Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Kombination von Wirkstoffen mit agonistischer Opioidwirkung an K und/oder S Opioid-Rezeptoren einerseits mit Wirkstoffen mit antagonistischer Opioidwirkung an ß Opioid-Rezeptoren andererseits.

Die erfindungsgemäße Kombination umfaßt sowohl die fixe Kombination zweier Stoffe (eines Agonisten und eines Antagonisten), deren freie Kombination i Form getrennter Zubereitungen, sowie die Kombination der erfindungsgemäßen agonistischen und antagonistischen Eigenschaften in einem Molekül. Die er¬ findungsgemäße Kombination kann als Antidiarrhoikum verwendet werden.

Stand der Technik

Opioid (Opiat)-Agonisten und Antagonisten wirken durch Aktivierung bzw. Blockade von Opioid-Rezeptoren, die in verschiedene Subtypen unterteilt werden (Holaday, Porreca und Rothman, TIPS 10/2, 1989: Opioid Rezeptor- Types; Watson und Abbott, TIPS Receptor Nomenclature Supplement 1991, Seite 22). Während verschiedene Agonisten und Antagonisten unselektiv mehr oder weniger alle diese Rezeptor-Subtypen aktivieren bzw. blockieren, wirken an¬ dere Substanzen selektiv an einem oder zwei der bekannten Rezeptor-Subtypen (j., K, 8) . Da viele Körperfunktionen bevorzugt durch den einen oder anderen Opioid-Rezeptor-Subtyp beeinflußt werden, haben selektive Rezeptor-Agoni- sten bzw. Antagonisten gegenüber unselektiven Substanzen häufig den Vorzug fehlender oder geringerer Nebenwirkungen an Organsystemen, deren Beeinflus¬ sung im Zusammenhang mit dem gewünschten Therapieziel unerwünscht ist.

Als Antidiarrhoikum wird derzeit weltweit der Opiat-Agonist Loperamid (INN) eingesetzt, der weitgehend unselektiv alle Opioid-Rezeptor-Subtypen aktiviert (Krevsky et al., Life Sei 48, 1597-1502, 1991). Die Bevorzugung des Loperamids als Antidiarrhoikum gegenüber den übrigen Opioiden (Opiaten) ergibt sich lediglich aus der Tatsache, daß Loperamid aufgrund seiner phy-

siko-chem sehen Eigenschaften in der Darmwand angereichert wird und dahe keine wesentlichen, systemischen Nebenwirkungen hervorruft. Nach der gän gen Meinung wäre die unselektive Wirkung von Loperamid jedoch kein Nach¬ teil, da bisher angenommen wird, daß die Aktivierung der verschiedenen Opioid-Rezeptor-Subtypen, insbesondere die Aktivierung des δ und des ß R zeptors, gleichermaßen zu einer Hemmung der Chloridsekretion des Darms u damit zu einer antidiarrhoischen Wirkung führt. Eine gegensinnige, thera peutisch unerwünschte Beeinflussung der Chloridsekretion des Darms durch die Aktivierung des einen oder anderen Opioid-Rezeptor-Subtyps, die eine selektive Beeinflussung der Opioid-Rezeptor-Subtypen notwendig oder zumi dest wünschenswert erscheinen ließe, wurde bisher nicht beschrieben.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die selektive Aktivierung des ß-Rezeptors nicht zu der erwarteten Hemmung der Chloridsekretion, so dern im Gegenteil zu einer Verstärkung der Chloridsekretion im Sinne ein therapeutisch unerwünschten Wirkung führt. Demgegenüber bewirkt die Akti¬ vierung von K und/oder S Opioid-Rezeptor-Subtypen die erwartete und thera peutisch erwünschte Hemmung der Chloridsekretion des Darmepithels (antidi arrhoische Wirkung). Es wurde weiter überraschenderweise gefunden, daß di Applikation eines ß Rezeptor-Antagonisten zu einer Hemmung der Chloridse¬ kretion führt. Dies weist darauf hin, daß dieser Rezeptortyp endogen durc in der Darmwand vorkommende /_ Rezeptor-Agonisten (Enkephaline) physiolo¬ gisch aktiviert wird und so dem therapeutisch erwünschten antidiarrhoisch Effekt exogen zugeführter Opioide entgegenwirkt.

Wird diese endogene Aktivierung des μ Rezeptors einerseits und die _ Reze tor-aktivierende Wirkkomponente des Loperamids oder verwandter Stoffe and rerseits durch gleichzeitige Gabe eines ß Rezeptor-Antagonisten aufgehobe bzw. verhindert, so wird die erwünschte antidiarrhoische Wirkung entspre¬ chend verstärkt. Die Kombination einer ja Rezeptor-Blockade mit der Aktivi rung von K und/oder S Opioid-Rezeptoren führt daher zu einer Verstärkung der antidiarrhoischen Wirkung.

Dies wird auch durch den ebenfalls überraschenden Befund gestützt, daß die selektive Aktivierung des K. Opioid-Rezeptors mit einem selektiven K Agoni¬ sten zu einer Hemmung der Chloridsekretion führt. Diese experimentellen Da¬ ten zeigen erstmals, daß eine Hemmung der Chloridsekretion des Darms und damit eine therapeutisch erwünschte, antidiarrhoische Wirkung durch selek¬ tive Aktivierung von K und/oder δ Rezeptoren bei gleichzeitiger Blockade von ß Rezeptoren gegenüber dem Stand der Technik optimiert werden kann.

Die erfindungsgemäße Kombination eines Wirkstoffs mit K und/oder δ agoni¬ stischer Opioidwirkung mit einem Wirkstoff mit ß antagonistischer Wirkung umfaßt die fixe oder freie Kombination aller K und/oder δ selektiven Opioid (Opiat)-Agonisten mit allen ß selektiven Opioid (Opiat)-Antagonisten sowie die Kombination beider Wirkprinzipien in einem Molekül.

Weiterer Gegenstand der Erfindung, der sich auf den obengenannten überra¬ schenden Befund stützt, daß die selektive Aktivierung des K Opioid-Rezep¬ tors mit einem selektiven K Agonisten zu einer Hemmung der Chloridsekretion führt, ist die Verwendung von K Agonisten und ihren phar akologisch ver¬ träglichen Salzen zur Herstellung von antidiarrhoisch wirkenden Arzneimit¬ teln.

Als Beispiele für Wirkstoffe, die im erfindungsgemäßen Sinn als solche oder in Kombination verwendet werden können, seien die folgenden Substanzen genannt:

A) Agonisten-Antagonisten, welche die gewünschten Wirkungen in einem Molekül vereinen.

Die nachstehend genannten Substanzen zeigen, mehr oder weniger stark ausgeprägt, mehrheitlich eine K agonistische (in wenigen Fällen eine δ agonistische) Wirkung, welche mit einer /_ antagonistischen Wirkung kombiniert ist.

Beispielsweise seien genannt:

Butorphanol , Nalbuphin, Oxymorphon-Naltrexonazin, Oximderivate von Naltrexon, 4-((E)Cyclopropyl-Phe)enkephalin, Nal.oxon-Benzoylhydrazon, Eptazocin, Cyclazocin, Ethylketazocin, Tifluadom, Pentazocin, Nalorphin, Meptazinol und Bremazocin.

Substanzen mit K agonistischer Wirkung, welche für eine freie oder fixe Kombination mit u Rezeptor-Antagonisten geeignet sind

Als Substanzen mit K agonistischer Wirkung seien beispielsweise ge¬ nannt:

Butorphanol, Nalbuphin, Ethylketazocin, Bremazocin, Tifluadom, Dynor- phin und strukturähnliche Peptide, Buprenorphin, Bemidon, Cyclazocin, Pentazocin, Propoxyphen, Ketobemidon, Norbemidon, Benzomorphane, Aryl- acetamide, Cyprodim, Oximderivate von Naltrexon, peripher wirksame K Agonisten vom Typ Ketazocin, Naloxon-Benzoylhydrazone, Eptazocin, Cyclacozin, Nalorphin, Meptazinol , U-50488 und verwandte Strukturen, U-69593, PD-117302, ICI-199441, U-62066 (= Spiradolin), UM 909, UM 911, UM 1070, UM 1071, UM 1382, UM 1345, UM 928, UM 979, MR 2266, MR 2264, MRZ-3218, MRZ-3219, MRZ-3225, MRZ 3215, MR-2184, MR-2261, MRZ-2400, MRZ-2429, MRZ-2479, MRZ-3217, MRZ-3224, MRZ-2549, MR 738, MR 2033, MR-2034, MRZ 3220, CI-977, ICI 19706, ICI 204879, U 63640, PD123475, RP 60180, 2-Acyl-3-substituierte-amino-methyl-l,2,3,4-tetra- hydro-isochinoline, Oxymorphon-Naltrexonazin, (-)-N-Cyclopropyl-methyl- morphinan-6-on, trans~3-(0ctahydro-2H-pyrano(2,3-c)pyridin-4a-yl)phe- nole, 14-A1koxy-morphinane, 1-Acyl-2-d alkylamino-methyl-pyrrolidine, l-Aminomethyl-2-acyl-l,2,3,4-tretrahydroisochinolin, N-Acyl-2-amino- ethyl-aza-heterocyclen, gewünschtenfalls N-substituierte Aryl- oder Heterocyclyl-acyl-l,2-diamino-ethane, 2-Acyl-l-substituierte Aminome- thyl-isochinoline, l-Acyl-2-substituierte Aminomethyl-piperidine, Amino-carbonyl-methylamino-l-oxaspiro(4,5)decane, Isochinolin-Derivate, Decahydrochinoline, 1,2-Diamino-indane, trans-2-Methyl-amino-l-acyl-me- thyla ino-cyclohexane, 2-Acylamino-methyl-1,4-benzodiazepine, N,N'- Dimethyl-N,N'-di-2-aminocyclohexyl-benzol-diamide, trans-N-Pyrrolidino- cyclohexyl-N-methyl-naphthyl-oxy-acetamide, N-substituierte Phenyl- acetyl-2-tert.-aminomethyl-piperidine, l-Acylamino-l-(meta-substitu- ierte Phenyl)-2-amino-ethane, l-Acetyl-2-aminomethyl-piperazine, 10-Aminopropyl-phenothiazin-2-carboxamide, Pyrrolidinyl-substituierte Cyclohexylaminoaryl-amide, N'-Oxide von 2,2-Diaryl-(4-aryl-4-hydroxy)- piperidinyl-butan-amid und Derivate, Opioid-Peptide mit N-terminalem Tyrosyl-propyl-Fragment und Opioid-Peptide der allgemeinen Formel Rl-Tyr-X-G y-Phe-Met-ol.

C) Substanzen mit δ agonistischer Wirkung, welche für eine freie oder fixe Kombination mit u Rezeptor-Antagonisten geeignet sind

Als Substanzen mit δ agonistischer Wirkung seien beispielsweise ge¬ nannt:

Opiod-Peptide vom Strukturtyp DADL, DSLET, DPDPE und DPLPE (Bispeni- cillamide), BW 942 C, BW 180 C, 4-((E)Cyclopropyl -Phe)enkephal in, BUBU, symmetrische di ere Enkephaline, lineare und cyclische Enkephalin-Deri- vate. Heptapeptide der allgemeinen Struktur H-Tyr-X-Phe-His-Leu-Met- Asp-Y, Picenadol.

D) Für die erfindungsgemäße Kombination mit den vorgenannten K und/oder δ Agonisten in Frage kommende selektive u Antagonisten

Als Substanzen mit μ antagonistischer Wirkung seien beispielsweise ge¬ nannt:

Butorphanol , Nalbuphin, Oxymorphon-Naltrexonazin, Naloxon und seine Derivate, beta-Funaltrexamin, beta-Chlornaltrexamin, Etonitazen, BIT, Naloxonazin, Somatostatin-Analoge (CTP, CTOP, CTAP, etc.), 4-((E)Cyc1o- propyl-Phe)Enkephalin, 16-Methyl -cyprenorphin, 14-Alkoxy-morphinane, Naltrexon-phenyloxim (NPC 168) und andere Oxim-Derivate von Naltrexon, 1-substituierte-3-substituierte-4-Methyl-4-substituierte-phe nylpiperi- dine, Dihydro-morphinon-azine und Analoge, Nalmefen, Naloxazon, Dezo- cin, Ciramadol, Naloxon-benzylhydrazon, Eptazocin, Cyclazocin, Ethyl- ketazocin, Tifluado , Pentazocin, Nalorphin, Meptazinol, Bremazocin, Leval1orphan-halomethylat, Morphinan-Derivate.

Die erfindungsgemäße Kombination schließt die Verwendung von Somatosta- tin-Analoga (s.o.) als /_ Rezeptor-Antagonisten mit vernachlässigbarer Affinität und Aktivität am Somatostatin-Rezeptor ein. Die in der Lite¬ ratur beschriebene Kombination von Octreotid (Sandostatin ^® ) mit dem Opiat Loperamid (Imodium®) verwendet Octreotid als ein am Somatostatin- Rezeptor aktives Peptid, nicht aber als ß Rezeptor-Antagonist (Parrish und McClain, Am. J. Gastroenterol 85 _» 1268, 1990). Octreotid ist ein am Somatostatin-Rezeptor aktives Peptid mit vernachlässigbarer μ Rezeptor-

antagonistischer Komponente. Die Aktivierung des Somatostatin-Rezeptor führt bekanntermaßen ebenfalls zu einer antidiarrhoischen Wirkung. Es handelt sich hierbei jedoch um einen anderen Rezeptor als den Opiat-Re zeptor sowie um eine andere Stoffklasse. Die o.g. selektiven μ Rezep¬ tor-Antagonisten CTP, CTOP, CT0P-NH ₂ und CTAP (sowie Analoga) leiten sich zwar chemisch vom Somatostatin her, besitzen aber keine nennens¬ werte Somatostatin-Aktivität mehr. Hierauf beruht ihre Verwendbarkeit für die erfindungsgemäße Kombination, da diese Stoffe die bekannten un erwünschten Wirkungen des Somatostatins auf zahlreiche Körperfunktione (z.B. Darmmotilität, Endokrinum) nicht mehr besitzen.

Derzeit als Antidiarrhoi a angewandte Opiate

Die erfindungsgemäße Kombination eines μ selektiven Antagonisten (sieh D) mit einem Opioid (Opiat) mit Wirkung an K und/oder δ Rezeptoren be¬ zieht sich insbesondere auf die Kombination eines μ Antagonisten mit Loperamid oder Diphenoxylat. Der Vorteil einer solchen Kombination ge¬ genüber der alleinigen Verwendung eines der beiden Agontsten ist, daß deren unerwünschte, μ agonistische Eigenschaft durch Kombination mit dem μ selektiven Antagonisten verhindert wird.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Die erfindungsgemäßen Kombinationen besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, die sie gewerblich verwertbar machen. Sie weisen inbesonder eine ausgeprägte antidiarrhoische Wirkung auf.

In ihren ausgezeichneten Eigenschaften erweisen sich die erfindungsgemäßen antidiarrhoisch wirksamen Kombinationen überraschenderweise den aus dem Stand der Technik bekannten Antidiarrhoica deutlich überlegen. Aufgrund dieser Eigenschaften sind diese Kombinationen für den Einsatz in der Human und Veterinärmedizin hervorragend geeignet, wobei sie insbesondere zur Be¬ handlung und/oder Prophylaxe von Durchfallerkrankungen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die erfindungsgemäßen Kom binationen zur Anwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Durch¬ fallerkrankungen.

Ebenso umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinati onen zur Herstellung von Arzneimitteln, die zur Behandlung und/oder Prophy laxe von Durchfallerkrankungen eingesetzt werden.

Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombi¬ nationen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Durchfallerkrankungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, die die erfin¬ dungsgemäßen Kombinationen enthalten.

Die Arzneimittel werden nach an sich bekannten, dem Fachmann geläufigen Verfahren hergestellt. Als Arzneimittel werden die erfindungsgemäßen phar- makologisch wirksamen Kombinationspartner entweder als solche, oder vor¬ zugsweise in Kombination mit geeigneten pharmazeutischen Hilfs- oder Trä¬ gerstoffen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Emul¬ sionen, Suspensionen oder Lösungen eingesetzt, wobei der Wirkstoffgehalt vorteilhafterweise zwischen 0,1 und 95 % beträgt.

Welche Hilfs- bzw. Trägerstoffe für die gewünschten Arzneimittelfor ulie-

rungen geeignet sind, ist dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens geläu¬ fig. Neben Lösemitteln, Gelbildnern, Suppositoriengrundlagen, Tabletten- Hilfsstoffen und anderen Wirkstoffträger können beispielsweise Antioxidan- tien, Dispergiermittel, E ulgatoren, Entschäumer, Geschmackskorrigentien, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Farbstoffe oder insbesondere Per- meationspromotoren und Komplexbildner (z.B. Cyclodextrine) verwendet wer¬ den.

Die Kombinationspartner können vorzugsweise oral oder parenteral appliziert werden.

Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierung und Applika¬ tionsart der Kombinationspartner kann durch jeden Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.

Im erfindungsgemäßen Sinn können anstelle der Kombinationen auch κ-Agoni- sten als solche eingesetzt werden.

Biologische Untersuchungen

Zum Nachweis der antidiarrhoischen Wirkung wurden Untersuchungen mit den Verbindungen U69593 (/-Agonist) , CT0P-NH ₂ (μ-Antagonist) , Nor- Binaltorphimin (Λ-Antagonist) , DAGO (μ-Agonist), DPDPE (δ-Agonist), ICI 174.864. (δ-Antagonist) und Naloxon (unselektiver Antagonist) durchgeführt.

Für Opiate allgemein wird in der Literatur eine antisekretorische (anti- diarrhoische) Wirkung für Darmepithelien beschrieben. Diese antisekretori¬ sche Wirkung beruht bekanntermaßen auf der Hemmung des Netto-Chloridtrans- portes von der serosalen zur mucosalen Seite von Darmepithel ien. Sekre- tionsfordernde Wirkungen von Opiat-Agonisten oder sekretionshemmende Wir¬ kungen von Opiat-Antagonisten sind in der Literatur bisher nirgendwo be¬ schrieben worden. Der unselektive Opiat-Antagonist Naloxon, der lediglich eine geringgradige Präferenz für μ-Rezeptoren gegenüber K und δ-Rezeptoren aufweist, wurde in der Literatur bisher ausschließlich eingesetzt, um die antisekretorische bzw. antidiarrhoische Wirkung von Opiat-Agonisten zu ver¬ hindern oder aufzuheben. Die gleichzeitige Anwendung eines Opiat-Agonisten mit einem Opiat-Antagonisten (welcher Rezeptorselektivität auch immer) mit dem Ziel, durch diese Kombination eine synergistische oder gar überadditive antisekretorische Wirkung zu erzielen, wurde in der Literatur bisher nir¬ gendwo beschrieben. Sie wäre auf der Basis bisher verfügbarer Literatur¬ angaben auch nicht logisch gewesen. Dieser Literaturstand wurde von W. Kro er ausführlich diskutiert (Endogenous and exogenous opioids in the control of gastrointestinal motility and secretion, Pharmacol . Rev. 40, 121-162, 1988). Auf Kapitel V dieses Reviews wird verwiesen. Hiernach wur¬ den bisher in der Literatur vor allem δ und μ-Rezeptoren als jene Opioid- Rezeptoren favorisiert, die für die antisekretorische (antidiarrhoische) Wirkung von Opioiden am Darm verantwortlich sind.

Die durchgeführten Untersuchungen sollten nun klären, ob ein «-selektiver Opiat-Agonist (U69593) eine wesentliche, antisekretorische Wirkung auf den Chloridtransport an der isolierten Mucosa mit anhaftendem Plexus submucosus des Meerscheinchen-Colons hat. Eventuelle μ-Effekte wurden durch gleich¬ zeitige Gabe des μ-selektiven Opiat-Antagonisten CTOP-NH- sicher verhin¬ dert.

Überraschenderweise ergaben die Untersuchungen nicht nur eine deutliche, ant sekretorische Wirkung des «.-Agonisten U69593, sondern darüber hinaus auch eine völlig überraschende antisekretorische Wirkung des μ-selektiven Antagonisten CTOP-NH^. Die bekannte Existenz und spontane Freisetzung von endogenen Opioid-Peptiden in Präparaten der Darmwand hätte aufgrund der in der Literatur beschriebenen, antisekretorischen Wirkung von μ-Agonisten allenfalls eine sekretionssteigernde Wirkung von CTOP-NH« erwarten lassen, die durch Blockade der antisekretorischen Wirkung endogener Opioide (Met-Enkephalin) zu erklären gewesen wäre.

Die weitere Bearbeitung dieses überraschenden Befundes ergab, daß die kombinierte Anwendung von U69593 und CT0P-NH ₂ zu einer statistisch signifi¬ kanten, überadditiven (synergistischen) antisekretorischen Wirkung auf die Chloridsekretion der Colon-Mucosa führt.

Im folgenden werden die obengenannten Untersuchungen sowie weitere Unter¬ suchungen, die zur Absicherung und Erklärung der genannten Beobachtung- durchgeführt wurden, näher erläutert.

Abbildung 1 zeigt eine Konzentrations-Wirkungskurve des κ-Agonisten U69593 in Abwesenheit ( T ) und in Anwesenheit ( ■ ) einer fixen Konzentration von 100 nmol/1 des μ-selektiven Antagonisten CT0P-NH ₂ . Die Wirkung von CT0P-NH ₂ allein ist ebenfalls dargestellt ( O ). Diese auf der linken Ordinate dargestellte Wirkung bezieht sich auf die Änderung einer durch PGE-, (1 μmol/1) und Theopyllin (100 μmol/1) bewirkten Chloridsekretion der Mucosa- präparate in der Ussing-Kammer (Voltage-Clamp-Anlage). Diese durch PGE _j und Theophyllin bewirkte Sekretionssteigerung ist als Zunahme des sogenannten Kurzschlußstromes (AI ) aufgetragen. Die sekretorische Wirkung von PGE, und Theophyllin in sonst nicht behandelten Kontrollpräparaten ist durch die Säule gekennzeichnet. Sie ist in der Skala am rechten Rand der Abbildung = 0 -Hemmung gesetzt. Ihr Rückgang auf eine Änderung des Kurzschlußstromes = 0 entspräche dann einer 100%igen Hemmung der durch PGE _j und Theophyllin be¬ wirkten Chloridsekretion (rechte Ordinate). Die Abbildung zeigt, daß stei¬ gende Konzentrationen von U69593 ab einer Konzentration von 10 nmol/1 eine signifikante Hemmung der durch PGE, und Theophyllin bewirkten Chloridse-

kretion verursachen. Die maximale Hemmung von etwa 65 % ist bei etwa 1 μmol/1 erreicht. 100 nmol/1 CT0P-NH ₂ bewirken eine Hemmung der Chloridse¬ kretion um ca. 30 %. Die Kombination aus dieser fixen Konzentration von CT0P-NH- einerseits und den jeweiligen Konzentrationen von U69593 anderer¬ seits führt überraschenderweise zur einer verstärkten, antisekretorischen Wirkung, die maximal ca. 75 % Hemmung erreicht.

Die Beurteilung, ob diese Kombinationswirkung additiv oder überadditiv ist, muß grundsätzlich auf der Basis einer Addition der Dosen, nicht der Wir¬ kungen erfolgen (siehe Pöch und Holzmann, Quantitative esti ation of over- additive and underadditive drug effects by means of theoretical, additive dose-response curves, J. Pharmacol . Meth. 4, 179, 1980). Dies geschieht, indem aus der Konzentrations-Wirkungskurve die Konzentration von U69593 ab¬ gelesen wird, die zu der gleichen Wirkung geführt hätte wie die fixe Kon¬ zentration von CT0P-NH ₂ . Diese theoretische Konzentration von U69593 wird zu der jeweiligen, im Kombinationsexperiment verwendeten Konzentration von U69593 addiert. Die zu dieser Summendosis gehörige, theoretische Wirkung wird aus der Konzentrations-Wirkungskurve von U69593 abgelesen und als theoretische, additive Konzentrations-Wirkungskurve aufgetragen ( D ). Zeigt die Kombination der beiden Substanzen im Experiment tatsächlich eine stärkere Wirkung, als aufgrund der theoretisch-additiven Konzentrations- Wirkungskurve zu erwarten wäre, so handelt es sich definitionsgemäß um einen überadditiven Synergismus. Im vorliegenden Falle der Abbildung 1 zeigt der statistische Test (Ein-Stichproben-t-Test) gegenüber der theo¬ retisch additiven Konzentrations-Wirkungskurve eine signifikant überaddi¬ tive Wirkung der Kombination an (n = 9; + = p < = 0.05; die übrigen p-Werte ( *) beziehen sich auf den Vergleich zur Kontrollgruppe = Säule).

Die neuen, im Hinblick auf den Stand der Technik überraschenden Befunde zeigen, daß die Aktivierung von Λ- (und evtl. δ-) Rezeptoren zu einer antisektretorisehen, die Aktivierung von μ-Rezeptoren jedoch zu einer se- kretionsfordernden Wirkung führt. Die prosekretorische Wirkung von μ-Rezep¬ toren bzw. ihren Agonisten geht aus den bisher geschilderten Befunden inso¬ fern indirekt hervor, als der μ-selektive Antagonist CT0P-NH ₂ eine antise¬ kretorische Wirkung zeigt, die durch Blockade der prosekretorischen Wirkung endogener, in der Darmwand vorkommender μ-Agonisten (Met-Enkephalin) zu er-

klären ist. Der direkte Nachweis einer sekretionsfordernden Wirkung von μ Rezeptoren wird weiter unten unter Verwendung des μ-selektiven Agonisten DAGO geführt.

Die neuen, überraschenden Befunde beinhalten also 3 Aspekte:

a) Im Gegensatz zur bisherigen Literaturmeinung führt die Aktivierung vo «-Rezeptoren zu einer deutlichen, antisekretorischen Wirkung. b) Im Gegensatz zur bisherigen Literaturmeinung bewirkt die Blockade von μ-Rezeptoren eine antisekretorische Wirkung. c) Im Gegensatz zur bisher in der Literatur beschriebenen Blockade der antisekretorischen/antidiarrhoisehen Wirkung von Opiaten durch Opiat- Antagonisten bewirkt die Kombination eines μ-selektiven Antagonisten mit einem «-selektiven Agonisten (oder δ-selektiven Agonisten) nicht eine Wirkungsabschwächung, sondern im Gegenteil eine überadditive Wir¬ kungsverstärkung.

Abbildung 2 zeigt, wie die Zugabe von PGE, und Theophyllin in das Organbad an Kontrollpräparaten zeitabhängig zu einer Netto-Sekretion von Chlorid¬ ionen führt ( O ). Bei dieser Darstellung ist zu beachten, daß die einge¬ zeichneten, horizontalen Linien ( ) den elektrischen Nullinien der je weiligen Präparategruppen entsprechen. Dies bedeutet, daß alle Meßpunkte unterhalb dieser Linien die Netto-Resorption, alle Punkte oberhalb dieser Linien die Netto-Sekretion von Chloridionen anzeigen. Prostaglandin E, überführt also die Netto-Resorption von Chloridionen, die im nicht-sti- mulierten Zustand beobachtet wird, in eine Netto-Sekretion. Diese sekre¬ tionsfordernde Wirkung von Prostaglandin wird durch den «-selektiven Ago¬ nisten U69593 abgeschwächt ( ■ ), durch den «-selektiven Antagonisten nor- Binaltorphimin jedoch verstärkt (• ; D). Diese "Eigenwirkung" von nor- Binaltorphimin bestätigt, daß in der Darmwand endogene Opioide (Dynorphin) spontan freigesetzt werden, deren antisekretorische Wirkung nun verhindert wird. Wichtiger ist im vorliegeden Zusammenhang jedoch der Befund, daß nor- Binaltorphimin die antisekretorische Wirkung von U69593 komplett verhindert ( D ). Dies bestätigt noch einmal, daß es sich hierbei um eine selektive Wirkung von U69593 am «-Rezeptor handelt.

Abbildung 3 zeigt nun überraschenderweise für den μ-Rezeptor das exakte Gegenteil dessen, was in Abbildung 2 für den «-Rezeptor nachgewiesen wurde. Die Daten aus Abbildung 3 stehen damit im Gegensatz zu dem, was bisher in der Literatur vermutet wurde. Sie zeigen, daß der μ-selektive Agonist DAGO die durch Prostaglandin E, stimulierte Chloridsekretion (Kontrollen: O ) geringfügig, aber statistisch signifikant verstärkt ( V ), während der μ-selektive Antagonist CT0P-NH ₂ diese Wirkung von DAGO nicht nur vollstä¬ ndig verhindert ( <S> ), sondern selbst eine antisekretorische Wirkung ausübt ( A). Auch dieser Befund belegt, daß in der Darmwand neben endogenen «-Agonisten (Dynorphin) auch endogen vorkommende μ-Agonisten (Met- Enkephalin; -Endorphin) spontan freigesetzt werden und ihrerseits eine Steigerung der Chloridsekretion bewirken. Die Blockade von μ-Rezeptoren führt daher entsprechend zu einer Hemmung der Chloridsekretion, relativ zu Ausgangszustand. Die spontane Freisetzung endogener Opioide (Dynorphin; Met-Enkephalin) in der Darmwand ist, unabhängig von einer möglichen Wirkung auf die Chloridsekretion, in der Literatur beschrieben (siehe Kromer, 1988). Dies wird noch einmal bestätigt durch die Wirkung des Kalziumkanal- Agonisten Bay K8644, der gegenüber Kontrollpräparaten zu einer hochsigni¬ fikanten Hemmung der durch Prostaglandin E, stimulierten Chloridsekretion führt (Abbildung 4). Abbildung 5 zeigt nun, daß diese durch Bay K8644 be¬ wirkte Hemmung der Chloridsekretion durch den «-Antagonisten nor-Binal- torphimin komplett verhindert werden kann. Dies belegt, daß die in der Lit¬ eratur beschriebene, spontane Freisetzung von Dynorphin (endogener «- Agonist) durch den Kalziumkanal-Agonisten Bay K8644 erwartungsgemäß ver¬ stärkt wird und für dessen Hemmung der Chloridsekretion verantwortlich ist.

Obwohl es sich bei der in diesen Experimenten zugrundeliegenden Voltage- Clamp-Anordnung um eine in der Literatur lange etablierte und akzeptierte Standardmethode handelt, soll in Abbildung 6 gezeigt werden, daß die in den vorangegangenen Abbildungen dargestellten Anstiege des Kurzschlußstroms (ΔI ) tatsächlich einer Sekretion von Chloridionen (im Gegensatz entweder zur Sekretion etwaiger anderer Anionen oder zur Resorption von Kationen) entsprechen. Abbildung 6 zeigt, daß Mucosapräparate in chloridfreier Lö¬ sung, bei sonst identischen Versuchsbedingungen, auf die Zugabe von Prosta¬ glandin und Theophyllin nicht mehr mit dem gewohnten Anstieg des Kurz¬ schlußstromes reagieren und CT0P-NH ₂ gegenüber Kontrollpräparaten keine

Wirkung mehr hat. In diesen Experimenten wurde in der. üblichen Weise Chlorid durch Gluconat ersetzt.

Die Selektivitäten und Spezifitäten des μ-Antagonisten CTOP-NH- (Gulya et al., Life Sei. 38, 2221, 1986) und des «-Agonisten U69593 (Lahti et al., Eur. J. Phar acol . 109, 281, 1985) sind in der Literatur gut beschrieben. Dennoch soll durch ein weiteres Experiment noch einmal gezeigt werden, daß die überraschende, antisekretorische Wirkung des μ-selektiven Antagonisten CT0P-NH ₂ tatsächlich durch Blockade von Opiat-Rezeptoren und nicht etwa durch unbekannte, nicht-opiatartige Mechanismen hervorgerufen wird. Abbil¬ dung 7 zeigt die Änderungen des Kurzschlußstromes unter nicht-sti ulierten Bedingungen (A) sowie unter Stimulation mit PGE, und Theophyllin (B), so¬ wohl an Kontrollpräparaten (Co) als auch unter dem Einfluß von CT0P-NH ₂ (CTOP 10 ^"7 mol/1), Naloxon (Nal 10 ^"6 oder 10 ^"4 mol/1) oder deren Kombina¬ tion. Die in Form von Säulen dargestellte Änderung des Kurzschlußstromes bezieht sich auf den Vergleich des Mittelwertes aus 4 sukzessiven Messungen nach Zugabe von PGE, und Theophyllin (B) bzw. des entsprechenden Zeitpunk¬ tes in nicht stimulierten Präparaten (A) mit der unmittelbar vorausgehen¬ den, basalen Messung. Theoretische Grundlage dieser Versuchsanordnung war, daß eine hohe Konzentration von Naloxon (10 ^" mol/1 = linker Teil der Ab-

-4 bildung; 10 mol/1 = rechter Teil der Abbildung) zu einer mehr oder weni¬ ger kompletten Blockade sämtlicher im Gewebe vorhandener Opiat-Rezeptoren führt, unabhängig von ihrer Zuordnung zu Rezeptor-Subtypen. Naloxon ist ein weitgehend unselektiver Antagonist mit lediglich geringer Präferenz für

-4 μ-Rezeptoren, der in hoher Konzentration (10 mol/1) sowohl μ- wie «- und δ-Rezeptoren blockiert. Unter diesen Umständen sollte ein μ-selektiver Antagonist wie CT0P-NH ₂ keine zusätzliche, antisekretorische Wirkung mehr ausüben, sofern sie Opiat-Rezeptor-spezifisch ist. Die Befunde aus Abbil¬ dung 7 zeigen, daß 10 mol/1 Naloxon (linker Teil der Abbildung) noch nicht zu einer vollständigen Blockade aller Opiat-Rezeptoren führen. Die Kombination beider Antagonisten hemmt folgerichtig die Chloridsekretion bis auf jenes Niveau, das durch CT0P-NH ₂ allein erreicht wird. Die sehr hohe Konzentration von 10 mol/1 Naloxon (rechter Teil der Abbildung) führt dosisabhängig zu einer stärkeren, jedoch nicht maximalen Hemmung der Chlo- ridsekretion und verhindert nun vollständig eine zusätzliche, hemmende Wirkung von CT0P-NH ₂ . Dies stimmt mit der Erwartung überein, daß diese hohe

Konzentration von Naloxon zu einer vollständigen Blockade von μ-Rezeptore führt, deren Blockade auch der "Wirkung" von CT0P-NH ₂ zugrundeliegt.

Abbildung 8 zeigt, daß der neue, unerwartete Befund einer antisekretori¬ schen Wirkung eines μ-selektiven Antagonisten (CTOP-NH«) nicht nur in vi¬ tro, sondern auch in vivo gefunden wird. Um eine möglichst hohe Sicherhei bezüglich der allgemeinen Gültigkeit dieser Aussage zu erreichen, wurden gegenüber den bisherigen Versuchen drei Variable verändert: In vivo statt in vitro, Ratte statt Meerschweinchen, Jejunum statt Colon. Angewandt wur die Methode des sogenannten Enteropoo ings, bei dem an der narkotisierten Ratte eine Darmschlinge proximal und distal abgebunden wird. Gefäßverbin¬ dungen mit benachbarten Darmsegmenten werden unterbunden, und die Sekreti des Testsegments wird durch Dauerinfusion von PGE ₂ in das zuführende arterielle Gefäß des Segments stimuliert. Vor Beginn der Stimulation werd 2 ml Tyrodelösung über einen Katheter in die abgebundene Darmschlinge in- stilliert. Die Netto-Sekretion der Darmschlinge wird am Ende des Versuchs gravimetrisch durch Messung des Flüssigkeitsvolumens in der Darmschlinge ermitte-lt. Die Werte sind in Abbildung 8 entsprechend als ml/g Darm angeg ben, wobei negative Werte eine Netto-Resorption, positive Werte eine Nett Sekretion von Flüssigkeit bedeuten. Auch hierbei handelt es sich um eine der Literatur akzeptierte Standardmethode.

Abbildung 8 zeigt nun den Einfluß von CT0P-NH ₂ (0.32 μg/min, intraarterie le Infusion), Naloxon (1 mg/kg s.c.) oder deren Kombination unter basalen Bedingungen (A) sowie unter der Stimulation mit entweder 31 ng/min (B) od 79 ng/min (C) PGE ₂ - Die Befunde zeigen zunächst, daß gegenüber Kontroll- präparaten (NaCl) die intraarterielle Infusion von PGE ₂ dosisabhängig zu einer Umkehr der Netto-Resorption in eine Netto-Sekretion führt. Diese durch PGE _? induzierte Netto-Sekretion wird durch CT0P-NH ₂ jeweils gehemmt wobei diese Hemmung im Falle der hohen PGE ₂ ~Dosis (C) für die verwendete CTOP-Dosis noch nicht signifikant ist. Im Falle der niedrigen PGE ₂ -Dosis (B) führt CT0P-NH ₂ jedoch zu einer Umkehr der durch Prostaglandin-induzie ten Netto-Sekretion in eine Netto-Resorption. Dieser Effekt ist statistis signifikant. Die hohe Dosis von 1 mg/kg Naloxon i.p. wurde gewählt, um ei vollständige Blockade aller Opiod-Rezeptoren zu erreichen. Sie führt im Falle der niedrigen Prostaglandin-Dosis (B) trendmäßig (nicht signifikant

zu einem geringen Anstieg, im Falle der hohen Prostaglandin-Dosis (C) trendmäßig (nicht signifikant) zu einem geringen Abfall der Netto-Sekretion unter dem Einfluß von Prostaglandin. Im Falle der niedrigen Prostaglandin- Dosis ist unter dem Einfluß von Naloxon die sekretions-hem ende/resorp- tions-fordernde Wirkung von CT0P-NH ₂ gegenüber den PGE ₂ -Kontrollen komplett aufgehoben, gegenüber den Nal-PGE-Kontrollen zumindest erheblich vermin¬ dert. Im Falle der hohen Prostaglandin-Dosis (C) verhindert Naloxon eine weitere, (trendmäßige) antisekretorische Wirkung von CT0P-NH _? vollständig. Hierbei muß beachtet werden, daß entsprechend den für PGE(31)-CT0P (siehe B) erhobenen Daten CT0P-NH ₂ prinzipiell in der Lage ist, eine Netto-Resorp¬ tion herbeizuführen. Die unter dem Einfluß von Naloxon bei der hohen Prostaglandin-Dosis gefundene Aufhebung der antisekretorischen Wirkung von CT0P-NH ₂ läßt sich also nicht dadurch erklären, daß aufgrund der antisekre¬ torischen Eigenwirkung von Naloxon eine zusätzliche Wirkung von CTOP-NH« durch eine evtl. Maximalauslenkung des Systems nicht mehr möglich sei. Vielmehr kann dieser Befund als Beleg dafür gewertet werden, daß die anti- sekretorische Wirkung von CT0P-NH ₂ auch am Jejunum der Ratte in vivo durch spezifische Blockade von μ-Opioid-Rezeptoren zustande kommt.

Naturgemäß handelt es sich bei dem Rattenmodell in vivo um ein erheblich komplexeres Modell, verglichen mit dem oben beschriebenen in vitro-Modell (Voltage-Clamp-Anordnung). Hieraus erklärt sich, daß Naloxon als nicht¬ selektiver Opiat-Antagonist in Abhängigkeit von dem Grad der Stimulation trendmäßig (nicht signifikant) entweder eine prosekretorische (B) oder antisekretor sche (C) Wirkung besitzt. Überwiegt nämlich endogen die Sti¬ mulation von «-Rezeptoren durch körpereigene Opiod-Peptide, so führt die Blockade dieser «-Rezeptoren durch Naloxon zu einer sekretionssteigernden Wirkung. In diesem Falle wird die zusätzliche Blockade von endogen nicht- stimulierten μ-Rezeptoren durch Naloxon funktionell auch nicht als anti¬ sekretorische Wirkung erkennbar (B). Überwiegt dagegen endogen die Sti¬ mulation von μ-Rezeptoren durch körpereigene Opioid-Peptide, so führt die Blockade von μ-Rezeptoren durch Naloxon zu einer antisekretorischen Wir¬ kung. Die Tatsache, daß beide Wirkungen lediglich einen Trend anzeigen, ohne statistische Signifikanz zu erreichen, steht im Einklang mit der Beobachtung an der Colonmucosa vom Meerschweinchen in vitro, wonach endogen sowohl «- wie μ-Rezeptoren stimuliert werden. Halten sich beide Rezeptor-

subtypen funktionell die Waage, so wäre für den nicht-selektiven Antago¬ nisten Naloxon bei hoher Dosierung auch keine Nettowirkung zu erwarten. Diese Überlegungen stehen im Einklang mit allen verfügbaren Literaturdate zur Freisetzung endogener Opioide in der Darmwand und belegen die Plausi- bilität der oben beschriebenen experimentellen Daten.

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