SOUS-UNITE TBP2 DE NEISSERIA MENINGITIDIS

La présente invention a pour objet un nouveau variant de la sous-unité Tbp2 du récepteur transferrine de Neisseria meningitidis, son utilisation à titre de médicament, ainsi que le fragment d'ADN codant pour ce variant.

D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. Les bactéries principalement responsables sont : N. meningitidis et Haemophilus inβuen∑ae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes.

On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N. meningitidis. Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2 500 à 3 000 par an.

L'espèce N. meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables à 3 sérogroupes : A. B et C.

Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à /V. meningitidis sérogroupes A et C. Ces poh saccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogéniques chez les enfants de moins de 2 ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse.

Par contre, le polysaccharide de N. meningitidis groupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. Ainsi, il apparaît hautement souhaitable de rechercher un vaccin à l'encontre des méningites induites par N meningitidis notamment du sérogroupe B. autre qu'un vaccin à base de polysaccharide.

A cette fin. différentes protéines de la membrane externe de .Y. meningitidis ont déjà été proposées. Il s'agit en particulier du récepteur membranaire de la transferrine humaine.

D'une manière générale, la grande majorité des bactéries ont besoin de fer pour leur croissance et elles ont développé des systèmes spécifiques d'acquisition de ce métal. En ce qui concerne notamment N. meningitidis qui est un pathogène strict de l'homme, le fer ne peut être prélevé qu'à partir de protéines humaines de transport du fer telles que la

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transferrine et la lactoferrine puisque la quantité de fer sous forme libre est négligeable chez l'homme (de l'ordre de 10 ^* 18 M), en tout cas insuffisante pour permettre la croissance bactérienne.

Ainsi, N. meningitidis possède un récepteur de la transferrine humaine et un récepteur de la lactoferrine humaine qui lui permettent de fixer ces protéines chélatrices du fer et de capter par la suite le fer nécessaire à sa croissance.

Le récepteur de la transferrine de la souche N. meningitidis B16B6 a été purifié par Schryvers et al (WO 90/12591) à partir d'un extrait membranaire. Cette protéine telle que purifiée apparaît essentiellement constituée de 2 types de polypeptides : un polypeptide d'un poids moléculaire apparent élevé de 100 kDa et un polypeptide d'un poids moléculaire apparent moindre d'environ 70 kDa, telles que révélés après électrophorese sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

Le produit de la purification notamment mise en oeuvre par Schryvers est par définition arbitraire et pour les besoins de la présente demande de brevet, appelé récepteur de la transferrine humaine (RTH) et les polypeptides le constituant, des sous-unités. Dans la suite du texte, les sous-unités de poids moléculaire élevé et de poids moléculaire moindre sont respectivement appelées Tbpl et Tbp2.

Depuis les travaux pionniers de Schryvers et al. on a découvert qu'il existait en fait au moins 2 types de souches qui diffèrent par la constitution de leurs récepteurs de la transferrine respectifs. Ceci a été mis en évidence en étudiant des extraits de membrane externe de plusieurs dizaines de souches de N. meningitidis d'origines variées. Ces extraits membranaires ont tout d'abord été soumis à une électrophorese sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, puis électrotransférés sur feuilles de nitrocellulose (Western Blot). Ces feuilles de nitrocellulose ont été incubées :

a) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine purifié à partir de la souche N. meningitidis B16B6. aussi appelée IM2394 ;

b) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine purifié à partir de la souche /V. meningitidis M982. aussi appelée IM2169 ; ou

c) en présence de la transferrine humaine conjuguée à la peroxydase.

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En ce qui concerne a) et b), la reconnaissance des sous-unités du récepteur de la transferrine est révélée par addition d'un anticorps anti-immunoglobulines de lapin couplé à la peroxydase, puis par addition du substrat de cette enzyme.

Les tableaux I et II ci-dessous indiquent le profil de certaines souches représentatives tel qu'il apparaît sur gel de polyacrylamide à 7.5 % après électrophorese en présence de SDS ; les bandes sont caractérisées par leur poids moléculaires apparents exprimés en kilodaltons (kDa) :

N.B. : Entre parenthèses sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe. le sérotype. le sous-type et l'immunotype.

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N.B. : Entre parenthèses sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe, le sérotype, le sous-type et l'immunotype. n s _* o- _* (Jt ce o

Les résultats répertoriés dans les 2 premières lignes des tableaux montrent qu'il existe 2 types de souches :

Le premier type (Tableau I) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues en Western blot par l'antiserum anti-récepteur IM2394, tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antiserum anti-récepteur IM2169.

Le second type (Tableau II) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues en Western blot par l'antiserum anti-récepteur IM2169, tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antiserum anti-récepteur IM2394.

En conséquence, il existe une diversité antigénique au niveau de la sous-unité de moindre poids moléculaire. Cette diversité est toutefois restreinte puisqu'elle se résout en 2 grands types, contrairement à ce qui est suggéré par Griffiths et al. FEMS Microbiol. Lett. ( 1990) 69 : 31.

Sur la base de ces observations, la demande WO 93/6861 distingue des souches de type M982 (IM2169) ou de type B 16B6 (IM2394).

Outre ies souches cités dans le tableau II. des souches de type M982 sont par exemples les souches S3032 (12. P 1.12.16). 6940 ( 19. P 1.6). M978 (8. P 1.1 , 7). 2223 (B : nd). 1610 (B : nd), C708 (A : 4. P 1.7), M981 (B : 4). aussi appelée 891. et 2996 (B : 2b, P 1.2). Le déposant a reçu, par envoi gracieux, les souches S3032, M978 et M981 du Dr. J. Poolman (RIVM, Bilthoven. Pays-Bas), et la souche C708 du Dr. Achtman (Max Planck Institute. Berlin, Allemagne).

La souche IM2154 (sérogroupe C) est citée à titre d'exemple comme étant de type B16B6.

En vertu des précédentes constatations, on pouvait supposer qu'un vaccin efficace à l'encontre de toutes les infections à N. meningitidis pourrait être constitué de manière suffisante, de la sous-unité de haut poids moléculaire, queile que soit la souche d'origine du récepteur, puisque cette dernière est reconnue par les 2 types d'antisérums. Toutefois, il semble que cela ne puisse être le cas dans la mesure où la sous-unité de haut poids

moléculaire ne serait pas capable d'induire la production d'anticorps de type neutralisant. Seule la plus petite des 2 sous-unités du récepteur (Tbp2) serait capable de remplir cette fonction.

En fait, la protéine Tbp2 plutôt que Tbpl, possède un certain nombre de caractéristiques qui en font un candidat vaccinal potentiel : une expression ubiquitaire, une accessibilité à la surface du germe, la capacité d'induire des anticorps neutralisants et une variabilité limitée puisque comme cela vient d'être exposé, deux groupes majeurs ont été identifiés à ce jour.

En vertu de cette découverte, on a déjà proposé des compositions pharmaceutiques contenant :

(i) le RTH d'au moins une souche de type B 16B6 et le RTH d'au moins une souche de type M982 ( WO 93/6861 ) ; ou

(ii) la Tbp2 d'au moins une souche de type B 16B6 et la Tbp2 d'au moins une souche de type M982 (WO 93/7172).

Pour accéder à de grandes quantités de protéines en vue d'un développement à l'échelle industrielle, on a clone les fragments d'ADN codant i.a. pour diverses Tbp2s. Les séquences en acides aminés des sous-unités Tbp2 des souches M982 et B 16B6 ont été divulguées dans la demande de brevet EPA 586 266 (publiée le 9 Ivlars 1994) ainsi que les fragments d'ADN correspondants. Ces séquences sont reprises dans les SEQ ID NO 1 à 4 de la présente demande.

L'étude des sous-unités Tbp2 quelque soit la souche d'origine, a permis de mettre en évidence, trois domaines de structure principaux associés pour au moins l'un d'entre eux à des propriétés particulières. Par définition, les domaines de Tbp2 M982 et Tbp2 B16B6 ont été fixés comme le montre le tableau ci-après, en indiquant la position des acides aminés, bornes incluses des différents domaines, et par référence à la numérotation apparaissant dans les SEQ ID NO 1 et 3.

Cette définition s'applique de même à toutes les Tbp2s de type M982 ou B16B6, après alignement d'une séquence type M982 ou B16B6 sur la séquence de référence, au maximum d'homologie. Ainsi, à titre d'exemple et par référence à la Figure 1 , on indique la position des domaines de la sous-unité Tbp2 de la souche 8680 comme suit : premier domaine (1 - 334), deuxième domaine (335 - 530) et troisième domaine (531 - 677).

Il est maintenant connu que le domaine N-terminal ou premier domaine comporte dans son intégralité le site de liaison à la transferrine et se trouve donc très vraisemblablement exposé vers l'extérieur. En conséquence le seul domaine N-terminal constitue un élément de choix à des fins i ci. vaccinales.

D'autre part, l'étude comparative des séquences Tbp2s M982 et B16B6 alignées au maximum d'homologie, a mis en évidence quatre portions hypervariables localisées au sein de la région charnière (aussi appelée domaine charnière, comme cela apparaît dans le tableau ci-dessus) de Tbp2 M982 ; portions qui sont absentes dans la Tbp2 B16B6. Ces portions hypervariables se retrouvent chez toutes ies Tbp2s de type M982 (Figure 2). Les souches de type B16B6 en sont dépourvues. Par la suite, on entend par "région charnière de type M982" une région charnière qui possède ces quatre portions hypervariables.

L'étude des séquences a permis de faire évoluer les définitions des types M982 et B 16B6, originellement fournies dans WO 93/6861. On convient maintenant de définir les types de souches sur la base de la présence ou l'absence des régions hypervariables et par conséquent sur la taille du gène tbp2 : environ 2.1 kb pour tbp2 de type M982 et 1.8 kb pour tbp2 de type B 16B6.

Par comparaison des séquences de diverses Tbp2s de type M982. on sait aussi que la région charnière présente une variabilité supérieure à celle des deux autres domaines. Dans

la mesure où la région charnière ne semblait pas indispensable à la fonction de fixation de la transferrine humaine, on a postulé que le rôle de cette région est au moins en partie d'induire une variabilité-"écran" afin d'éviter la reconnaissance d'une souche par le système immunitaire d'un individu ayant connu ultérieurement une autre souche.

Dans cette hypothèse, la région charnière des souches de type M982 constitue un problème majeur dans la réalisation d'un vaccin. En effet si cette région est immunodominante, lors d'une immunisation, les anticorps induits seront dirigés majoritairement contre cette région et par conséquent la réponse immunitaire sera spécifique de la protéine Tbp2 de la souche homologue.

En tenant compte des observations et hypothèses évoquées ci-dessus, il déjà été proposé d'utiliser i.a. à des fins vaccinales, non plus des Tbp2s de type M982 entières, mais des Tbp2s au moins délétées de leurs quatre portions hyperλ'ariables ou de façon alternative, délétées des deuxième et troisième domaines.

Une région essentielle pour l'induction d'une immunité à large spectre étant vraisemblablement le premier domaine, une composition pharmaceutique de choix est apparue comme pouvant être par exemple, au moins composée :

(i) d'un polypeptide correspondant à une Tbp2 de type M982 délétée au moins partiellement du deuxième ou du troisième domaine e.g. d'un polypeptide correspondant au premier domaine d'une Tbp2 de type M982 ; et

(ii) d'une Tbp2 de type B16B6 ou d'un polypeptide correspondant à une Tbp2 de type B 16B6, délétée au moins partiellement du deuxième ou du troisième domaine e.g. d'un polypeptide correspondant au premier domaine d'une Tbp2 de type B 16B6 (demande PCT n° de dépôt PCT/FR95/000701 ; référence est faite aux définitions initiales des types de souches).

Par la suite, l'étude de l'immunodominance de la région charnière des Tbp2s de type M982 a été poursuivie et complétée en analysant vis-à-vis d'un grand nombre de souches de type M982. la réactivité croisée des sérums obtenus à l'encontre :

(i) de la protéine Tbp2 M982 entière (Tbp2 100%) ;

(ii) de la protéine Tbp2 M982 tronquée ne comportant que les 350 premiers acides aminés N-terminaux (Tbp2 50%) ; et

(iii) de la protéine Tbp2 M982 délétée des quatre portions hypervariables (Δ 362- 379 ; Δ 418-444 ; Δ 465-481 ; et Δ 500-520) de la région charnière (Tbp2

80%).

Pour ce faire, les protéines Tbp2s entières, tronquées et délétées ont été tout d'abord produites dans E. coli par voie recombinante. Pour ce qui concerne Tbp2 M982 entière, sa production est décrite dans EPA 586 266 (publiée le 9 mars 1994). Celles des deux autres Tbp2s M982 sont reportées dans les Exemples 4 et 6 de la présente demande.

La préparation des sérums hyperimmuns ainsi que l'analyse de ces sérums. préliminaire à l'étude d'immunodominance. fait l'objet de l'Exemple 8 de la présente demande. L'étude de la réactivité croisée fait l'objet de plus de détails dans l'Exemple 9.

Cinquante quatre souches classées dans le type M982 soit par analyse des protéines de membrane externe en électrophorese de SDS-Page suivie d'une immunorévélation. soit sur la base de la taille du gène tpb2 amplifié par PCR, ont été étudiées en dot blot (analyse sur geπnes entiers) pour leur réactivité croisée (voir l'Exemple 9). Ces souches ont été obtenues à titre gracieux auprès du Dr D.A. Caugant. Elles ont été isolées dans des régions du monde très diverses et à différentes périodes. Par conséquent, cette collection devrait être représentative. 14 souches ne sont pas reconnues par le sérum anti-Tbp2 M982 100%, tandis que seulement 4 échappent à la reconnaissance par le sérum anti-Tbp2 M982 80% et 1 par le sérum anti-Tbp2 M982 50%.

Ces résultats confirment l'hypothèse initiale selon laquelle une protéine Tbp2 délétée des portions hypervariables induit une réactivité croisée plus importante que celle observée avec une protéine entière. La réactivité croisée est encore améliorée dans le cas d'une protéine Tbp2 n'ayant conservé que le domaine de liaison à la transferrine, puisque seulement une souche parmi 54. n'est pas reconnue. L'immunogénicité d'une Tbp2 est influencée par la présence de la région charnière qui induit des anticorps spécifiques de la souche homologue. En supprimant au moins les quatre portions hypervariables, la réponse immune contre des épitopes situés en dehors de la région charnière, semble favorisée.

Seulement 4 souches parmi les 54 souches de type M982 n'ont pas réagi avec le sérum anti-Tbp2 80%. Ce résultat peut s'expliquer notamment par le fait qu'au moins une de ces souches diffère très largement de la souche de référence M982. Par conséquent il apparaît nécessaire d'ajouter aux compositions pharmaceutiques déjà connues, au moins une troisième valence.

C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de N. meningitidis ; la souche étant caractérisée en ce qu'elle n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des portions hypervariables de sa région charnière (Tbp2 M982 Δ 362 - 379 ; Δ 418 - 444 ; Δ 465 - 481 ; Δ 500 - 520) ; et la sous-unité Tbp2 étant caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb.

En d'autres termes, puisque la sous-unité Tbp2 selon l'invention est caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb, la souche de N. meningitidis dont elle dérive, est elle-même caractérisée en ce que son génome comprend un cadre de lecture ouvert (ORF) codant pour ladite sous-unité Tbp2 d'environ 2,1 kb.

Puisque la protéine selon l'invention est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb. il est bien évident, compte tenu de ce qui a été dit précédemment, que cette protéine possède une région charnière de type M982.

La réactivité entre un sérum anti-Tbp2 80% et un sérum anti-Tbp2 50% peut aussi s'expliquer par le fait que dans la construction qui a servi à la production du sérum anti- Tbp2 80% certaines séquences variables demeurent alors que dans les protéines 50%, toutes ces séquences sont supprimées. En effet, seule une souche parmi les 54 souches de type M982 n'a pas réagi avec le sérum anti-Tbp2 50%. Il s'agit de la souche 8680 B: 15:P1.3, isolée au Chili lors de l'épidémie de 1987, et appartenant au groupe électrophorétique ET-5. Cette souche provient de la collection du Dr D.A. Caugant, WHO Collaborating Centre for Référence and Research on Meningococci, National Institute of Public Health, Oslo, Norway. La protéine Tbp2 issue de cette souche constitue donc tout particulièrement un candidat vaccinal de choix.

C'est pourquoi une sous-unité Tbp2 selon l'invention dérive de manière avantageuse d'une souche de N. meningitidis qui n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un fragment de Tbp2 M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en positon 350 c'est-à-dire à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 substantiellement délétée des deuxième et troisième domaines.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention dérive notamment d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche M982 (antisérum anti-RTH M982) et par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche B 1616 (antisérum anti-RTH B16B6). De tels antisérums ont été décrits dans la demande de brevet WO 93/6861.

Par "sous-unité Tbp2 qui dérive d'une souche de Λ ^' . meningitidis" on entend bien évidemment une dérive prise dans son sens le plus général ; c'est-à-dire non limitée à un procédé physique, mais le fruit d'un processus intellectuel. Ainsi cette expression recouvre i.a. une Tbp2 produite par voie recombinante e.g. dans E. coli.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie (d'identité) avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 60 à 70%, avantageusement d'environ 65%. Sous un autre aspect, une sous-unité Tbp2 selon l'invention comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 8680, telle que montrée dans l'ID SEQ No. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 677. est de 80 à 100%, avantageusement de 90 à 100%. de manière préférée de 95 à 100%. Selon un mode particulier, elle comprend une séquence d'acides aminés substantiellement telle que montrée dans l'ID SEQ No. 5 commençant avec le résidu acide aminé en position 1 et finissant avec le résidu acide aminé en position 677.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention peut être sous forme dissociée de la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl) de la souche de N. meningitidis dont est issue la Tbp2 ou bien en association avec cette Tbpl, formant ainsi un complexe Tbpl-Tbp2 considéré comme le récepteur de la transferrine humaine. Qu'elle soit sous forme dissociée ou sous forme de complexe Tbpl-Tbp2, la sous-unité Tbp2 selon l'invention doit être substantiellement purifiée ; c'est-à-dire séparée de l'environnement dans lequel elle existe

de manière naturelle. Entre autres, il peut s'agir d'une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et périplasmiques à'H.pylori.

L'invention concerne également un fragment d'ADN isolé codant pour une protéine selon l'invention ainsi que pour un précurseur de cette protéine ; ce dernier comprenant un peptide signal homoloque ou hétérologue à la protéine selon l'invention. Un fragment d'ADN codant pour une protéine selon l'invention est décrit dans le ID SEQ NO 5 de l'acide nucléique en position 30 à l'acide nucléique en position 2061. Un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une protéine selon l'invention est décrit dans le ID SEQ NO 5 de l'acide nucléique en position 1 à l'acide nucléique en position 2061.

Un fragment d'ADN selon l'invention peut aussi comprendre une séquence d'acides nucléiques autre que celle montrée dans l'ID SEQ NO 5 à condition qu'il puisse s'hybrider au fragment d'ADN montré dans l'ID SEQ NO 5, dans des conditions de forte stringence.

Des méthodes d'hybridation ainsi que la mise en oeuvre de conditions de forte stringence sont à la portée de l'homme de l'art. Par exemple, des procédures d'hybridation sont décrites dans Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.. 1994 ; Silhavy et al. Experiments with Gène Fusions. Cold Spring Harbor Lab.. 1984 : Davis et al, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics, CSH Lab.. 1980. Pour ligne de conduite générale, on indique des paramètres importants dont on doit tenir compte afin d'optimiser les conditions d'hybridation, se retrouvent dans la formule qui permet de calculer une valeur critique, la température de fusion (Tm), au dessus de laquelle deux brins complémentaires se séparent (Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. ( 1977) 4 : 1539). Cette formule est comme suit : Tm = 81.5 + 0.5 X (% G+C) + 1.6 log (positive ion concentration) - 0.6 X (% formamide). Dans des conditions de forte stringence. la température d'hybridation est environ 20-25°C en dessous de la température de fusion telle que calculée. Par exemple, des conditions de forte stringence sont obtenus en réalisant des incubations de pré-hybridation et d'hybridation pendant 4 - 16 hrs, à environ 55 - 60°C, en solution 6 x SSC (NaCl 1 M, sodium citrate 0.1 M. pH 7.0).

L'invention concerne également (i) un polypeptide dérivé notamment par délétion d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention ; et (ii) un fragment d'ADN isolé codant pour un tel polypeptide.

II s'agit plus particulièrement d'un polypeptide ayant une séquence en acides aminés qui dérive de celle d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention dont le premier, deuxième et troisième domaines sont définis par alignement au maximum d'homologie, sur la séquence de la sous-unité Tbp2 de la souche de référence M982 ; notamment par délétion totale ou partielle d'au moins un domaine de ladite sous-unité Tbp2 selon l'invention, à condition que le premier et deuxième domaines ne soient pas simultanément et totalement délétés.

Par "séquence qui dérive d'une autre séquence" on entend bien évidemment une séquence issue par processus intellectuel de cette autre séquence.

Sous un autre aspect, il s'agit d'un polypeptide capable de se lier à la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale ou dans la région des quarante premiers acides aminés de la sous-unité Tbp2. L'extrémité C-terminale est définie comme étant la partie de Tbp2 correspondant aux deuxième et troisième domaines.

De manière plus particulière, un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acides aminés qui dérive d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention :

(i) notamment par délétion totale ou partielle d'au moins un domaine de ladite sous-unité Tbp2. sélectionné parmi les deuxième et troisième domaines ; de préférence par délétion totale ou partielle du troisième domaine ou des deuxième et troisième domaines ;

(ii) notamment par délétion totale des premier et troisième domaines, ou

(iii) notamment par délétion intégrale du troisième domaine et par délétion partielle du premier domaine, optionellement par délétion partielle du deuxième domaine.

D'une manière avantageuse, un polypeptide selon l'invention présente une délétion partielle, quasi totale ou totale du troisième domaine, de préférence totale. Dans ce cas là, le premier ainsi que le deuxième domaine peuvent être maintenus dans leur intégralité, partiellement ou totalement délétés; ceci indépendamment l'un de l'autre.

Sont possibles les combinaisons suivantes (sachant que les premier, deuxième et troisième domaines dans leur intégralité sont respectivement représentés par 1, 2 et 3, et que O et Δ signifient de manière respective, partiellement et totalement délété) :

1,2,Δ3; l,θ2,Δ3; 1,Δ2,Δ3;

01,2,Δ3;01,02,Δ3;01,Δ2,Δ3; Δl,2,Δ3;Δl,θ2,Δ3 ;

1,2,03;1,02, 03;1,Δ2,03; 01,2, 03; 01,02,03 ;01,Δ2, 03;

Δl,2, 03 ;Δ1,02, 03 ;

Est aussi d'intérêt tout particulier, un polypeptide dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention par délétion partielle du deuxième domaine, qui comporte dans leur intégralité ou quasi intégralité le premier et troisième domaines ; soit la combinaison 1, O 2.3. (Par "domaine maintenu dans sa quasi-intégralité" on entend ici et dans la suite du texte, un domaine modifié en un très faible nombre de positions, environ 5 maximum.) Un polypeptide selon l'invention peut aussi répondre à la combinaison Ol.02, 3, la délétion partielle du premier domaine portant avantageusement sur tout ou partie de la région homologue de celle de Tbp2 M982, allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé approximativement en position 40.

De manière avantageuse, lorsqu'un polypeptide dérive notamment par délétion partielle du deuxième domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, cette délétion partielle porte substantiellement sur une ou des régions du deuxième domaine qui sont les homologues des régions de la séquence M982 allant :

(i) de l'acide aminé en position 388 à l'acide aminé en position 396 ;

(ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 476 ; ef

(iii) de l'acide aminé en position 499 à l'acide aminé en position 521.

De manière alternative, une délétion partielle du deuxième domaine porte substantiellement sur une ou des portions hypervariables. Ces portions sont, après

alignement au maximum d'homologie, les homologues des portions de la séquence M982 allant :

(i) de l'acide aminé en position 362 à l'acide aminé en position 379 ;

(ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 444 ;

(iii) de l'acide aminé en position 465 à l'acide aminé en position 481 ; et

(iv) de l'acide aminé en position 500 à l'acide aminé en position 520.

De préférence, la délétion partielle porte simultanément sur les quatre portions (i) à (iv) sus-décrites.

Lorsqu'un polypeptide selon l'invention dérive notamment par délétion intégrale du troisième domaine et délétion quasi intégrale du deuxième domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention et comporte l'intégralité du premier domaine ou dérive en outre par délétion de la partie N-terminale du premier domaine, la délétion quasi intégrale du deuxième domaine s'étend sur ia région qui est l'homologue de la région du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 M982 allant de l'acide aminé dans l'une des positions 346 à 361 à l'acide aminé en position 543.

Lorsqu'un polypeptide dérive notamment par délétion partielle du premier domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, cette délétion partielle porte avantageusement sur tout ou partie de la région qui est l'homologue de la région du premier domaine de la sous- unité Tbp2 de type M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 281.

A titre d'exemple de ce qui précède, on cite une délétion d'intérêt portant sur tout ou partie de la région qui est l'homologue de la région du premier domaine de ladite sous-unité Tbp2 de type M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé approximativement en position 40.

Le degré d'homologie peut être aisément calculé en alignant les séquences de manière à obtenir le degré maximal d'homologie ; pour ce faire, il peut être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants, comme cela est illustré dans la

Figure 1. Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rapport au nombre total de positions.

II serait fastidieux de décrire des séquences homologues autrement que de manière générique, en raison du trop grand nombre de combinaisons. L'homme du métier connaît toutefois les règles générales qui permettent de remplacer un acide aminé par un autre sans abolir la fonction biologique ou immunologique d'une protéine.

A titre d'exemple préféré, on cite un polypeptide selon l'invention dont la séquence possède au moins 70-75%, de manière avantageuse au moins 80%. de préférence au moins 90%. de manière tout à fait préférée 100% d'homologie avec :

(i) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351, avantageusement en position en position 334 ;

(ii) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5, de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 677. délétée des régions 377-385, 407- 465 et 488-508 ;

(iii) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 677, délétée des portions 351-368. 407-433, 454-470 et 489-508; ou avec

(iv) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5. de l'acide aminé en position 335 à l'acide aminé en position 530.

Un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acide aminés qui comprend au moins 10, avantageusement au moins 20. de préférence au moins 50, de manière tout à fait préférée au moins 100 acides aminés.

Bien évidemment, un polypeptide selon l'invention peut aussi comprendre de manière additionnelle, une séquence d'acides aminés qui ne présente pas d'homologie avec les séquences des sous-unités Tbp2 selon l'invention.

D'une manière générale, une séquence additionnelle peut être celle de tout autre polypeptide à l'exclusion de Tbp2.

Par exemple, une séquence additionnelle peut être celle d'un peptide signal localisé en position N-terminale d'un polypeptide selon l'invention. Des exemples de séquence signal sont montrés dans les ID SEQ NO 1 à 4. D'autre part, on indique qu'une séquence signal hétérologue appropriée peut être une séquence signal retrouvée chez le précurseur d'une lipoprotéine.

Une sous-unité Tbp2 selon l'invention peut être directement purifiée à partir de la souche native ou bien de manière avantageuse, obtenue par voie recombinante dans un système d'expression hétérologue ou homologue. Les polypeptides selon l'invention sont de préférence des produits recombinants. Afin de mettre en oeuvre une expression par voie recombinante, le fragment d'ADN codant pour la Tbp2 de la souche 8680 a été clone et séquence.

L'invention a donc aussi pour objet :

(i) un fragment d'ADN isolé codant pour une sous-unité Tbp2 ou un polypeptide selon l'invention ;

(ii) une cassette d'expression qui comprend au moins un fragment d'ADN selon l'invention, placé sous le contrôle d'éléments capables d'assurer son expression dans une cellule-hôte appropriée : et

(iii) un procédé de production d'un polypeptide selon l'invention, selon lequel on cultive une cellule-hôte comportant une cassette d'expression selon l'invention.

Dans la cassette d'expression, le fragment d'ADN selon l'invention peut être ou non associé à un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue ou non. au polypeptide codé par ledit fragment d'ADN, selon que l'on recherche ou non la sécrétion du polypeptide. De préférence, cette sécrétion sera recherchée.

Des éléments tels qu'un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue

(région signal) ou un promoteur existent déjà en assez grand nombre et sont connus de

l'homme du métier. Ses compétences générales lui permettront de choisir une région signal ou un promoteur particulier qui seront adaptés à la cellule-hôte dans laquelle il envisage l'expression.

Aux fins du procédé selon l'invention, la cellule-hôte peut être une cellule de mammifère, une bactérie ou une levure ; ces deux dernières étant préférées. Là aussi, le choix d'une lignée particulière est à la portée de l'homme du métier.

Enfin, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif, une sous-unité Tbp2 ou un polypeptide selon l'invention.

Une composition pharmaceutique selon l'invention est notamment utile pour induire une réponse immunitaire chez les humains à l'encontre de N meningitidis, entre autre un effet vaccinal de manière à protéger les humains contre des infections à N meningitidis, en prévention ou en thérapie.

Une composition selon l'invention peut comprendre en outre :

(i) une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6 ; ou

(ii) un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. mentngiiidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2 ; ou

(iii) une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6 ; ou

(ι\ ) un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un

antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.

Une composition selon l'invention comprend avantageusement au moins un, de préférence deux éléments additionnels choisis parmi les quatre énoncées ci-avant.

La sous-unité Tbp2 additionnelle de type M982 comprend avantageusement une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 90 à 100 %. Il s'agit de préférence de la sous-unité Tbp2 M982.

La sous-unité Tbp2 additionnelle de type B 16B6 comprend avantageusement une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 B16B6, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 3, est de 90 à 100 %. Il s'agit de préférence de la sous-unité Tbp2 B 16B6.

De préférence, le polypeptide additionnel (ii) dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6. notamment par délétion partielle du deuxième domaine, entre autre par délétion substantielle des régions hypervariables du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 ou par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2.

Avantageusement, ce polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1. est de 90 à 100 %. De manière préférée, il s'agit d'un polypeptide qui dérive de la Tbp2 M982.

De préférence. le polypeptide additionnel (iv) dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B 16B6. notamment par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2, de préférence des deuxième et troisième domaines.

Avantageusement, ce polypeptide denve d'une sous-unite Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982. telle que montrée dans l'ID SEQ No 3, est de 95 a 100 % De manière préférée, il s'agit d'un polypeptide qui denve de la Tbp2 B16B6

Selon un mode préféré, une composition selon l'invention comprend

(i) un polypeptide qui dérive d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, notamment par délétion partielle du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2, entre autre par délétion substantielle des portions hypervanables du deuxième domaine de la sous- unite Tbp2 ,

(u) un polypeptide qui denve d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B 16B6, notamment par délétion partielle du deuxième domaine, entre autre par délétion substantielle des portions hypervanables du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 . et

( m) une sous-unité Tbp2 qui dérive d'une souche de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B I 6B6

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle En particulier on associe le ou les polypeptιde(s) selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue phaπnaceutique Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conv entionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanee, par voie intra-musculaire ou par voie intra- veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle Le dosage approprie varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration

Afin de déterminer l'objet de la présente invention, on précise que les souches de N meningitidn IM2394 (M982) et IM2169 (B 16B6) sont publiquement disponibles auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur. 25 rue

du Dr Roux 75015 Paris sous les numéros d'enregistrement respectifs LNP N 1511 et LNP N 1520.

L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après et par référence aux Figures 1 à 5.

La Figure 1 présentent respectivement les alignements des séquences Tbp2 M982 et 8680. au maximum d'homologie selon le programme Kanehisa (Bisance CITI-2). Le degré d'homologie est de 65%.

La Figure 2 présente les alignements au maximum d'homologie des séquences des domaines charnières (deuxième domaine) de Tbp2 M982 ( 1 ). 6940 (2), 2223 (3), C708 (4), M978 (5), 1610 (6), 867 (7), S3032 (8) et 981 (9). En italiques est donnée la numérotation de la séquence de Tbp2 M982, telle qu'elle apparaît dans ID SEQ NO 1. En gras apparaissent les séquences des portions hypervariables que l'on peut déléter selon un mode préféré. (C) indique la séquence consensus.

Les Figures 3 à 5 illustrent respectivement la construction des plasmides pTG5782. pTG5755 et pTG5783.

EXEMPLE 1 : Purification du RTH de la souche de N. meningitidis 8680

IA - Culture

Un congelât de la souche N. meningitidis 8680 est repris dans environ 1 ml de bouillon Muller Hinton (BMH, Difco). La suspension bactérienne est ensuite étalée sur le milieu solide Muller Hinton contenant du sang cuit (5 %).

Après 24 h d'incubation à 37°C dans une atmosphère contenant 10 % de CO2, la nappe bactérienne est recueillie pour ensemencer 150 ml de BMH pH 7.2, répartis en 3 erlens de 250 ml. L'incubation est poursuivie pendant 3 h à 37°C sous agitation. Chacune des 3 cultures ainsi réalisées permet d'ensemencer 400 ml de BMH pH 7,2 supplémenté avec 30 μm de Ethylènediamine - Di (O-Hydroxyphenyl - acetic acid (EDDA, Sigma), qui est un agent chélatant du fer sous forme libre.

Après 16 h de culture à 37°C sous agitation, les cultures sont contrôlées pour leur pureté par observation au microscope après une coloration de Gram. La suspension est centrifugée, le culot contenant les germes est pesé et conservé à - 20°C.

IB - Purification

La méthode de purification est essentiellement telle que décrite par Schryvers et al (supra).

Le culot bactérien obtenu en IA est décongelé, puis remis en suspension dans 200 ml de tampon Tris HCl 50 mM, pH 8.0 (tampon A). La suspension est centrifugée pendant 20 min à 15 000 xg à 4°C. Le culot est récupéré, puis remis en suspension dans du tampon A à la concentration finale de 150 g/1. Des fractions de 150 ml sont traitées pendant 8 min à 800 bars dans un lyseur de cellules travaillant sous haute pression (Rannie, modèle 8.30H). Le lysat cellulaire ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 min à 4°C à 15 000 x g. Le surnageant est récupéré, puis centrifugé pendant 75 min à 4°C à 200 000 x g. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans du tampon A et après dosage de protéines selon Lowry, la concentration de la suspension est ajustée à 5 mg/ml.

A 1,4 ml de la suspension de membrane on ajoute 1,75 mg de transferrine humaine biotynylée selon le procédé décrit par Schryvers. La concentration finale de la fraction membranaire est de 4 mg/ml. Le mélange est incubé 1 heure à 37°C puis centrifugé à 100 000 xg pendant 75 min. à 4°C. Le culot de membranes est repris par le tampon A contenant du NaCl 0,1 M et incubé pendant 60 min. à température ambiante.

Après solubilisation, on ajoute à cette suspension un certain volume de N Lauroyl Sarkosine à 30% (p/v) et d'EDTA 500 mM de façon que les concentrations finales en Sarkosyl et EDTA soient de 0,5% et 5 mM respectivement. Après une incubation de 15 min. à 37°C sous agitation, on ajoute 1 ml de résine streptavidine- agarose (Pierce) préalablement lavée en tampon A. La suspension est incubée à 15 min. à température ambiante puis centrifugée à 1 000 x g pendant 10 min. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne et l'éluat est éliminé.

La résine est lavée par 3 volumes de colonnes de tampon Tris-HCI 50 mM pH 8.0 contenant NaCl IM, EDTA 10 mM Sarkosyl 0.5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HCl 750 mM. Le récepteur de la transferrine est ensuite élue par le tampon B contenant de la guanidine HCl 2M. L'éluat est collecté en fraction dont le volume correspond à IV. dans des tubes contenant IV de Tris HCl 50 mM pH 8.0. NaCl IM. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV.

Les fractions correspondant au pic d'elution sont recueillies, dialysées contre du tampon phosphate 10 mM. pH 8.0 contenant du Sarkosyl 0.05 % et lyophilisées Le lyophilisât est repris dans de l'eau à une concentration 10 fois supérieure. La solution est dialysée une seconde fois contre du tampon phosphate 50 mM pH 8.0 contenant du Sarkosyl 0.05 % (tampon C) puis la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0.22 μm.

Le contenu en protéines est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à -70°C.

EXEMPLE 2 : Purification de la sous-unité Tbp2 de la souche de N. meningitidis 8680 par chromatographie hydrophobe

La culture de la souche N. meningitidis 8640, ainsi que les étapes de purification allant jusqu'à la préparation de la suspension membranaire sont effectuées dans des conditions identiques à celles décrites dans l'Exemple 1.

A un volume de la suspension de membranes, on ajoute un volume identique de Tris- HCI 50mM pH 8,0 contenant NaCl 2M, EDTA 20 mM, Sarkosyl 1 % (p/v). Le mélange est incubé 15 min à 37°C sous agitation douce. Puis un volume de cette suspension est mis en contact avec un volume identique de résine Sepharose 4B couplée à la transferrine humaine. Cette résine d'affinité a été couplée en greffant de la transferrine humaine (Sigma, St Louis USA) à du Sepharose 4B-CNBr (Pharmacia) selon les recommandations du fabricant. La densité du ligand et de 5 mg transferrine/ml de résine. Le contact se fait en bain pendant 1 h à température ambiante sous agitation rotative douce. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne, l'éluat direct est éliminé.

La résine est lavée par 3 volumes de colonnes de tampon Tris-HCI 50 mM pH 8.0 contenant NaCl I M, EDTA lO mM Sarkosyl 0.5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HCl 750 mM. Le récepteur de la transfeσine est ensuite élue par le tampon Tris-HCI 50 mM pH 8.0 NaCl 1 M EDTA lOmM Sarkosyl 0.05 % et guanidine HCl 2M. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV. Les fractions correspondant au pic d'elution sont réunies et la protéine est précipitée par addition de trois volumes d'éthanol refroidi.

Après une nuit d'incubation à + 4°C, la protéine est recueillie par centrifugation pendant une heure à 10.000 x g. Le précipité est repris par un certain volume de tampon phosphate 10 mM pH 7,0 contenant NaCl 0,5 M, guanidine-HCl 5 M (tampon D) de façon à ce que la concentration finale en protéine soit d'environ 1 mg/ml. La solution est mise en contact avec la résine de phényl-Sépharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le même tampon. L'incubation se fait en bain sous agitation rotative pendant 2 heures à température ambiante. Le gel est ensuite conditionné dans une colonne.

Dans ces conditions, la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl ) est recueillie dans l'éluat direct, tandis que la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) est fixée sur la résine. La colonne est rincée par trois volumes de tampon D puis par 5 volumes de

tampon phosphate 10 mM pH 7,0. Tbp2 est éluée par le tampon phosphate 1 OmM pH 7,0 contenant 0,5 % de Sarkosyl. L'excès de Sarkosyl contenu dans le tampon d'elution de Tbp2 est éliminé par précipitation à l'éthanol, la protéine est ensuite reprise dans le tampon phosphate 50 mM pH 8,0 contenant du Sarkosyl 0,05 % (tampon C).

La solution est ensuite filtrée sur une membrane de porosité 0,22 μm. Le contenu en protéine est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à -70°C.

EXEMPLE 3 : Clonage du fragment d'ADN codant pour Tbp2 8680

L'ADN est extrait par une méthode classique au phénol chloroforme. Pour une quantité de germes correspondant à 1 à 2 g de poids humide, le culot est repris par 25 ml de solution de lyse (glucose 50 mM, EDTA, 10 mM, Tris, 25 mM pH 8.0) supplémentée par 1 ml de protéinase K (Sigma) à 10 mg/ml. Le mélange est incubé 10 min à température ambiante, puis 0,5 ml de sarkosyl à 20% sont ajoutés. Ceci est suivi par une incubation de 10 min à 4°C. Après passage de la suspension à travers une aiguille de 18G, 1 ml de RNAse A (Sigma) à 2 mg/ml est ajouté puis la suspension est incubée à 37°C pendant 90 min. A l'issue de cette étape, l'ADN est extrait par addition de 0.5 volume de phénol . L'extraction se fait par agitation pendant 10 min. puis 0.5 volume de chloroforme-alcool isoamylique (24: 1 ) sont ajoutés. Après centrifugation du mélange à 5000 tours/min, pendant 15 min le surnageant est prélevé et est de nouveau traité au phénol/chloroforme. L'étape d'extraction au phénol/chloroforme est répétée jusqu'à éclaircissement de la phase aqueuse.

A l'issue de l'extraction, l'ADN est précipité par 2 volumes d'éthanol absolu en présence d'acétate de sodium 0,3 M pH 7. puis rincé en éthanol à 70 %. L'ADN est repris dans 1 ml d'eau distillée, puis dosé au spectrophotomètre à 260 nm et à 280 nm. Une unité de DO 260 nm correspond à 50 ng d'ADN/μl. Les préparations d'ADN sont considérées comme satisfaisantes et utilisables si le rapport DO 260/DO 280 est compris entre 1.8 et 2.

A partir de 10 ng d'ADN génomique le gène tbp2 est amplifié Par PCR à l'aide des amorces suivantes :

Interl Bam : 5 ' - CCACGGATCCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC- 3

- 3 ' Met 2 Eco : 5 ^• -CGCGGATCCTGCTATGGTG- 3 '

Le milieu réactionnel est comme suit : 10 ng d'ADN génomique ; 0,5 μM d'amorces 5' et 3' ; 200 μM de dNTPs (Boehringer) ; 10 μl de tampon PCR l Ox (Biotaq) et 2,5 U de Taq polymérase (Biotaq). Le volume réactionnel est ajusté à 100 μl avec de l'eau distillée. Les conditions d'amplification dans un appareil Trioblock (Biolabs) sont les suivantes : dénaturation : 94°C, 1 min ; hybridation : 58°C, 2 min ; elongation : 72°C, 3 min ; nombre de cycles : 25.

Le fragment d'ADN amplifié par PCR est soumis à une électrophorese sur gel d'agarose préparatif 1% ("Electrophoresis grade". BRL) est préparé en tampon TAE (Tris acétate 0.04M, EDTA 0,002M pH 8,0). La bande amplifiée correspondant au gène tbpl est découpée. L'ADN contenu dans l'agarose est purifié à l'aide d'un kit Geneclean (Bio 101). L'ADN est ensuite digéré par EcoRI et BamHI pendant 2h à 37°C. L'ADN digéré est ensuite repurifié par extraction au phénol/chloroforme, précipité par 2 volumes d' éthanol, puis repris par 20 μl de tampon Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCI. 1 mM EDTA pH 8,0).

Le vecteur pBSK (-) (Stratagène) est digéré par £coRI et BamH] puis purifié comme décrit ci-avant pour l'insert EcoRllBamHl.

L'insert EcoRl/BamUl et pBSK sont ligués en présence de ligase T4 (Boehringer) à 16°C pendant la nuit dans les conditions suivantes : vecteur 100 ng; insert 200-300 ng; tampon T4 ligase 10X (Boehringer) 1 μl; ligase 5U; eau qsp 10 μl.

E. coli XLl-Blue (recAl. endA\ , gyr A96, thi- \ . /,.«/R17. supE44. relAl . lac. (F proAB, lacQZδMlS, TnlO (tet ^1" )) est précultivées dans 10 ml de milieu SB (Difco) en présence de tétracycline à 10 μg/ml pendant une nuit à 37°C. 500 μl de préculture sont utilisés pour ensemencer 11 de milieu SB. Lorsque la culture atteint la phase exponentielle (DO 600 nm = 0,8), les germes sont lavés trois fois en glycerol 10% en eau en diminuant les volumes de lavage de 500 ml à 120 ml. Le surnageant est éliminé après centrifugation à 2500 x g pendant 15 min à 4°C. Après le dernier lavage, les bactéries sont reprises dans 3 ml de glycerol 10%. 1 mM Hepes pH 7,5. Les germes sont aliquotés sous 100 μl dans des tubes placés dans de l'azote liquide. Les bactéries electrocompétentes sont conservées pendant un mois à -70°C.

Cinq μl de la réaction de ligation sont utilisés pour transformer 100 μl de bactéries E.coli XL-1 par électroporation dans des cuves de 2 mm d'épaisseur (Eurogentec) sous un voltage de 2500 volts. Après électroporation, les germes sont incubés 1 heure à 37°C puis 1/10 et 9/10 du volume de la préparation sont étalés sur des boites de milieu LB (Difco) plus ampicilline (100 μg/ml) supplémenté avec du X-gal (25 μg/ml) et de l'IPTG (25 μg/ml) permettant une sélection blanc/bleu des clones recombinants.

Les clones recombinants (blancs) sont analysés après mini-préparation de plasmide selon une méthode classique (Maniatis et al., 1989) par double digestion EcoRI, BamHI. Les clones retenus sont ceux qui ont intégrés un fragment de 2,1 kb. Le sens d'intégration de l'insert est déterminé après digestion par Hincll. L'ADN plasmidique des clones d'intérêt est préparé en quantité importante par une maxi-préparation en utilisant une méthode de purification sur colonne tip-250 ( Kit Quiagen) .

L'ADN plasmidique purifié sur colonne (Quiagen) est séquence en utilisant le kit

Sequenase (USB, version 2.0). Cette technique dérive de la méthode de séquençage décrite par Sanger (Sanger et al., 1977). Trois à cinq μg d'ADN sont utilisés par réaction de séquence. Les réactions de séquences sont chargées sur un gel d'acrylamide 6% en présence d'urée 8M. La séquence nucléotidique révélée et la séquence d'acides aminés déduite sont telles que montrées dans l'ID SΕQ N° 5.

EXEMPLE 4 : Polypeptide T/2169 (1 , 02, Δ3 ; 1 -350) dont la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1 (IM2169). de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 350.

4A - Préparation du fragment d'ADN codant pour T/2169 (1-350) : Construction du vecteur pTG 5782.

A partir du plasmide pTG3721 décrit dans la demande EPA 586 266, on introduit, par mutagenèse dirigée, un site de restriction Hindlll en aval de la séquence codant pour Tbp2. pour générer le plasmide pTG4704.

A partir du plasmide pTG3721. on amplifie par PCR. à l'aide des amorces OTG4915 et OTG4651 , un fragment comportant la séquence codant pour le signal de

sécrétion de RlpB et du début de la séquence codant pour Tbp2 mature jusqu'au site Haell interne.

OTG4915 : AAACCCGGATCCGTTGCCAGCGCTGCCGT Hael l

OTG4651 :

BspHI TTTTTTCATG AGA TAT CTG GCA ACA TTG TTG TTA TCT CTG Met Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Leu Leu Ser Leu

GCG GTG TTA ATC ACC GCC GGG TGC CTG GGT GGC Ala Val Leu Ile Thr Ala Gly Cys Leu Gly ...

_clivage du peptide signal

GGC GGC AGT TTC

Le fragment PCR est ensuite digéré par BspHI et Hc/ell et inséré simultanément avec le fragment Hαell-Hindlll de pTG4704 qui comporte la partie 3' de la région codant pour Tbp2. dans le plasmide pTG3704 décrit dans la demande EPA 586 266, digéré par Ncol et HinόUï, pour générer le plasmide pTG5768.

A partir de plasmide pTG3721, on amplifie par PCR. à l'aide des amorces OTG4928 et OTG501 1, un fragment comportant la séquence codant pour la partie N- terminale de Tbp2.

S phi OTG4928 : GTG TTT TTG TTG AGT GCA TGC CTG GGT GGC Val Phe Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly _Clivage du peptide signal

OTG5011 : TGCGCAAGCTTACAGTTTGTCTTTGGTTTTCGCGCTGCCG HindiII

Ce fragment PCR est digéré par Sphl et HmdlII, puis clone dans le plasmide pTG4710 décrit dans la demande EPA 586 266 ; on génère ainsi le plasmide pTG5740.

Le fragment Haell-Hindlll de pTG5740 comportant la partie 3' de la séquence codant pour le domaine de liaison à la transferrine humaine (hTf) ( 3' de la région codant pour le premier domaine) est inséré dans le plasmide pTG3704 digéré par BamHI et H/πdlII, simultanément avec le fragment BamHl-Haell de pTG5768 comportant le promoteur araE, la séquence signal rlpB et le début de la séquence codante de Tbp2 ; on génère ainsi le plasmide pTG5782. Ce vecteur comporte le promoteur araB. la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2 ( 1 - 350).

4B - Production et purification de T/2169 (1-350)

Une souche d'E. coli est transformée par pTG5782. Les transformants sont mis en culture à 37°C en milieu M9 + succinate 0.5% + arginine 50μg/ml + ampicilline 100 μg/ml. En phase exponentielle, on ajoute 0.2% d'arabinose (inducteur). Après une heure d'induction, on prélève des cellules et des extraits sont préparés. Une analyse en Western Blot suivie d'une révélation par la hTF-peroxidase permet de détecter une bande majoritaire dont le P. M. correspond à celui attendu pour cette forme tronquée de Tbp2.

Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de W093/6861 (publié : 15. 04. 93) T/2169 purifié se révèle capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.

EXEMPLE 5 : Polypeptide T/2394 (1, 02, Δ3 ; 1-340) dont la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 2 (IM2394), de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 340.

5A - Préparation du fragment d'ADN codant pour T/2394 (1-340) :

Construction du vecteur pTG 5755

A partir du plasmide pTG4710 décrit dans la demande EPA 586 266, on amplifie par PCR, à l'aide des amorces OTG4873 et OTG4877, un fragment comportant la région codant pour la partie C-terminale du domaine de liaison à la hTf. Ce fragment est ensuite digéré par Mlul et Hindlll.

OTG4873 : AAAAAGCATGCATAAAAACTACGCGTTACACCATTCAAGC

Ml uJ

OTG4877 :TATATAAGCTTACGTTGCAGGCCCTGCCGCGTTTTCCCC HindiII

Le plasmide pTG4710 est digéré par Mlul et Hindlll. Le fragment Mlul- HmdlII comportant la partie 3' de la séquence codant pour Tbp2 est remplacé par le fragment PCR codant pour la partie C-terminale du domaine de liaison à la hTf. On génère ainsi le plasmide pTG5707. On remplace ensuite dans le plasmide pTG5707. un fragment BamHl-Mlul comportant le promoteur araB et le début de la séquence codant pour Tbp2, par un fragment BamHl-Mlul de pTG4764 décrit dans la demande EPA 586 266 qui comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2.

On génère ainsi le plasmide pTG5755. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2 (1 - 340).

5B - Production et purification de T/2394 (1-340)

T/2394 (1 -340) est produit et purifié tel que décrit dans l'Exemple 4B.

- j l -

Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié : 15. 04. 93) T/2394 purifié se révèle capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.

EXEMPLE 6 : Polypeptide D4/2169 (1, 02, 3) dont la séquence est identique à celle telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1 , de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 691, délétée des régions 362-379, 418-444, 465- 481 et 500-520.

Polypeptide D4/2169 (1 , 02, 3) dont la séquence est identique à celle telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1, de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 691. délétée des régions 362-379, 418-444, 465-481 et 500-520.

6A - Préparation du fragment d'ADN codant pour D4/2169

1.1. Clonage du fragment d'ADN

Le fragment d'ADN codant pour la sous-unité Tbp2 de la souche de N. meningitidis IM2169 est amplifié par PCR (Polymérase chain reaction) à l'aide d'amorces spécifiques complémentaires des régions 5' et 3', (respectivement

A5' et A3') sur 10 ng d'ADN génomique extrait d'une culture de bactéries de la souche IM2169.

A5 ' : 5 ' CCCGAATTCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC 3 '

A3 ' : 5 ' CCCGAATTCTGCTATGGTGCTGCCTGTG 3 '

Un fragment d'ADN est ainsi obtenu et après digestion par EcoRI. il compte 2150 nt. Ce fragment EcoRI est ensuite ligué aux extrémités EcoRI déphosphorylées du phagemide pBluescriptSK(-) (Stratagene) pour donner le phagemide recombinant pSK/2169tbp2.

1.2. Mise en oeuyre des délétions.

Le clone pSK/2169tbp2 contenant les séquences tbp2 de la souche M982 est délété par la technique de Kunkel, PNAS (1985) 82 : 448.

En bref, la forme phagique du phagemide recombinant pSK/2169tbp2 est obtenue après sauvetage par le phage "helper" VCS Ml 3 selon la technique décrite par Stratagene, fournisseur du vecteur de base, et utilisée pour infecter la souche bactérienne CJ236. Les mutations dut et ung portées par la souche CJ236 ont pour conséquence la synthèse de molécules d'ADN ayant incorporé le précurseur nucléotidique dUTP.

Les phages sont récoltés et l'ADN simple brin est extrait par un mélange phénol/chloroforme. Cet ADN est hybride dans les conditions classiques, aux oligonucléotides suivants :

2169dl 5 ' CGCATCCAAAACCGTACCTGTGCTGCCTGA 3 2169d2 5 ' TTTATCACTTTCCGGGGGCAGGAGCGGAAT 3 2169d3 5' GTTGGAACAGCAGACAGCGGTTTGCGCCCC 3 2169d4 5' GAACATACTTTGTTCGTTTTTGCGCGTCAA 3

La réaction d'hybridation est poursuivie 30 min. en température décroissante à partir de 70°C jusqu'à 30°C.

Le second brin complémentaire est ensuite achevé par synthèse complète en présence des quatre desoxynucléotides. de la T4 DNA polymérase et de la T4 DNA ligase, selon les conditions classiques.

La souche E. coli SURE (Stratagene) est transformée par l'ADN ainsi obtenu. Dans cette souche, les molécules porteuses de dUTP. c'est-à-dire non- mutées, sont détruites.

Les phages obtenus sont analysés par les techniques classiques de préparation rapide d'ADN plasmidique et de digestion par les enzymes de restriction appropriées. La présence de la mutation recherchée est ensuite vérifiée par séquençage nucléotidique.

Le clone pSK2169#7, porteur des quatre mutations Δ 1203-1256, Δ 1371- 1451, Δ 1512-1562, et Δ 1617-1679 est sélectionné.

6B - Construction du vecteur d'expression pTG5783

Le plasmide pTG5768 décrit précédemment est digéré par Hpal et Xcml. On insère simultanément dans ce vecteur un fragment Xcml-Xcml de pTG5768 et le fragment Hpάl-Xcml du plasmide pSK/2169ed#7. pour générer le plasmide pTG5783. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence tbpl modifiée (délétions dl à d4).

6C - Préparation et purification de D4/2169.

D4/2169 est produit et purifié selon l'Exemple 4B.

Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié : 15. 04. 93) D4/2169 purifié s'est révélé capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.

EXEMPLE 7 : Détermination du niveau d'expression des RTHs des souches de N. meningitidis

Le taux d'expression de la protéine RTH par N. meningitidis est déterminé par la mesure de la capacité d ^" un nombre défini de germes à fixer la Tfh couplée à la peroxydase.

Une préculture de 18 heures à 37°C sur MHA sert à ensemenser un erlen contenant 50 ml de MHB supplémenté avec 30 μM d'EDDA. La densité optique est mesurée à 600 nm au début de de la culture et après 5 heures de culture, on appelle croissance, la différence de densité optique entre ces deux temps. L'expression du RTH est mesurée après 5 heures de culture comme suit :

La densité bactérienne de la culture est calculée à partir de fabsorbance de la suspension mesurée à 600 nm sachant qu ^' une unité d ^' absorbance correspond à 3.1θ" CFU/ml.

Un ml d'une culture bactérienne est centrifugé pendant 15 min à 2500 g puis le culot bactérien est repris par un volume de Tris-HCI 50 mM pH 8,0 de façon à obtenir une suspension de 1.10^ CFU/ml. Dans le même tampon une série de dilutions de raison 2 est effectuée à partir de cette suspension (1/2 à 1/2048). Cinquante μl de chacun de ces

5 échantillons sont déposés dans chacun des puits d ^' un appareil de "dot-blot" (Biorad) fonctionnant sous vide et équipé d'une membrane de nitrocellulose 0,45 μm (Schleicher et Schull) préalablement imbibée de tampon. Après dépôt des échantillons la membrane est incubée pendant lh à température ambiante en tampon bloquant (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCl 9g/l, lait écrémé 10 g/1). La membrane est ensuite incubée pendant lh à

10 37°C sous agitation avec une solution de Tfh-peroxydase à 1 μg/ml en tampon bloquant. Après trois lavages en tampon bloquant, la fixation de la Tfh-peroxydase est révélée par faddition d'un substrat colorimétrique de la peroxydase. le 4-Chloro-l-Naphtol (4-C1- N) à 0,01% dans de l'éthanol 1%.

15 Après 20 min d ^' incubation à température ambiante, le titre d'expression du RTH est déterminé: il correspond à l'inverse de la dernière dilution pour laquelle une coloration violette est encore visible. La lecture se fait soit visuellement soit en utilisant un densitomètre (Appareil Sebia-Preference).

20

EXEMPLE 8 : Préparation et titrage des sérums hyperimmuns anti-Tbp2s recombinantes (Tbp2M982 100 %. Tbp2 M982 80 % et Tbp2 M982 50 %), anti-RTH M982 et anti-RTH B16B6

">^ 8A - Préparation des immunogènes

Une culture de la souche d'E. coli décrite dans l'Exemple 4B ci-avant ou dans l'Exemple 6B ci-avant est lysée par passage dans un appareil de lyse (Rannie) puis centrifugée. Le matériel insoluble est chargé sur un gel d'acrylamide 10% de 5 mm

30 d'épaisseur (10 mg de protéines insolubles par gel) puis soumis à électrophorese. La protéine Tbp2 ainsi que les formes 80 et 50 % sont visualisées par coloration au Bleu de Coomassie puis extraites du gel. En parallèle, on réalise un témoin négatif correspondant à l'extraction d'une protéine d'E. coli de même taille que la protéine Tbp2.

35

Les RTH M982 et B16B6 sont quant à eux purifiés comme décrit dans les Exemples 1 et 2 de WO 93/6861.

8B - Préparation des antisérums

Des lapins néozélandais albinos reçoivent par voie sous-cutanée multisite, 50 μg d'un des produits décrit ci-avant dans le présent exemple, en présence d'adjuvant complet de Freund. 21 jours et 42 jours après la première injection, les lapins reçoivent à nouveau 50 μg du même produit mais ces fois-ci en présence d'adjuvant incomplet de Freund. 15 jours après la dernière injection, le sérum de animaux est prélevé, puis décomplémenté pendant 30 min à 56°C et stérilisé par filtration sur membrane de porosité 0,22 μm (Millipore).

Lorsque l'immunogène mis en oeuvre est un RTH. le filtrat est par la suite épuisé par contact avec la souche initiale (M982 ou B 16B6) qui pour se faire, a été cultivée au préalable en présence de fer sous forme libre (dans ces conditions, la synthèse du récepteur de la transferrine est réprimée). Les modalités de contact sont comme suit : 10 ml du filtrat sont ajoutés à 10^ cfu (unités formant des colonies) d'une culture de la souche initiale. L'adsoφtion est poursuivie une nuit à 4°C, sous agitation. Les bactéries sont ensuite éliminées par centrifugation de 15 min à 2500 x g. Le surnageant est récupéré puis soumis à nouveau à 3 opérations d'adsoφtion successives comme précédemment décrit. Les sérums adsorbés sont filtrés sur une membrane de porosité 0.22 μm (Millipore) et conservés à -20°C.

Dans le cas des sérums dirigés contre des protéines Tbp2 recombinantes, l'adsoφtion s'effectue contre la souche d'E coli qui a servi à produire les protéines recombinantes, cultivées pendant 5h en milieu LB (Difco) supplémenté en ampicilline à 100 μg/ml.

8C - Titrage de l'activité bactéricide des sérums

La capacité des sérums anti-RTH ou anti-Tbp2 à induire la lyse des différentes souches de N. meningitidis est évaluée par un essai de bactéricidie. Cette technique consiste à mettre en présence deux volumes des dilutions de raison 2 ( 1/4 à 1/2048) du sérum adsorbé et décomplémenté à titrer, un volume de complément de jeune lapin dilué au 1/1.5 et un volume de suspension bactérienne contenant 70 germes issue d'une

culture de 5h à 37°C en bouillon MHB pH 7.2, EDDA 30 μM. Les réactifs sont mélangés les uns aux autres dans des cupules et incubés pendant 30 min à 37°C sous agitation. La réaction de bactéricidie du sérum vis à vis des germes est arrêtée par l'addition d'1 ml de gélose constituée de bouillon MH pH 7,2, de 20% de supplément G (Pasteur Diagnostic) et 15% d'agar noble (Difco). Les cupules sont ensuite incubées pendant une nuit à 37°C en présence de 10% CO2- La lecture des résultats consiste à numérer les colonies formées à partir des bactéries non lysées. Le titre est défini comme l'inverse de la dernière dilution du sérum induisant la lyse de 50% des bactéries introduites initialement.

8D - Caractérisation des sérums anti-Tbp2s M982 recombinantes

La spécificité de quatre sérums hyperimmuns dirigés respectivement contre une protéine Tbp2-100% (sérum 577), Tbp2-80% (580). Tbp2-50% (583) ou encore contre une protéine non-sens d' Escherichia coli (sérum témoin 582) est analysée soit par une méthode de "dot-blot" sur germes entiers, soit par la méthode de "western-blot" sur des protéines de membranes externes.

1.1. Analyse sur des geπnes entiers

La préparation des germes, leur dépôt sur membrane de nitrocellulose sont identiques à ce qui a été décrit dans l'Exemple 9. M982 et B16B6 sont cultivées en absence ou en présence d'agent chélatant.

Après l ^' étape de saturation en tampon bloquant, la membrane est incubée avec un des différents sérums hyperimmuns à analyser (dilué en tampon bloquant: dilutions allant de 1/500 à 1/10000) pendant i h à 37°C. La membrane est ensuite lavée deux fois en tampon bloquant sous agitation forte puis, afin de révéler le premier sérum, elle est de nouveau incubée avec un sérum de chèvre anti IgG de lapin couplé à la peroxydase (Zymed) dilué au 1/1000 en tampon bloquant. Pour augmenter la sensibilité de la détection du signal, le substrat de la peroxydase utilisée est un substrat chimioluminescent (Kit ECL, Amersham) utilisé selon les recommandations du fabriquant.

Les résultats que l'on obtient, indiquent que le sérum anti-protéine d'E. coli

(sérum 582) est un bon témoin négatif dans le sens ou il ne permet de détecter ni la souche M982, ni la souche B 16B6 quelque soit les conditions de culture. Les

trois autres sérums reconnaissent uniquement la souche M982 et à un niveau plus élevé quand elle est cultivée en présence d'EDDA ce qui correspond à une reconnaissance du RTH. En effet la souche M982 exprime le RTH à un niveau basai quand elle est cultivée en l'absence d'agent chélatant et ce niveau augmente en présence d'agent chélatant. Les résultats indiquent que les sérums anti-Tbp2

100% (577), anti-Tbp2 80% (580) et anti-Tbp2 50% (583) sont spécifiques du RTH de la souche M982.

1.2. Analyse sur des protéines de membranes externes

La souche M982 est cultivée en milieu appauvri en fer. Cinq ml de la culture en phase exponentielle (environ 1.10° germes/ml) sont centrifugés à

1500 g pendant 15 min. Le culot est repris par 1,5 ml de Tris-HCI 125 mM, pH

8,0. La suspension est lysée par sonication (appareil Branson-Sonifer 450, sonde de 3 mm de diamètre) pendant 2 min. La lyse est poursuivie par addition de

Triton XI 00 à 1% final et incubation 30 min dans de la glace. La suspension est centrifugée à 8000 g pour éliminer les bactéries non lysées. puis le surnageant est centrifugé 30 min à 10000 g pour obtenir sous forme de culot les membranes externes. Le culot est repris en Tris-HCI 125 mM. pH 8.0. puis dosé en protéines par une microméthode (Kit Micro-BCA. Pierce) utilisée selon les recommandations du fabriquant.

Une électrophorese est réalisée sur gel de polyacrylamide en présence de SDS selon la méthode de Laemmli (Laemli. 1970). Le gel séparateur contient 12,5% d'acrylamide et le gel de concentration en contient 5 %. Les échantillons à analyser sont dilués au demi en tampon échantillon (0.125 M de tampon Tris à pH 6,8; 25 % de glycerol; 2,5 % de 2-Mercaptoethanol: 0,001 % de bleu de Bromophénol) et hydrolyses à 100°C. Cinquante μg de protéines sont déposés pour un grand gel et 1 μg pour les gels Phast (Pharmacia, reticulation 12,5%). La migration est réalisée à un voltage constant 50 V pour des gels de 15x12 cm

(appareil vertical Biorad) et de 250 V sur les gels Phast .

Après une étape de fixation de 30 min dans une solution d'acide acétique

10%, isopropanol 25%, les gels sont colorés au bleu de Coomassie (0,25 % bleu; 45% méthanol: 10% acide acétique). Les gels sont ensuite décolorés

progressivement dans des bains successifs de méthanol 20%, acide acétique 10%.

Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schull ; 0,45 μm) selon la méthode de Towbin (Towbin et al., 1979). Le transfert se fait sous ampérage constant (1 mAJcxxfi) pendant 90 min pour un grand gel et 1 heure pour un gel Phast. L'efficacité du transfert est révélée par coloration au rouge Ponceau (Kodak). Après transfert, la nitrocellulose est lavée en tampon bloquant (Tris-HCI 0,5 M pH 7,5 ; 1 % lait écrémé ; 150 mM NaCl) pendant 1 heure à température ambiante.

L'incubation avec l'antiserum dilué en tampon bloquant a lieu pendant une heure à 37°C. Le premier sérum est révélé par un antisérum couplé à la peroxydase (chèvre anti-lapin, Zymed) pendant une heure à 37°C. Le substrat de la peroxydase est le 4-chloro 1 -naphtol à 1 % (coloration violette).

Les résultats obtenus indiquent que la protéine Tbp2 de la souche M982 est spécifiquement reconnue par les sérums anti-Tbp2 100%), anti-Tbp2 80% et anti-Tbp2 50%. Aucune autre protéine de N. meningitidis n'est reconnue par ces sérums. Le sérum anti-protéine d'E. coli ne reconnaît pas la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982.

8Ε - Titrage des sérums anti-Tbp2 M982 recombinantes

Pour pouvoir comparer les sérums hyperimmuns anti-Tbp2 100, 80 et 50 % adsorbés sur E. coli, il est nécessaire de connaître leur titre vis à vis de la souche homologue. C'est pourquoi un titrage en "dot-blot" sur des germes M982 cultivés en milieu appauvri en fer est réalisé en appliquant le protocole décrit en 9.D.2.

Une concentration identique de germes ( 1.10° germes/ml) est déposée sur des filtres de nitrocellulose qui sont ensuite révélés avec des dilutions de raison 2 des différents sérums à titrer. Les titres sont définis comme l'inverse de la dernière dilution pour laquelle un signai positif est observé. Avec une révélation colorimétrique les titres obtenus sont les suivants: 512 pour le sérum anti-Tbp2 100% (sérum 577); 256 pour le sérum anti-Tbp2 80% (sérum 580); 256 pour le sérum anti-Tbp2 50% (sérum

583)

Ceci indique que les trois sérums hyperimmuns anti-Tbp2 100, 80 et 50 % ont à une raison 2 près le même titre vis à vis de la souche M982. De ce fait pour l'analyse de leur réactivité croisée vis à vis de différentes souches type M982, ils peuvent être utilisés à la même concentration.

EXEMPLE 9 : Analyse de la réactivité croisée des sérums anti-Tbp2 M982 recombinantes

La détermination du niveau de réactivité croisée vis à vis des souches de type M982 est mise en oeuvre par la méthode de dot blot comme décrit dans l'Exemple 8.

Après culture en milieu MHB + 30mM EDDA pendant 5 heures, des dilutions de raison 2 des différentes suspensions bactériennes sont déposées sur 5 filtres de nitrocellulose différents :

un premier filtre est révélé avec de la transferrine humaine couplée à la peroxydase (TGH) et permet de définir un titre de fixation de la TFH :

- le second est révélé avec un sérum anti-protéine d'E. coli (sérum utilisé au

1 /2000e ; témoin négatif) ;

le troisième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982 recombinante entière ( 100%) ;

le quatrième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982 recombinante délétée des portion hypervariables de la région "charnière" (80%) ; et

- le cinquième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982 recombinante correspond à la région 50% N-terminale. Les titres sont définis comme l'inverse de la dernière dilution pour laquelle une coloration est visible.

Pour pouvoir quantifier la réactivité croisée de chacun des sérums avec chacune des souches, il est nécessaire de définir une valeur qui tienne compte de la variabilité du niveau d'expression du RTH parmi les souches analysées.

C'est pourquoi un index correspondant au titre sérique rapporté au titre d'expression de la transferrine est calculé. Cet index est la valeur retenue pour l'analyse car elle tient compte du niveau variable d'expression du RTH d'une souche à l'autre dans nos conditions de culture. Cependant cet index ne peut pas rendre compte d'une éventuelle différence d'affinité des RTH.

Pour information, on présente dans le tableau ci-dessous un récapitulatif des valeurs d'index obtenus pour les 54 souches.

EXEMPLE 10 : Etude de bactéricidie croisée

10A. Préparation d'un antisérum anti-RTH de /V. meningitidis 8680

Une préparation de RTH 8680 telle qu'obtenue dans l'Exemple 1 est utilisée comme immunogène afin de préparer un antisérum selon le protocole décrit dans l'Exemple 8B.

10B. Culture des souches

Les souches N. meningitidis 92/04. M871. 504/91 , 8680, 8726, BZ83, 44, 52 et 8710 (souches provenant du laboratoire de référence des méningoccoques : Dr. Caugant, WHO-collaborationg center for référence and research on meningococci, NIPH. Oslo, Norway ; et faisant partie du groupe électrophorétique ET5 (B. Mohamed-Rokbi, Thèse présentée le 10 octobre 1995, devant l'Université Claude Bernard. Lyon, France pour l'obtention du diplôme de Doctorat) ainsi que les souches M982 et B16B6 sont cultivées comme décrit dans l'Exemple 1 A.

10C. Test de bactéricidie

L'activité bactéricide de l'antiserum préparé en 10A est testée à l'encontre des souches cultivées en 10B selon le protocole décrit dans l'Exemple 8C.

Les résultats sont présentés dans le tableau ci-après :

Les titres de bactéricidie obtenus à l'encontre des souches du groupe électrophorétique ET5 mettent en évidence une bactéricidie croisée. Ceux obtenus à

l'encontre des souches B16B6 et M982 par contre témoignent d'une absence de bactéricidie croisée.

Ces résultats tendent à supporter la proposition faite par la présente demande, à savoir l'ajout éventuel d'une protéine Tbp2 ou d'un RTH qui dérive d'une souche de type 8680, à une composition vaccinale contenant (i) une Tbp2 ou un RTH qui dérive d'une souche de type M982 et (ii) une Tbp2 ou un RTH qui dérive d'une souche de type B16B6 ; ceci sans préjudice porté aux résultats déjà constatés en matière de reconnaissance de la souche 8680 en Western blot, par les antisérums anti-RTH M982 et anti-RTH B16B6.

ID SEQ NO Nom du Séquence Projet

1, 2 IM2169-2 Tbρ2 IM2169 complète

3, 4 IM2394-2 Tbp2 IM2394 complète

5, 6 8680 Tbp28680 complète

7 2D IM2169 2ième domaine de Tbp2 IM2169

8 2D6940 2ième domaine de Tbp26940

9 2D2223 2ième domaine de Tbp22223

10 2D 708 2ième domaine de Tbp2708

11 2D M978 2ième domaine de Tbp2 M978

12 2D 1610 2ième domaine de Tbp21610

13 2D867 2ième domaine de Tbp22D867

14 2D S3032 2ième domaine de Tbp2 S3032

15 2D891 2ième domaine de Tbp2 M981

16 OTG 4915 OTG 4915

17 OTG 4651 OTG 4651

18 OTG 4928 OTG 4928

19 OTG 5011 OTG 5011

20 OTG 4873 OTG 4873

21 OTG 4877 OTG 4877

22 A 5' A 5'

23 A 3' A 3'

24 2169 D1 2169 D1

25 2169 D2 2169 D2

26 2169 D3 2169 D3

27 2169 D4 2169 D4

28 Inter 1 Bam Inter 1 Bam

29 Met 2 Eco Met 2 Eco

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:

(l) DEPOSANT

(A) NOM Pasteur Merieux sérums et vaccins

(B) RUE 58, avenue leclerc (C) VILLE: Lyon

(E) PAYS: France

(F) CODE POSTAL: 69007

(ii) TITRE DE L' INVENTION: Fragments Tbp2 de N. meningitidis (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 29

(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Tape

(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D ¹ EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 2230 paires de bases

(B) TYPE: nucl,otιde

(C) NOMBRE DE BRINS: Simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomιque)

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Neisseria meningitidis

(B) SOUCHE: IM2169

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: sιg_peptιde

(B) EMPLACEMENT: 60..119

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: mat_peptιde

(B) EMPLACEMENT:120..2192

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:60..2192

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: mιsc_feature

(B) EMPLACEMENT: 120..1154

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: mιsc_feature

(B) EMPLACEMENT:1155..1748

(ix) CARACTERISTIQUE.

(A) NOM/CLE: misc_feature

(B) EMPLACEMENT:1749..2192

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: misc_binding

(B) EMPLACEMENT:237..1169

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

ATTTGTTAAA AATAAATAAA ATAATAATCC TTATCATTCT TTAATTGAAT TGGGTTTAT 59

ATG AAC AAT CCA TTG GTA AAT CAG GCT GCT ATG GTG CTG CCT GTG TTT 107 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5

TTG TTG AGT GCC TGT CTG GGC GGC GGC GGC AGT TTC GAT CTT GAT TCT 155 Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10

GTC GAT ACC GAA GCC CCG CGT CCC GCG CCA AAG TAT CAA GAT GTT TCT 203 Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser 15 20 25

TCC GAA AAA CCG CAA GCC CAA AAA GAC CAA GGC GGA TAC GGT TTT GCG 251 Ser Glu Lys Pro Gin Ala Gin Lys Asp Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala 30 35 40

ATG AGG TTG AAA CGG AGG AAT TGG TAT CCG GGG GCA GAA GAA AGC GAG 299 Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu 45 50 55 60

GTT AAA CTG AAC GAG AGT GAT TGG GAG GCG ACG GGA TTG CCG ACA AAA 347 Val Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys 65 70 75

CCC AAG GAA CTT CCT AAA CGG CAA AAA TCG GTT ATT GAA AAA GTA GAA 395 Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gin Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu 80 B5 90

ACA GAC GGC GAC AGC GAT ATT TAT TCT TCC CCC TAT CTC ACA CCA TCA 443 Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 95 100 105

AAC CAT CAA AAC GGC AGC GCT GGC AAC GGT GTA AAT CAA CCT AAA AAT 491 Asn His Gin Asn Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gin Pro Lys Asn 110 115 120

CAG GCA ACA GGT CAC GAA AAT TTC CAA TAT GTT TAT TCC GGT TGG TTT 539 Gin Ala Thr Gly His Glu Asn Phe Gin Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe 125 130 135 140

TAT AAA CAT GCA GCG AGT GAA AAA GAT TTC AGT AAC AAA AAA ATT AAG 587 Tyr Lys His Ala Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys 145 150 155

TCA GGC GAC GAT GGT TAT ATC TTC TAT CAC GGT GAA AAA CCT TCC CGA 635 Ser Gly Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg

160 165 170

CAA CTT CCT GCT TCT GGA AAA GTT ATC TAC AAA GGT GTG TGG CAT TTT 683 Gin Leu Pro Ala Ser Gly Lys Val Ile Tyr Lys Gly Val Trp His Phe 175 180 185

GTA ACC GAT ACA AAA AAG GGT CAA GAT TTT CGT GAA ATT ATC CAG CCT 731 Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gin Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gin Pro 190 195 200

TCA AAA AAA CAA GGC GAC AGG TAT AGC GGA TTT TCT GGT GAT GGC AGC 779 Ser Lys Lys Gin Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser 205 210 215 220

GAA GAA TAT TCC AAC AAA AAC GAA TCC ACG CTG AAA GAT GAT CAC GAG 827 Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu 225 230 235

GGT TAT GGT TTT ACC TCG AAT TTA GAA GTG GAT TTC GGC AAT AAG AAA 875 Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys 240 245 250

TTG ACG GGT AAA TTA ATA CGC AAT AAT GCG AGC CTA AAT AAT AAT ACT 923 Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr 255 260 265

AAT AAT GAC AAA CAT ACC ACC CAA TAC TAC AGC CTT GAT GCA CAA ATA 971 Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Gin Ile 270 275 280

ACA GGC AAC CGC TTC AAC GGC ACG GCA ACG GCA ACT GAC AAA AAA GAG 1019 Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Lys Glu 285 290 295 300

AAT GAA ACC AAA CTA CAT CCC TTT GTT TCC GAC TCG TCT TCT TTG AGC 1067 Asn Glu Thr Lys Leu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser 305 310 315

GGC GGC TTT TTC GGC CCG CAG GGT GAG GAA TTG GGT TTC CGC TTT TTG 1115 Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gin Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu 320 325 330

AGC GAC GAT CAA AAA GTT GCC GTT GTC GGC AGC GCG AAA ACC AAA GAC 1163 Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp 335 340 345

AAA CTG GAA AAT GGC GCG GCG GCT TCA GGC AGC ACA GGT GCG GCA GCA 1211 Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala 350 355 360

TCG GGC GGT GCG GCA GGC ACG TCG TCT GAA AAC AGT AAG CTG ACC ACG 1259 Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr 365 370 375 380

GTT TTG GAT GCG GTT GAA TTG ACA CTA AAC GAC AAG AAA ATC AAA AAT 1307 Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn 385 390 395

CTC GAC AAC TTC AGC AAT GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT ATG 1355 Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met 400 405 410

ATT CCG CTC CTG CCC AAG GAT TCC GAA AGC GGG AAC ACT CAG GCA GAT 1403 Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gin Ala Asp 415 420 425

AAA GGT AAA AAC GGC GGA ACA GAA TTT ACC CGC AAA TTT GAA CAC ACG 1451 Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr 430 435 440

CCG GAA AGT GAT AAA AAA GAC GCC CAA GCA GGT ACG CAG ACG AAT GGG 1499 Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin Thr Asn Gly 445 450 455 460

GCG CAA ACC GCT TCA AAT ACG GCA GGT GAT ACC AAT GGC AAA ACA AAA 1547 Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys 465 470 475

ACC TAT GAA GTC GAA GTC TGC TGT TCC AAC CTC AAT TAT CTG AAA TAC 1595 Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr 480 485 490

GGA ATG TTG ACG CGC AAA AAC AGC AAG TCC GCG ATG CAG GCA GGA GGA 1643 Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin Ala Gly Gly 495 500 505

AAC AGT AGT CAA GCT GAT GCT AAA ACG GAA CAA GTT GAA CAA AGT ATG 1691 Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 510 515 520

TTC CTC CAA GGC GAG CGT ACC GAT GAA AAA GAG ATT CCA ACC GAC CAA 1739 Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gin 525 530 535 540

AAC GTC GTT TAT CGG GGG TCT TGG TAC GGG CAT ATT GCC AAC GGC ACA 1787 Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr 545 550 555

AGC TGG AGC GGC AAT GCT TCT GAT AAA GAG GGC GGC AAC AGG GCG GAA 1835 Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu 560 565 570

TTT ACT GTG AAT TTT GCC GAT AAA AAA ATT ACC GGC AAG TTA ACC GCT 1883 Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala 575 580 585

GAA AAC AGG CAG GCG CAA ACC TTT ACC ATT GAG GGA ATG ATT CAG GGC 1931 Glu Asn Arg Gin Ala Gin Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gin Gly 590 595 600

AAC GGC TTT GAA GGT ACG GCG AAA ACT GCT GAG TCA GGT TTT GAT CTC 1979 Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu 605 610 615 620

GAT CAA AAA AAT ACC ACC CGC ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA GAT GCC 2027 Asp Gin Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala

625 630 635

AAG GTA AAG GGC GGT TTT TAC GGG CCT AAA GCC GAA GAG TTG GGC GGA 2075 Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly 640 645 650

TGG TTT GCC TAT CCG GGC GAT AAA CAA ACG GAA AAG GCA ACA GCT ACA 2123 Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Gin Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr 655 660 665

TCC AGC GAT GGA AAT TCA GCA AGC AGC GCG ACC GTG GTA TTC GGT GCG 2171 Ser Ser Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala 670 675 680

AAA CGC CAA CAG CCT GTG CAA TAAGCACGGT TGCCGAACAA TCAAGAATAA 2222

Lys Arg Gin Gin Pro Val Gin 685 690

GGCTTCAG 2230

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 711 acides amin.s

(B) TYPE: acide amin,

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(il) TYPE DE MOLECULE: prot,ine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5

Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10

Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser 15 20 25

Ser Glu Lys Pro Gin Ala Gin Lys Asp Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala 30 35 40

Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu 45 50 55 60

Val Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys 65 70 75

Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gin Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu 80 85 90

Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 95 100 105

Asn His Gin Asn Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gin Pro Lys Asn 110 115 120

Gln Ala Thr Gly His Glu Asn Phe Gin Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe 125 130 135 140

Tyr Lys His Ala Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys 145 150 155

Ser Gly Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg 160 165 170

Gin Leu Pro Ala Ser Gly Lys Val Ile Tyr Lys Gly Val Trp His Phe 175 180 185

Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gin Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gin Pro 190 195 200

Ser Lys Lys Gin Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser 205 210 215 220

Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu 225 230 235

Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys 240 245 250

Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr 255 260 265

Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Gin Ile 270 275 280

Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Lys Glu 285 290 295 300

Asn Glu Thr Lys Leu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser 305 310 315

Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gin Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu 320 325 330

Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp 335 340 345

Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala 350 355 360

Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr 365 370 375 380

Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn 385 390 395

Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met 400 405 410

Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gin Ala Asp 415 420 425

Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr

430 435 440

Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin Thr Asn Gly 445 450 455 460

Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys 465 470 475

Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr 480 485 490

Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin Ala Gly Gly 495 500 505

Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 510 515 520

Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gin 525 530 535 540

Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr 545 550 555

Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu 560 565 570

Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala 575 580 585

Glu Asn Arg Gin Ala Gin Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gin Gly 590 595 600

Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu 605 610 615 620

Asp Gin Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala 625 630 635

Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly 640 645 650

Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Gin Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr 655 660 665

Ser Ser Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala 670 675 680

Lys Arg Gin Gin Pro Val Gin 685 690

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 1808 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: IM2394

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: sig_peptide

(B) EMPLACEMENT:1..60

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: mat_peptide

(B) EMPLACEMENT:61..1797

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:1..1797

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: misc_feature

(B) EMPLACEMENT:61..1035

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: misc_feature

(B) EMPLACEMENT: 1036..1386

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: misc_feature

(B) EMPLACEMENT:1387..1797

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: misc_binding

(B) EMPLACEMENT:46..1050

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

ATG AAC AAT CCA TTG GTA AAT CAG GCT GCT ATG GTG CTG CCT GTG TTT 48 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5

TTG TTG AGT GCT TGT CTG GGT GGC GGC GGC AGT TTC GAT TTG GAC AGC 96 Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10

GTG GAA ACC GTG CAA GAT ATG CAC TCC AAA CCT AAG TAT GAG GAT GAA 144 Val Glu Thr Val Gin Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu 15 20 25

AAA AGC CAG CCT GAA AGC CAA CAG GAT GTA TCG GAA AAC AGC GGC GCG 192 Lys Ser Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala 30 35 40

GCT TAT GGC TTT GCA GTA AAA CTA CCT CGC CGG AAT GCA CAT TTT AAT 240 Ala Tyr Gly Phe Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn 45 50 55 60

CCT AAA TAT AAG GAA AAG CAC AAA CCA TTG GGT TCA ATG GAT TGG AAA 288

Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys 65 70 75

AAA CTG CAA AGA GGA GAA CCA AAT AGT TTT AGT GAG AGG GAT GAA TTG 336 Lys Leu Gin Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu 80 85 90

GAA AAA AAA CGG GGT AGT TCT GAA CTT ATT GAA TCA AAA TGG GAA GAT 384 Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp 95 100 105

GGG CAA AGT CGT GTA GTT GGT TAT ACA AAT TTC ACT TAT GTC CGT TCG 432 Gly Gin Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser 110 115 120

GGA TAT GTT TAC CTT AAT AAA AAT AAT ATT GAT ATT AAG AAT AAT ATA 480 Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile 125 130 135 140

GTT CTT TTT GGA CCT GAC GGA TAT CTT TAC TAT AAA GGG AAA GAA CCT 528 Val Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro 145 150 155

TCC AAG GAG CTG CCA TCG GAA AAG ATA ACT TAT AAA GGT ACT TGG GAT 576 Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp 160 165 170

TAT GTT ACT GAT GCT ATG GAA AAA CAA AGG TTT GAA GGA TTG GGT AGT 624 Tyr Val Thr Asp Ala Met Glu Lys Gin Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser 175 180 185

GCA GCA GGA GGA GAT AAA TCG GGG GCG TTG TCT GCA TTA GAA GAA GGG 672 Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly 190 195 200

GTA TTG CGT AAT CAG GCA GAG GCA TCA TCC GGT CAT ACC GAT TTT GGT 720 Val Leu Arg Asn Gin Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly 205 210 215 220

ATG ACT AGT GAG TTT GAG GTT GAT TTT TCT GAT AAA ACA ATA AAG GGC 768 Met Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly 225 230 235

ACA CTT TAT CGT AAC AAC CGT ATT ACT CAA AAT AAT AGT GAA AAC AAA 816 Thr Leu Tyr Arg Asn Asn Arg Ile Thr Gin Asn Asn Ser Glu Asn Lys 240 245 250

CAA ATA AAA ACT ACG CGT TAC ACC ATT CAA GCA ACT CTT CAC GGC AAC 864 Gin Ile Lys Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gin Ala Thr Leu His Gly Asn 255 260 265

CGT TTC AAA GGT AAG GCG TTG GCG GCA GAT AAA GGT GCA ACA AAT GGA 912 Arg Phe Lys Gly Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly 270 275 280

AGT CAT CCC TTT ATT TCC GAC TCC GAC AGT TTG GAA GGC GGA TTT TAC 960 Ser His Pro Phe Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 285 290 295 300

GGG CCG AAA GGC GAG GAA CTT GCC GGT AAA TTC TTG AGC AAC GAC AAC 1008 Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn 305 310 315

AAA GTT GCA GCG GTG TTT GGT GCG AAG CAG AAA GAT AAG AAG GAT GGG 1056 Lys Val Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gin Lys Asp Lys Lys Asp Gly 320 325 330

GAA AAC GCG GCA GGG CCT GCA ACG GAA ACC GTG ATA GAT GCA TAC CGT 1104 Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg 335 340 345

ATT ACC GGC GAG GAG TTT AAG AAA GAG CAA ATA GAC AGT TTT GGA GAT 1152 Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gin Ile Asp Ser Phe Gly Asp 350 355 360

GTG AAA AAG CTG CTG GTT GAC GGA GTG GAG CTT TCA CTG CTG CCG TCT 1200 Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 365 370 375 380

GAG GGC AAT AAG GCG GCA TTT CAG CAC GAG ATT GAG CAA AAC GGC GTG 1248 Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gin His Glu Ile Glu Gin Asn Gly Val 385 390 395

AAG GCA ACG GTG TGT TGT TCC AAC TTG GAT TAC ATG AGT TTT GGG AAG 1296 Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys 400 405 410

CTG TCA AAA GAA AAT AAA GAC GAT ATG TTC CTG CAA GGT GTC CGC ACT 1344 Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gin Gly Val Arg Thr 415 420 425

CCA GTA TCC GAT GTG GCG GCA AGG ACG GAG GCA AAC GCC AAA TAT CGC 1392 Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg 430 435 440

GGT ACT TGG TAC GGA TAT ATT GCC AAC GGC ACA AGC TGG AGC GGC GAA 1440 Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu 445 450 455 460

GCC TCC AAT CAG GAA GGT GGT AAT AGG GCA GAG TTT GAC GTG GAT TTT 1488 Ala Ser Asn Gin Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe 465 470 475

TCC ACT AAA AAA ATC AGT GGC ACA CTG ACG GCA AAA GAC CGT ACG TCT 1536 Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser 480 485 490

CCT GCG TTT ACT ATT ACT GCC ATG ATT AAG GAC AAC GGT TTT TCA GGT 1584 Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly 495 500 505

GTG GCG AAA ACC GGT GAA AAC GGC TTT GCG CTG GAT CCG CAA AAT ACC 1632 Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gin Asn Thr 510 515 520

GGA AAT TCC CAC TAT ACG CAT ATT GAA GCC ACT GTA TCC GGC GGT TTC 1680

Giy Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 525 530 535 540

TAC GGC AAA AAC GCC ATC GAG ATG GGC GGA TCG TTC TCA TTT CCG GGA 1728 Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly 545 550 555

AAT GCA CCA GAG GGA AAA CAA GAA AAA GCA TCG GTG GTA TTC GGT GCG 1776 Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gin Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala 560 565 570

AAA CGC CAA CAG CTT GTG CAA TAAGCACGGC T 1808

Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 575

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 599 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: prot, ine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5

Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10

Val Glu Thr Val Gin Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu 15 20 25

Lys Ser Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala 30 35 40

Ala Tyr Gly Phe Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn 45 50 55 60

Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys 65 70 75

Lys Leu Gin Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu 80 85 90

Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp 95 100 105

Gly Gin Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser 110 115 120

Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile 125 130 135 140

Val Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro 145 150 155

Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp 160 165 170

Tyr Val Thr Asp Ala Met Glu Lys Gin Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser 175 180 185

Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly 190 195 200

Val Leu Arg Asn Gin Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly 205 210 215 220

Met Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly 225 230 235

Thr Leu Tyr Arg Asn Asn Arg Ile Thr Gin Asn Asn Ser Glu Asn Lys 240 245 250

Gin Ile Lys Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gin Ala Thr Leu His Gly Asn 255 260 265

Arg Phe Lys Gly Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly 270 275 280

Ser His Pro Phe Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 285 290 295 300

Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn 305 310 315

Lys Val Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gin Lys Asp Lys Lys Asp Gly 320 325 330

Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg 335 340 345

Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gin Ile Asp Ser Phe Gly Asp 350 355 360

Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 365 370 375 380

Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gin His Glu Ile Glu Gin Asn Gly Val 385 390 395

Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys 400 405 410

Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gin Gly Val Arg Thr 415 420 425

Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg 430 435 440

Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu 445 450 455 460

Ala Ser Asn Gin Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe 465 470 475

Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser 480 485 490

Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly 495 500 505

Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gin Asn Thr 510 515 520

Gly Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 525 530 535 540

Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly 545 550 555

Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gin Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala 560 565 570

Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 575

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 2064 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Neisseria meningitidis

(B) SOUCHE: 8680

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT: 1..2061

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: sig_peptide

(B) EMPLACEMENT:1..30

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: mat peptide

(B) EMPLACEMENT:31..2061

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

ATG GTG CTG CCT GTG TTT TTG TCG AGT GCT TGT CTG GGC GGA GGC GGC 48

Met Val Leu Pro Val Phe Leu Ser Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly -10 -5 1 5

GGC AGT TTC GAT CTT GAT TCT GTC GAT ACC GAA GCC CCG CGT CCC GCG 96

Giy Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala 10 15 20

CCA AAG TAT CAA GAT GTT TCT TCC GAA AAG CCG AAA GCC CAA AAA GAC 144 Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Gin Lys Asp 25 30 35

CAA GGC GGA TAC GGT TTT GCA ATG CGC TTT AAG CGG AGG AAT TGG TAT 192 Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr 40 45 50

CAG AAG GCG AAT CCT AAA GAA GAT GAG ATA AAA CTC TCT GAA AAT GAT 240 Gin Lys Ala Asn Pro Lys Glu Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asn Asp 55 60 65 70

TGG GAA CAA ACG GAT AAT GGT GAT ATC AAA AAC CCT TCC AAA CAA AAA 288 Trp Glu Gin Thr Asp Asn Gly Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gin Lys 75 80 85

AAT ATT ATT AAT GCC TTA CCT GGA AAT AAT GGA GGA GCT ACA TTG CAA 336 Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro Gly Asn Asn Gly Gly Ala Thr Leu Gin 90 95 100

GAT TCC AGT CAA GAA AAT CAG GGT ATA TCT AAG GTT ACG GAC TAT CAC 384 Asp Ser Ser Gin Glu Asn Gin Gly Ile Ser Lys Val Thr Asp Tyr His 105 110 115

AAT TTC CAA TAC GTA TGG TCG GGG TTT TTT TAT AAA CAG ATT AAA AAT 432 Asn Phe Gin Tyr Val Trp Ser Gly Phe Phe Tyr Lys Gin Ile Lys Asn 120 125 130

ACA ATT GAA AAA AAC GGT TCA TCT ATA ACC GCA GCC AGA AAC GGT CCT 480 Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro 135 140 145 150

GAC GGT TAT ATT TTT TAT AAA GGC AAA GAT CCC TCG AGA CAA CTC CCT 528 Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Ser Arg Gin Leu Pro 155 160 165

GTA TTG GGA CAG GTT ACG TAT AAA GGG ACT TGG GAT TTC TTA ACT GAT 576 Val Leu Gly Gin Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp 170 175 180

GTG AAA ATA AAT CAG AAA TTT ATA GAT TTA GGG AAT ACT TCT ACG AAA 624 Val Lys Ile Asn Gin Lys Phe Ile Asp Leu Gly Asn Thr Ser Thr Lys 185 190 195

CCC GGC GAC CGA TAT AGT GCT TTT TCC GGG GAG TTG GAT TAT ATC GTC 672 Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val 200 205 210

AAT AAA GAT AGC GAT AAG AAA GAC GGG CAC GTA GCA AAG GGA TTA ACA 720 Asn Lys Asp Ser Asp Lys Lys Asp Gly His Val Ala Lys Gly Leu Thr 215 220 225 230

ACG GAA ATA ACG GTT GAT TTT GAG AAA AAA ACC CTC AAC GGA AAA TTA 768 Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe Glu Lys Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu 235 240 245

ATT AAA AAC AAC AGT GTA AGC AAT AAT GAG TTC AAC GCT AAA TAC ACC 816 Ile Lys Asn Asn Ser Val Ser Asn Asn Glu Phe Asn Ala Lys Tyr Thr 250 255 260

ACC CAA TAC TAT AGC CTT GAT GCG ACG CTT AGG GGA AAC CGC TTC AAC 864 Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn Arg Phe Asn 265 270 275

GGC AAG GCA ACG GCA ACC GAC AAA CCT GGC ACT GGA GAA ACC AAA CAA 912 Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr Lys Gin 280 285 290

CAT CCC TTT GTT TCC GAC TCG TCT TCT TTG AGC GGC GGC TTT TTC GGC 960 His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly 295 300 305 310

CCG AAG GGT GAG GAA TTG GGT TTC CGC TTT TTG AGC GAC GAT AAA AAA 1008 Pro Lys Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys 315 320 325

GTT GCG GTT GTC GGC AGC GCG AAA ACC CAA GAC AAA CCG GGA AAT GGC 1056 Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Gin Asp Lys Pro Gly Asn Gly 330 335 340

GCG GCG GCT TCA GAC GGC GAG GTG CGG CAG CAT CAA ACG GTG CGG CAG 1104 Ala Ala Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Gin His Gin Thr Val Arg Gin 345 350 355

CTA GAT GGC TCT GAA AAC GGT AAG CTG ACC ACG GTT TTG GAT GCG GTC 1152 Leu Asp Gly Ser Glu Asn Gly Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val 360 365 370

GAG CTG ACG CAC GGC GGC ACA GCA ATC AAA AAT CTC GAC AAC TTC AGC 1200 Glu Leu Thr His Gly Gly Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser 375 380 385 390

AAC GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT ATG ATT CCG CTC CCT GCC 1248 Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Pro Ala 395 400 405

GAG GCT TCC GAA AGT GGG AAC AAT CAA GCC AAT CAA GGT ACA AAT GGC 1296 Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly 410 415 420

GGA ACA GCC TTT ACC CGC AAA TTT GAC CAC ACG CCG AAA AGC GAT GAA 1344 Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu 425 430 435

AAA GAC ACC CAA GCA GGT ACG GCG GCG AAT GGC AAT CCA GCC GCT TCA 1392 Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser 440 445 450

AAT ACG GCA GGT GAT ACC AAT GGC AAA ACA AAA ACC TAT GAA GTC GAA 1440 Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu 455 460 465 470

GTC TGC TGT TCC AAC CTC AAT TAT CTG AAA TAC GGG TTG CTG ACG CGC 1488

Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg 475 480 485

AAA ACT GCC GGT AAC ACG GTG GGA AGC GGC AAC GGC AGC CCA ACC GCC 1536 Lys Thr Ala Gly Asn Thr Val Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Thr Ala 490 495 500

GCC GCC CAA ACG GAC GCG CAG AGT ATG TTC TTA CAA GGC GAG CGC ACC 1584 Ala Ala Gin Thr Asp Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr 505 510 515

GAT GAA AAA GAG ATT CCA AGC GAG CAA AAC GTC GTT TAT CGG GGG TCT 1632 Asp Glu Lys Glu Ile Pro Ser Glu Gin Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser 520 525 530

TGG TAC GGG CAT ATT GCC AAC AGC ACA AGC TGG AGC GGC AAT GCT TCC 1680 Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser 535 540 545 550

AAT GCA ACG AGT GGC AAC AAG GCG GAC TTT ACC GTG AAT TTT GGC GAG 1728 Asn Ala Thr Ser Gly Asn Lys Ala Asp Phe Thr Val Asn Phe Gly Glu 555 560 565

AAA AAA ATT ACC GGC ATG TTA ACC GCT GAA AAC AGG CAG GCG GCA ACC 1776 Lys Lys Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gin Ala Ala Thr 570 575 580

TTT ACC ATT GAG GGA ACG ATT CAG GGC AAC GGT TTT TCC GGT ACG GCA 1824 Phe Thr Ile Glu Gly Thr Ile Gin Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala 585 590 595

AAA ACT GCT GAC TCA GGC TTT GAT CTC GAT CAA AGC AAT ACC ACC GGC 1872 Lys Thr Ala Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Ser Asn Thr Thr Gly 600 605 610

ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA AAC GCC AAG GTG CAG GGC GGT TTT TAC 1920 Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asn Ala Lys Val Gin Gly Gly Phe Tyr 615 620 625 630

GGG CCT AAA GCC GAA GAA ATG GGT GGA TGG TTT GCT TAT CCG GGC GAC 1968 Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp 635 640 645

AGT CAG ACG CAG CGG TCC GCT TCG GGG TCA GGC GCA TCA GCC GCC AAC 2016 Ser Gin Thr Gin Arg Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ala Asn 650 655 660

AGC GCG ACC GTG GTA TTC GGT GCG AAA CGC CAA CAG CTT GTG CAA 2061

Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 665 670 675

TAA 2064

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 687 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: prot.ine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

Met Val Leu Pro Val Phe Leu Ser Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly -10 -5 1 5

Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala 10 15 20

Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Gin Lys Asp 25 30 35

Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr 40 45 50

Gin Lys Ala Asn Pro Lys Glu Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asn Asp 55 60 65 70

Trp Glu Gin Thr Asp Asn Gly Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gin Lys 75 80 85

Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro Gly Asn Asn Gly Gly Ala Thr Leu Gin 90 95 100

Asp Ser Ser Gin Glu Asn Gin Gly Ile Ser Lys Val Thr Asp Tyr His 105 110 115

Asn Phe Gin Tyr Val Trp Ser Gly Phe Phe Tyr Lys Gin Ile Lys Asn 120 125 130

Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro 135 140 145 150

Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Ser Arg Gin Leu Pro 155 160 165

Val Leu Gly Gin Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp 170 175 180

Val Lys Ile Asn Gin Lys Phe Ile Asp Leu Gly Asn Thr Ser Thr Lys 185 190 195

Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val 200 205 210

Asn Lys Asp Ser Asp Lys Lys Asp Gly His Val Ala Lys Gly Leu Thr 215 220 225 230

Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe Glu Lys Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu 235 240 245

Ile Lys Asn Asn Ser Val Ser Asn Asn Glu Phe Asn Ala Lys Tyr Thr 250 255 260

Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn Arg Phe Asn

265 270 275

Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr Lys Gin 280 285 290

His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly 295 300 305 310

Pro Lys Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys 315 320 325

Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Gin Asp Lys Pro Gly Asn Gly 330 335 340

Ala Ala Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Gin His Gin Thr Val Arg Gin 345 350 355

Leu Asp Gly Ser Glu Asn Gly Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val 360 365 370

Glu Leu Thr His Gly Gly Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser 375 380 385 390

Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Pro Ala 395 400 405

Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly 410 415 420

Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu 425 430 435

Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser 440 445 450

Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu 455 460 465 470

Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg 475 480 485

Lys Thr Ala Gly Asn Thr Val Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Thr Ala 490 495 500

Ala Ala Gin Thr Asp Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr 505 510 515

Asp Glu Lys Glu Ile Pro Ser Glu Gin Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser 520 525 530

Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser 535 540 545 550

Asn Ala Thr Ser Gly Asn Lys Ala Asp Phe Thr Val Asn Phe Gly Glu 555 560 565

Lys Lys Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gin Ala Ala Thr 570 575 580

Phe Thr Ile Glu Gly Thr Ile Gin Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala 585 590 595

Lys Thr Ala Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Ser Asn Thr Thr Gly 600 605 610

Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asn Ala Lys Val Gin Gly Gly Phe Tyr 615 620 625 630

Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp 635 640 645

Ser Gin Thr Gin Arg Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ala Asn 650 655 660

Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 665 670 675

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 198 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: IM2169

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

Thr Lys Asp Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly 1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30

Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys 35 40 45

Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60

Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80

Gin Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95

Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin 100 105 110

Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly

115 120 125

Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140

Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160

Ala Gly Gly Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu 165 170 175

Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190

Thr Asp Gin Asn Val Val 195

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 198 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: 6940

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

Thr Lys Asp Lys Thr Glu Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30

Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu 35 40 45

Val Gin Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60

Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn 65 70 75 80

Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95

Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin 100 105 110

Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly 115 120 125

Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140

Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160

Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu 165 170 175

Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190

Ser Glu Gin Asn Ile Val 195

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 198 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: 2223

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

Thr Lys Asp Lys Thr Glu Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30

Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu 35 40 45

Val Gin Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60

Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn 65 70 75 80

Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95

Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin 100 105 110

Ala Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly 115 120 125

Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140

Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160

Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Gly 165 170 175

Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190

Ser Glu Gin Asn Ile Val 195

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 198 acides amin, s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: C708

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

Thr Gin Asp Lys Pro Arg Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15

Ala Ala Arg Ser Asn Gly Ala Ala Gly Gin Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30

Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys 35 40 45

Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60

Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Lys Asn 65 70 75 80

Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95

Asn His Thr Pro Lys Ser Asp Glu Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Ala 100 105 110

Glu Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Ala Asn Gly 115 120 125

Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140

Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin

145 150 155 160

Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Gly 165 170 175

Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190

Asn Asp Gin Asn Val Val 195

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 211 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: M978

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

Thr Gin Asp Lys Ala Ala Asn Gly Asn Thr Ala Ala Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15

Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn 20 25 30

Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp 35 40 45

Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val 50 55 60

Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ser Gly 65 70 75 80

Ser Asn Gin Ala Asp Lys Gly Lys Lys Gly Lys Asn Gly Lys Asn Gly 85 90 95

Gly Thr Asp Phe Thr Tyr Lys Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Asp Asp 100 105 110

Lys Asp Thr Lys Ala Gin Thr Gly Ala Ala Gly Ser Ser Gly Ala Gin 115 120 125

Thr Asp Leu Gly Lys Ala Asp Val Asn Gly Gly Lys Ala Glu Thr Lys 130 135 140

Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr 145 150 155 160

Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin Ala Gly Gly 165 170 175

Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 180 185 190

Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gin 195 200 205

Asn Val Val 210

12) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 200 acides amin, s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: 1610

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

Lys Arg Asp Lys Ala Glu Ser Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15

Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn 20 25 30

Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Ser Gly Gly 35 40 45

Lys Glu Val Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val 50 55 60

Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly 65 70 75 80

Asn Thr Gin Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Lys Phe Thr Arg 85 90 95

Lys Phe Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly 100 105 110

Thr Gin Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr 115 120 125

Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu 130 135 140

Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr 145 150 155 160

Gly Glu Gly Gly Asn Gly Ser Gin Thr Ala Ala Ala Gin Thr Ala Gin 165 170 175

Gly Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu 180 185 190

Ile Pro Ser Glu Gin Asn Val Val 195 200

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 200 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: 867

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

Thr Lys Asp Lys Pro Arg Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Gly Lys 20 25 30

Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys 35 40 45

Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Ser 50 55 60

Gly Ile Met Ile Pro Leu Met Pro Glu Thr Ser Glu Ser Gly Asn Asn 65 70 75 80

Gin Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95

Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Pro 100 105 110

Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Gly Thr Ala Gly Val Thr Gly Gly 115 120 125

Gin Ala Gly Lys Thr Tyr Ala Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn 130 135 140

Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Asp Asn Thr Val 145 150 155 160

Gly Ser Gly Asn Gly Ser Ser Thr Ala Ala Ala Gin Thr Ala Gin Gly

165 170 175

Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile 180 185 190

Pro Lys Glu Gin Gin Asp Ile Val 195 200

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 198 acides amin, s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: S3032

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

Thr Lys Asp Lys Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ala Glu Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15

Thr Asp Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn 20 25 30

Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr His Gly Gly 35 40 45

Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val 50 55 60

Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Gin Asn Ser Thr Gly Lys 65 70 75 80

Asn Asn Gin Pro Asp Gin Gly Lys Asn Gly Gly Thr Ala Phe Ile Tyr 85 90 95

Lys Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Asp Asp Lys Asp Thr Lys Ala Gin 100 105 110

Thr Val Thr Gly Gly Thr Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Ala 115 120 125

Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu 130 135 140

Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr 145 150 155 160

Val Gly Ser Gly Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Ala Gin Thr Asp Ala 165 170 175

Gln Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Asn Lys Ile Pro 180 185 190

Ser Glu Gin Asn Val Val 195

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 195 acides amin,s

(B) TYPE: acide amin,

(C) NOMBRE DE BRINS:

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: N. meningitidis

(B) SOUCHE: 891

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

Thr Lys Asp Lys Pro Gly Asn Gly Ala Arg Leu Gin Ala Ala Arg Cys 1 5 10 15

Gly Thr Ser Asn Gly Ala Ala Gly Gin Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu 20 25 30

Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu Val 35 40 45

Gin Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly 50 55 60

Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Lys Asn Gin 65 70 75 80

Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Glu Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu 85 90 95

His Thr Pro Glu Ser Asp Glu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Pro Ser 100 105 110

Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys 115 120 125

Thr Lys Thr Tyr Glu Val Asn Leu Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys 130 135 140

Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr Gly Glu Gly Gly 145 150 155 160

Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Gin Thr Ala Gin Gly Ala Gin Ser Met 165 170 175

Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gin 180 185 190

Asn Val Val 195

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 29 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AAACCCGGAT CCGTTGCCAG CGCTGCCGT 29

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 85 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: TTTTTTCATG AGATATCTGG CAACATTGTT GTTATCTCTG GCGGTGTTAA TCACCGCCGG 60 GTGCCTGGGT GGCGGCGGCA GTTTC 85

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 30 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:

GTGTTTTTGT TGAGTGCATG CCTGGGTGGC 30

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 40 paires de bases

(B) TYPE: nucl,otιde

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(11) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomιque)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: TGCGCAAGCT TACAGTTTGT CTTTGGTTTT CGCGCTGCCG ₄ 0

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 40 paires de bases

(B) TYPE: nucl,otιde

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: AAAAAGCATG CATAAAAACT ACGCGTTACA CCATTCAAGC 40

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR- 39 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE. SEQ ID NO: 21: TATATAAGCT TACGTTGCAG GCCCTGCCGC GTTTTCCCC 39

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:

(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 29 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomιque)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO ^• 22'

CCCGAATTCT GCCGTCTGAA GCCTTATTC 29

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 28 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: CCCGAATTCT GCTATGGTGC TGCCTGTG 28

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 30 paires de bases

(B) TYPE: nucl,otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24: CGCATCCAAA ACCGTACCTG TGCTGCCTGA 30

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 30 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: TTTATCACTT TCCGGGGGCA GGAGCGGAAT 30

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:

(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 30 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: GTTGGAACAG CAGACAGCGG TTTGCGCCCC 30

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 30 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: GAACATACTT TGTTCGTTTT TGCGCGTCAA 30

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 30 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: CCACGGATCC TGCCGTCTGA AGCCTTATTC 30

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 19 paires de bases

(B) TYPE: nucl.otide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: lin,aire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29: CGCGGATCCT GCTATGGTG 19