ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de mortalidad en países desarrollados. Entre los factores de riesgo no genéticos asociados al desarrollo de enfermedades cardiovasculares se encuentra la dieta. Así, se ha demostrado que la incidencia de estas enfermedades está directamente relacionada con la presencia de niveles altos de colesterol en sangre, que se puede originar por una dieta rica en colesterol y grasa saturada.

Por otra parte, hay numerosos estudios que ponen de manifiesto que la oxidación o modificación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) son las desencadenantes de todo el proceso aterosclerótico, en el cual la activación endotelial y las especies de oxígeno activado tienen un papel muy relevante. Estudios epidemiológicos indican que la dieta mediterránea está relacionada con la incidencia baja de enfermedades cardiovasculares. Entre los componentes más frecuentes de esta dieta están las frutas y las verduras, y también el aceite de oliva como principal fuente de grasas, productos todos ellos ricos en antioxidantes. Resultados obtenidos de estudios in vivo e in vitro demuestran que los antioxidantes presentes en los alimentos son capaces de contrarrestar los efectos nocivos de los radicales libres, previniendo la oxidación de LDL y, por lo tanto, que se desencadene el proceso aterosclerótico.

El estrés oxidativo y la generación de radicales libres también juega un papel importante en enfermedades hepáticas y renales, debido a la alta presencia de oxígeno en dichos órganos, así como en el desencadenamiento de procesos inflamatorios en múltiples situaciones. Por esta razón los antioxidantes de la dieta pueden ser cruciales para prevenir este tipo de enfermedades.

Estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto que la radiación UV es el principal factor de riesgo en la incidencia de cáncer de piel. La piel cuenta con un sistema de defensa frente a las especies reactivas de oxígeno que se producen tras la exposición a la radiación UV, principalmente a través de las actividades enzimáticas superoxido dismutasa y glutatión peroxidasa. Una disminución de este sistema de defensa, concretamente, de los niveles de glutatión reducido intracelulares, produce un aumento de la pigmentación, envejecimiento de la piel, inducción de apoptosis y, finalmente, puede llevar a generar cáncer de piel. Así, se ha demostrado que la suplementación con antioxidantes (vitamina E) revierte la situación de estrés oxidativo inducida por la radiación UV en fibroblastos humanos.

El aceite de oliva es un alimento saludable rico en ácido oleico y antioxidantes. El tirosol y el hidroxitirosol son compuestos fenólicos obtenidos del olivo, que poseen una fuerte capacidad antioxidante que ha sido descrita in vitro e in vivo. El posible papel favorable del tirosol y el hidroxitirosol en las enfermedades cardiovasculares ha sido apuntado por diversos autores, que han demostrado que reduce la susceptibilidad de las lipoproteínas LDL a la oxidación in vitro e in vivo (Masella et al. 2001, Lipids, 36,1195-1202). También se ha sugerido que el hidroxitirosol podría disminuir la peroxidación lipídica en microsomas hepáticos en estudios en animales, e incluso que los compuestos antioxidantes fenólicos presentes en el aceite de oliva (tirosol e hidroxitirosol) podrían presentar un potente efecto antiinflamatorio.

El tirosol y el hidroxitirosol son fácilmente oxidables y por lo tanto su uso a partir de extractos de olivo puede originar que una parte importante del tirosol y el hidroxitirosol se oxide en la matriz alimentaria, lo que prevendría la oxidación del alimento, pero degradaría ambos antes de su entrada en el organismo. Por esta

razón, sería de gran interés conseguir que el tirosol y el hidroxitirosol llegaran intactos al organismo y fuera allí donde ejercieran su potente actividad antioxidante.

Al mismo tiempo, los extractos de olivo que contienen tirosol e hidroxitirosol son fracciones polares muy solubles en fase acuosa. Un proceso que aumentara la solubilidad del antioxidante en una fase oleosa sería de un claro interés para la industria alimentaria. La solubilidad de tirosol e hidroxitirosol se puede incrementar, como en cualquier molécula polar, uniéndole cadenas de ácidos grasos. En este caso se pueden utilizar aquellos ácidos grasos que a su vez tengan efectos favorables en el tipo de enfermedades que se tratan en esta invención.

Se ha descrito que dietas como la mediterránea, rica en ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y pobres en grasa saturada tienen efectos favorables en un perfil de riesgo cardiovascular (Feldman et al. 1999, Am. J. Clin. Nutr., 70,953- 4). Se ha demostrado que la ingesta de MUFA disminuye la concentración de triglicéridos y de colesterol en plasma en voluntarios sanos con niveles lipídicos normales (Kris-Etherton et al. 1999; Am. J. Clin. Nutr., 70,1009-15).

También se ha descrito que los ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3 (n-3 PUFA), principalmente el ácido eicosapentanoico (EPA) y el ácido docosahexanoico (DHA), ejercen efectos beneficiosos en el sistema cardiovascular y en procesos inflamatorios. Entre las actividades descritas para los n-3 PUFA están su actividad antiarrítmica, inhibición de la agregación plaquetaria y disminución de los lípidos plasmáticos y de los niveles de colesterol (Connor et al.

2000, Am. J. Clin. Nutr., 71, 171S-5S).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención es por tanto proporcionar una serie de compuestos que, como se mencionó anteriormente, sirvan para la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, hepáticas, renales e inflamatorias, que además presenten protección contra su degradación y que incluso puedan ser fácilmente incorporados a productos nutricionales.

La presente invención proporciona moléculas de tirosol e hidroxitirosol modificadas con al menos un ácido graso a través de un enlace de tipo éster. Estas moléculas sirven para la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares, hepáticas, renales, diabetes y enfermedades inflamatorias, así como a tratamientos cosméticos a través de la acción antioxidante de tirosol e hidroxitirosol, ya que todas estas enfermedades mencionadas cursan con un acusado estrés oxidativo.

Los ésteres de ácido graso de tirosol e hidroxitirosol se hidrolizan in vivo produciendo tirosol e hidroxitirosol, respectivamente, además del ácido graso correspondiente. Así, los componentes resultantes pueden ejercer a continuación sus actividades antioxidante, antiinflamatoria y nutricional en el organismo.

Adicionalmente, y gracias a la inclusión del radical o radicales de ácido graso en la molécula, los ésteres de la presente invención presentan por un lado autoprotección contra su degradación por oxidación, de tal forma que tanto el tirosol como el hidroxitirosol puedan llegar intactos al organismo; y por otro, presentan diferentes grados de solubilidad en fase acuosa y fase grasa, la cual puede ser modulada en función del grado de esterificación del tirosol o hidroxitirosol y del ácido graso esterificante seleccionado, de tal forma que se facilita su incorporación a cualquier tipo de productos nutricionales. Finalmente, la esterificación de tirosol o hidroxitirosol aporta un suplemento adicional de ácidos grasos mono y poliinsaturados, de conocido efecto beneficioso para la salud.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los derivados de tirosol e hidroxitirosol descritos en esta invención tienen una estructura común representada por la fórmula (I), donde al menos un hidroxilo debe estar modificado con una cadena de ácido graso. El grupo R varía dentro de la fórmula llevando a distintas series de derivados de tirosol e hidroxitirosol. Los grupos R1 y R2 pueden ser un grupo hidroxilo o un grupo hidroxilo protegido con una cadena de ácido graso vía un enlace de tipo éster. El grupo R3 puede ser hidrógeno (en el caso de tirosol o ésteres de tirosol), un grupo hidroxilo (en el caso de hidroxitirosol o ésteres de hidroxitirosol), o un grupo hidroxilo protegido con una

cadena de ácido graso vía un enlace de tipo éster (en el caso de ésteres de hidroxitirosol). Los compuestos pueden contener una, dos o tres cadenas de ácido graso con una longitud de entre 2 y 22 carbonos. Nota : Hidroxitirosol o 2- (3, 4-dihidroxifenil) etanol posee la fórmula (11) : R1, R2 y R3 son grupos hidroxilo.

Tirosol o 2- (4-hidroxifenil) etanol posee la fórmula (XV) : R1 y R2 son grupos hidroxilo y R3 es hidrógeno.

Una ilustración más práctica de alguno de los derivados de hidroxitirosol incluidos en la invención son : (1) Acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (III) : R2 y R3 son grupos hidroxilo y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido acético vía un enlace de tipo éster.

(2) Estearato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (IV) : R2 y R3 son grupos hidroxilo y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido esteárico vía un enlace de tipo éster.

(3) Oleato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (V) : R2 y R3 son grupos hidroxilo y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido oleico vía un enlace de tipo éster.

(4) 2- (3-esteariloxi-4-hidroxifenil) etanol (VI) : R1 y R3 son grupos hidroxilo y R2 es un grupo hidroxilo protegido con ácido esteárico vía un enlace de tipo éster.

(5) 2-(4-esteariloxi-3-hidroxifenil) etanol (VII) : R1 y R2 son grupos hidroxilo y R3 es un grupo hidroxilo protegido con ácido esteárico vía un enlace de tipo éster.

(6) Acetato de 2-(3, 4-diacetoxifenil) etilo (Vlil) : R1, R2 y R3 son grupos hidroxilo protegidos con ácido acético vía un enlace de tipo éster.

(7) Estearato de 2- (3, 4-diesteariloxifenil) etilo (IX) : R1, R2 y R3 son grupos hidroxilo protegidos con ácido esteárico vía un enlace de tipo éster.

(8) Oleato de 2- (3, 4-dioleiloxifenil) etilo (X) : R1, R2 y R3 son grupos hidroxilo protegidos con ácido oléico vía un enlace de tipo éster.

(9) Eicosapentanoato de 2-(3, 4-dihidroxifenil) etilo (Xl) : R2 y R3 son grupos hidroxilo y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido eicosapentanoico vía un enlace de tipo éster.

(10) Docosahexanoato de 2-(3, 4-dihidroxifenil) etilo (Xll) : R2 y R3 son grupos hidroxilo y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido docosahexanoico vía un enlace de tipo éster.

(11) Eicosapentanoato de 2- (3, 4-dieicosapentanoiloxifenil) etilo (XIiI) : R1, R2 y R3 son grupos hidroxilo protegidos con ácido eicosapentanoico vía un enlace de tipo éster.

(12) Docosahexanoato de 2- (3, 4-didocosahexanoiloxifenil) etilo (XIV) : R1, R2 y R3 son grupos hidroxilo protegidos con ácido docosahexanoico vía un enlace de tipo éster.

(13) Acetato de 2- (4-hidroxifenil) etilo (XVI) : R2 es un grupo hidroxilo, R3 es hidrógeno y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido acético vía un enlace de tipo éster.

(14) Estearato de 2- (4-hidroxifenil) etilo (XVII) : R2 es un grupo hidroxilo, R3 es hidrógeno y R2 es un grupo hidroxilo protegido con ácido esteárico vía un enlace de tipo éster.

(15) Oleato de 2- (4-hidroxifenil) etilo (XVIII) : ) : R2 es un grupo hidroxilo, R3 es hidrógeno y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido oléico vía un enlace de tipo éster.

(16) Eicosapentanoato de 2- (4-hidroxifenil) etilo (XIX) : R2 es un grupo hidroxilo, R3 es hidrógeno y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido eicosapentanoico vía un enlace de tipo éster.

(17) Docosahexanoato de 2- (4-hidroxifenil) etilo (XX) : R2 es un grupo hidroxilo, R3 es hidrógeno y R1 es un grupo hidroxilo protegido con ácido docosahexanoico vía un enlace de tipo éster.

(18) Acetato de 2- (4-acetoxifenil) etilo (XXI) : R1 y R2 son grupos hidroxilo protegidos con ácido acético vía un enlace de tipo éster y R3 es un hidrógeno.

(19) Estearato de 2- (4-esteariloxifenil) etilo (XXII) : R1 y R2 son grupos hidroxilo protegidos con ácido esteárico vía un enlace de tipo éster y R3 es un hidrógeno.

(20) Oleato de 2- (4-oleiloxifenil) etilo (XXIII) : R1 y R2 son grupos hidroxilo protegidos con ácido oléico vía un enlace de tipo éster y R3 es un hidrógeno.

(21) Eicosapentanoato de 2- (4-eicosapentanoiloxifenil) etilo (XXIV) : R1 y R2 son grupos hidroxilo protegidos con ácido eicosapentanoico vía un enlace de tipo éster y R3 es un hidrógeno.

(22) Docosahexanoato de 2- (4-docosahexanoiloxifenil) etilo (XXV) : R1 y R2 son grupos hidroxilo protegidos con ácido docosahexanoico vía un enlace de tipo éster y R3 es un hidrógeno.

Tirosol e hidroxitirosol son buenos candidatos para ser utilizados en la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares, hepáticas, renales e inflamaciones tanto agudas como crónicas, implementándolos como fármaco o como ingrediente alimentario, ya que combaten eficientemente el estrés oxidativo y, así, la producción de sustancias proinflamatorias y el reclutamiento de las células implicadas en estos procesos. Pero existen dos problemas para ser utilizado como antioxidante para prevenir estas enfermedades : 1) La oxidación en la matriz alimentaria o en la formulación farmacéutica.

2) La solubilidad de tirosol e hidroxitirosol en productos alimentarios de alta composición grasa.

La presente invención presenta derivados de tirosol e hidroxitirosol que evitan estos dos problemas. Los grupos hidroxilo de tirosol e hidroxitirosol en los nuevos derivados están parcial o totalmente protegidos a la oxidación. Cuando se comparan los ésteres de tirosol e hidroxitirosol con tirosol e hidroxitirosol, los ésteres son mucho más estables a la oxidación.

Al mismo tiempo, la solubilidad de estos derivados esterificados puede ser modulada dependiendo de la longitud de la cadena del ácido graso y del número de cadenas que esterifican la molécula de tirosol o hidroxitirosol. Se puede obtener un gran rango de solubilidades, desde compuestos totalmente solubles en fase acuosas, por ejemplo utilizando ácido acético para la formación de un éster de hidroxitirosol protegiendo uno sólo de los hidroxilos, hasta compuestos totalmente solubles en fase grasa, por ejemplo, utilizando ácido oléico para la formación de un éster de hidroxitirosol.

Además, se plantea la posible inclusión de los nuevos derivados de tirosol e hidroxitirosol en liposoms, lo que también protegería a estos compuestos de la oxidación y de la presencia de metales que puedan degradarlos, inutilizándolos como antioxidantes. Estos liposoms podrían incluirse tanto en un alimento con fase mayoritariamente acuosa o mayoritariamente oleosa.

Los nuevos derivados de tirosol e hidroxitirosol se hidrolizan en el tracto intestinal de ratones en sus dos componentes, tirosol o hidroxitirosol y el correspondiente ácido graso. A continuación las dos moléculas son rápidamente absorbidas por el organismo y se detectan en el plasma. Una vez absorbidos, ambos compuestos pueden actuar como antioxidantes para prevenir enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo y enfermedades inflamatorias.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 consiste en un gráfico que muestra la diferente estabilidad a la oxidación que poseen los compuestos acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (III), acetato de 2-(3, 4-diacetoxifenil) etilo (Vlil) e hidroxitirosol (II) cuando se encuentran incorporados en una matriz alimentaria oleosa.

La figura 2 consiste en un gráfico que muestra un estudio comparativo sobre la absorción tras ingesta por vía oral de hidroxitirosol y ácido vanílico, concretamente, las concentraciones plasmáticas promedio de hidroxitirosol y ácido vanílico detectadas después de la administración de una solución acuosa de hidroxitirosol (2.5mg/Kg peso).

Los siguientes ejemplos ilustran la invención Ejemplo 1 Preparación de acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (III).

A una disolución de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etanol (100 mg, 0.65 mmol) en THF seco (5 ml) se le adicionó K2CO3 anhidro (90mg, 0.65 mmol), cloruro de acetilo (0.46 ml, 0.66 mmol) e hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio (TBAH) (22 mg, 0.06 mmol). La mezcla se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 15h, y a continuación se filtró y evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (50mL), se lavó con agua (2x50mL) y la fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía

en columna utilizando como eluente una mezcla de hexano-éter etílico (1 : 1) para obtener 72 mg (57%) del compuesto III como un sirupo transparente.

RMN-'H (300 mHz, CDCI3) : 6.78 (d, J=8.1 Hz, 1H, aromático), 6.73 (d, J=1.5 Hz, 1H, aromático), 6.63 (dd, J=8.0, 1.5 Hz, 1H, aromático), 4.23 (t, J=7.1 Hz, 2H,- CH200C-), 2.81 (t, J=7.1 Hz, 2H, ar-CH2-), 2.03 (s, 3H,-CH3) Preparación de estearato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (IV).

A una disolución de 2-(3,4-dihidroxifenil)etanol (100 mg, 0.65 mmol) en THF seco (5 mi) se le adicionó K2CO3 anhidro (90mg, 0.65 mmol), cloruro de estearilo (197 mg, 0.66 mmol) y 22 mg de hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio (TBAH). La mezcla se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 24h, y a continuación se filtró y evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (50mL), se lavó con agua (2x50mL) y la fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna utilizando como eluente una mezcla de hexano-éter etílico (2 : 1) para obtener 132 mg (48%) de compuesto IV como un sólido blanco.

RMN-'H (300 mHz, CDCl3) : 6.79 (d, J=8.1 Hz, 1H, aromático), 6.72 (d, J=2, 1H, aromático), 6.63 (dd, J=8.0, 2.0 Hz, 1 H, aromático), 4.23 (t, J=7.1 Hz, 2H,- CH2OOC-), 2.80 (t, J=7.1 Hz, 2H, ar-CH2-), 2.28 (t, J=7.4 Hz, 2H,-OOC-CH2-), 1.58 (m, 2H,-OOC-CH2-CH2-), 1.24 (m, 28H,-CH2-), 0.87 (t, J=6.9, 3H,-CH3).

Preparación de oleato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (V).

A una disolución de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etanol (100 mg, 0.65 mmol) en THF seco (5 mi) se le adicionó K2CO3 anhidro (90mg, 0.65 mmol), cloruro oléico (0.27 mi, 0.75 mmol) e hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio (TBAH). La mezcla se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 24h, y a continuación se filtró y evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (50mL), se lavó con agua (2x50mL) y la fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna utilizando

como eluente una mezcla de hexano-éter etílico (4 : 1) para obtener 128 mg (47%) del compuesto V como un sirupo ligeramente amarillento.

RMN-'H (300 mHz, CDCl3) : 6.78 (d, J=8.1 Hz, 1H, aromático), 6.72 (d, J=2, 1H, aromático), 6.63 (dd, J=8.0, 2.0 Hz, 1H, aromático), 5.34 (m, 2H, HC=CH), 4.23 (t, J=7.1 Hz, 2H,-CH200C-), 2.80 (t, J=7.1 Hz, 2H, ar-CH2-), 2.28 (t, J=7.6 Hz, 2H,- OOC-CH2-), 1.99 (m, 4H,-CH2-HC=CH-CH2-), 1.58 (m, 2H,-OOC-CH2-CH2-), 1.26 (m, 26H,-CH2-), 0.87 (t, J=6.9, 3H,-CH3).

Preparación de 2-(3,4-monoestearolioxifenil) etanol. (VI y VII) A una disolución de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etanol (80 mg, 0.52 mmol) en THF seco (5 ml) se le adicionó piridina (0.06 ml) y anhídrido esteárico (290 mg, 0.53 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante 24 h en atmósfera inerte y a temperatura ambiente. A continuación se eliminaron los restos de piridina co- evaporando con tolueno (3x25 mi) y el residuo se llevó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (50 ml), se lavó con agua (2x50 ml), se secó sobre sulfato sódico anhidro y la fase orgánica se concentró a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna empleando como fase móvil una mezcla cloroformo-metanol 20 : 1, para obtener 44 mg (20 %) de un sólido blanco que resultó ser una mezcla (1 : 1) de los compuestos VI y VII.

RMN-'H de la mezcla 1 : 1 de los compuestos VI y VII (300 mHz, CDCl3) : 7.00 (d, J=8.1 Hz, 1 H, aromático), 6.96 (dd, J=5. 3, 2.1 Hz, 2H, aromático), 6.95 (s, 1 H, aromático), 6.87 (d, J=2.1 Hz, 1H, aromático), 6.77 (dd, J=8.2, J=2.1 Hz, 1H, aromático), 3.83 (t, J=6.4 Hz, 2H,-CH2OH), 3.82 (t, J=6.4 Hz, 2H, -CH2OH), 2.80 (t, J=6.4 Hz, 2H,-ar-CH2-), 2.78 (t, J=6.4 Hz, 2H,-ar-CH2-), 2.59 (t, J=7.4 Hz, 4H,,- ar-OOC-CH2-), 1.75 (m, 4H, -ar-OOC-CH2- CH2-), 1.25 (m, 56H,-CH2-), 0.87 (t, J=6.9 Hz, 6H,-CH3).

Preparación de acetato de 2-(3,4-diacetoxifenil) etilo (VIII).

A una disolución de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etanol (200mg, 1.3 mmol) en THF seco (10 mi) se le adicionó piridina (0.5 ml), anhidrido acético (0.6 ml) y 4-

dimetilaminopiridina (30 mg). La mezcla de reacción se agitó bajo argón durante 7h a temperatura ambiente. A continuación se le añadió metanol (25 mi) y la mezcla se co-evaporó con tolueno (3x10ml) a sequedad. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna utilizando como eluente una mezcla de hexano-éter etílico (1 : 1) para obtener 136 mg (75%) de compuesto Vil como un sirupo.

RMN-'H- (300 mHz, CDCl3) : 7.10 (dd, J=10. 2,1. 9 Hz, 2H, aromático), 7.04 (s, 1H, aromático), 4.26 (t, J=6.9 Hz, 2H,- CH2OOC-), 2.89 (t, J=6.9 Hz, 2H ar-CH2-), 2.27 (s, 3H,-ar-OCOCH3), 2.26 (s, 3H,-ar-OCOCH3), 2.02 (s, 3H,-CH2-OCO).

Preparación de estearato de 2- (3, 4-diesteariloxifenil) etilo (IX).

A una disolución de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etanol (100 mg, 0.65 mmol) en THF seco (10 mi) con agitación a 0°C, se le adicionó ácido esteárico (563 mg, 1.98 mmol), diciclohexilcarbodiimida (410 mg, 1.98 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (25 mg, 0.19 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo argón durante 24h a temperatura ambiente. A continuación se filtró la urea precipitada y el filtrado se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (25 ml), se lavó dos veces con 0.5 N HCI (2x50 ml), con una disolución saturada de NaHCO3 y con una disolución saturada de cloruro sódico (1x50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato sódico anhidro, se filtraron y se evaporaron a sequedad. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna utilizando como eluente una mezcla de hexano-éter etílico (6 : 1) para obtener 200 mg (32%) del compuesto IX como un sólido blanco.

RMN-'H (300 mHz, CDC13) : 7.08 (m, sistema AB, 2H aromático), 7.02 (s, 1H, aromático), 4.26 (t, J=7.0 Hz,-CH2OOC-), 2.91 (t, J=7.0 Hz, 2H, ar-CH2-), 2.50 (t, J=7.5 Hz, 4H, ar-OOC-CH2-), 2.26 (t, J=7.5 Hz, 2H,-OOC-CH2-), 1.71 (m, 4H,-ar- OOC-CH2-CH2-), 1.62 (m, 2H,-OOC-CH2-CH2-), 1.24 (m, 84H-CH2-), 0.87 (t, J=6.9 Hz, 9H,-CH3).

Ejemplo 2 Estabilidad a la oxidación de acetato de 2-(3,4-dihldroxifenil) etilo (III), acetato de 2-(3,4-diacetoxifenil) etilo (VIII) e hidroxitirosol (II) cuando se encuentran incorporados en una matriz alimentaria oleosa.

Se evaluó la estabilidad a la oxidación de li, 111 y VIII cuando se encontraban disueltos en aceite refinado. Para ello se midió la cantidad que quedaba de cada uno de los compuestos cuando eran sujetos a una oxidación forzada a 120°C. La oxidación se llevó a cabo pasando un flujo de aire seco (-20L/h) a través de una alícuota de muestra (4mL) colocada en un reactor calentado a 120°C haciendo uso de un aparato de Rancimat de la marca Metrohm-Herisau A. G.

Las disoluciones de todos los compuestos se prepararon en aceite refinado. Se disolvieron 5 mg de 11 en 5 g de aceite refinado, y finalmente 0.5 g de esta disolución se disolvieron en 5 g de aceite refinado. De igual manera se prepararon las disoluciones de 111 y Vlil en aceite refinado. Se fueron colectando alícuotas de 0.3 mL a distintos tiempos para cada disolución y fueron almacenadas a-20°C. El aislamiento de los compuestos II y III del aceite refinado se realizó utilizando extracción en fase sólida (cartucho de fase diol) con preacondicionamiento de 6 ml metanol, 6 ml hexano, después de colocar la muestra se pasaron pasan 6 ml de hexano, 6 mi de hexano/acetato de etilo (9 : 1) y 10 mi de metanol, y a continuación la fracción metanólica se concentró a 1 ml de volumen. En el caso del compuesto Vlil se aisló también utilizando extracción en fase sólida con cartucho LC-Diol, con el mismo preacondicionamiento, y pasándole a la muestra 12 mi de hexano y 10 mi de metanol. De nuevo se concentró la fase metanólica a 1 mi de volumen para su análisis. El análisis y la cuantificación de li, 111 y VIII se llevó a cabo por cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC) con detección UV a 254 y 280 nM. La figura 1 muestra la cantidad que resta de los compuestos 11, 111 y VIII a distintos tiempos durante la oxidación forzada a 120°C.

Se observa claramente en la figura 1 que el compuesto mono-acetilado (III) tarda más en degradarse que el hidroxitirosol (II), estando por lo tanto hidroxitirosol en

esta forma acetilada mejor preservado en la matriz alimentaria que cuando no lleva la modificación del grupo éster. Y este efecto es mucho más claro en el caso del compuesto tri-acetilado (Vlil), donde incluso después de 10 horas aún queda un 50% de compuesto mientras que los compuestos 11 y 111 se han degradado completamente.

Ejemplo 3 Absorción de hidroxitirosol (II) administrado por vía oral en voluntarios humanos.

Diseño experimental y métodos.

Se obtuvo hidroxitirosol puro a partir de hoja de olivo empleando procedimientos de extracción estándar compatibles con el uso alimentario.

Se administró una dosis de 2.5 mg de hidroxitirosol por Kg peso a 5 voluntarios sanos en ayunas de edades comprendidas entre 22-30 años, que no habían tomado aceite de oliva durante al menos dos días antes del estudio. El hidroxitirosol disuelto en agua se administró por vía oral, y a continuación se obtuvieron muestras de sangre a los tiempos 0, 10,20, 30,60, 120 minutos. Se determinó la concentración plasmática de hidroxitirosol y metabolitos derivados mediante cromatografía de gases-masas, empleando antraceno y naftol como estándares internos.

Resultados Los resultados del estudio se muestran en la figura 2. Se identificaron en plasma hidroxitirosol (3,4 dihidroxifeniletanol) y su metabolito derivado, el ácido vanílico (ácido 4 hidroxi 3 metoxi fenilacético), probablemente resultado de la actividad de la enzima catecol ortometil transferasa sobre ei hidroxitirosol. No se encontraron alcohol ni aldehido homovanílico en las muestras de plasma. La absorción del hidroxitirosol se llevó a cabo de manera muy rápida ya que la concentración plasmática máxima se detectó a los 10 minutos después de su administración, volviendo a valores próximos a los iniciales transcurridos 30 minutos. Por otra

parte, en ácido homovanílico comienzó a detectarse en el plasma de forma significativa a partir de los 10 minutos de administración de hidroxitirosol y mostró un máximo de absorción a los 30 minutos después de la administración de la solución. Es además interesante constatar que el ácido homovanílico desaparece del plasma más lentamente que hidroxitirosol.

En conclusión, el estudio de absorción muestra que el hidroxitirosol 1) se absorbe rápidamente en el intestino, 2) es biodisponible durante al menos 30 minutos después de su administración y 3) se metaboliza rápidamente a ácido homovanílico.

Ejemplo 4 Absorción de hidroxitirosol (II) y los derivados de hidroxitirosol III y IX administrado por vía oral en ratones.

Se estudió la absorción en ratas de hidroxitirosol (II), acetato de 2- (3, 4- dihidroxifenil) etilo (III), también llamado acetato de hidroxitirosol y de estearato de 2- (3, 4-diesteariloxifenil) etilo (IX), también llamado triestearato de hidroxitirosol.

Para ello, se prepararon soluciones oleosas de cantidades equivalentes de cada compuesto (10 mg de 11, 13 mg de 111 y 70 mg de IX) para ser administradas por vía oral a ratones y recoger su sangre después de 15 y 60 minutos. Se aisló plasma de cada muestra de sangre por extracción con acetato de etilo, y se analizaron por cromatografía de gases-masas.. Las cantidades de hidroxitirosol detectadas en plasma después de la administración oral de los compuestos 11 y 111 resultaron ser muy similares (ver tabla debajo) Compuesto administrado Hidroxitirosol en plasma, Hidroxitirosol en plasma, 15 min. 60 min. Hidroxitirosol (II) 0.79 mg/L 0. 05 mg/L acetato de 2- (3, 4- 0. 68 mg/L 0.06 mg/L dihidroxifenil) etilo (III) estearato de 2- (3, 4- no detectado 0.44 mg/L diesteariloxifenil) etilo (IX)

Cuando se administró estearato de 2- (3, 4-diesteariloxifenil) etilo (IX) a ratones, sólo se pudo detectar hidroxitirosol (II) en plasma tras una hora de la toma, pues después de 15 minutos no se detectaba hidroxitirosol en plasma (ver tabla superior). Estos resultados indican que aunque a diferente velocidad, tanto el acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo (III), como el estearato de 2- (3, 4- diesteariloxifenil) etilo (IX), liberan hidroxitirosol en el estómago o intestino de los ratones y a continuación éste puede ser absorbido y pasar a la corriente sanguínea.

Ejemplo 5 Preparación de un zumo enriquecido Se preparó un zumo enriquecido con los siguientes ingredientes : Ingrediente Cantidad por Kg. Zumo concentrado 200 g Acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo 1 g Fibra insoluble 10 g Lecitina 0.5 g Aromas 2 g Vitamina C 90 mg Vitamina B1 2.1 mg Vitamina B2 2.4 mg Vitamina B6 3 mg Vitamina B12 1. 5 pg Vitamina A 1. 2 mg Vitamina D 7. 5 pg Acido fólico 300 pg Procesado El producto final se preparó por adición de agua y los ingredientes solubles en agua sobre el concentrado de zumo. A continuación, se añadió el acetato de 2- (3, 4-

dihidroxifenil) etilo, se mezcló convenientemente y el producto resultante se pasteurizó y homogeneizó. Finalmente, el producto se dejó enfriar y se procedió a su envasado.

Ejemplo 6 Preparación de un producto con base de leche U. H. T.

Se preparó un producto con base de leche U. H. T. con los siguientes ingredientes : Ingrediente Cantidad por litro Leche desnatada 960 g Leche desnatada en polvo 17g Acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo 1 g Fosfato bisódico 0.5 g Fosfato tripotásico 0.2 g Agua 2 g Vitamina B6 3 mg Vitamina B12 3. 8 pg Vitamina A 1200 pg Vitamina D 7. 5 pg Vitamina E 15 mg Acido fólico 300 pg Procesado Los ingredientes sólidos se mezclaron con la leche líquida y el agua. A continuación se adicionó el acetato de hidroxitirosol y la mezcla se homogeneizó en ausencia de oxígeno. El producto lácteo resultante se sometió a un tratamiento U. H. T. (150°C durante 4-6 segundos) y finalmente se envasó en ausencia de oxígeno.

Ejemplo 7 Preparación de una bebida con formulación equilibrada nutricionalmente.

Se preparó una bebida con formulación equilibrada nutricionalmente con los siguientes ingredientes :

Ingrediente Cantidad por litro Leche desnatada 814. 3 g Concentrado de proteína de suero 11.8 9 Mezcla de aceites 32.5 g Sacarosa 27 g Maltodextrina 71 9 Fibra soluble 10 9 Vitamina A 1200 mg Vitamina D 7. 5 pg Vitamina E 15 mg Vitamina K 120 pg Vitamina C 90 mg Tiamina 2.25 mg Riboflavina 2.55 mg Piridoxina 3 mg Vitamina B12 3 jg Niacina 28.5 mg Acido fólico 30 jg Acido pantoténico 4 mg Biotina 40 pg Calcio 1200 mg Fósforo 970 mg Magnesio 47 mg Sodio 480 mg Potasio 1000 mg Cloruro 700 mg Hierro 43 mg Zinc 24.5 mg Yodo 150 pg Manganeso 100 ug Selenio 10 ug

Ingrediente Cantidad por litro Mono-y diglicéridos 1. 5 g Fosfato bisódico (Na2HP04 5H2O) 0.6 9 Carragenatos 4 9 Agua desmineralizada 70 9 Aromas 2.75 9 Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil) etilo 1.5 g Procesado Todos los ingredientes sólidos se mezclaron con la leche liquida y el agua haciendo uso de un tanque con agitación y calefacción apropiados. A continuación se adicionó el acetato de 2- (3, 4-diacetoxifenil) etilo. La mezcla se calentó a 60-70°C y se emulsionó con un homogeneizador de una sola etapa a 6-7 MPa en ausencia de oxígeno. Después de preparar la emulsión, la mezcla se calentó a 140-150° C, 4-6 s, y acto seguido se pasó por un homogeneizador de dos etapas (27-29 MPa and 3-4 MPa). Finalmente, la mezcla se envasó en ausencia de oxígeno.

Ejemplo 8 Preparación de una mantequilla con antioxidantes Se preparó una mantequilla con formulación equilibrada nutricionalmente con los siguientes ingredientes :

Ingredientes Cantidad por kg <BR> <BR> <BR> Mantequilla 200 g Mezcla de aceites 208 g Almidón 8 g Caseinato 6 g Emulsificante 2 g Maltodextrina 6 g Agua 570 g Oleato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo 1.5 g Procesado En primer lugar se preparó la fase acuosa con los ingredientes solubles en agua.

Los emulsificantes y el oleato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) etilo se disolvió en la mezcla de aceites. A continuación, la fase acuosa se fue incorporando en la fase grasa por adición continua a alta temperatura y con agitación. Esta mezcla se pasteuriza utilizando intercambiadores caloríficos de superficie. El producto final sólido se obtuvo haciendo uso de un rotor de alta velocidad con un sistema externo de refrigeración.