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Title:
NATURAL PRODUCTS AS RETINOIC ACID RECEPTOR (RARS) EXCITOMOTORS AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2013/097752
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed are natural products as retinoic acid receptor (RARs) excitomotors and the uses thereof. The marine natural products Luffariellolide and Manoalide are specific excitomotors of retinoic acid receptors (RARs), able to inhibit the growth of multiple tumor cells, including colon cancer cells with drug resistance to retinoic acid, by means of retinoic acid receptors.

Inventors:
LI YONG (CN)
WANG SHANSHAN (CN)
WANG ZHAO (CN)
Application Number:
PCT/CN2012/087753
Publication Date:
July 04, 2013
Filing Date:
December 28, 2012
Export Citation:
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Assignee:
XIAMEN UNIVESITY (CN)
International Classes:
C07D307/60; A61K31/365; A61P35/00; C07D407/04
Domestic Patent References:
WO2011094708A22011-08-04
Foreign References:
CN102532070A2012-07-04
Other References:
BARBARA C. M. POTTS ET AL.: "Chemical Mechanism of Inactivation of Bee Venom Phospholipase A2 by the Marine Natural Products Manoalide, Luffariellolide, and Scalaradial", J. AM. CHEM. SOC., vol. 114, 1992, pages 5093 - 5100, XP055073543
Attorney, Agent or Firm:
SHOUCHUANG JUNHE PATENT AGENT CO., LTD. XIAMEN (CN)
厦门市首创君合专利事务所有限公司 (CN)
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Claims:
权利要求书

[权利要求 1] 一种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选的方法, 其特征在于, 目 的化合物:

R1主要代表含有一个或多个 C=C键的烯烃碳链, C6~C10垸基、 C6^C10烷氧基、 C3〜C6环垸基、 0、 羰基、 -SH、 含氮杂环垸基 或者任意上述结合。

[权利要求 2] 一种具有结构式 I的化合物用途, 该化合物通过高特异性与高 结合亲和力来调控包括 RAR a, RAR I3 和 RAR Y在内的维甲酸受 体(RARs), 用作 RARs激动剂。

[权利要求 3] 如权利要求 2所述的具有结构式 I的化合物用途,其特征在于:

作为特异性的激活 RARs靶基因的表达的药物。

[权利要求 4] 如权利要求 2所述的具有结构式 I的化合物用途,其特征在于:

作为治疗 RARs介导的疾病的药物。

[权利要求 5] 如权利要求 2所述的具有结构式 I的化合物用途,其特征在于:

作为治疗包括急性早幼粒白血病、 乳腺癌和结直肠癌在内的癌 症的药物。

[权利要求 6] 如权利要求 2所述的具有结构式 I的化合物用途,其特征在于:

作为治疗包括结直肠癌在内的对维甲酸类药物产生耐药性的疾 病的药物。 [权利要求 7] 如权利要求 2-6所述的具有结构式 I的化合物用途, 其特征在 于, 所述化合物为 Luffariel lol ide或 Manoal ide,为以下结构 式, 具有 Y -羟基丁烯酸内酯环基团:

Luffariellolide

Manoalide

[权利要求 8] —种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选的方法, 其特征在于: 该方法根据 Luffariellolide与 RARs的结合结构及位点, 该晶 体结构见附录 1的结构, 以 Luffariellolide与 Manoalide及 其衍生物作为模板进行药物设计、 药物合成和 /或药物筛选。

[权利要求 9] 如权利要求 8所述的一种药物设计、药物合成和 Z或药物筛选的 方法, 其特征在于, 该药物结构中包含与 RAR a, β 和 γ通过 共价键特异性结合的 Υ -羟基丁烯酸内酯环。

[权利要求 10] 如权利要求 8所述的一种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选 的方法, 其特征在于: 该方法根据 Luffariel lolide 与 Manoal ide及其衍生物的结构, 将现有 RARs配体对应位置上的 基团替换为 Y -羟基丁烯酸内酯环。

[权利要求 11] 如权利要求 8所述的一种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选 的方法, 其特征在于: 全反式维甲酸, 13-顺式维甲酸与 9-顺 式维甲酸, 相应位置基团被 Y -羟基丁烯酸内酯环取代, 表示 为以下的结构式:

全反式维甲酸 γ-羟基丁烯酸内酯环

L3-顺式维甲酸 γ-羟基丁烯酸内酯环

9-顺式维甲 ν-羟基丁烯酸内酯环

[权利要求 12] 如权利要求 1, 7, 8, 9, 10, 11所述的化合物, 还包括在药学 上可接受的盐。

[权利要求 13] 如权利要求 1, 7, 8, 9, 10, 11所述的化合物, 还包括在药学 上可接受的赋型剂 <

Description:
说明书

发明名称: 一类作为维甲酸受体 (RARs)激动剂的天然产物及其用途 技术领域

[1] 本发明属于药物化学、 生物化学与结构生物学领域。 具体涉及一类维甲 酸受体 (RARs)激动剂的天然产物及其用途。 背景技术

[2] 维甲酸类化合物, 也可称之为类维生素 A, 是对维生素 A及其衍生物的统 称。 这类化合物对细胞的增殖与分化具有重要的调 节作用。 维甲酸类化合 物通过激活维甲酸受体 (RARs, 三个亚型: RAR a, β , y ) 或维甲酸 X受体

(RXRs, 三个亚型: RXR a , β , y ) 发挥作用。 这些小分子配体与受体的配 体结合域 (LBDs)结合后, RARs与 RXRs就会以异源二聚体的形式募集辅因子

( cof actor ) 从而调控下游靶基因。 RARs这种配体依赖性的辅因子募集方 式是通过 RARs的配体结合域 (LBDs ) 与辅因子的 LXXLL基序 (motif ) 的 相互作用实现的, 这一点与其他核受体相似。 蛋白质晶体结构研究向我们 展现了这种核受体与辅因子结合的经典模式: 首先激动剂与受体结合, 进 而核受体结构发生变化会形成一个疏水区域, 以便与辅因子 (如 steroid receptor coactivators , SRCs )所含有的 LXXLL基序结合。 核受体 helix 5 和 C端的 AF-2螺旋所形成的 "口袋" (charge clamp pocket ) 使 LXXLL基 序的结合更加稳定。

[3] RARs配体所具有的减缓或阻抑细胞增殖的作用 经广泛应用于多种癌症 的治疗中, 例如急性早幼粒白血病 (acute promyelocytic leukemia, APL) 与乳腺癌。但是,过于强烈的副作用会限制维 甲酸类 RARs配体的临床应用。 例如维甲酸对人体具有极为强烈的致畸作用。 此外, 维甲酸的临床使用还 受到细胞耐药性的影响, 这已经在多种癌细胞中得到证实。 因此, 改变针 对维甲酸受体 (RARs)配体的药物研发策略, 研制不同于维甲酸类化合物的 维甲酸受体 (RARs)配体, 可能会降低基于维甲酸受体 (RARs)配体的药物的 发明内容

[4] 本发明的主要目的, 在于提供一种不同于维甲酸类化合物的维甲酸 受体 (RARs)配体, 以降低基于维甲酸受体 (RARs)配体的药物的副作用。

[5] 本发明的另一目的, 在于提供一种维甲酸受体 (RARs)配体药物的设计方 法。

[6] 本发明的技术方案如下:

[7] —种药物设计、 药物合成和 Z或药物筛选的方法, 其特征在于, 目标药物

[8] 1主要代表含有一个或多个 C=C键的烯烃碳链, C6~C10垸基、 C6 10垸 氧基、 C3~C6环烷基、 0、 羰基、 -SH、 含氮杂环烷基或者任意上述结合。

[9] 一种具有结构式 I的化合物用途, 化合物通过高特异性与高结合亲和力来 激活包括 RAR α, RAR β和 RAR γ在内的维甲酸受体(RARs), 用作 RARs激动剂。

[ 10] 前述的具有结构式 I的化合物用途, 其作为特异性的激活 RARs靶基因 的表达的药物。

[ 1 1 ] 前述的具有结构式 I的化合物用途, 其作为治疗 RARs介导的疾病的药 物。

[ 12] 前述的具有结构式 I的化合物用途, 其作为治疗包括急性早幼粒白血 病、 乳腺癌和结直肠癌在内的癌症的药物。

[ 13] 前述的具有结构式 I的化合物用途, 其作为治疗包括结直肠癌在内的对 维甲酸类药物产生耐药性的疾病的药物。

[ 14] 前述的具有结构式 I 的化合物用途, 其中, 所述化合物为 Luffariellolide Manoalide,框内基团是 Y -羟基丁烯酸内酯环:

[15] 一种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选的方法, 其特征在于: 该方法 根据 Luffariellolide与 RARs的结合结构及位点, 该晶体结构见附录 1的 结构, 以 Luffariellolide与 Manoalide及其衍生物作为模板进行药物设 计、 药物合成和 /或药物筛选。

[16] 前述的一种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选的方法, 该药物结构中 包含与 RARa, β 和 Y 通过共价键特异性结合的 Υ-羟基丁烯酸内酯环。

[17] 前述的一种药物设计、 药物合成和 Ζ或药物筛选的方法, 该方法根据 Luffariellolide与 Manoalide及其衍生物的结构, 将现有 RARs配体相同 位置上的基团替换为 Y-羟基丁烯酸内酯环。

[18] 前述的一种药物设计、 药物合成和 /或药物筛选的方法, 全反式维甲酸

(AT A) , 13-顺式维甲酸(13-cis RA)与 9-顺式维甲酸(9-cis RA) , 框内相应位 置基团被 Y-羟基丁烯酸内酯环取代, 表示为以下的结构式:

全反式维甲酸 (AT A) γ-羟基丁烯酸内酯环

13-顺式维甲酸(13-cisRA) γ-羟基丁烯酸内酯环

9-顺式维甲酸 (9-cisRA) Ύ-羟基丁烯酸内酯环

[19] 本发明发现海洋天然产物 Luffariellolide和 Manoalide是维甲酸受体

(RA s)的特异激动剂, 并且基于分子结构水平来阐述这种特异的选择 性。

Luffariellolide和 Manoalide均来自海洋生物海绵,值得注意的是两 者能够通 过维甲酸受体 (RARs)抑制多种肿瘤细胞的生长, 同时降低了维甲酸类药物引起 的剧烈副作用。 本发明通过证明了 Luffariellolide和 Manoalide的医疗效果, 从它与维甲酸受体 (RARs)的相互作用揭示了迄今不明的这种多方面 药效药物的 信号通路机理。 本发明还通过 X射线晶体衍射, 从原子水平上提供了 RARa与 Luffariellolide所形成的蛋白复合物的三维结构, 展现了 RARa的配体结合袋 与 Luffariellolide 的共价结合模式, 是配体与维甲酸受体 (RARs)共价结合模 式的首次发现。 因此, 本发明为以维甲酸受体 (RARs)为靶标, Luffariellolide 为结构模板的新配体药物设计提供了药物优化 和设计方法。 本发明还发现

Luffariellolide和 Manoalide能够调节维甲酸受体(RARs)的重要靶向 因的表 达从而抑制肿瘤细胞的生长。 因此, 通过实验得出的结果表明, 通过优化 Luffariellolide和 Manoalide, 能够提供一种设计策略以研发用于抑制肿瘤生 长且有效减轻耐药性的药物。

附图说明

[20] 附图 1. 全反式维甲酸(All-trans RA, ATRA), Luffariellolide 和 Manoalide 的化学结构式。 (A) 全反式维甲酸(ATRA)的化学结构式。 (B) Luffariellolide的化学结构式。 (C) Manoalide的化学结构式。

[21] 附图 2. Luffariellolide和 Manoalide对不同核受体转录激活作用的检 测。 将 pG5Luc质粒和连接有 Gal-4 DNA结合域的编码核受体 LBDs的质粒转染进入 Cos7细胞中, 分别向培养细胞中加入 ΙμΜ的 Luffariellolide, Manoalide或二甲 基亚砜作为对照。 (图中 Luff为 Luffariellolide的縮写, Mano为 Manoalide的缩 写, 以下同。)

[22] 附图 3. Luffariellolide和 Manoalide剂量对 RARa的转录激活的影响。 (A) 将 pG5Luc质粒和连接有 Gal-4 DNA结合域的编码 RARa LBD与 Gal4 DBD的质粒 共转染 Cos7细胞, 向培养细胞中加入中加入不同浓度的 Luffariellolide或二甲 基亚砜作为对照。 (B) 将 pG5Luc质粒和连接有 Gal-4 DNA结合域的编码 RARa LBD 与 Gal4 DBD的质粒共转染 Cos7细胞, 向培养细胞中加入中加入不同浓度的 Manoal ide或二甲基亚砜作为对照。

[23] 附图 4. Luffariellolide是一种 "泛 RAR"激动剂。 将 pG5Luc质粒和连 接有 Gal-4 DNA结合域的编码核受体 LBDs的质粒转染进入 Cos7细胞中, 分别向培 养细胞中加入 ΐμΜ的 Luffariellolide或其他作为阳性对照核受体配体( RARs,全 反式维甲酸; RXRa, 9-顺式维甲酸; GR, 地塞米松; PPARy, 罗格列酮)。 此 外, 一部分细胞培养液中会加入拮抗剂 BMS493以供检测 Luffariellolide的作用 机制。

[24] 附图 5. Luffariellolide 促进 SRC1辅激活因子 LXXLL基序与 RARs的相 互作用。 利用 AlphaScreen技术检测终浓度为 1 μ Μ的 Luffariellolide对 RARs与 RXRa的 LBD与 SRC1的 LXXLL基序相互作用的影响。 另外还检测了 RARs的拮抗剂 BMS493对 Luffariellolide作用的影响。

[25] 附图 6. Luffariellolide/RARa LBD复合体结构的示意图。 绿色带状 部分表示 RARa LBD, 红色带状部分表示 SRC1。 Luffariellolide用棒状图来表 示, 黄色棒状部分表示该化合物的碳原子, 红色棒状部分表示氧原子。

[26] 附图 7. Luffariellolide/RARa 结构与功能的联系 。 在下列各图中带 状图表示核受体蛋白质的结构, 棒状图表示配体化合物的结构。 (A) RARa /Luffariellolide复合体 (绿色) 与 RAR α /全反式维甲酸复合体 (蓝色) 三维结构重叠比较, 在配体的重叠图像中, 绿色和红色分别代表全反式维甲酸 的碳原子和氧原子, 黄色代表 Luffariellolide 的碳原子; (B) SRCl-4(红色) 与 Luffariellolide/RAR LBD 复合体的结合模式图; (C) RAR LBD 与 Luffariellolide之间的范德华力结合; (D)RAR LBD与 Luffariellolide共 价键结合图; (E)RAR 的关键氨基酸突变后对 Luffariellolide诱导的转录活 性的影响。将编码 RAR 全长和含有 β RARE报道基因的质粒共转染到 Cos7细胞 后用浓度为 ΙμΜ维甲酸受体 (RARs)激动剂处理细胞。

[27] 附图 8. MALDI-T0F质谱验证 Luffariellolide 与 RARa LBD的共价键 结合作用。 RARa LBD分别与二甲基亚砜, 全反式维甲酸, 或 Luffariellolide 孵育, 然后利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF MS) 进行分析。 此外还对 RARa LBD与二甲基亚砜和 Luffariellolide的混合物进行孵育后进行 质谱分析。这两个峰分别是 RARa LBD和 结合了 Luffariellolide的 ARa LBD。

[28] 附图 9. Luffariellolide和 Manoalide对急性早幼粒白血病细胞 THP-1 的影响。 (A) 利用 MTT实验检测 Luffariellolide或 Manoalide对 THP-1细胞 增殖的抑制作用。 以细胞存活率作为检测指标 (纵坐标), 利用浓度为 5 μΜ 的 配体或二甲基亚砜处理细胞 24 小时。 (Β)利用流式细胞术检测 Luffariellolide和 Manoalide处理后 Gl, S, and G2/M期细胞所占比例。 (C) Luffariellolide或者 Manoalide诱导维甲酸受体 (RARs)关键靶基因在 THP-1 细胞中的表达。 利用浓度为 5 μΜ 的 Luffariellolide或 Manoalide处理急 性早幼粒白血病细胞 THP-1然后使用荧光定量 PCR实验检测维甲酸受体(RARs) 关键靶基因的表达。

[29] 附图 10. Luffariellolide和 Manoalide对人原髓细胞白血病细胞 HL-60 的影响。 (A) 利用 MTT实验检测 Luffariellolide或 Manoalide 对 HL- 60细胞 增殖的抑制作用。 以细胞存活率作为检测指标 (纵坐标), 利用浓度为 5 μΜ 的 配体或二甲基亚砜处理细胞 24小时。 (B) Luffariellolide或 Manoalide 诱 导 RAR关键靶基因在肿瘤细胞中的表达。 利用浓度为 5 μΜ 的 Luffariellolide 或 Manoalide 处理多种肿瘤细胞然后使用荧光定量 PCR实验检测 RAR关键靶基 因的表达。

[30] 附图 11. Luffariellolide和 Manoalide对人乳腺癌细胞 MCF-7的影响。 (A) 利用 MTT实验检测 Luffariellolide 或 Manoalide对 MCF-7细胞增殖的抑 制作用。 以细胞存活率作为检测指标 (纵坐标), 利用浓度为 5 μΜ 的配体或二 甲基亚砜处理细胞 24小时。 (B) Luffariellolide 或 Manoalide 诱导 RAR关 键靶基因在肿瘤细胞中的表达。 利用浓度为 5 μΜ 的 Luffariellolide 或 Manoalide 处理多种肿瘤细胞然后使用荧光定量 PCR实验检测 RAR关键靶基因 的表达。

[31] 附图 12. Luffariellolide对具有全反式维甲酸敏感性的结直 肠癌细胞 HCT-15和具有全反式维甲酸耐药性的结直肠癌细 胞 HCT-116 的作用。 (A) MTT 实验检测 Luffariellolide对 HCT-15和 HCT-116细胞增殖的抑制作用。 结果表 示为相对对照组的百分比。 (B-C) Luffariellolide诱导 HCT- 15和 HCT-116细 胞 RAR 关键的靶基因 RARP (B) 和 CRABPII (C)的表达。 使用 ΙμΜ Luffariellolide和 Ιθμ BMS493分别处理 HCT- 15和 HCT-116细胞。 使用荧光 实时定量 PCR技术检测 mRNA表达量。

具体实施方式

[32] 蛋白纯化

[33] 1. 克隆

[34] (1)以 pcDNA-RAR质粒为模板, 0.5 μ L 50 mM前向引物 5 ' GATATGGATTC CCGGAGGTGGG, 0.5 L 50 mM 反向引物 3 ' GATATGCGGCCGCACTCCAACATTTCC为 引物, 5 10 X PCR buffer, 1 u L 10 raM dNTP及 5 U pf u酶 (Invitrogen) 加水 (Milli-Q) 补足至 50 体系进行 PCR反应以获得含有双酶切位点 BamH I和 Not I的人源 RARa LBD (配体结合域) (氨基酸残基数 182-415 ) 的 PCR 产物。

[35] PCR反应程序为: [36] 94 °C 3分钟 94 °C

58 °C 30个循环

72 °C

72 °C 10 分钟

[37] (2)酶切克隆插入 DNA片段和 pET24a (Novagen) 载体

[38] 用 BamH I和 Not I对 PCR产物及 pET24a载体进行酶切。

[39] 酶切体系为:

[40] RARa LBD PCR产物或 pET24a载体 1 ug (10 μ ί)

[41] BamH I (Thermo ) 0. 5 L

[42] Not I (Thermo) 0. 5 L

[43] 10 X Digestion Buffer (Thermo) 4 ί

[44] ddH20 (Mi ll i-Q) 25 L

[45] 37°C 1小时。

[46] (4) 酶切后的 PCR产物和 pET24a载体通过加有 SYBR DNA 染料的 1%琼 脂糖凝胶分离并通过 Promega胶回收试剂盒进行片段回收处理。 [47] (5) 将回收片段和载体以摩尔比 3 : 1连接。 [48] 连接体系为:

[49] RARa LBD PC 产物 2 μ L

[50] pET24a (Novagen) 载体 2

[51] 5 X Ligation Buffer连接缓冲液 (Invitrogen ) 2 L

[52] T4 DNA Ligase (T4 DNA连接酶 -Invitrogen) 0. 5 L [53] 加 ddH20至 10

[54] 室温反应 30分钟。

[55] (6) 取 2 连接产物转化入 50 L Trans 109感受态细胞, 冰浴 30 分钟后 42°C热激 30秒。加入无抗生素的 LB液体培养基 250 μ L,于 225 rpm 3 °C 预摇 40分钟后, 取 100 μ L转化产物涂于添加有 50 8 /ιτι1 卡那霉素的 LB固 体培养基平板, 37°C过夜培养。

[56] (7)次日, 挑取单克隆于 2 ml含 50 μ g/ml卡那霉素的 LB液体培养基, 37 °C摇床培养 10小时。

[57] (8)采用 Qiagen MiniPrep 质粒小提试剂盒对所摇菌液进行质粒提取。

[58] (9) 对提取的质粒进行酶切鉴定。 酶切鉴定体系:

质粒 2

BamH I (Thermo ) 0. 5 μ L

Xho I (Thermo) 0. 5 L

10 X Digestion Buffer ( Thermo ) 2 μ L ddH20 (Mi ll i-Q) 15 L

[64] 37°C恒温箱酶切反应 30分钟后用 1%琼脂糖凝胶进行检测以确定目的片 段成功插入表达载体。 最后将获得的质粒进行测序鉴定。 得到六聚组氨酸标记 的人类核受体 ARa LBD的表达质粒, 表示为 pET24a-His6- RARa LBD。

[65] 2. 目的蛋白表达和纯化

[66] ( 1) 转化

[67] 将 pET24a_His6- RARa LBD转化进 BL21 (DE3 ) 感受态细胞, 取 1 质粒转化入 50 BL21感受态细胞, 冰浴 30分钟后放入 42 °C水浴锅中热激 30秒。 加入无抗生素的 LB液体培养基 250 L于 225 rpm 37°C预摇 40分钟后 取 15 涂于添加有 50 μ g/ml卡那霉素的 LB固体培养基平板, 37 °C过夜培 养。

[68] (2) 摇菌

[69] 次日挑单克隆于 50 ml含 50 μ g/ml卡那霉素的 LB液体培养基中 37°C预 摇 8小时后转入含 50 μ g/ml卡那霉素的 1. 5 L LB液体培养基中, 当 OD600达 到 1. 0左右时, 加入 0. 1 mM的 IPTG在 16°C下低温诱导表达。

[70] (3) 收集含有诱导目的蛋白的菌体细胞

[71] 诱导表达过夜的 1. 5 L菌液于 4。C 3, 000 rpm 离心 10 min收集细菌, 用纯化缓冲液 100 ml ( 20 mM Tri s pH8. 0, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 25 mM imidazol e ) 重悬菌液, 冻存于 -80°C。

[72] (4) 蛋白质提取

[73] 采用 Fi sher Scient ific Sonic Di smembrator超声破碎仪以振幅 60%,

5秒工作 10秒休息的频率超声波处理 8分钟。

[74] BECKMAN离心机以 20, 000 rpm 4°C离心 30分钟后取上清。

[75] (5) 蛋白质纯化

[76] 将上清过 5 ml 的镍离子交换柱 (NiS0 4 -loaded Hi sTrap HP column,

GE Healthcare ) , 使目的蛋白质充分富集到镍柱上。

[77] 采用 GE公司 AKTA蛋白质纯化系统及 UNICORN软件操作。

[78] 洗泵: 先用水洗, 再用缓冲液洗。 操作步骤为: 在 System Control 窗 口中, 依次选择: Manual Pump Pumpwashbas ic PumpA, PumpB On

Excute。 [79] 层析柱连接:先启动系统泵, 待有溶液流出时, 将层析柱动态接入系统, 使流出的蛋白质可以经过 UV检测到峰值, 打开 UNICOR 软件, 编辑蛋白洗脱的 程序:

[80] 20 ml洗脱缓冲液进行柱平衡

[81] 25-500 mM咪唑进行梯度竞争性结合柱子以洗脱目的蛋 质

[82] 15 ml缓冲液进行柱平衡。

[83] 蛋白质洗脱: 用洗脱缓冲液 A、 B梯度洗脱该柱子上的蛋白 (洗脱缓冲 液 A成分: 25 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM Imidazole和 10%甘油, pH 7.5; 洗脱缓冲液 B成分: 25 mM Tris, 150 mM Imidazole和 10%甘油, pH7.5), 通 过控制咪唑浓度梯度变化在 25-500 mM, 以在合适浓度竞争下洗脱含相似结构的 组氨酸标签的目的蛋白质。

[84] 采用 Hiload26分子筛层析柱 (GE Healthcare) 利用分子量不同进一步 纯化目的蛋白质, 步骤如下:

[85] 将收集的蛋白质盛入 Millipore 10 kD的浓缩管, 4°C 4, 000 g, 20 min 离心到终体积 10 ml后, 经注射器注入 AKTA端口后开始程序运行, 方法同上。 蛋白洗脱缓冲液换为含有 lOmMNaCl的洗脱缓冲液 C (洗脱缓冲液 C: 25 mM Tris, pH7.5)。

[86] (6) 制备蛋白质复合体

[87] 采用从金斯瑞 (Genscript)公司定制合成的 SRC1多肽 (AQQKSLLQQLLTE) 与 RARa LBD蛋白复合体: 分子筛柱层析得到的 20 ml 蛋白质与 SRC1 多肽及 Luffariellolide按摩尔比 1:1:1混合加入 10 kD MILLIPORE 15 ml 浓缩管中 浓缩, 4°C 4,000 离心浓缩, 将蛋白浓缩到 10 mg/ml的终浓度。 [88] 蛋白结晶, 晶体数据收集与结构解析

[89] 采用悬滴法进行结晶筛选, RARa/Luffariel lol ide/ SRCl复合物在室温 条件下, 悬滴液成分为 1. 0 μ ΐ 上述蛋白多肽配体复合体溶液混合上 1. 0 μ ΐ 结晶缓冲液 (2% V/V Tacsimate pH7. 0, 5% 2-propanol, 0. 1 M Imadazole and 8% PEG 3350)。 生长成熟的蛋白晶体用液氮进行急速冷冻保存 。 在美国先进光 源 (Advanced Photon Source ) 的生物 21 号实验站进行数据采集。 数据使用 HKL2000 软件进行初歩分析整理。 具体结构解析使用由 CCP4 程序包 (http:〃 www. ccp4. ac. uk ) 中的 Molr印、 Phaser等通过分子置换确定出大致 结构模型, 通过 Coot的人工模型精细构建及 REFMAC和 phenix. refine深入修 饰的多次循环, 得到最终蛋白复合物结构(Otwinowski and Minor, 1997, Methods in Enzymology 276, 307-326)。

[90] 辅因子结合实验

[91] 通过 Alphascreen分析方法,用 Alpha Screen nickel chelate detection kit试剂盒 (Perkins-Elmer ) 检测配体诱导核受体募集各种辅调节因子的结 合 能九 是核受体功能调控的一个重要指标 (Li, Y. et al. 2005, Mol Cell 17, 491-502)。该实验的反应体系是 20 nM的融合组氨酸标签的受体 LBD蛋白, 20 nM 生物素化标记的辅因子多肽, 5 gZml的供体和受体珠子, 缓冲液 (50 mM M0PS, 50 mM NaF, 0. 05 mM CHAPS, and 0. 1 mg/ml bovine serum albumin, pH7. 4) , 反应体系 50 μ L于 384孔板中室温反应 1小时后用 AlphaScreen检测仪读取 680 nm激发光下 520-620 nm的发射光信号。 用于 Alphascreen分析的生物素标记的 多肽序列如下:

[92] S C1-2, SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP; [93] SRC2-3, QEPVSPKKKENALL YLLDKDDTKD;

[94] SRC3-3, PDAASKHKQLSELLRGGSG ;

[95] NCO -2, GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF.

[96] 瞬时转染实验

[97] 1. 质粒:

[98] (2 ) 获得关键结合位点的 RARa 点突变表达载体。 使用 Quick-Change site-directed mutagenesi s 试齐 ll盒 (Stratagene ) 进行突变, 突变反应体系 如下:

[99] 野生型质粒 pCMX- RARa (50 ng) 0. 5 u L

[100] 突变引物 (100 μ Μ stock) 0. 2

[101] pfu DNA聚合酶 ( Invitrogen) (2 U) 1 μ L

[102] 10 mM dNTPs 1

[103] 10 X PCR buffer 5 L

[104] ddH20 43 u L

[105] 94 °C 3分钟

[106] 94 °C 30秒

[107] 55 °C 1分钟 15个循环

[108] 72 °C 7分钟

[109] 4°C forever

[110] 20 μ L PCR产物用 Dpn I甲基化酶消化后取 2 μ L消化产物转化入大 肠杆菌 Trans l09感受态细胞, 冰浴 30分钟后 42°C热激 30秒。加入无抗生素的 LB液体培养基 250 μ L 于 225 rpm 37°C预摇 40分钟后取 150 μ L涂于添加有 100 μ g/ml氨苄青霉素的 LB固体培养基平板, 37°C过夜培养。

[111] 次日, 挑取单克隆于 2 ml含 100 μ g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基, 37°C过夜培养。 采用 Qiagen MiniPrep 质粒小提试剂盒对所摇菌液进行质粒提 取。 对质粒进行测定鉴定。

[112] (2) 各内源结合元件的报告基因直接商业购买。

[113] 2转染:

[114] 使用含有 10%胎牛血清的 DMEM培养基进行猴肾上皮细胞 C0S-7细胞培 养,转染前一天在 24孔板进行 C0S-7细胞接种,接种密度为 5 X 104细胞 /每孔, 第二天进行转染。 转染使用 Lipofectaraine 2000 ( Invitrogen) 进行瞬时转染。 在报告基因分析实验中, 使用 200 ng的核受体全长表达质粒或其突变体表达质 粒与 200 ng的内源启动子报告基因以及 30 ng的 Renil la荧光素酶表达质粒进 行共转染。 每孔添加 500 LOpti-MEM培养 5小时后, 添加稀释在 Opt i -MEM的 配体药物至相应浓度, 处理 18小时。

[115] 3. 报告基因分析:

[116] 配体药物处理 18小时后, 用 Promega公司的双荧光素梅报告基因分析 试剂盒进行报告基因活性分析。 裂解细胞用于荧光素酶检测实验, 取 10 细 胞裂解细胞转移到 96孔板, 加入 50 μ L荧光素酶反应液后使用 EnSpireTM2300 多功能酶标仪 (Perkin Elmer)检测在 560 nm下的发射光信号,后加入 Stop&Glo® 反应液终止荧光素酶反应并检测 reni l la 荧光素酶活力。 报告基因的活性以 reni lla活性为内参。

[117] 基因表达分析

[118] HCT-15等细胞用 1 μ Μ全反式维甲酸或 Luffariel lol ide处理 24小时。 使用 Trizol试剂 (Life Technologies, Inc. ) 提取细胞的总 RNA。 反转录采用 TAKARA反转录试剂盒, 荧光定量 PCR采用 SYBR绿色荧光染料在 CFX TM 96系统 (BI0- AD)实时监测系统下进行基因表达量分析。

[119] 反应体系如下:

[120] SYBR Premix Ex Taq (2*) 12.5 L

[121] PCR前引物 (ΙΟμΜ) 1 μ L

[122] PCR后引物 (ΙΟμΜ) 1 μ L 总计 25μ

[123] cDNA模版 2uL

[124] 灭菌蒸馏水 8.5μ L

[125] 两步法扩增 PCR程序:

[126] 预变性

[127] 95 °C 30秒

[128] PC 反应

[129] 95。C 5秒 40个循环

[130] 60 °C 30秒 」

[131] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-T0F- S) 分析

[132] 将纯化后的 RARaLBD(30 M)蛋白溶液与二甲基亚砜,全反式维甲酸或

Luffariellolide 4°C共同孵育 24小时。 利用 Reflex III time-of-f light 质 谱仪 (Bruker-Daltonics, Bremen, Germany) 进行基质辅助激光解吸电离飞行 时间质谱分析。 利用强度为 19 keV的脉冲 W激光束 (λ = 337 nm) 使其离子 化 并 加 速 。 所 用 的 样 品 均 利 用 过 饱 和 的 芥 子 酸 (3, 5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid), 50%乙腈和 0.1%的 TFA作为基质。 将样品和基质按照同样的体积 (0.8 L) 混合后点样检测。

[133] ΜΤΤ法检测细胞增殖

[134] 按照每孔 IxlO 4 的数量将细胞培养于 24孔板。培养过夜后加入全反式维 甲酸, Luffariellolide或 Manoalide处理 24小时。 然后加入 MTT (3- 〔4, 5) -dimethyl thiahiazo (- z- yl) - 3, 5― diphenytetrazoliumromide)再处理 4小时。 最后将包括培养基, 药物和多余的 MTT—起去除后利用二甲基亚砜溶解甲瓒, 检测 490nm处和 630nm处的吸光度。

[135] 流式细胞术分析细胞周期

[136] 按照每孔 5χ10 5 的数量将细胞培养于 24孔板。 细胞培养 24小时后用 5 μ Μ的全反式维甲酸, Luffariellolide或者 Manoalide处理 24小时。 然后收 集细胞, 利用 70%乙醇固定过夜后利用碘化丙啶染色 1小时。至少 20, 000个细 胞利用 Epics XL Flow Cytometer (Beckman Coulter, Minnesota, USA)检测。 结果使用 Modf it software version 3.2 (Verity Software House, Inc. , Top sham, ME)分析。

[137] 我们的发明表明 Luffariellolide和 Manoalide及通过设计两者的衍 生物, 能够特异地以维甲酸受体 RAR为靶点, 作为治疗多种癌症的可选替代药 物。基于我们所展示的结构与构效(SAR)的分 ,我们提供了一种用以提高 RAR 亲和性和特异性, 降低耐药性的合理的设计范本。

[138] 实施例 1,证明 Luffariellolide和 Manoalide是维甲酸受体 RAR的配 体。

[139] 在寻找 RAR配体的过程中,将 RARs的 LBD当做"诱饵"利用 AlphaScreen 技术对化合物库进行筛选, 这一技术目前已经广泛应用于基于核受体与配 体相 互作用的药物研发中(Lin et al., 2012, Cell Res. 22 (4) : 746-56) 。 Luffariellolide是一种海洋天然产物, 化学本质为二倍半萜, 最初分离自海绵 (包括 Luffariellasp.和 Fascaplysinopsis)。 与全反式维甲酸 (ATRA)类似, Luffariellolide 由一条疏水的碳链和一个三甲基环己烯基团组 成 (附图 1)。 值得注意的是在 Luffariellolide与全反式维甲酸的化学结构对比中 , 关键位 置的基团是完全不同的。全反式维甲酸为丁烯 酸(羧基),而在 Luffariellolide 的相应位置上则为 Y-羟基丁烯酸内酯环。这一点不同是极其重要 , 是药物研 发新策略的关键所在。 Manoalide也是分离自海绵的天然产物, 属于倍半萜类化 合物。 Manoalide与 Luffariellolide的结构基本相同 (附图 1), 都含有三甲 基环己烯环和 Y-羟基丁烯酸内酯环这两个主要基团。 不同之处在于 Manoalide 中与 Y -羟基丁烯酸内酯环相连的是一个二氢吡喃环 而 Luffariellolide不含 有此二氢吡喃环。

[140] 为了进一步研究 Luffariellolide和 Manoalide对 RARs的激活作用, 我们将编码 Gal4DNA结合域、 报道基因、 多种核受体 LBD的质粒共转染到 Cos7 细胞中。 实验结果与最初对化合物的筛选结果一致, Luffariellolide 和 Manoalide均可以激活维甲酸受体 RAR,但不能激活其他核受体(包括 RXRo PPAR y GR、 RTR、 ERRa、 RORa, β , γ以及 TR3) (附图 2), 说明 Luffariellolide 和 Manoalide是维甲酸受体 RAR的独特配体。

[141] 为了检测了 Luffariellolide和 Manoalide与 ARs的结合特性, 我们 使用一系列不同浓度的 RARs配体进行荧光素酶报道基因检测来进行比 (附图 3)。 全剂量曲线表明 Luffariellolide 对 RARs 的激活具有浓度依赖性, 其 EC 50 =600nM (附图 3A)o 我们同时检测了 Manoalide, 实验结果表明 Manoalide 对 RAR的激活也具有浓度依赖性, 其 EC 5 。=600nM (附图 3B)。 我们进一歩利用荧 光素酶报告基因实验将编码 Gal4 DNA结合域、 报道基因、 多种核受体 LBD的质 粒共转染到 Cos7细胞中。结果显示 Luffariellolide可以激活 RARa, AR^, RAR Y , 表明 Luffariellolide是一种 "泛 RAR"激动剂 (附图 4)。 此外 RARs特异 性的拮抗剂 BMS493会抑制 Luffariellolide对 RARs的激活作用, 进一步证明 Luffariellolide是通过与 RARs直接结合的方式发挥作用的 (附图 4)。

[142] 为了研究 Luffariellolide 与 RARs 相互作用的生化机理, 我们采用 AlphaScreen技术检测了 Luffariellolide对 RARs募集辅激活因子 (含 LXXLL) 的影响。 如附图 5所示, Luffariellolide极大地增强了 RARs对辅激活因子的 募集, 但是对 RXRa没有影响。 并且 Luffariellolide对 RARs的这种增强作用 会因为拮抗剂 BMS493的加入而被抑制, 从而进一步说明 Luffariellolide是直 接结合于 RARs的激动剂。

[143] 实施例 2,RARa配体结合域片段与 Luffariellolide的复合物的分子结 构验证实验。

[144] 为了研究 Luffariellolide与 RARs结合的分子基础,我们解析了 RARa 与 Luffariellolide 复合体的晶体结构。 晶体结构表明结合 Luffariellolide 后的 RARa LBD形成二聚体, 其构象与 RAR/全反式维甲酸复合体相似, 配体均锚 定于 RARa的相似位置〔附图 6和附图 7A)。 RAR/Luffariellolide复合体的 AF-2 与 a螺旋 H3、 H4和 H5共同构成一个 "口袋", 与辅激活子 SRC1的 LXXLL基序发 生相互作用(附图 6和附图 7B)。这是一种核受体与辅激活因子相互作用的 典型 模式。其中,位于 H3的 K244和位于 AF-2的 E412是其相互作用的关键位点。 对 这两个关键氨基酸残基进行突变 (K244E,E412K), 然后进行报告基因检测实验 (附图 7E)。 实验结果表明, 任何一个关键残基的突变均会导致 RARa被全反式 维甲酸或 Luffariellolide 的激活作用显著减弱。 这一实验结果有力证明了由 配体调控的 RARs激活作用的典型机制。

[145] 将 RAR/Luffariellolide复合体与 RAR/全反式维甲酸复合体的结构重 叠后进行对比发现与全反式维甲酸相比, Luffariellolide分子更大, 导致所对 应的配体结合口袋也增大, 表现为部分 α螺旋 H10向外移动 1.2 Α (附图 7A)。 除此之外 Luffariellolide 在 RARa配体结合口袋中的结合方式还有其独特之 处: Luffariellolide通过范德华引力与 RARa的 a螺旋 H3的 W225氨基酸残基 相互作用, 这一作用有利于 Luffariellolide的结合(附图 7C)。对这一位点进 行点突变处理 (W225F) 破坏了相互作用, 导致 Luffariellolide对 RARs的激 活作用显著降低, 但是同样的点突变对全反式维甲酸的结合能力 与功能均没有 影响。 值得注意的是, 电子密度图显示 RARa的 C235 氨基酸残基与 Luffariellolide的 Y _羟基丁烯酸内酯环上的酮基形成共价键, 而在维甲酸类 化合物相应的位置上则是一个羧基 (附图 7D)。 质谱分析的结果为 Luffariellolide与 RARa形成共价键提供了有力的证据 (附图 8)。 为了检测这 个共价修饰对 Luffariellolide结合以及激活囊 作用的影响, 对 C235残基 进行点突变(C235A,C235L), 使用荧光素酶报道基因检测的方法发现: C235A和 C235L均会使 Luffariellolide对 RARa的激活作用丧失或显著下降, 而对全反 式维甲酸却没用影响 (附图 7E), 这说明该共价键对 Luffariellolide与 RARa 的结合是至关重要的。

[146] 实施例 3, Luffariellolide和 Manoalide对多种癌细胞增殖和基因 表达的调控 [147] 申请人设计了一系列细胞生物学实验来进一步 研究 Luffariellolide 和 Manoalide的生理功能。 通过对急性早幼粒白血病 THP-1细胞系进行的 MTT 和流式细胞术实验, 结果发现: Luffariellolide和 Manoalide与全反式维甲酸 相似, 可以抑制 THP-1细胞增殖并且使 THP-1细胞周期 G1期的细胞所占比例上 升 (附图 9A和附图 9B)。 申请人还检测了经过 Luffariellolide或 Manoalide 处理的 THP-1细胞 RAR靶基因的表达情况。 如附图 9C所示, 两者均可诱导一些 已知的 RAR靶基因 (RAR α, β和 interferon regulatory factor- 1, IRF-1 ) 上 调。 这进一步证明了 Luffariellolide和 Manoalide对 RAR靶基因的表达有很 强的诱导作用。 此外, 申请人还在人原髓细胞白血病细胞 (HL-60)和人乳腺癌细 胞 (MCF-7) 中进行了相关实验, 进一歩证明了 Luffariellolide对多种肿瘤细 胞均具有抑制增殖的作用 (附图 10和附图 11)。

[148] 实施例 4, Luffariellolide对具有全反式维甲酸耐药性的结直 肠癌细 胞的作用

[149] 申请人进一歩的研究了 Luffariellolide对结直肠癌细胞系 HCT-116 和 HCT-15增殖的抑制作用。 两种细胞系的不同之处在于: HCT-116具有维甲酸 药物耐药性, 而 HCT-15则是维甲酸药物敏感型的。 如附图 12A所示, 全反式维 甲酸和 Luffariellolide都可以抑制 HCT-15的增殖。 对于 HCT-116细胞而言, 全反式维甲酸对 HCT-116的增殖没有影响, 但是 Luffariellolide可以有效抑 制 HCT-116的增殖 (附图 12A), 这表明在抗癌方面 Luffariellolide可能要优 于全反式维甲酸。 基于以往研究, RAR 和 CRABPII 这两个基因在维甲酸药物 耐药性方面有着重要指示作用, 选取这两个基因作为研究对象。 正如附图 12B, 12C所示, 全反式维甲酸和 Luffariellolide都可以诱导 HCT-15中这两个基因 的表达; 而由于 HCT-116细胞耐药性的影响, 全反式维甲酸不能诱导该细胞中 RAR β和 CRABPI I这两个基因的表达, 但是 Luf far i e 11 ol i de可以诱导 HCT_ 116 细胞的 RAR i¾和 CRABPII基因表达上调。另外, 我们还在以上检测细胞增殖和基 因表达的实验体系的基础上加入了拮抗剂 BMS493 , 结果发现 Luffariel lol ide 的作用因为丽 S493的加入明显减弱, 更进一步说明 Luffariel lol ide对癌细胞 发挥作用是通过 RARs对癌细胞发挥作用的。

[150] 鉴于 RAR配体在药物开发尤其是抗癌药物的研制方面 具有重要作用, 近年来针对可以调控 RARs活性的小分子化合物 (包括激动剂和拮抗剂) 的研发 深受相关工作者的重视。 但是到目前为止, 大多数已经发现的 RAR配体都在结 构上与维甲酸相似。 因此, 这些配体也同样面临着严重的副作用和广泛的 耐药 性。 而本发明研究的 Luffariel lol ide和 Manoalide首先在结构上与维甲酸类 化合物不同,其独特之处在于通过共价键与 RARs结合,这一特点此前尚未在 RARs 配体中发现。更为重要的是, Luffariellol ide和 Manoal ide对已经具有维甲酸 药物耐药性的癌细胞 (如 HCT-116 ) 也有治疗作用。 因此, Luffariel lol ide 和 Manoalide的发现对针对以 RARs为代表的重要核受体的药物研发指明了新 方向。

工业实用性

[151] 通过实验得出的结果表明, 通过优化 Luffariellol ide和 Manoal ide, 能够提供一种设计策略以研发用于抑制肿瘤生 长且有效减轻耐药性的药物。

[152] 上述仅为本发明的具体实施例, 但本发明的设计构思并不局限于此, 凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动, 均应属于侵犯本发明保护范围的 行为。

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA RRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

EEEEEEEEEEEEEEEEEEEETTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTT RRRRRRRRRRRRRRRRRRRR w

Luffanellolide与 RARa复合体的三维晶

PROGRAM : REFMAC 5. 2. 0019

AUTHORS : MURSHUDOV, VAGIN, DODSON

REFINEMENT TARGET LIKELIHOOD

DATA USED IN REFINEMENT.

RESOLUTION RANGE HIGH (ANGSTROMS) 2. 55 RESOLUTION RANGE LOW (ANGSTROMS) 47. 46 DATA CUTOFF (SIGMA (F) ) NONE

COMPLETENESS FOR RANGE (%) 84. 89 NUMBER OF REFLECTIONS 17479

FIT TO DATA USED IN REFINEMENT.

CROSS-VALIDATION METHOD THROUGHOUT FREE R VALUE TEST SET SELECTION R VALUE (WORKING + TEST SET) 0. 22820 R VALUE (WORKING SET) 0. 22743

FREE R VALUE 0. 24318

FREE R VALUE TEST SET SIZE (%) 5. 0 FREE R VALUE TEST SET COUNT 922

N PRO A 182 -40. 823 -13. 893 10. 581 1. 00 91. 51

CA PRO A 182 -40. 907 - 12. 536 9. 986 1. 00 90. 96

CB PRO A 182 -41. 863 -11. 789 10. 953 1. 00 92. 46

CG PRO A 182 -41. 580 -12. 541 12. 429 1. 00 93. 36

CD PRO A 182 - 41. 469 -14. 019 11. 929 1. 00 91. 75

C PRO A 182 -39. 503 -11. 868 9. 985 1. 00 89. 00

0 PRO A 182 -38. 697 -12. 054 9. 092 1. 00 86. 88

N GLU A 183 -39. 229 -11. 080 11. 017 1. 00 86. 80

CA GLU A 183 -37. 926 —10. 524 11. 249 1. 00 83. 51

CB GLU A 183 -38. 130 - 9. 502 12. 359 1. 00 85. 36

CG GLU A 183 -37. 525 8. 133 12. 065 1. 00 92. 11

CD GLU A 183 -36. 362 - 7. 801 13. 028 1. 00100. 12

0E1 GLU A 183 -35. 191 - 7. 796 12. 567 1. 00103. 55

0E2 GLU A 183 -36. 610 - 7. 584 14. 244 1. 00102. 09

C GLU A 183 -36. 873 -11. 627 11. 671 1. 00 78. 96

0 GLU A 183 - 35. 672 -11. 419 11. 670 1. 00 73. 60

N VAL A 184 - 37. 367 - 12. 822 12. 014 1. 00 75. 56

CA VAL A 184 —36. 553 - 13. 992 12. 311 1. 00 70. 77

CB VAL A 184 - 37. 427 - 15. 125 12. 874 1. 00 71. 34

CGI VAL A 184 -36. 587 -16. 283 13. 274 1. 00 68. 77

CG2 VAL A 184 -38. 258 -14. 617 14. 127 1. 00 70. 78

C VAL A 184 -35. 832 -14. 436 11. 042 1. 00 69. 55

0 VAL A 184 -34. 574 -14. 616 11. 059 1. 00 69. 16

N GLY A 185 -36. 600 -14. 563 9. 945 1. 00 66. 32

CA GLY A 185 -36. 059 -14. 932 8. 653 1. 00 60. 46

C GLY A 185 -34. 866 -14. 062 8. 257 1. 00 60. 43

0 GLY A 185 -33. 812 -14. 533 7. 814 1. 00 57. 15

N GLU A 186 - 35. 022 - 12. 758 8. 422 1. 00 61. 80

CA GLU A 186 -34. 029 -11. 843 7. 971 1. 00 62. 20

CB GLU A 186 -34. 532 —10. 455 8. 135 1. 00 65. 33

CG GLU A 186 -35. 767 -10. 220 7. 381 1. 00 78. 05

CD GLU A 186 -36. 289 8. 841 7. 714 1. 00 94. 53

0E1 GLU A 186 -36. 477 -8. 041 6. 750 1. 00100. 05

0E2 GLU A 186 -36. 468 -8. 552 8. 938 1. 00101. 22

C GLU A 186 -32. 768 -11. 987 8. 758 1. 00 60. 97

0 GLU A 186 -31. 714 -11. 894 8. 197 1. 00 62. 23

N LEU A 187 -32. 882 -12. 233 10. 062 1. 00 60. 36

CA LEU A 187 -31. 722 -12. 420 10. 964 1. 00 55. 78

CB LEU A 187 -32. 183 - 12. 432 12. 401 1. 00 55. 16

40 CG LEU A 187 -31. 058 -12. 705 13. 425 1. 00 55. 77 41 CD1 LEU A 187 -30. 082 -11. 464 13. 616 1. 00 58. 32 42 CD2 LEU A 187 -31. 706 - 13. 021 14. 751 1. 00 48. 33

C LEU A 187 -30. 905 - 13. 678 10. 683 1. 00 53. 30

0 LEU A 187 -29. 707 - 13. 599 10. 611 1. 00 51. 87

N ILE A 188 -31. 600 -14. 794 10. 443 1. 00 50. 34

46 CA ILE A 188 —30. 961 -16. 032 10. 000 1. 00 50. 20 3 08 19 00 ΐ 0Ζ ε Z1 11- 029 \Z 961 V 1 93 S T T

3 Z6 'If 00 •ΐ 692 ~f £ΐ9 7ΐ- f9f ■QZ 961 V NO V3

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