本発明は、血管新生の促進において配列� ��号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列で表され� ��タンパク質を用いることに大きな特徴を有� ��、本発明の血管新生促進剤としては、配列� ��号2、4、6、8及び10からなる群より選ばれる� ��ミノ酸配列で表されるポリペプチドからな� ��促進剤(態様1)と配列番号2、4、6、8及び10か� ��なる群より選ばれるアミノ酸配列で表され� ��ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ� ��、即ち、配列番号1、3、5、7及び9からなる� �より選ばれる塩基配列で表されるポリヌク� �オチドを含有してなるベクターからなる促� �剤(態様2)が例示され、共に血管新生を促進� �る観点から使用される。なお、配列番号2の� ��ミノ酸配列で表されるポリペプチドは、WO20 06/073052において、バソヒビン(Vasohibin)のバリ� ��ントとして報告されているAK022567タンパク� �(バリアント1)である。配列番号4、6、8及び10 のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、 WO2006/073052において、前記バリアント1の4つの スプライシングバリアントであり、それぞれ 、バリアント2、3、4及び5として報告されて� �る。これらのバリアントはバソヒビンと相� �性が高いものであることが既に知られてい� �。また、バソヒビンは、腫瘍細胞や間質細� �、マクロファージなどから分泌される血管� �生促進因子(VEGF、FGF-2等)により血管内皮細胞 に発現し、内皮細胞自身にオートクライン的 に作用して、血管新生を抑制する物質である 。従って、バリアント1~5は、バソヒビンと相 同性が高いことから血管新生抑制に関して優 れた効果を奏するものと期待されたが、驚く べきことに、低酸素状態のマウス血管新生モ デルに該バリアントのポリヌクレオチドを尾 静脈より投与して発現させると逆に血管新生 が促進されることが見出され、かかるバリア ントあるいは該遺伝子を体外より投与するこ とにより、さらに強く血管新生を促進するこ とができると考えられた。

 バソヒビンにはバソヒビン1及びバソヒビ ン2が存在し、WO02/090546、WO2006/073052等に開示� �れているように、バソヒビン1とバソヒビン2 は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子で あるが、それらの遺伝子がコードするタンパ ク質のアミノ酸配列は58%の相同性を有してお り、共に血管新生に対する抑制活性を有する 。本発明における配列番号2、4、6、8又は10の アミノ酸配列で表されるポリペプチド、及び 配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列で表され� ��ポリヌクレオチドによりコードされるタン� ��ク質はバソヒビン2のバリアントに含まれる 。

 本発明におけるポリペプチドとしては、� ��列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列から� ��るポリペプチド(以下、それぞれ、バリアン ト1、2、3、4、5ともいう)、前記アミノ酸配列 において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、� �換もしくは付加されたアミノ酸配列からな� �、かつ血管新生促進作用を有するポリペプ� �ド、及びそれらの誘導体、ならびにそれら� �塩が例示される。

 本明細書中において、「ポリペプチドの� ��導体」とは、例えば、ポリペプチドをアセ� ��ル化、パルミトイル化、ミリスチル化、ア� ��ド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン� ��、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、� ��ンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、� ��トロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環� ��化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチ� ��化、トリメチル化、グアニジル化、アミジ� ��化、マレイル化、トリフルオロアセチル化� ��カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニ� ��ロトロポニル化、ポリエチレングリコール� ��又はアセトアセチル化した誘導体等をいう� ��これらの中でもN末端のアセチル化、C末端� �アミド化、C末端のメチル化は、末端からポ� ��ペプチドを分解するエキソペプチダーゼに� ��する抵抗性が付与され、また、グリコシル� ��またはポリエチレングリコール化によって� ��生体中における安定性が高くなることが期� ��されるので好ましい。

 本明細書において、「塩」とは、ポリペ� ��チド又はそれらの誘導体の薬理学的に許容� ��れる任意の塩(無機塩及び有機塩を含む)を� �い、例えば、ポリペプチド又はそれらの誘� �体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウ� �塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩� �塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩(酢� ��塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸� ��、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマ� ��酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸� ��、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等) 等が挙げられる。これらの中でも、好ましく は、ナトリウム塩、カリウム塩、燐酸塩が望 ましい。

 上記ポリペプチドは、公知の方法に準じ� ��調製することができ、例えば、WO02/090546、WO 2006/073052等に開示された方法に従って調製す� ��ことができる。

 また、上記ポリペプチドの誘導体は、当� ��分野で公知の方法により、作製され得る。� ��た、上記ポリペプチドの塩も、当該分野で� ��知の任意の方法により、当業者によって容� ��に作製され得る。

 本発明におけるポリヌクレオチドとして� ��、配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列から� �るポリヌクレオチド、より詳細には、配列� �号1の351番目のAから1223番目のGで表される塩� ��配列、配列番号3の311番目のAから1246番目のG で表される塩基配列、配列番号5の327番目のA� ��ら836番目のAで表される塩基配列、配列番号 7の300番目のAから770番目のAで表される塩基配 列又は配列番号9で表される塩基配列からな� �ポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオ� �ド又はそれらの相補鎖とストリンジェント� �条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレ� �チドであって、かつ、血管新生促進作用を� �するポリペプチドをコードするポリヌクレ� �チドが、例示される。

 ここでいう「ストリンジェントな条件下� ��ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」� ��は、ポリヌクレオチドの断片をプローブと� ��て、当該分野において周知慣用な手法、例� ��ば、コロニーハイブリダイゼーション法、� ��ラークハイブリダイゼーション法あるいは� ��ザンブロットハイブリダイゼーション法な� ��を用いることにより得られるポリヌクレオ� ��ドを意味し、具体的には、コロニーあるい� ��プラーク由来のポリヌクレオチドを固定化� ��たメンブランを用いて、0.7~1.0MのNaCl存在下� ��65℃でハイブリダイゼーションを行った後� �0.1~2倍濃度のSSC(Saline Sodium Citrate:150mM 塩化� ��トリウム、15mM クエン酸ナトリウム)溶液を 用い、65℃でメンブランを洗浄することによ� ��同定できるポリヌクレオチドを意味する。� ��イブリダイゼーションは、Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbo r Laboratory Press)、Current Protocols in Molecular B iology(1994)(Wiley-Interscience)、DNA Cloning 1:A Practi cal Approach Core Techniques,Second Edition(1995)(Oxford  University Press)などに記載されている方法に� ��じて行うことができる。ここで、ストリン� ��ェントな条件でハイブリダイズする配列か� ��は、好ましくは、アデニン(A)又はチミン(T)� ��みからなる配列は除外される。

 本明細書において「ハイブリダイズしう� ��ポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダ� ��ズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリ� ��イズすることができるポリヌクレオチドを� ��う。そのようなポリヌクレオチドとして、� ��体的には、配列番号2の塩基配列で表される ポリヌクレオチドと少なくとも60%以上、好ま しくは80%以上、より好ましくは95%以上の相同 性を有するポリヌクレオチドを挙げることが できる。なお、本明細書において、相同性は 、例えば、Altschulら(The Journal of Molecular Biol ogy,215,403-410(1990))の開発したアルゴリズムを� �用した検索プログラムBLASTを用いることによ り、スコアで類似度が示される。

 上記ポリヌクレオチドは、公知の方法に� ��じて調製することができ、例えば、WO02/09054 6に開示された方法に従って調製することが� �きる。また、アミノ酸配列に基づいて、該� �リペプチドやポリペプチドをコードするDNA� �化学合成することによっても調製すること� �できる。DNAの化学合成は、チオホスファイ� �法を利用した島津製作所社製のDNA合成機、� �ォスフォアミダイト法を利用したパーキン� �エルマー社製のDNA合成機model392などを用いて 行うことができる。

 態様1の促進剤は、実質的に、前記バリア ント1、2、3、4又は5により構成され、態様2の 促進剤は前記バリアント1、2、3、4又は5をコ� ��ドするポリヌクレオチドを含有してなるベ� ��ターにより構成される。

 ベクターは、宿主細胞において自立複製� ��能であると同時に、プロモーター、リボソ� ��ム結合配列、バリアント1、2、3、4又は5を� �ードする遺伝子、転写終結配列により構成� �れていることが好ましい。また、プロモー� �ーを制御する遺伝子が含まれていてもよい� �本発明に用いられる好適なベクターとして� �、後述するベクターが挙げられる。

 上記ベクターは、公知の方法に準じて調� ��することができ、例えば、WO02/090546、WO2006/0 73052等に開示された方法に従って調製するこ� ��ができる。

 本発明の促進剤は、バリアント1、2、3、4 又は5が循環血中を介して送達された部位に� �血管新生の促進作用を奏することから、静� �内に投与されることが好ましい。

 本発明はまた、前記本発明の促進剤を含� ��してなる、血管新生促進作用を要する疾患� ��治療用医薬組成物、即ち、治療剤を提供す� ��。

 本発明において、治療に血管新生促進作� ��を要する疾患としては、血管新生を促進す� ��ことにより治療効果がみられる疾患であれ� ��特に限定はないが、例えば、閉塞性末梢血� ��疾患、虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、� ��ージャー病、脳血管障害、間歇性跛行等が� ��示される。なかでも、閉塞性動脈硬化症に� ��本発明の治療剤の適用が期待される。

 本発明の治療剤としては、本発明の促進� ��を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化� ��たものが挙げられる。また、本発明の治療� ��としては、バリアント1、2、3、4又は5を前� �バリアントと同じ用途に使用可能な他の成� �、例えば公知の血管新生を促進する作用を� �する成分、例えばVEGFなどと配合することも� ��きる。

 本発明の治療剤の製造は、前記バリアン� ��が循環血中を介して血管新生促進作用を要� ��る部位に到達できるような剤型を製造でき� ��のであれば、通常、本発明の促進剤を薬学� ��に許容できる液状又は固体状の担体と配合� ��ることにより行われ、所望により溶剤、分� ��剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結� ��剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆� ��剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤� ��、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とする� ��とができる。また、使用前に適当な担体の� ��加によって液状となし得る乾燥品や、その� ��、外用剤とすることもできる。なお、医薬� ��担体は、治療剤の投与形態及び製剤形態に� ��じて選択することができ、特に限定はない� ��本明細書において、血管新生促進作用を要� ��る部位とは、上記血管新生促進作用を要す� ��疾患の発症部位を意味する。

 上記のような各種製剤形態での治療剤は� ��それぞれ公知の医薬用担体などを利用して� ��適宜、常法により製造することができる。� ��た、かかる治療剤における本発明の促進剤� ��含有量は、その投与形態、投与方法などを� ��慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ� ��るような量であればよく、特に限定される� ��のではない。本発明の治療剤中の本発明の� ��進剤の含有量としては通常1~100重量%程度で� ��る。

 本発明の治療剤は、製剤形態に応じた適� ��な投与方法で投与される。投与方法も前記� ��リアントを循環血中を介して送達できるの� ��あれば特に限定はなく、例えば内用、外用� ��び注射により投与することができる。本発� ��の治療剤を注射により投与する場合は、た� ��えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投� ��し得、外用により投与する場合は、たとえ� ��、座剤等の外用剤として、その適する投与� ��法により投与すればよい。

 本発明の治療剤の投与量は、その製剤形� ��、投与方法、使用目的及び当該治療剤の投� ��対象である患者の年齢、体重、症状によっ� ��適宜設定され一定ではない。また、投与は� ��所望の投与量範囲内において、1日内におい て単回で、又は数回に分けて行ってもよい。 投与期間も任意である。

 本発明はまた、血管新生促進作用を要す� ��疾患の治療剤の製造のための、バリアント1 、2、3、4又は5の使用、及び該バリアントを� �ードするポリヌクレオチドの使用を提供す� �。ならびに、本発明は、血管新生促進作用� �要する疾患の治療又は予防に使用するため� �バリアント1、2、3、4又は5、及び該バリアン トをコードするポリヌクレオチドを提供する 。

 本発明はまた、被験体に、バリアント1、 2、3、4又は5を投与する工程を含む、血管新� �促進作用を要する疾患の治療方法を提供す� �。

 本明細書中において被験体とは、好まし� ��は血管新生促進作用を必要とするヒトであ� ��が、ペット動物等であってもよい。

 また、本明細書中において有効量とは、� ��リアント1、2、3、4又は5を上記被験体に投� �した場合に、かかるバリアントを投与して� �ない被験体と比較して、血管新生促進作用� �発揮する前記バリアントの量である。具体� �な有効量としては、投与形態、投与方法、� �用目的及び被験体の年齢、体重、症状等に� �って適宜設定され一定ではない。

 本発明の血管新生促進作用を要する疾患� ��治療方法においては、有効量のバリアント1 、2、3、4又は5をそのまま上記被験体に投与� �てもよく、また、上記のような治療剤等の� �薬として投与してもよい。また、投与方法� �も限定はなく、例えば、上記の医薬と同様� �、経口投与や注射等により投与すればよい� �

 本発明の治療方法によれば、前記の本発� ��の治療剤の対象となる疾患を治療すること� ��でき、例えば、血管新生促進作用を要する� ��患の治療を行う効果が発揮され得る。

 また、本発明のバリアント1、2、3、4又は 5をコードするポリヌクレオチドを含有して� �るベクターからなる血管新生促進剤は、血� �新生促進作用を要する疾患の患者における� �伝子治療に使用することができる。

 本発明のベクターからなる促進剤の患者� ��の導入方法としては、該促進剤を直接体内� ��導入するin vivo法及びヒトからある種の細� �を取り出して体外でDNAを該細胞に導入し、� �の細胞を体内に戻すex vivo法がある[日経サ� �エンス、4月号、20-45(1994)、月間薬事、36、23- 48(1994)、実験医学増刊、12、15(1994)]。本発明� �は、in vivo法が好ましい。

 in vivo法により投与する場合は、治療目� �の疾患、標的臓器などに応じた適当な投与� �路により投与される。例えば、病変の認め� �れる組織に直接局所投与するか又は静脈、� �脈、皮下、筋肉内、腹腔内、内視鏡的、エ� �ロゾル的等により投与することも可能であ� �。投与方法としては静脈内又は腹腔内投与� �好ましい。また、病変の見られる組織の直� �注射も好ましい。核磁気共鳴撮像又はコン� �ューター断層撮影等の当該技術分野で利用� �きる任意のものを使用して病変の見られる� �織を撮影し、例えば、定位注射により本発� �のベクターからなる促進剤を投与すること� �できる。

 本発明のベクターからなる促進剤を遺伝� ��治療用ベクターとして用いる場合、前記促� ��剤の形態としては、上記の各投与形態にあ� ��た種々の製剤形態をとることができる。例� ��ば、有効成分であるバリアント1、2、3、4又 は5をコードするDNAを含有する注射剤とした� �合、当該注射剤は常法により調製すること� �できる。遺伝子治療剤に用いる基剤として� �、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に� �限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は� �化ナトリウムと無機塩等との混合物の塩溶� �、マンニトール、ラクトース、デキストラ� �、グルコース等の溶液、グリシン、アルギ� �ン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶� �とグルコース溶液との混合溶液等が挙げら� �得る。また、常法に従い、これらの基剤に� �透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等 の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界 面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、 溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製し てもよい。これらの注射剤を粉末化、凍結乾 燥等の操作により用事溶解用製剤とすること もできる。

 前記製剤中のバリアント1、2、3、4又は5� �コードするDNAの含有量は、治療目的の疾患� �投与部位、投与回数、所望治療期間、患者� �年齢、体重等により異なり、適宜調整する� �とができるが、通常患者(体重60kgとして)に� �いては、一般に、前記バリアントをコード� �るDNAの重量にして約0.01~2000mg、好ましくは0.1 ~100mgである。

 以下に、バリアント1~5の作製方法および� ��伝子治療用ベクターの作成方法等を具体的� ��記載する。

(1)バリアント1~5の作製方法
 バリアント1~5は、Molecular Cloning:A Laboratory  Manual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbor Laborator y Press)、Current Protocols in Molecular Biology(1994) (Wiley-Interscience)等に記載された方法等を用い� ��例えば、以下の方法により、バリアント1、 2、3、4又は5の遺伝子を宿主細胞中で発現さ� �、作製することができる。

 バリアント1、2、3、4又は5のタンパク質� �コードする全長DNAを基にして、必要に応じ� �、該タンパク質をコードする部分を含む適� �な長さのDNA断片を調製する。また、該タン� �ク質をコードする部分の塩基配列を、宿主� �発現に最適なコドンとなるように、塩基を� �換したDNAを調製する。該DNAは該タンパク質� �生産率を向上させるうえで有用である。該DN A断片、又は全長DNAを適当な発現ベクターの� �ロモーターの下流に挿入することにより、� �換え体DNA(発現用プラスミド)を作製する。該 発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合 した宿主細胞に導入することにより、バリア ント1、2、3、4又は5を生産する形質転換体を� ��ることができる。

 宿主細胞としては、原核細胞、動物細胞� ��昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現でき� ��ものであればいずれも用いることができる� ��発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお� ��て自立複製が可能、又は染色体中への組込� ��が可能で、バリアント1、2、3、4又は5をコ� �ドする遺伝子の転写に適した位置にプロモ� �ターを含有しているものが用いられる。

(i)原核生物を宿主として用いる場合
 バリアント1、2、3、4又は5タンパク質の発� �ベクターは、原核生物中で自立複製可能で� �ると同時に、プロモーター、リボソーム結� �配列、前記バリアントをコードする遺伝子� �転写終結配列より構成されていることが好� �しい。プロモーターを制御する遺伝子が含� �れていてもよい。

 発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、p BTac1、pBTac2(ロシュダイアグノスティックス社 製)、Bluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)(スト ラタジーン社製)、pSTV28、pUC118、pUC19(宝酒造� �製)、pKK233-2(アマシャムバイオサイエンス社� ��)、pSE280、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus(イ� ��ビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)� �pQE-8(キアゲン社製)、pGEX(ファルマシア社製)� ��pETシステム(ノバジェン社製)、pMAL-c2(New Engl and Biolabs社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200(A gricultural Biological Chemistry,48,669(1984))、pLSA1(Agr icultural Biological Chemistry,53,277(1989))、pGEL1(Proce eding of the National Academy of Sciences USA,82,4306 (1985))、pEG400(Journal of Bacteriology,172,2392(1990))� �pTrs30(FERM BP-5407)、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM� �BP-400)、pGKA2(FERM B-6798)、pPA1(特開昭63-233798)、 pTerm2(特開平3-22979、US4686191、US4939094、US5160735) 等を例示することができる。

 プロモーターとしては、大腸菌等の宿主� ��胞中で発現できるものであればいかなるも� ��でもよい。例えば、trpプロモーター(Ptrp)、l acプロモーター(Plac)、PLプロモーター、PRプロ モーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やフ ァージ等に由来するプロモーター、SPO1プロ� �ーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター 等をあげることができる。またPtrpを2つ直列� ��せたプロモーター(Ptrpx2)、tacプロモーター� �lacT7プロモーター、letIプロモーターのよう� �人為的に設計改変されたプロモーター等も� �いることができる。

 また、リボソーム結合配列であるシャイ� ��-ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと� �間を適当な距離、例えば、6~18塩基に調節し� ��プラスミドを用いることが好ましい。バリ� ��ント1~5の遺伝子の発現において転写終結配� ��は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直� ��に転写終結配列を配置することが好ましい� ��

 宿主細胞としては、Escherichia属、Serratia属 、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Mi crobacterium属、Pseudomonas属等の原核生物が挙げ� ��れ、Escherichia属としてE.coliのXL1-Blue株、XL2-Bl ue株、DH1株、MC1000株、KY3276株、W1485株、JM109株 、HB101株、No.49株、W3110株、NY49株、BL21(DE3)株� �BL21(DE3)pLysS株、HMS174(DE3)株及びHMS174(DE3)pLysS株 等が、Serratia属として、S.ficaria株、S.fonticola� �、S.liquefaciens、S.marcescens株等が、Bacillus属と� ��て、B.subtilis株、B.amyloliquefaciens株等が、Brevi bacterium属として、B.ammoniagenes株、B.Immariophilum( ATCC:14068)株、B.saccharolyticum(ATCC:14066)株等が、Co rynebacterium属として、C.glutamicum(ATCC:13032)株、C. glutamicum(ATCC:14067)株、C.gulutamicum(ATCC:13869)株、C .acetoacidophilum(ATCC:13870)株等が、Microbacterium属� �して、M.ammoniaphilum(ATCC:15354)株等が、Pseudomonas 属として、S.mephitica株等が例示される。

 発現用プラスミドの導入方法としては、� ��記宿主細胞へDNAを導入する方法であればい� ��れも用いることができ、例えば、エレクト� ��ポレーション法(Nucleic Acids Research,16,6127(198 8))、リン酸カルシウム法(Proceedings of the Nati onal Academy of Sciences,USA,69,2110(1972))、プロト� �ラスト法〔特開昭63-2483942、Gene,17,107(1982)やMo lecular & General Genetics,168,111(1979)〕に記載� ��方法等が挙げられる。

(ii)動物細胞を宿主として用いる場合
 宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベ� ��ターとして、例えば、pcDNA1/Amp、pcDNA1、pCDM8� ��pREP4(インビトロジェン社製)、pHM6(ロシュダ� ��アグノスティクス社製)、pKK223-3、pGEX(アマ� �ャムバイオサイエンス社製)、pAGE107(Cytotechnol ogy,3,133(1990))、pAGE103(The Journal of Biochemistry,10 1,1307(1987))、pAMo、pAMoA(pAMoPRSA)(The Journal of Bio logical Chemistry,268,22782-22787(1993))、pAS3-3(特開平 2-22705)等を用いることができる。

 プロモーターとしては、宿主中で発現で� ��るものであればいずれも用いることができ� ��例えば、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)のI E(Immediate-early)遺伝子のプロモーター、SV40の� �期プロモーター、モロニー株マウス白血病� �イルス(Moloney Murine Leulemia Virus)のロング・� ��ーミナル・リピート・プロモーター(Long Ter minal Repeat Promoter)、レトロウイルスのプロモ ーター、HSPプロモーター、SRαプロモーター� �びメタロチオネインのプロモーター等を挙� �ることができる。また、hCMVのIE遺伝子のエ� �ハンサーをプロモーターと共に用いてもよ� �。

 宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由� ��株細胞のHEK293(ヒト胎児腎細胞、ATCC:CRL-1573)� ��Namalwa(バーキットリンパ腫、ATCC:CRL-1432)、HeL a(子宮頚部癌細胞、ATCC:CCL-2)、HBT5637(白血病細 胞、特開昭63-299)、BALL-1(白血病細胞)及びHCT-15 (大腸癌細胞);マウス由来株細胞のSp2/0-Ag14(マ� ��ス骨髄種細胞、ATCC:CRL-1581)及びNSO(マウス骨� ��種細胞);サル由来株細胞のCOS-1(アフリカミ� �リザル腎細胞(SV40形質転換細胞)、ATCC:CRL-1650) 及びCOS-7(アフリカミドリザル腎細胞(SV40形質� ��換細胞)、ATCC:CRL-1651);ハムスター由来株細胞 のCHO-K1(チャイニーズハムスター卵巣細胞、AT CC:CCL-61)及びBHK-21(C-13)(シシリアンハムスター� ��腎細胞、ATCC:CCL-10);ラット由来株細胞のPC12(� ��腎褐色細胞腫、ATCC:CRL-1721)及びYB2/0(ラット� �髄種細胞、ATCC:CRL-1662)等を例示することがで きる。

 発現用プラスミドの導入方法としては、� ��主にDNAを導入する方法であればいずれも用� ��ることができ、例えば、エレクトロポレー� ��ョン法(Cytotechnology,3,133,(1990))、リン酸カル� �ウム法(特開平2-22705)、リポフェクション法(P roceedings of the National Academy of Sciences,USA,84, 7413(1987)、Virology,52,456(1973))が挙げられる。

(iii)昆虫細胞を宿主として用いる場合
 宿主として昆虫細胞を用いる場合、発現ベ� ��ターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlue BacIII、pFASTBac1(インビトロジェン社製)等が、� ��染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ� ��昆虫に感染するバキュロウイルス(Vaculovirus) Autographa california nuclear polyhedrosis virus(AcMNPV) Bac-N-Blue DNA等が挙げられる。昆虫細胞の形質 転換の方法は、例えば、Baculovirus Expression Ve ctor:A Laboratory Manual(1992)(W.H.Freeman and Company)� ��Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1 989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Current Pro tocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)、B iotechnology,6,47(1988)等に記載の方法が用いられ� ��。

 昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含む発現� ��クター及び昆虫細胞への感染用のバキュロ� ��イルスDNAを添加し、組換えにより作製され� ��目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞� ��感染することによりバリアント1、2、3、4又 は5を発現することができる。

 宿主に用いる昆虫細胞としては、Spodoptera  frugiperda(ヨトウガ)由来株細胞、Trichoplusia ni (イラクサキンウワバ)由来株細胞等が挙げら� ��、具体的には、S.frugiperda由来細胞としては� ��Sf9(ATCC:CRL-1711、卵巣細胞)、Sf21(卵巣細胞)等� ��、T.ni由来細胞株としては、High Five、BTI-TN-5 B1-4(卵細胞、インビトロジェン社製)等が例示 される。

 発現用プラスミドの導入方法としては、� ��主に導入できる方法であればいずれも用い� ��ことができ、例えば、リン酸カルシウム法( 特開平2-22705)、リポフェクション法(Proceedings� �of the National Academy of Sciences USA,84,7413(1987) )等を挙げることができる。リポフェクショ� �法では、CELLFECTIN試薬(インビトロジェン社)� �用いることができる。また、動物細胞と同� �に、エレクトロポレーション法(Cytotechnology,3 ,133(1990))等も用いることができる。

(iv)形質転換体の培養方法
 バリアント1、2、3、4又は5をコードするDNA� �組み込んだ発現用プラスミドを保有する形� �転換体が、大腸菌、動物細胞等の細胞の場� �、各種宿主に適した通常の培養方法に従っ� �培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、� �質転換体又は培養液より該タンパク質を回� �することにより、該タンパク質を作製する� �とができる。形質転換体が、動物個体又は� �物個体の場合、各種宿主に適した通常の生� �方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク� �を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個� �より該タンパク質を回収することにより、� �タンパク質を作製することができる。

 宿主が動物個体の場合、例えば、バリア� ��ト1、2、3、4又は5をコードする遺伝子を保� �する非ヒトトランスジェニック動物を飼育� �、該プラスミドのコードするバリアントを� �動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中か� �該タンパク質を回収することにより、バリ� �ント1、2、3、4又は5を作製することができる 。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例 えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げる ことができる。

 宿主が大腸菌等の原核生物である場合、� ��えば、バリアント1、2、3、4又は5をコード� �る遺伝子を保有する形質転換体を培地中で� �養し、該プラスミドのコードするバリアン� �を培養液に産生・蓄積させ、該培養液から� �タンパク質を回収することにより、バリア� �ト1、2、3、4又は5を作製することができる。

 バリアント1、2、3、4又は5の形質転換体� �培地で培養する方法は、宿主の培養に用い� �れる通常の方法に従って行うことができる� �

 得られた形質転換体を培養する培地とし� ��は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、� ��機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効� ��的に行える培地であれば天然培地、合成培� ��のいずれを用いてもよい。

 炭素源としては、それぞれの微生物が資� ��し得るものであればよく、グルコース、フ� ��クトース、スクロース、これらを含有する� ��蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物� ��の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機� ��、エタノール、プロパノール等のアルコー� ��類を用いることができる。

 窒素源としては、アンモニア、塩化アン� ��ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニ� ��ム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や� ��機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質� ��並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス� ��コーンスチープリカー、カゼイン加水分解� ��、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵� ��体及びその消化物等を用いることができる� ��

 無機塩としては、リン酸第一カリウム、� ��ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、� ��酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第� ��鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ� ��等を用いることができる。培養は、振盪培� ��又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で� ��う。

 形質転換体が大腸菌等の原核生物である� ��合、かかる培地としては、例えば、バクト� ��リプトン、イーストエクストラクト及び塩� ��ナトリウムを含むYT培地が好ましい。

 培養温度は15~40℃がよく、培養時間は、� �常5時間~7日間である。培養中pHは、3.0~9.0に� �持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸 、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、ア ンモニア等を用いて行う。また培養中必要に 応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等 の抗生物質を培地に添加してもよい。

 プロモーターとして誘導性のプロモータ� ��を用いた発現ベクターで形質転換した微生� ��を培養するときには、必要に応じてインデ� ��ーサーを培地に添加してもよい。例えば、l acプロモーターを用いた発現ベクターで形質� ��換した形質転換体を培養するときにはイソ� ��ロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、t rpプロモーターを用いた発現ベクターで形質� ��換した形質転換体を培養するときにはイン� ��ールアクリル酸等を培地に添加してもよい� ��

 バリアント1、2、3、4又は5作製用形質転� �体が動物細胞である場合、該細胞を培養す� �培地は、一般に使用されているRPMI1640培地(Th e Journal of the American Medical Association,199,519( 1967))、MEM培地(Science,130,432(1959))、D-MEM培地(Viro logy,8,396(1959))、199培地(Proceedings of the Society� �for the Biological Medicine,73,1(1950))又はこれら� �地に牛胎児血清(FCS)等を添加した培地等が用 いられる。

 培養は、通常pH6~8、25~40℃、5% CO ₂ 存在下等の条件で1~7日間行う。また培養中必 要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ス トレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加 してもよい。

 形質転換体が昆虫細胞である場合、培養� ��る培地としては、一般に使用されているTNM- FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900II SFM培� ��(インビトロジェン社製)、ExCell400、ExCell405(J RHバイオサイエンシーズ社製)、Grace’s InsectM edium(Nature,195,788(1962))等を用いることができる 。

(v)作製方法
 バリアント1、2、3、4又は5は、形質転換体� �培養し、培養液から前記バリアントを単離� �精製することにより作製することができる� �バリアントの単離・精製方法は、当該分野� �おいて周知慣用の常法により行うことがで� �、例えば、酵素の単離・精製方法やSandlerら� ��糖転移酵素の精製方法(Methods in Enzymology,83, 458)を用いることができる。

 バリアント1、2、3、4又は5が溶解性ポリ� �プチドとして産生・蓄積される場合、上記� �ように形質転換体を培養した培養液を、例� �ば、遠心分離等の方法で細胞又は菌体と培� �に分離する。バリアント1、2、3、4又は5が宿 主細胞内に存在する場合、採取した細胞又は 菌体をSTE溶液等の適当な緩衝液で洗浄した後 、超音波、フレンチプレス、マントンガウリ ンホモジナイザー、ダイノミル等で細胞又は 菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞 溶液として得ることができる。

 バリアント1、2、3、4又は5の分離・精製� �用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれ� �いてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリ� �ム(SDS)やN-ラウロイルサルコシンナトリウム( サルコシル)等を含んでいてもよい。

 得られた粗精製物に含まれる目的タンパ� ��質の分離・精製方法は自体公知の各種分離� ��精製方法を組み合わせて行うことができる� ��これらの公知の方法としては、例えば、溶� ��抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法� ��透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過� ��、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セ ファロースクロマトグラフィー、DIAION HPA-75( 三菱化学社製)等のリジンを用いた陰イオン� �ロマトグラフィーやイオン交換クロマトグ� �フィー、S-Sepharose FF(GE Healthcare社製)等のリ� ��ンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、� ��チルセファロース等の疎水性クロマトグラ� ��ィーやアフィニティークロマトグラフィー� ��の各種クロマトグラフィー法、SDS-ポリアク リルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動 法等の各種電気泳動法等が例示される。アフ ィニティークロマトグラフィーは、バリアン ト1、2、3、4又は5に対する抗体を用いること� ��よっても行うことができる。

 バリアント1、2、3、4又は5が不溶性ポリ� �プチドとして産生・蓄積される場合、上記� �様に細胞又は菌体を分離し、適当な方法に� �り破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回� �する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナト� �ウム(SDS)やN-ラウロイルサルコシンナトリウ� ��(サルコシル)等の界面活性剤等の可溶化剤� �可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含� �ないか殆ど含まれない濃度にまで希釈又は� �析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に� �成させた後、上記と同様の分離・精製方法� �より精製標品を得ることができる。

 また、バリアント1、2、3、4又は5を他の� �ンパク質との融合タンパク質として生産し� �融合したタンパク質に親和性をもつ物質を� �いたアフィニティークロマトグラフィーを� �用して精製することもできる(山川彰夫,実験 医学,13,469-474(1995))。融合タンパク質に使用す る付加タンパク質としてはプロテインA、FLAG� ��が例示される(Proceedings of the National Academy  of Sciences,USA,86,8227(1989)、Genes Development,4,1288 (1990)、特開平5-336963、特開平6-823021)。プロテ� ��ンAを使用する場合、バリアント1、2、3、4� �は5とプロテインAの融合タンパク質を生産し 、イムノグロブリンGを用いてアフィニティ� �クロマトグラフィーを行うことにより精製� �ることができる。FLAGペプチドを使用する場� ��、バリアント1、2、3、4又は5とFLAGの融合タ� ��パク質を生産し、抗FLAG抗体を用いてアフィ ニティークロマトグラフィーを行うことによ り精製することができる。

 上記の形質転換体により作製する方法以� ��には、バリアント1、2、3、4又は5は、公知� �方法に準じて、in vitro転写・翻訳系を用い� �も生産することができる(Journal of Biomolecular  NMR,6,129-134(1995)、Science,242,1162-1164(1988)、The J ournal of Biochemistry,110,166-168(1991))。

 また、バリアント1、2、3、4又は5は、そ� �アミノ酸配列を基に、Fmoc法(フルオレニルメ チルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオ� ��シカルボニル法)等の化学合成法や市販され ているペプチド合成機器、例えば、APEX396(ア� ��バンストケムテック社製)、433A(アプライド� ��イオシステムズ社製)、PS3(プロテインテク� �ロジーズ社製)、9050(パーセプティブ社製)、P SSM-8(島津製作所製)等のペプチド合成機器に� �り化学合成することができる。

(2)遺伝子治療用ベクターの作製方法
 遺伝子治療用ベクターの作製方法、細胞に� ��ける発現方法等は上記「バリアント1~5の作� ��方法」に記載の発現ベクターと同様である� ��

 発現ベクターは安全で低毒性であるので� ��例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、 マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ 、イヌ、サル等)に対して投与することがで� �る。遺伝子治療に用いる際には、ヒトを含� �哺乳動物の細胞内でタンパク質を発現でき� �かつ、安全性の高いDNA若しくはRNAウイルス� �クター又はプラスミドベクターを用いるの� �好ましい。遺伝子治療に好ましいウイルス� �クターとしては,アデノウイルス、アデノ随� ��ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ポックス� �イルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペス� �イルス、レンチウイルス(HIV)、センダイウイ ルス、エプスタイン-バールウイルス(EBV)、ワ クシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビ スウイルス、SV40等に由来するベクターが挙� �られる。遺伝子治療に好ましいプラスミド� �しては、pCAGGS(Gene,108,193-200(1991))、pBK-CMV、pcDN A3.1、pZeoSV(インビトロゲン社、ストラジーン� ��)等が挙げられる。

 なお、バリアント1、2、3、4又は5をコー� �するDNAにシグナル配列を付加することによ� �、分泌タンパク質となり、局所投与する必� �は必ずしもなく、細胞内で産生、分泌され� �タンパク質が遠く離れた標的臓器に作用し� �リンパ管新生抑制作用を生ずる。従って、� �理組織以外の正常組織内又は正常細胞内へ� �投与も可能である。なお、ヒトに投与する� �合は静脈内投与又は筋肉内投与が好ましい� �