. J. Agricultural and Food Chemistry 45: 1 152-1 155.

45. Tomás-Barberán F. A., Ferreres F., García-Viguera C. & Tomás-Lorente

F. 1993. Flavonoids in honey of different geographical origin. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung 196(1): 38-44 46. Ueda H., Yamazaki C. & Yamazaki M. 2003. Inhibitory effect of perilla leaf extract and luteolin on mouse skin tumor promotion. Biological &

Pharmaceutical Bulletin 26(4): 560-563.

47.Valcic S., Montenegro G., Timmermann B. N. 1998. Lignans from

Chilean propolis. J. Natural Products 61(6): 771-775. 48.Valc¡c S, Montenegro G, Mujica AM, . 1999. Phytochemical, morphological, and biológica! investigations of propolis from Central Chile. Zeitschríñ fur Naturforschung c - A J. Biosciences 54(5-6): 406-

416. 49.Wahdan H. A. L. 1998. Causes of the antimicrobial activity of honey.

Infθction 26(1): 30-35.

50.Weston R. J., Brocklebank L. K. & Lu Y. 2000. Identification and quantitative levéis of antibacterial components of some New Zealand honeys. Food Chemistry 70: 427-435.