MALADIES INFECTIEUSES

La présente invention concerne de nouvelles souches atténuées d'apicomplexes et leur utilisation comme vecteur d'antigène pour la prévention de maladies infectieuses.

Les Apicomplexes sont des parasites majoritairement intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles.

Toxoplasma gondii (T. gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Le chat, hôte définitif, excrète le parasite dans l'environnement sous forme d'oocystes. Les hôtes intermédiaires (i.e. l'ensemble des homéothermes) et définitif peuvent s'infecter en ingérant des oocystes présents sur les aliments. Le parasite se transforme alors en tachyzoïtes qui se disséminent dans l'organisme et qui, sous la pression du système immunitaire, s'enkystent avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine ou les muscles. L'ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires.

Récemment, une souche vivante atténuée de Toxoplasma gondii, le parasite responsable de la toxoplasmose a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMICl et TgMIC3 (Cérède et al, 2005, J. Exp. Med, 201(3) : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo tgmicl-3 KO génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre Toxoplasma gondii et permet de prévenir les effets d'une infection ultérieure chez la souris (Ismael et al., 2006, J. Infect. Dis., 194(8) : 1176-83) et chez la brebis (Mévelec et al., 2010, Vet. Res., 41(4) :49).

Neospora caninum (N. caninum) est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose. Il appartient également à la famille des Sarcocystidae. Le cycle de vie de Neospora caninum est très proche de celui de T. gondii avec deux phases distinctes : une phase sexuée chez l'hôte final {i.e. les canidés et le chien en particulier) qui conduit à la production d'oocystes éliminés dans les fèces et une phase asexuée chez un hôte intermédiaire {i.e. les ovins, les caprins, les bovins, les équidés, etc ..) qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes. Plus récemment, il a été obtenu une souche vivante atténuée de Neospora caninum, la souche Neo ncmicl-3 KO, qui a été invalidée pour les gènes ncmicl et ncmic3 par recombinaison homologue. Il a été montré que cette souche mutante possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose.

Les parasites de la famille Sarcocystidae tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum peuvent être utilisés pour exprimer des protéines hétéro logues provenant d'autres parasites tels que Plasmodium spp, Cryptosporidium parvum ou Leishmania spp.

Ainsi, la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii a été utilisée comme vecteur de l'antigène CSP (Protéine Circum Sporozoïte) de Plasmodium knowlesi (Di Cristina et al., 1999, Infect Immun., 67(4) : 1677-82,). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, la souche recombinante a été inoculée à des singes Rhésus et induit chez l'animal une réponse immunitaire humorale spécifique de la protéine CSP. En la souche thermosensible ts-4 HXGPR ^" de Toxoplasma gondii a été utilisé comme vecteur de l'antigène CSP de Plasmodium yoelii (Charest et al., 2000, J. Immunol, 165(4) : 2084-92). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, les parasites recombinants ont été inoculés à la souris induisant une réponse immunitaire humorale spécifique de l'antigène CSP mais insuffisante pour induire une protection contre une infection avec Plasmodium yoelii.

Une souche de Toxoplasma gondii a également été utilisée pour exprimer les gènes gp40, gpl5 et le précurseur gp40/gpl5 de Cryptosporidium parvum, le parasite responsable de la cryptosporidiose (O'Connor et al, Infect. Immun., 2003 71(10) :6027-35 ; O'Connor et al, 2007, Mol Biochem Parasitol, 152(2) : 148-58). Les gènes gp40/gpl5, gp40 et gpl5 ont été clonés, placés sous le contrôle d'un promoteur de T. gondii et intégrés de manière aléatoire dans le génome du parasite. Les auteurs ont montré que les parasites recombinants exprimaient les protéines d'intérêt et que la glycosylation de la protéine GP40 exprimée par T. gondii était similaire à la glycosylation de la protéine native. Cependant, les auteurs ont démontré que le clivage de la pré-protéine GP40/GP15 était inefficace dans les tachyzoïtes bien que des enzymes permettant le clivage soient présentes chez le parasite T. gondii. Une autre équipe s'est également intéressée à l'utilisation de Toxoplasma gondii comme vecteur d'antigène de Cryptosporidium parvum et notamment de la protéine de surface immunodominante P23 (Shirafuji et al, 2005, J. Parasitol, 91(2) :476-9). Le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de P23 recombinantes sont similaires à ceux de protéine native et des souris immunisées avec des tachyzoïtes lysés exprimant la protéine P23 produisent des anticorps neutralisant dirigés contre C. parvum.

Enfin, T. gondii a été utilisé comme vecteur d'expression de l'antigène Kmpl l de Leishmania. La souche recombinante obtenue permet une protection significative des animaux lors d'un challenge avec L. major (Ramirez et al ., 2001, Vaccine, 20:455-61).

Neospora caninum a également été utilisé comme vecteur d'antigènes hétérologues et une souche recombinante de N. caninum exprimant de manière stable l'antigène S AGI de T. gondii a été construite (Zhang et al, 2010, Vaccine, 60(1) : 105-7). Le niveau d'expression, le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de la protéine S AGI exprimée dans N. caninum sont similaires à ceux de la protéine S AGI native et des souris immunisées produisent une réponse immunitaire de type Thl spécifique de S AGI de T. gondii et sont protégées contre un challenge létal avec T. gondii.

Le système Cre/loxP a été utilisé dans les stratégies d'activation ou d'inactivation des gènes de cellules de mammifères (Fukushige et Sauer, 1992, PNAS, 89(17) : 7905-9) ou de souris transgéniques (Tsien et al, 1996, Cell, 87(7) : 1317-26.).

La Cre Recombinase est une enzyme issue du bactériophage PI (Sternberg and Hamilton, 1981, J. Mol Biol, 150(4) : 487-507) de la famille des intégrases qui reconnaissent des sites très spécifiques et permettent une recombinaison entre deux sites identiques. Le site de restriction de la Cre Recombinase est le site loxP, une séquence nucléotidique de 34 paires de bases (SEQ ID NO : 12) qui comprend deux petites séquences de 13 paires de bases répétées et inversées et une région spacer (en gras) de 8 paires de bases. Plusieurs mutants du site loxP sont décrits et 3 sites ont été identifiés comme étant incompatibles entre eux (Livet et al, 2007, Nature, 450(7166) : 56-62). Il s'agit des sites LoxP (SEQ ID NO : 12), LoxN (SEQ ID NO :5) et Lox 2272 (SEQ ID NO :68).

Les propriétés de la Cre recombinase sont multiples et peuvent être utilisés pour (Figure 1) :

• Supprimer une séquence d'ADN présente entre deux sites Lox identiques et avec la même orientation,

• Inverser une séquence d'ADN présente entre deux sites Lox identiques et avec l'orientation inverse,

• Intégrer au niveau d'un site LoxP ou LoxN une séquence d'ADN contenant le site LoxP ou LoxN.

Chez Toxoplasma gondii, le système Cre/Lox a été utilisé la première fois en 1999 (Brecht et al, 1999, Gene, 234(2) :239-47). Suite à l'insertion aléatoire d'un gène rapporteur encadré de sites LoxP orientés dans un sens identique, l'action de la Cre Recombinase a permis la délétion du gène rapporteur et la formation d'une cicatrice LoxP. La Cre Recombinase a ensuite été utilisée pour intégrer un nouveau transgène hétérologue au niveau de cette cicatrice LoxP. Plus récemment ; le système Cre/LoxP a été utilisé pour la réalisation d'une souche de Toxoplasma gondii délétée pour le gène mornl (Heaslip et al., 2010, PloS Pathog, 6(2) : el000754). Enfin dernièrement, des souches KO (knockout) de T. gondii ont été créées en utilisant une forme dimérisable de la Cre Recombinase inductible seulement après ajout d'un ligand : la rapamycine (Andenmatten et al., 2013, Nat. Methods, 10(2) : 125-7 ; Rugarabamu et al., 2015, Mol. Microbiol, 97(2) :244-62).

La présente invention concerne de nouvelles souches atténuées de Sarcocystidae {Toxoplasma gondii et Neospora caninum).

La présente invention concerne également l'utilisation de nouvelles souches atténuées de Sarcocystidae (Toxoplasma gondii et Neospora caninum), comme vecteur d'antigène pour la prévention de maladies infectieuses.

La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle l'un au moins des gènes miel ou mic3 est délété, contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus dudit au moins un gène délété, et dans le cas où les deux gènes miel et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété est potentiellement différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Par « enzyme permettant une recombinaison spécifique », on entend enzyme catalysant la recombinaison d'ADN dans un sens défini, entre des sites spécifiques déterminés par des séquences propres à chaque enzyme. Elles permettent notamment l'excision, l'insertion, l'inversion ou la translocation d'une séquence nucléotidique flanquée de sites spécifiques. Comme exemple d'enzyme permettant une recombinaison spécifique, on peut citer par exemple la Cre recombinase, la FLP recombinase, la Tre recombinase, les protéines RecA et Hin recombinase (bactérie). Les gènes miel et mic3 permettent de coder les protéines MIC1 et MIC3. Ce sont sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l'adhésion aux cellules hôtes.

Dans un mode de réalisation particulier, l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la cre-recombinase. Ainsi, dans ce cas la souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle l'un au moins des gènes miel ou mic3 est délété contient un site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase, au locus dudit au moins un gène délété. et dans le cas où les deux gènes miel et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase, au locus du gène miel délété est différent de celui au locus du gène mic3 délété.

On entend par « délétion du gène », la délétion de la séquence codante entière (introns et exons), la délétion de la région promotrice et la délétion des régions transcrites non traduites 5' et 3', dites 5' et 3'UTR, le terme « gène » désignant la région promotrice (également appelée promoteur), la séquence codante et les régions 5' et 3' UTR.

La Cre recombinase est une topoisomerase dérivée du bacteriophage PI, cette enzyme est fonctionnelle chez les parasites. L'utilisation possible de plusieurs sites lox n'interagissant pas entre eux permet d'envisager plusieurs délétions.

Comme exemples de sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (sites lox), on peut citer de manière non exhaustive, les sites ΙοχΡ, ΙοχΝ, 1οχ2272, 1οχ71, 1οχ66, lox511, lox5171 et loxM2.

La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase et dans laquelle dans le cas où les deux gènes miel et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété est différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Toxoplasma spp..

Ce genre comprend entre l'espèce Toxoplasma gondii.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche de l'espèce Toxoplasma gondii.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii.

Selon un autre mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Neospora spp..

Ce genre comprend entre autres les espèces suivantes : Neospora caninum, Neospora hughesi.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche de l'espèce Neospora caninum.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété. Dans le cas où l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, ladite souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés. Par « ne contenant pas d'ADN hétérologue autres que les ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique», on entend que la souche peut contenir comme seul(s) ADN hétérologue(s), une ou plusieurs séquences correspondant à un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique.

Dans le cas où l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, ladite souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés.

Par « contenant un ADN hétérologue, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison de la cre-recombinase », on entend que ladite souche contient un ADN hétérologue qui ne correspond pas à une séquence d'un site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase et qui ne comprend pas de séquence correspondant à un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés,

et dans laquelle chacun des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif des gènes miel et mic3 délétés sont choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, le site de recombinaison de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante selon l'invention, dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase, et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés et contenant deux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, ladite enzyme étant la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, lesdits sites de recombinaison spécifique étant des sites de recombinaison spécifique de la cre-recombinase choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, le site de recombinaison de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre- recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété, et

- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété, ce second site étant apporté de manière additionnelle aux sites déjà présents dans la souche, en raison de la recombinaison spécifique supplémentaire lors de l'ajout de l'ADN hétérologue. lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, et

- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ladite souche comprenant les moyens nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue. Ce mode de réalisation cible la production d'un ARN hétérologue à partir dudit ADN hétérologue dans une souche mutante telle que décrite ci-dessus.

Par « moyens nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue », on entend un promoteur, un site d'initiation de la transcription, TATA box, un terminateur de transcription.

L'ARN ainsi transcrit peut être un ARN messager, un ARN interfèrent, un ARN long non codant, un ARN tige-boucle (en anglais « Hairpin RNA »),

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété ou celui au locus du gène mic3 délété, et

- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique

et les moyens nécessaires à la transcription du susdit ADN hétérologue.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche selon l'invention, contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés,

ledit ADN hétérologue étant flanqué :

• d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,

• d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,

et les moyens nécessaires à sa transcription, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, autre que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété, et

- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, et

- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ledit ADN hétérologue codant pour au moins une protéine, ladite souche mutante comporte également les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue.

Ce mode de réalisation cible l'expression protéique dudit ADN hétérologue dans une mutante telle que décrite précédemment. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche selon l'invention contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, ledit ADN hétérologue codant pour une protéine et étant flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus du gène miel délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et

d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,

et les moyens nécessaires à l'expression protéique du susdit ADN hétérologue, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre- recombinase et, les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue codant pour au moins une protéine et étant flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase au locus du gène miel délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et

- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique

et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (appelé site A) étant différent de celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différents de ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A),

et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété,

et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue. lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que

ledit site A et ledit site B sont différents, et

ledit site C est identique audit site A ou B, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, dans laquelle ladite enzyme est la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:

le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété

le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et

le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que

ledit site A et ledit site B sont différents, et

ledit site C est identique audit site A ou audit site B.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) correspond à un site loxN SEQ ID NO : 5 et celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B) correspond à un site loxP SEQ ID NO : 12,

et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) correspond à un site loxP SEQ ID NO : 12 et celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B) correspond à un site loxN SEQ ID NO : 5, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, dans laquelle ladite enzyme est la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:

le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété

le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et

le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68,

tels que

- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5

- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, et

ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que

- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5

- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, et

ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B ; ou tels que

- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12

- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et

ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que

- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12

- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et

ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété.

Le gène ropl6 permet de coder la protéine Ropl6 qui est une protéine de rophtries. Cette protéine est une sérine thréonine kinase.

Ces protéines ROPs, sont sécrétées pour permettre l'invagination de la membrane plasmique de la cellule hôte et la formation de la vacuole parasitophore. Les ROPs relarguées dans le cytosol de la cellule hôte peuvent migrer à la surface de la vacuole parasitophore (ROP5, ROP18, ROP2) ou dans le noyau (ROP16, protéine phosphatase 2C ou PP2C-hn), permettant une modulation de l'expression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène roplôl est délété, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété. et dans laquelle ladite souche mutante contient également au locus du gène roplôl , en aval dudit site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété, un gène codant pour la protéine GRA15II , ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine,

Les protéines GRAs sont associées au réseau nanotubulaire membraneux et à la membrane de la vacuole parasitophore (Mercier et al, Int J Parasitol. 2005 Jul;35(8):829-49. Review. Erratum in: Int J Parasitol. 2005 Dec;35(14): 1611-2). Elles participent à l'échange de nutriments entre le parasite et les organelles (mitochondries et du réticulum endoplasmique) de la cellule hôte (Sibley, Immunol Rev. 2011 Mar;240(l):72-91).

Récemment, certaines protéines des granules denses dont GRA15, ont été identifiées comme protéines jouant un rôle dans la modulation/contrôle de la réponse immunitaire de la cellule hôte. GRA15 présente un polymorphisme selon la typologie du parasite (I, II, III...).

Dans ce mode de réalisation, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène rop 161 délété est donc flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop 161 délété.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène rop 161 est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop 161 délété,

ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, et ladite souche comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène rop 161 délété,

ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène rop 161 délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop 161 délété.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,

et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété

ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,

et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété,

et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété

lesdits sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus des gènes miel, mic3 et roplôl délété sont choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68,

tels que ces trois sites sont différents l'un de l'autre.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété,

et dans laquelle ladite souche mutante contient également au locus du gène roplôl , en aval dudit site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété, un gène codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété et au locus du gène mic3 délété.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,

et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (appelé site D) est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (appelé site A) et du site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase situé au locus du gène mic3 délété (appelé site B). tels que

ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que

ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

dans laquelle le gène roplôl est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété,

ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:

le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété

le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et

le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que

- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5

- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que

- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12

- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp.,

et dans laquelle le gène roplôl est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété

et ladite souche mutante comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène roplôl délété,

ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène roplôl délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, notamment dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est, la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N SEQ ID NO :5, lox P SEQ ID NO : 12 et lox 2272 SEQ ID NO :68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété et au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement : le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété

le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et

le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété

en particulier tels que

ledit site A est le site lox N,

ledit site B est le site lox P,

ledit site D est le site lox 2272.

Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,

et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété (appelé site B),

et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (appelé site D) est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (appelé site A) et du site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase situé au locus du gène mic3 délété (appelé site B),

ladite souche contenant éventuellement un codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens d'expression nécessaires à l'expression de ladite protéine,

et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène roplôl délété, différent des ADN hétéro logues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel, mic3 et roplôl délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène roplôl délété (site D), et

- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène roplôl (site D) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.

Dans ce mode de réalisation particulier, ladite souche mutante contient alors quatre sites de recombinaison spécifique de la cre-recombinase défini de la manière suivante : le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété,

ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68;

ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,

ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 ; ou tels que lorsque l'ADN hétéro logue est inséré au locus du gène roplôl délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

- ledit site C correspond à un lox 2272, SEQ ID NO : 68

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, dans laquelle le gène roplôl est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété, ladite souche contenant quatre sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:

le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété

le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et

le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B), ou au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D)

le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que

- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5

- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,

ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que

- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5

- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,

ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que

- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12

- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,

ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que

- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12

- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,

ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que

- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12

- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,

ledit site C est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 , ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site D, et

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5

- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,

ledit site C est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 , ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site D, et

- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue telle que définies ci-dessus, dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour une protéine d'intérêt.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue cité dans l'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrit, est choisi parmi :

la séquence SEQ ID NO : 212 qui code pour la protéine SEQ ID NO :208, la séquence SEQ ID NO : 213 qui code pour la protéine SEQ ID NO :209, la séquence SEQ ID NO : 214 qui code pour la protéine SEQ ID NO :210, la séquence SEQ ID NO : 215 qui code pour la protéine SEQ ID NO :211, la séquence SEQ ID NO : 173 qui code pour la protéine SEQ ID NO : 167, ou la séquence SEQ ID NO : 168 qui code pour la protéine SEQ ID NO : 165.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue cité dans l'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrit, est choisi parmi :

une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :208, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :209, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :210, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :211, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO : 167, ou une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO : 165, selon la dégénérescence du code génétique.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue telle que définies ci-dessus, dans laquelle ladite protéine d'intérêt est un antigène hétérologue immunogène.

Par « antigène hétérologue immunogène » on entend tout peptide ou protéine provenant d'un organisme différent de ladite souche mutante et capable de provoquer une réaction immunitaire.

Un antigène peut correspondre à un épitope ou à plusieurs épitopes. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins deux protéines d'intérêt et comprend les moyens nécessaires à leurs expressions, chacune desdites au moins deux protéines d'intérêt étant traduites de manière indépendante, c'est-à-dire qu'elles sont chacune contrôlées par des éléments nécessaires à leur traduction indépendants.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins deux protéines d'intérêt et comprend les moyens nécessaires à leurs expressions, chacune desdites au moins deux protéines d'intérêt étant traduites de manière indépendante, et dans laquelle lesdites au moins deux protéines d'intérêt sont des antigènes hétérologues immunogènes.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine d'intérêt et une protéine de résistance et les moyens nécessaires l'expression desdites protéines, chacune desdites protéines d'intérêt et de résistance étant traduites de manière indépendantes.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine d'intérêt et une protéine de résistance et les moyens nécessaires l'expression desdites protéines, chacune desdites protéines d'intérêt et de résistance étant traduites de manière indépendantes, et dans laquelle ladite au moins une protéine d'intérêt est un antigène hétérologue immunogène.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de virus. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène du virus Inf uenza.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza choisi parmi : la protéine de SEQ ID NO : 208(fragment N-ter d'un virus influenza humain I), ou la protéine de SEQ ID NO : 209 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO : 201 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza aviairel) ou la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza aviairell) ou la protéine de SEQ ID NO : 167, correspondant à la fusion, dans l'ordre, de deux protéines SEQ ID NO : 208, une protéine SEQ ID NO : 209, une protéine SEQ ID NO : 210 et une protéine SEQ ID NO : 211, espacée chacune par un linker pour permettre une bonne conformation de la protéine de fusion SEQ ID NO : 167, ou la protéine SEQ ID NO : 165, correspondant à la fusion, dans l'ordre, de la protéine SAG1 de T. gondii SEQ ID NO : 166, de deux protéines SEQ ID NO : 208, une protéine SEQ ID NO : 209, une protéine SEQ ID NO : 210 et une protéine SEQ ID NO : 211.

Selon un autre mode de réalisation particulier, les deux protéines SEQ ID NO : 208, la protéine SEQ ID NO : 209, la protéine SEQ ID NO : 210 et la protéine SEQ ID NO : 211, peuvent être fusionnées dans l'un des ordres suivants, en veillant toujours à ce qu'elles soient espacées par un linker :

['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210\ 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209']

['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208']

['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209']

['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211']

['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID ΝΟ:210', 'SEQ ID ΝΟ:208', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO :208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO :210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO :208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210']

['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209'],

la protéine issue de la fusion de ces protéines pouvant également être exprimée en fusion avec la protéine SAG1 de T. gondii SEQ ID NO : 166.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de bactérie.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de parasite.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue code pour un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie, et est en particulier constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173, codant pour l'antigène du virus Influenza SEQ ID NO : 167.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii et dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165,

ledit ADN hétérologue étant au locus du gène miel délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox N de SEQ ID NO : 5.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165,

ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic3 délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox P de SEQ ID NO : 12. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle les gènes mic 1, le gène mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5, et

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12, et

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est le site lox 2272 de SEQ ID NO :68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante selon l'invention, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii choisi parmi

- une souche dans laquelle

o le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N SEQ ID NO : 5 et

o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12.

- une souche dans laquelle le gène mic 1, le gène mic 3 et le gène roplôl sont délétés, et comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène roplôl délété,

ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène roplôl délété, étant flanqué en amont par un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase,

dans laquelle

o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N SEQ ID NO : 5, et

o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12, et o ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase qui flanque en amont ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène roplôl délété, est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés, contenant trois sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété étant différent des sites de recombinaison spécifique situés aux loci des gènes miel et mic3 délétés et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène roplôl délété, ledit ADN hétérologue étant différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel, mic3 et roplôl délétés, de telle façon que :

• lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et

d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (site A),

- lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et

d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 (site B) délété, o lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, il est flanqué :

- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène roplôl délété (site D), et

- d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène roplôl (site D) délété, ladite souche comportant les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine, ladite souche mutante contenant alors quatre sites de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase définis de la manière suivante :

le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,_ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété,

ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque Γ ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,

ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5

ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12

ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68

ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum et dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12.

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165, ledit ADN hétérologue étant au locus du gène miel délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox P de SEQ ID NO : 12.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12.

le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165,

ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic3 délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox N de SEQ ID NO : 5.

La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche mutante telle que définies précédemment, ne contenant pas d'ADN hétérologue différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, pour l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue, à l'exception d'une utilisation à des fins thérapeutiques.

La présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou comme immunostimulant. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère ou des oiseaux.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant en particulier choisi parmi l'Homme, les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un oiseau, ledit oiseau étant en particulier choisi parmi les poules, dindes, pintades, canards, oies, cailles, pigeons, faisans, perdrix, les autruches, les nandous, les émeus et les kiwis élevés ou détenus en captivité en vue de leur reproduction, de la production de viande ou d'œufs de consommation ou de la fourniture de gibier de repeuplement.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil digestif, provocant des diarrhées, affectant la digestibilité alimentaire ou l'absorption intestinale. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant le système nerveux central ou périphérique et toutes les conséquences sur les autres systèmes qui y seraient associées.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil locomoteur, notamment affectant le système musculo- squelettique ou articulaire en particulier les affections d'origine infectieuse provoquant des myosites, des arthrites ou affectant le vol.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil respiratoire et notamment les fièvres catarrhales, les abcès obstructifs, les perforations et emphysème d'origine infectieux, les trachéites, les bronchites, les pneumonies, les pleurésies ou dans le cas particulier des oiseaux, d'aerosacculites.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil reproducteur, la fécondité et la fertilité, notamment, une pathologie infectieuse affectant le développement normal de l'appareil reproducteur du mâle ou de la femelle, la physiologie du cycle reproducteur chez les femelles, affectant le bon déroulement de la gestation chez les mammifères incluant le développement fœtal ou affectant la qualité des œufs, en particulier, les pathologies infectieuses induisant des métrites, des salpingites, les mammites ou le syndrome de chute de ponte.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie d'origine infectieuse affectant l'appareil cardio-circulatoire, la moelle osseuse ou le sang, en particulier dans la prévention des affections d'origine infectieuse provocant une altération de la genèse des éléments figurés du sang et les septicémies incluant les conséquences associées sur les autres organes.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention chez l'animal du portage de virus, de bactéries ou de parasites par un animal ou par un sous-produit dérivé et ayant un caractère potentiellement zoonotique, en particulier, pour une utilisation dans la prévention du portage chez l'animal de Salmonella spp., d'Escherichia spp. zoonotique, de Clostridies, de mycobactéries dont la tuberculose.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse d'origine virale causée par un virus appartenant aux groupes suivant :

• Groupe I, II de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ADN susceptible d'infecter un mammifère ou un oiseau, en particulier un virus naturel appartenant à la famille des Herpesviridae, et plus particulièrement le virus Epstein-Barr responsable de la mononucléose humaine, l'herpès virus bovin de type I responsable de la rhinotrachéite infectieuse bovine ou le virus de la maladie Marek chez la poule domestique.

• Groupe III, IV et V de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ARN simple brin ou double brin et qui sont susceptibles d'affecter un mammifère ou un oiseau, en particulier des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae et plus particulièrement les virus Influenza humains, aviaires et porcins.

• Groupe VI de la classification de Baltimore comprenant les virus à ARN requérant une rétrotranscription en ADN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un mammifère ou un oiseau, en particulier les virus de la famille des Retroviridae, tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de l'immunodéficience féline (FIV), le virus de l'arthrite et encéphalite caprine ou le virus de la leucose féline FELV.

• Groupe VII de la classification de Baltimore comprenant les virus à ADN requérant une rétrotranscription en ARN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un mammifère ou un oiseau en particulier les virus de la famille des Hepadnaviridae, et plus particulièrement le virus de l'hépatite B humaine ou le virus de l'hépatite du canard de Pékin (DHBV).

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue SEQ ID NO : 165, pour son utilisation dans la prévention de la grippe causée par le virus Influenza.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse d'origine bactérienne (ou causée par une toxine provenant d'une bactérie), ladite bactérie pouvant appartenir aux groupes suivant :

• Des Coques GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau. En particulier des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, Streptococcus ou Enteroccoccus ;

• Des Coques GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Neisseria ;

• Des bacilles GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium ou Bacillus ;

• Des bacilles GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriacae. Pseudomonaceae, Vibrionaceae ou appartenant aux genres Escherichia, Brucella, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Legionella, Ornithobacterium ou Salmonella ;

• Des bactéries de forme spiralées GRAM positives ou négatives qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Treponema, Leptospira ou Borrelia ;

• Des bactéries de type mycoplasme qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Mycoplasma et Ureaplasma ;

• Des bactéries non sus-mentionnées ayant la capacité d'envahir une cellule d'un mammifère ou d'un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Chlamydia, Rickettsia ou Micobacterium.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie ayant pour origine une infection parasitaire, le parasite pouvant appartenir aux groupes suivant :

• Protozoaires susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des protozoaires appartenant à l'embranchement des sporozoaires, Rhizoflagellés, des ciliés ou appartenant aux genres Encephalitozoon, Enterocytozoon ou blastocystis ;

• Némathelminthes susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des Némathelminthes appartenant au genre Trichuris, Ascaris, Anisakis, Necator, Strongyloïdes, Toxocara, Ancylostoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, ou Enterobius ;

• Plathelminthes susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des Plathelminthes appartenant au genre Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis et Shistosoma ;

• Arthropodes susceptibles d'être responsable d'une affection ou de la vectorisation d'un agent infectieux vis-à-vis d'un mammifère ou d'un oiseau, en particulier des arthropodes appartenant à l'ordre des Anoploures des hétéroptères, des Shiphonaptères, des Diptères, des Brachycères ou des Acariens. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation comme immunostimulant.

On entend par « immunostimulant », que ladite souche mutante, contenant éventuellement un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, permet de stimuler les défenses immunitaires (comme un vaccin, par exemple).

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant au moins un produit choisi parmi : un adjuvant, un stabilisant ou un conservateur, ou un mélange de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une composition pharmaceutique, formulée sous forme de dose unitaire variant de 10 ² à 10 ⁹ tachyzoïtes d'une souche mutante telle que définie précédemment.

La présente invention concerne également une composition vaccinale comprenant une souche mutante telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également une méthode de prévention d'une pathologie infectieuse d'origine virale, parasitaire ou bactérienne comprenant une étape d'administration à un mammifère ou à un oiseau d'une souche mutante. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel et mic3 sont délétés, à partir d'une souche sauvage, comprenant :

une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété,

une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété

les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, et les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3.

La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés et dans laquelle un gène codant pour la protéine GRA15II est intégré au locus du gène roplôl délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant :

- Une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété,

Une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi d'une étape d'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3

- une étape C comprenant ou constituée de la délétion du gène roplôl par recombinaison homologue et insertion d'une cassette comprenant une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique , et comprenant en aval de cette cassette de sélection une séquence codant pour le gène gral5II, suivi d'une étape d'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle ladite séquence codant pour le gène gral5II est alors intégrée au locus du gène roplôl délété en aval d'un seul site de recombinaison spécifique les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène roplôl étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant les cassettes de sélection insérées aux locus des gènes miel et mic3.

les étapes A, B et C pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B suivi de C, ou A suivi de C suivi de B, ou B suivi de A suivi de C, ou B suivi de C suivi de A, ou C suivi de A suivi de B, ou C suivi de B suivi de A.

La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel et mic3 sont délétés et dans laquelle un ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant :

- une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété,

une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A,

puis une étape D comprenant ou constituée de l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue flanqué par un site de recombinaison spécifique, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété,

ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic3 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété

une fois intégré, ledit ADN hétérologue sera donc encadré par deux sites de recombinaison spécifique.

La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés et dans laquelle un ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et un gène codant pour la protéine GRA15II est intégré au locus du gène roplôl délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant :

- Une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une première cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, Une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase,

suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3

- Une étape C comprenant ou constituée de la délétion du gène roplôl par recombinaison homologue et insertion d'une cassette comprenant une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique, ces deux sites de recombinaison spécifique étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel et de ceux encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3, et comprenant en aval de cette cassette de sélection une séquence codant pour le gène gral5II,

suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle ladite séquence codant pour le gène gral5II est alors intégrée au locus du gène roplôl délété en aval d'un seul site de recombinaison spécifique les étapes A, B et C pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B suivi de C, ou A suivi de C suivi de B, ou B suivi de A suivi de C, ou B suivi de C suivi de A, ou C suivi de A suivi de B, ou C suivi de B suivi de A, puis

une étape D comprenant ou constituée de l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue flanqué par un site de recombinaison spécifique, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété,

ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic3 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ledit ADN hétéro logue est intégré au locus du gène ropl6 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène ropl6 délété,

une fois intégré, ledit ADN hétérologue sera donc encadré par deux sites de recombinaison spécifique.

DESCRIPTIONS DES FIGURES

Figure 1 : cette figure est une représentation schématique de recombinaison par le système Cre/loxP appliqué au gène X encadré par les sites loxP identiques

Figure 2- A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC3-KO- CAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10063 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmic3.

Figure 2-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMICl-KO- CAT-GFP loxP. Ce plasmide de 10069 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmicl.

Figure 2-C : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTSAGl- Cre Recombinase. Ce plasmide de 4 694 paires de bases comprend le gène codant pour la protéine CRE-Recombinase placé sous le contrôle du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii est insérée pour stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase.

Figure 3-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Neo ncmicl-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmicl-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase.

Figure 3-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum, la souche Neo ncmic3 KO, la souche Neo ncmic3 KO 2G, la souche Neo ncmicl-3 KO et la souche Neo ncmicl-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 3.

Figure 3-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Neo ncmicl-3 KO 2G et confirme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxP et LoxN.

Figure 4- A : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection de la protéine MIC3 obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et souche Neo ncmicl-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC3.

Figure 4-B : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection de la protéine CATGFP obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et les souches mutantes de Neospora caninum en utilisant la fluorescence intrinsèque de la protéine CATGFP. Cette figure permet de mettre en évidence la présence de la protéine CATGFP ou l'absence de la protéine CATGFP suite à l'action de la Cre Recombinase. Figure 5-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC3-KO- CAT-GFP loxP. Ce plasmide de 9 931 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmic3.

Figure 5-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMICl-KO- CAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10 285 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmicl.

Figure 6-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmicl-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase.

Figure 6-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmicl-3 KO et la souche finale Toxo tgmicl-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 7.

Figure 6-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G et confirme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxN et LoxP. Figure 7 : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection des protéines MIC1, MIC3 ou CAT-GFP obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmicl-3 KO et la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC1, MIC3 ou directement avec les propriétés fluorescentes intrinsèques de la protéine CAT-GFP.

Figure 8 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgRopl6KO- Gral5nKI-CAT-GFP lox2272. Ce plasmide de 12721 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites lox2272 identiques de même orientation, ajoutés par PCR. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d'expression permettant de coder la protéine Gra51HAII. Puis de part et d'autre de ces cassettes ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgroplô.

Figure 9-A : cette figure illustre les 2 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP et le gène gral5IIHA au locus du gène ropl6. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche mutante Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15n Kl. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT- GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase pour obtenir la souche Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15 _n KI-2G.

Figure 9-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO 2G, Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 _n Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 _n Kl 2G.

Figure 9-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl 2G et confirme que les gènes ropl6 et cat-gfp ont été supprimés et remplacés par la cicatrice Lox2272 et le gène gral5HAII.

Figure 10 : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15 _n Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 _n KI-2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag HA. Cette figure illustre également la suppression de la cassette CATGFP avec la disparition de la fluorescence GFP pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 _n KI-2G.

Figure 11-A : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes ncmic3, ncmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic3 KO 2G et/ou Neo ncmicl-3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO 2G de Neospora caninum. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO : x) définies dans la présente demande.

Figure 11-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgmic3, tgmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic3 KO et/ou Toxo tgmic3 KO 2G et/ou Toxo tgmicl-3 KO et/ou Toxo tgmicl-3 KO 2G de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO : x) définies dans la présente demande.

Figure 11-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgroplô, gral5ll, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO : x) définies dans la présente demande.

Figure 12 : cette figure illustre le titrage en anticorps spécifique dirigé contre Neospora caninum dans le sérum de souris vaccinées 30 jours au préalable par la souche NeoKO 2G. Le véhicule ayant été utilisé en contrôle. n=2 par groupe. ANOVA deux voies. .

Figure 13-A : cette figure illustre le suivi des scores cliniques observés pour les souris.

Figure 13-B : cette figure illustre le titrage en anticorps spécifique dirigé contre T. gondii dans le sérum de souris à J-2, J28 et J129. ANOVA une voie (**** : pO.0001, * : p<0.05). Figure 13-C : cette figure illustre le dosage d'IFNy suite à une restimulation des splénocytes avec l'extrait total de T. gondii 72h après la restimulation. ANOVA une voie (**** : p<0.0001, * : p<0.05). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.

Figure 13-D : cette figure illustre le nombre de kystes cérébraux détectés chez les mères. ANOVA une voie (* : p<0.05). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.

Figure 13-E : cette figure illustre la prolificité obtenue pour chaque lot.

Figure 13-F : cette figure illustre le sex-ratio obtenu pour chaque lot. ANOVA deux voies (** : p<0.01), * : p<0.05).

Figure 13-G : cette figure illustre les résultats obtenus pour la mortinalité.

Figure 13-H : cette figure illustre les résultats obtenus pour la mortalité observée par portée pour chaque lot. ANOVA une voie (**** : p<0.0001, *** : p<0.001). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.

Figure 13-1 : cette figure illustre le pourcentage de survie obtenue pour les souriceaux sur 32 jours. Log-rank (Mantel-Cox) test (**** : p<0.0001). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.

Figure 13-J : cette figure illustre le suivi des scores cliniques observés pour les souriceaux.

Figure 13-K : cette figure illustre le titrage en IgM spécifique dirigé contre T. gondii dans le sérum de souris de chaque lot. ANOVA une voie (**** : p<0.0001, ** : p<0.01). Exemple 1 : Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G

L'haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Neospora caninum utilisés ont été produits en fîbroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des plasmides

• Plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN

Le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Ρα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène cat-gfp SEQ ID :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxN SEQ ID NO :5 identiques de même orientation.

Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces cat-gfp LoxN For SEQ ID NO :7 et catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 (2380pb), digérée par les enzymes de restriction Clal et Xbal (2348 pb) et clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par Clal et Xbal (7715 pb).

Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1.

Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 1 ci-dessous. Le plasmide pNcMic3KO- CAT-GFP loxN contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par une séquence 5 'HR du gène ncmic3 SEQ ID NO : 98 et une séquence 3'HR du gène ncmic3 SEQ ID NO : 97. Tableau 1 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcMIC3-KO-CAT- GFP loxN catgfp loxN For SEQ ID NO : 7

TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCGTATAGT ATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGTCCGCGTTCGTGA AATCTC Clal LoxN

catgfp loxN rev SEQ ID NO :8

ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGGTATACT ATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAATTGTGTTAACCG Xbal loxN

GTTCGA

• Plasmide pNcMIC 1 -KO-CAT-GFP lox

Le plasmide pNcMicl KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval de la séquence codant CAT-GFP, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser PARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxP SEQ ID NO : 12 identiques de même orientation.

Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces CN10 SEQ ID NO : 13 et CN11 SEQ ID NO : 14 permettant l'ajout des sites loxP SEQ ID NO : 12 (2394 pb), digérée par les enzymes de restriction HindIII et BamHI (2339 pb) et clonée dans le plasmide pT230-ble SEQ ID NO : 37 digéré par HindIII et BamHI (293 lpb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 113.

La région 3 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmicl F Kpnl et 3 HR NCmicl R HindIII (SEQ ID NO: 114 et SEQ ID NO: 115) permettent l'amplification de la région 3 HR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 113. Le plasmide obtenu est dénommé pNcmicl-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118.

La région 5 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR NCmicl F BamHI et 5 HR NCmicl R Notl (SEQ ID NO: 116 et SEQ ID NO: 117) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pNcmicl-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118 (BamHI -Notl).

Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11. Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par une séquence 5'HR du gène ncmicl SEQ ID NO : 96 et une séquence 3'HR du gène ncmicl SEQ ID NO : 95.

Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP

Construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP

SEQ ID NO : 13

CN10 GCGGCCAAGCTT/ί TAA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGA Hindlll, loxP

yiGr 47OATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg

SEQ ID NO : 14

cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGA^C 4GrGGATCCyiryiyi

CN1 1 Spel, BamHI, loxP

CTTCGTA TA GCA TA CA TTA TA CGAA GTTA 7CCCTCGGGGG

GGCAAGAATT

3 HR NCmicl F SEQ ID NO: 1 14

Kpnl

Kpnl CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGAAGGTTCCTC

3 HR NCmicl R SEQ ID NO: 1 15

Hindlll

Hindlll CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAAAGAAGC

5 HR NCmicl F SEQ ID NO: 1 16

BamHI

BamHI CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGTTGCACAC

5 HR NCmicl R SEQ ID NO: 1 17

Notl

Notl CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGCAGAACTCTG

• Plasmide pTSAGl- Cre Recombinase

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage PI (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment). Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial). qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl .

Dans le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO : 16 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase.

L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase.

Construction de la souche Neomicl-3 KO - 2G

La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Neo ncmicl- 3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes :

1. Délétion par recombinaison homologue du gène ncmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences LoxN SEQ

ID NO : 5.

Pour obtenir cette souche, la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum est électroporée avec le plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO : 1. 20 μg de plasmide purifié puis linéarisé par Kpnl sont ajoutés à 10 ⁷ parasites mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de ΑΤΡ (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun l l ; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 μΕ, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous- clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 101. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 106 est présente dans le génome de la souche.

Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO : 6 : la souche Neo ncmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15.

L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 106 est présente dans le génome de la souche.

Délétion par recombinaison homologue du gène ncmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO : 12.

Pour obtenir cette souche, la souche Neo ncmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pNcMICl-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO : 11 linéarisé par Kpnl, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmicl-3 KO Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Dans cette souche, le gène miel a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 102.

4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO : 6 : la souche Neo ncmicl-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15.

L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmicl-3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 91.

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G par PCR

Pour valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-A et sont détaillées dans le Tableau 3 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 3-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 4 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 3-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (ncmic3, ncmic3KO CATGFP et ncmic3KO loxN (2 G) ou ncmicl, ncmiclK ) CATGFP et ncmicl Jd loxP(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues Tableau 3 : Liste des amorces utilisées pour la validation des souches.

Tableau 4 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Neospora caninum

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces c SEQ ID NO : 22 et d SEQ ID NO : 23 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 850 paires de bases pour la souche NC-1, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène ncmic3 SEQ ID NO : 105 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmic 1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces i SEQ ID NO : 24 et j SEQ ID NO : 25 et les amorces k SEQ ID NO : 26 et 1 SEQ ID NO : 27 (mix Ncmic3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 2960 et 3668 paires de bases pour la souche Neo ncmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp dans cette souche à la place du gène ncmic3. Cette bande n'est pas détectée dans les souches NC-1, Neo ncmic3 KO - 2G, Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmic 1- 3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 au locus ncmic 3 dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces amorces g SEQ ID NO : 32 et h SEQ ID NO :33 (cicatrice Ncmic3) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2163 paires de bases pour la souche NC-1, confirme la présence du gène ncmic3 SEQ ID NO : 105 dans cette souche. Une bande de 2575 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo ncmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène ncmic3. Enfin une bande de 276 paires de bases est mise en évidence pour les souches Neo ncmic3 KO - 2G Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO : 5 dans le génome.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces a SEQ ID NO : 20 et b SEQ ID NO :21 (mix Ncmic 1) permettent de mettre en évidence une bande à 644 paires de bases pour les souches NC-1, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène ncmic 1 SEQ ID NO : 106 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmicl- 3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces m SEQ ID NO : 28 et j SEQ ID NO : 25 et les amorces k SEQ ID NO : 26 et n SEQ ID NO : 29 (mix Ncmic 1) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3359 et 3421 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche à la place du gène ncmic 1. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage NC-1 de N. caninum, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, et Neo ncmic 1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection at-gfp SEQ ID NO : 2 au locus ncmic 1 dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO : 30 et f SEQ ID NO : 31 (cicatrice Ncmic 1) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2182 paires de bases pour les souches NC-1, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G confirme la présence du gène ncmic 1 dans ces souches. Une bande de 2560 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo ncmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène ncmic 1. Enfin une bande de 261 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO : 12 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquencés et les séquençages ont confirmés que :

• le gène ncmic3 SEQ ID NO : 105 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO : 5 conforme à la séquence attendue (Figure 3C).

• le gène ncmic 1 SEQ ID NO : 106 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO : 12 conforme à la séquence attendue (Figure 3C).

Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G par immunofluorescence

Les tachyzoïtes cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBSIX, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBSIX, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBSIX pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min.. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBSIX puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 permet une reconnaissance de la protéine Ncmic3, il permet de détecter l'expression de la protéine NcMIC3 SEQ ID NO : 118 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb anti-MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor ^® 594 chèvre anti- lapin (Life technologies réf. A-l 1012). Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC3 (Figure 4- A).

L'anticorps primaire Tgmicl ne permet pas une reconnaissance de la protéine NcMICl SEQ ID NO : 119.

Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Neo ncmic3 KO et Neo ncmicl-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Neo ncmic3 KO - 2G et Neo ncmicl-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP SEQ ID NO :6) (Figure 4-B).

Exemple 2 : Construction de la souche Toxo tsmicl-3 KO - 2G

L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des plasmides

• Plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP

Le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP Lox P SEQ ID NO : 34 (Figure 5A) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC3 de Toxoplasma gondii (référence ATCC : souche RH Pra310) par recombinaison homologue.

Le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant un gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3. En aval du gène cat-gfp SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 qui permettent l'ajout des sites loxP (SEQ ID NO : 12) et des sites de restrictions HindIII et Spel. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR (2389 pb) a ensuite été cloné dans le plasmide pT230TUB Ble SEQ ID NO : 37 par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction HindIII et Spel. Le plasmide obtenu est dénommé pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38.

La région 3'HR du gène tgmic3 SEQ ID NO : 39 a été obtenu par la double digestion enzymatique du plasmide pmic3KO-2 SEQ ID NO : 40 avec les enzymes de restriction Kpnl et HindIII (2145pb), puis cloné dans le plasmide pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38 digéré par Kpnl et HindIII (5238pb). Le plasmide obtenu est dénommé p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO : 41.

La région 5'HR du gène tgmic3 SEQ ID NO : 42 a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche RH de T. gondii. Pour l'amplification, les amorces SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène tgmic3 et la création de deux sites de restrictions (2568pb / sites Spel et Xbal). Ces sites de restrictions ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR digéré par Spel et Xbal (2548pb) dans le plasmide p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO : 38 en aval de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 au niveau du site Spel du plasmide précédemment décrit (7383pb) pour obtenir le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34.

Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 5 ci-après.

Tableau 5 : Séquences des amorces utilisées pour la construction du plasmide pTgMIC3-KO- CAT-GFP loxP .

Construction du plasmide pTgmic3KO CAT-GFP loxP

GCGGCCAAGCTT/ί TAA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGA

SEQ ID NO : 35 /ÎGrr/i7GATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg HindIII, loxP cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGA^C 4G7OGATCC^r 4

SEQ ID NO : 36 CTTCGTA TA GCA TA CA TTA TA CGAA GTTA 7CCCTCGG Spel, BamHI, loxP

GGGATCCACTAGTTTACGTATCGCGACTAGCAGCAAG BamHI, Spel,

SEQ ID NO : 43 TTGAGTGACAGCG SnaBI, NruI

GCTGCAGTCTAGAGATATCCACGTGGAATTCCTCTTGG PstI, Xbal, EcoRV

SEQ ID NO : 44 GAAGAACAAT Pmll • Plasmide pTgMIC 1 -KO-CAT-GFP loxN

Le plasmide pTgMICl -KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 (Figure 5-B) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC 1 de Toxoplasma gondii par recombinaison homologue.

Le plasmide pTgMicl KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3. En aval du gène cat-gfp SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 a été insérée.

La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47 qui permettent l'ajout des sites loxN (SEQ ID NO : 5) et des sites de restrictions Clal et Xbal. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR a ensuite été cloné dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par Clal et Xbal (7715 pb) par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction Clal et Xbal.

Le plasmide obtenu est dénommé pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48.

Le fragment 5HR tgmicl SEQ ID NO : 49 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 (2364pb), les sites de restriction Kpnl et Clal ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction Kpnl et Clal (2337pb) et cloné dans le plasmide pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48 (voir exemple 1 pour l'obtention du plasmide pNCmic3KO CATGFP LoxN) digéré par Kpnl et Clal (7740pb) pour remplacer le fragment 5HR ncmic3 (fragment digéré par Kpnl et Clal). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmiclK05HR-NCmic3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111.

Puis le fragment 3HR tgmicl SEQ ID NO : 52 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 (2750pb), les sites de restriction Xbal et Notl ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction Xbal et Notl (2720 pb) puis cloné dans le plasmide pTgmiclK05HR-NCmic3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111 digéré par les enzymes de restriction Xbal et Notl (7565 pb) pour remplacer le fragment 3HR ncmic3 (fragment digéré par Xbal et Notl). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmiclKO CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 45. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 6 ci-dessous.

Tableau 6 : Amorces permettant la construction du plasmide pTgmic3KO CAT-GFP loxP

• Plasmide pTSAGl- Cre Recombinase

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage PI (Brecht et al, 1999, même référence que précédemment).

Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial) qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl . Dans le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO : 16, est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO : 16, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase.

L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase.

Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G

La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmicl-3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes (Figure 6-A) : Délétion par recombinaison homologue du gène tgmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO : 12.

Pour obtenir cette souche, la souche sauvage de Toxoplasma gondii RH (référence ATCC : PRA-310) est électroporée avec le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO :34. 20 μg de plasmide purifié puis linéarisé par Kpnl sont ajoutés à 10 ⁷ parasites mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de ΓΑΤΡ (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al, Nucleic Acid Research, Jun 11 ; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 μΡ, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 103. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 108 est présente dans le génome de la souche.

Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO : 6 : la souche Toxo tgmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15.

L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo igmic3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 108 est présente dans le génome de la souche. Délétion par recombinaison homologue du gène tgmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences Lox N SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgMICl-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :45 linéarisé par Pcil, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 104.

Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmicl-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G par PCR

Pour valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-B et sont détaillées dans le Tableau 7 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 6-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 8 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 6-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (tgmic3, tgmic3KO CATGFP et tgmic3KO loxP (2 G) ou tgmicl, tgmiclKO CATGFP et tgmiclKO loxN(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues.

Tableau 7 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches.

Tgmic3 5 TgMlC3 SEQ ID NO 61 : 6 TgMlC3 SEQ ID NO 62 :

(mixl) For CCTCCGATGTGACTTTTGGT Rev GATCCTCGGAGCAAGTCAAC

Validation 1 CN58 SEQ ID NO 63 : j ORF

KO 3 ATACGAAGGGATTCGACGTG CATGFP

5'Tgmic3(mi R SEQ ID NO 25 :

x2) CCGTTTGGTGGATGTCTTCT

Validation k ORF 1 HR Mic3 SEQ ID NO 64

KO CATGF SEQ ID NO 26 : 4 RL ATATGCGGATGAGTGCTCGAA

3'Tgmic3 P F GCATCGACTTCAAGGAGGAC TT

(mix3)

Cicatrice 9 Tgmic3 SEQ ID NO 65 : 1 Tgmic3 SEQ ID NO 66 :

Tgmic3 loxN F GTGTGGAGACTTTTTACTTCGT 0 loxN R CCTCCGATGTGACTTTTGGT

(mix4) GTTAC

Tgmicl 3 TgMICI SEQ ID N0 55 : 4 TgMICIR SEQ ID NO 56 :

(mix5) For ATGCGCGCTATAAAGAATCG ev AGAAACAACGCCTGGCCCAT

Validation 1 tgmicl K SEQ ID NO 57 : j ORF SEQ ID NO 25 :

KO 1 O integ GTGCGATGACGTGGCTTCTCTATC CATGFP CCGTTTGGTGGATGTCTTCT

5'Tgmicl(mi F ATGTGT R

x6)

Validation k ORF SEQ ID NO 26 : 1 tgmiclKO SEQ ID N0 58 :

KO CATGF GCATCGACTTCAAGGAGGAC 2 integ R GATTCGCTTCGTCACTTCTGGTACG

3 'Tgmicl P F GATGC

(mix7)

Cicatrice 7 Tgmicl SEQ ID N0 59 : 8 Tgmicl SEQ ID NO 60 :

Tgmicl loxN F CCCGTCTAGCAAGACCTCAA loxN R TCGGTGCTGCTCAGTAATTG

(mix8) Tableau 8 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Toxoplasma gondii

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 5 SEQ ID NO :61 et 6 SEQ ID NO : 62 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 808 paires de bases pour la souche RH, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène tgmic3 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 13 SEQ ID NO :63 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 14 SEQ ID NO :64 (mix 2 et 3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3253 et 3537 paires de bases pour la souche Toxo tgmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches RH, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Tgmic 3 dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 9 SEQ ID NO :65 et 10 SEQ ID NO :66 (mix 4) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 1596 paires de bases pour la souche RH, confirme la présence du gène tgmic3 SEQ ID NO : 107 dans cette souche. Une bande de 2525 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène tgmic3. Enfin une bande de 226 paires de bases est mise en évidence pour les souches Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat- gfp SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO : 12 dans le génome.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 3 SEQ ID NO :55 et 4 SEQ ID NO :56 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 608 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène tgmicl SEQ ID NO :108 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 11 SEQ ID NO :57 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO : 26 et 12 SEQ ID NO : 58 (mix 6 et 7) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3040 et 3593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche à la place du gène tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage RH de T. gondii (référence ATCC : PRA-310), Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Tgmicl dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 7 SEQ ID NO :59 et 8 SEQ ID NO : 60 (mix 8) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 4198 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G confirme la présence du gène tgmicl SEQ ID NO : 108 dans ces souches. Une bande de 3129 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène tgmicl. Enfin une bande de 830 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome.

Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquencés et les séquençages ont confirmés que : • le gène tgmic3 SEQ ID NO :107 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT- GFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO : 12 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C).

• le gène tgmicl SEQ ID NO :108 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT- GFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la CRE-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C).

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G par immunofluorescence

Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PB S IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2%> SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.

L'anticorps primaire Tgmic3 utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMIC3 SEQ ID NO : 121 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb anti- MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor ^® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-l 1012).

L'anticorps primaire Tgmicl utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMICl SEQ ID NO : 122 dans le parasite (anticorps de souris anti-miel : mAb anti-MICl T104F8E12) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor ^® 594 chèvre anti-souris, Life technologies réf. A-l 1005).

Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC1 et MIC3 dans des tachyzoïtes Toxo tgmicl-3 KO - 2G alors qu'une fluorescence au pôle apical du parasite de la souche sauvage démontre l'expression des protéines MIC1 et MIC3 (figure 7).

Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmicl-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Toxo tgmic3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP) (Figure 7).

Exemple 3 : Construction de la souche Toxo tsmicl-3 KO wp!6 KO GralSII Kl

Matériel et méthode

L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction du plasmide

Le plasmide pTgRopl6KO-Gral5 _n KI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67 (Figure 8) contient la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2, codant pour la protéine de fusion CAT-GFP conférant une résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène de sélection SEQ ID NO : 2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT-GFP.

La cassette de sélection SEQ ID NO : 6 est encadrée par deux sites Lox2272 SEQ ID NO : 68, sites de reconnaissance spécifiquement reconnus par la Cre Recombinase et qui seront utilisés ultérieurement pour supprimer la cassette de sélection CAT-GFP.

En aval du deuxième site Lox2272, une cassette d'expression du gène gral5n SEQ ID NO : 69 a été cloné. Cette cassette d'expression est constituée du promoteur de gra 15u amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49 et du gène gral5n SEQ ID NO : 70 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49, incluant un tag HA en 3 ' SEQ ID NO : 72 pour faciliter la localisation et de la séquence 3'UTR du gène sagl de T. gondii SEQ ID NO :4 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche RH. Ce plasmide permet donc la réalisation simultanée d'un mutant roplôKO lox2272 CATGFP lox2272 et l'insertion de gral5IIHA au locus ropl6.

Le plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 contient une cassette CAT- tdTomato SEQ ID NO : 125 - encadrée par une séquence 5'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 100.

Le clonage a été fait à partir du plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par les enzymes SphI et Agel (6073pb). Ce clonage a nécessité 4 PCR indépendantes.

La première PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pCATGFP lox P SEQ ID NO : 38, d'une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comportant le promoteur aTubuline, le gène de sélection cat-gfp et la région 3'UTR de sagl de T. gondii, avec ajout du site lox2272 SEQ ID NO : 68 avec les amorces tub F Agel SEQ ID NO : 74 et 3 UTR lox2272 R SEQ ID NO : 75 (2090pb).

La deuxième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du promoteur gral5II SEQ ID NO : 71 avec ajout en 5' du site lox2272 SEQ ID NO : 68 avec les amorces pGral5 F lox2272 SEQ ID NO : 77 et P Gral5 R SEQ ID NO : 78 (1975pb).

La troisième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID

NO :76, du gène gral5II HA avec le 3'UTR de sagl SEQ ID NO : 79 (2092 pb) avec les amorces Gral5F SEQ ID NO 126et UTR sagl roplô R SEQ ID NO 127.

Les amorces utilisées pour la construction de ce plasmide sont répertoriées dans le tableau 9 ci-dessous.

Tableau 9 : Amorces utilisées pour la construction du plasmide pT230 2G Gral5II

La dernière PCR a permis l'amplification d'une partie de 3'Ropl6 SEQ ID NO : 80 avec les amorces Ropl6F SEQ ID NO : 81 et Ropl6R SphI SEQ ID NO : 82 (570pb) sur le plasmide pTgroplô KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 comme matrice.

Les 4 fragments de PCR amplifiés ont été directement clonés dans le vecteur pTgroplô KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par Agel et SphI grâce à au kit In-Fusion® de Ozyme (In-Fusion® HD Cloning Kit - Clonetech). La technologie de clonage In-Fusion® permet le clonage en une étape sans purification ou digestion d'un ou de plusieurs produits de PCR dans un vecteur linéarisé. Des extrémités complémentaires aux extrémités des fragments adjacents sont ajoutées par PCR. La réaction se fait selon les recommandations du constructeur. Le plasmide obtenu est dénommé pTgRopl6KO-Gral5 _n KI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67. Le plasmide dénommé pTgRopl6KO-Gral5 _n KI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67 contient donc une cassette CAT- GFP SEQ ID NO : 6 et une cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO : 69, encadrées par une séquence 5'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 100.

Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G

La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmicl-3 KO roplô KO GralSII Kl -2G, est faite en 2 étapes distinctes :

1. Délétion par recombinaison homologue du gène roplô et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences Lox2272

SEQ ID NO : 38 et la cassette gral5IISEQ ID NO :69. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgRopl6KO-Gral5 _n KI-CAT-GFP lox 2272 SEQ ID NO : 67 (20 μg) linéarisé par Pcil, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GralSII KL

Dans cette souche, le gène ropl6 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 et la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène ropl6 délété contenant la cassette de sélection CATGFP et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 112. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Suppression de la cassette de sélection: la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15 (Figure 2-C). L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GralSII Kl -2G.

Dans cette souche, le gène ropl6 a été délété et remplacé par la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène ropl6 délété contenant la cassette un seul site lox 2272 SEQ ID NO : 68 et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 93.

Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.

Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl -2G par PCR

Pour valider la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11- C et sont détaillées dans le Tableau 10 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 9-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 11 ci-dessous.

Tableau 10 : liste des amorces utilisées pour la validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G.

Tableau 11 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G

Toxo tgmicl- Toxo tgmicl-3 KO Toxo tgmicl-3 KO

3 KO - rop 16 KO rop 16 KO

2G Gral5II KI Gral5II KI -2G

Tgroplô (mixl) 1682 - -

Validation KO 5 'Tgro lô - 2759 -

(mix2)

Validation KO 3' Tgro lô - 2870 2870

(mix3)

Cicatrice ro lôKO - 2550 321

gral51oxP (mix4)

Gral5I/II (mix5) 560 560 et 308 560 et 308 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rgl SEQ ID NO : 83 et rg2 SEQ ID NO: 84 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 1682 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène tgroplô dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg3 SEQ ID NO: 85et rg4 SEQ ID NO: 86 (mix 2) permettent de mettre en évidence une bande à 2759 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène tgroplô dans cette souche et l'insertion du gène de sélection CATGFP et gral5II à la place du gène tgroplô. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II KI -2G.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg5 SEQ ID NO: 87 et rg6 SEQ ID NO: 88 (mix 3) permettent de mettre en évidence une bande à 2870 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène tgroplô dans cette souche et l'insertion du gène gral5II à la place du gène tgroplô. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg7 SEQ ID NO: 89 et rg8 SEQ ID NO: 90 (mix 4) permettent de mettre en évidence une bande de 2550 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène tgroplô. Enfin une bande de 321 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice lox2272 SEQ ID NO : 68 dans le génome. Aucune bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Le produit PCR « cicatrice » obtenue pour la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G (321 paires de bases) a été séquencé et les séquençages ont confirmés que :

• le gène tgroplô a été supprimé et que la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :

6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice Lox2272 SEQ ID NO : 68 conforme à la séquence attendue (Figure 9-C). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO: 109 et SEQ ID NO: 110 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 560 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène tggral5 dans cette souche. Une bande supplémentaire à 308 paires de bases est détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la présence du gène gral5HAII dans ces souches.

Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl -2G par

immunofluorescence

Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PB S IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2%> SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.

L'anticorps primaire utilisé est l'anticorps de souris anti-HA qui permet de détecter l'expression de la protéine GRA15n-HA SEQ ID NO : 123 dans le parasite. L'anticorps secondaire est l'anticorps secondaire commercial : Alexa fluor® 594 chèvre anti lapin (Life Technologies A-l 1012). Les anticorps sont dilués au 1/1000 dans du PBS SVF 2%.

Pour la souche sauvage Toxo tgmicl-3 KO 2G, aucune fluorescence rouge n'est observée au pôle apical du parasite révélant ainsi l'absence de la protéine GRA15n-HA. Au contraire, pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl, une fluorescence rouge est observée démontrant la protéine GRA15n-HA. La souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl exprime une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 alors qu'après action de la Cre recombinase, la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl lox2272 n'est plus fluorescente (Figure 10). Exemple 4 : Construction de souches recombinantes exprimant la protéine M2eGPI après intégration ciblée

L'objectif de cette expérience est d'évaluer si les souches Toxo tstnicl-3 KO 2G et Neo ncmicl-3 KO 2G peuvent exprimer des antigènes hétérologues.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fîbroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des plasmides

Plasmide pUC 4G2 ICrel

Le plasmide pUC 4G2 ICrel SEQ ID NO : 156 a été construit pour permettre l'intégration d'un transgène hétérologue dans les souches Toxo tgmicl-3 KO 2G, Neo ncmicl-3 KO 2G et Toxo tgmicl-3 KO roplô KO gral5II Kl.

Le plasmide est notamment composé :

1- d'une cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 229 (Donald & Roos, Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 15;90(24): 11703-7; Scahill et al, (Mol Biochem Parasitol. 2008 Jan;157(l):73-82. Epub 2007 Oct 6.)), placée sous la dépendance du promoteur de dhfr* SEQ ID NO : 230 de T. gondii et en aval de la séquence 3'UTR du gène dhfr* SEQ ID NO : 231 de Toxoplasma gondii. Cette cassette de sélection permet de coder la protéine de fusion DHFR*TYTK SEQ ID NO : 207 et permet une sélection positive par la pyriméthamine et une sélection négative par le ganciclovir.

2- d'une cassette d'expression constitué du promoteur de I'a-Tub8 SEQ ID NO : 128 (Soldati et al, Mol Cell Biol. 1995 Jan;15(l):87-93 - fusion d'une partie du promoteur de Tgsagl et Tgtub), d'un site de clonage multiple MCS pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène tgsagl SEQ ID NO : 4 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. La cassette de sélection dhfr*-ty-tk a été réalisée à partir de 3 fragments PCR obtenus avec les amorces du tableau 20:

• L'amplification du premier fragment PCR SEQ ID NO : 129 a été effectuée sur le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 130 (Donald & Roos 1993, même référence que précédemment) avec les amorces Dhtkl SEQ ID NO : 131 et Dhtk2 SEQ ID NO : 132 (674pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de DHFR* SEQ ID NO : 133 et d'ajouter la séquence codant le TY en 3' SEQ ID NO : 134.

• La deuxième PCR a été effectuée sur une séquence synthétisée du gène codant la Thymidine Kinase de l'Human herpesvirus 1 (TK) SEQ ID NO : 135 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 136 et Dhtk4 SEQ ID NO : 137 (1161pb) et permet l'amplification de la séquence codante de la Thymidine Kinase avec ajout de la séquence codant le TY en 5' SEQ ID NO : 138.

• L'amplification du troisième fragment de PCR a été effectuée sur pUC18DHFR* SEQ ID NO : 130 avec les amorces Dhtk5 SEQ ID NO : 139 et Dhtk6 SEQ ID NO : 140 (363pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de la Thymidine Kinase et du 3'UTR de DHFR* SEQ ID NO : 141.

Les deuxième et troisième fragments de PCR sont fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 136 et Dhtk6 SEQ ID NO : 140 (1501pb) pour donner la séquence SEQ ID NO : 191. Enfin le premier fragment SEQ ID NO : 129 digéré par BamHI et BglII (646pb) et la fusion des deux autres PCR SEQ ID NO : 191 digéré par BamHI et Xbal (1474pb) sont clonés dans le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 130 digéré par BglII et Xbal (5258pb). Le plasmide obtenu est appelé pUC 18DHFR*TYTK SEQ ID NO : 142.

Tableau 20 : Liste de amorces utilisées

Dhtk AF SEQ ID NO : 131 Dhtk AF SEQ ID NO : 132

1 DHFRi CTGAGAAGGGCGTGAAGA 2 DHFR GTCAAGTGGATCCTGGTTAGTA nt Bgl TC TY R TGGACCTCGACAGCCATCTCCA

F TCTGGATTCG

Dhtk TY SEQ ID NO : 136 Dhtk HSVT SEQ ID NO : 137

3 HSVT GAGGTCCATACTAACCAG 4 K stop TTAGTTAGCCTCCCCCATCTCC

K F GATCCACTTGACATGGCTT TAA C CGTACCCCTGCCATCA R

Dhtk AFHS SEQ ID NO : 139 Dhtk AF SEQ ID NO : 140

5 VTK3 GGGAGATGGGGGAGGCTA 6 3UTR TTTTTCTAGAATCCTGCAAGTG UTRD ACTAACGGAAATACAGAA DHFR CATAGAAGGAA HFRF GCTGCCCGTCTCT XbaR La cassette d'expression est composée du promoteur de Pa-Tub8 SEQ ID NO : 128 (Soldati et al, 1995, même référence que précédemment), d'un site de clonage multiple pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO : 4 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. La partie promotrice de I'a-Tub8 SEQ ID NO : 128 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcsl SEQ ID NO : 143 et K7mcs2 SEQ ID NO : 144 (530pb) sur le pTUB8TY TAIL SEQ ID NO : 145 (Meissner et al., J Cell Sci. 2002;115:563-574). La séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO : 4 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcs3 SEQ ID NO : 146 et K7mcs4 SEQ ID NO : 147 (395 pb). Puis les deux fragments de PCR ont été fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces K7mcsl SEQ ID NO : 143 et K7mcs4 SEQ ID NO : 147 (914pb) pour donner la séquence SEQ ID NO : 192. La PCR chevauchante SEQ ID NO : 192 digérée par Kpnl et Sacl (902pb) a été clonée dans le pUC18 (plasmide commercial) Kpnl Sacl (2682pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 12 ci-dessous. Le plasmide obtenu est le pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 148.

Tableau 12 : liste des amorces utilisées pour la construction de la cassette d'expression

La cassette d'expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 149 obtenue par digestion du pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 148 avec l'enzyme Xbal (890pb) a ensuite été clonée dans le plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO : 142 digéré par Xbal et déphosphorylé (7378pb). Le plasmide obtenu a sa cassette d'expression Tub8MCS 3UTR transcrite en sens inverse par rapport à la cassette DHFR*TYTK. Le plasmide obtenu est nommé pUC4G2 SEQ ID NO : 150.

Le fragment de PCR SEQ ID NO : 193 amplifié avec les amorces Icrell SEQ ID NO : 151 et IcreI2 SEQ ID NO : 152 sur le pTsaglIcrel αβγ SEQ ID NO : 153 (142pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 194 amplifié avec les amorces IcreB SEQ ID NO : 154 et IcreI4 SEQ ID NO : 155 sur le pUC4G2 SEQ ID NO : 150 (153pb) permettent l'ajout de la séquence αβ Icrel SEQ ID NO : 157. Les deux fragments PCR SEQ ID NO : 193 et SEQ ID NO : 194 ont été directement clonés dans le plasmide pUC4G2 SEQ ID NO : 150 digéré par les enzymes de restriction Pml I et KasI (7990pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme.

Puis le fragment de PCR SEQ ID NO : 195 amplifié avec les amorces IcreI5 SEQ ID NO : 159 et IcreI6 SEQ ID NO : 160 sur le pTIcrellOO SEQ ID NO : 158 (546pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 196 amplifié avec les amorces IcreI7 SEQ ID NO : 161 et IcreI8 SEQ ID NO : 162 sur le pTsaglIcrel αβγ SEQ ID NO : 153 (133pb) permettent l'ajout de la séquence Icrel βγ SEQ ID NO : 163 dans le plasmide précédemment décrit digéré par les enzymes de restriction Nsil et Avril (7734pb). Le plasmide obtenu est nommé pUc4G2 Icrel SEQ ID NO : 164. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 21 ci-dessous.

Tableau 21 : Liste de amorces utilisées

Plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164

Ce plasmide permettra la production d'une protéine de fusion sagl M2eGPI SEQ ID NO : 165, comprenant la protéine S AGI de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 166, une répétition de 5 M2e (fragment Nter de la protéineM2 du virus d'Influenza) espacée par des linkers (Lee et al, 2015, PLoS ONE 10(9): e0137822. doi: 10.1371/journal.pone.0137822) SEQ ID NO : 167 et en Cter une séquence d'ancrage en GPI de la protéine S AGI de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 169. L'amplification de 3 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction. L'amplification du premier fragment de PCR SEQ ID NO : 197 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii de la séquence codante de sagl SEQ ID NO : 170 avec les amorces da SEQ ID NO : 171 et db SEQ ID NO : 172 (906pb). La deuxième PCR SEQ ID NO : 198 a été effectuée sur une séquence synthétisée comprenant une répétition de 5 M2e SEQ ID NO : 173 (Lee et al) avec les amorces de SEQ ID NO : 174 et dd SEQ ID NO : 175 (588pb). Cette séquence M2e a été optimisée pour l'expression chez Toxoplasma gondii. L'amplification du troisième fragment de PCR SEQ ID NO : 199 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii de la séquence codante de sagl (partie ancrage GPI) SEQ ID NO : 176 avec les amorces de SEQ ID NO : 177 et df SEQ ID NO : 178 (98pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 13 ci-dessous.

Tableau 13 : liste des amorces utilisées pour la construction des plasmides pUC 4G2 Icrel M2eGPI

Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide p4G2 ICrel SEQ ID NO : 156 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb) avec la technique In- Fusion de Ozyme.

Plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179

Le site LoxP SEQ ID NO : 12 a été introduit par PCR dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel (8901 pb). Le fragment de PCR SEQ ID NO : 200 obtenu avec les amorces aa SEQ ID NO : 180 et ab SEQ ID NO : 181 (438pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 201 obtenu avec les amorces ac SEQ ID NO : 182 et ad SEQ ID NO : 183 (534pb) ont été clonés avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 14 ci-dessous.

Tableau 14 : liste des amorces utilisées pour l'introduction du site loxP

- Plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184

Le site loxN SEQ ID NO : 5 a été introduit par PCR dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel (8901 pb ). Le fragment de PCR SEQ ID NO : 202 obtenu avec les amorces aa SEQ ID NO : 180 et bb SEQ ID NO : 181 (438pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 203 obtenu avec les amorces bc SEQ ID NO : 182 et ad SEQ ID NO : 183 (534pb) ont été clonés avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 15 ci-dessous.

Tableau 15 : liste des amorces utilisées pour l'introduction du site loxN

Construction des souches Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI intégration ciblée ou aléatoire.

Intégration ciblée au site loxP

La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après F électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP.

Intégration ciblée au site loxN

La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN. Intégration aléatoire

La souche ToxoKO miel -3 KO 2G est électroporée avec 20 μg du plasmide linéarisé purifié pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179 ou pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après F électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont analysés pour l'expression de la protéine de fusion SAG1 M2eGPI SEQ ID NO : 165 (analyse sur la population totale).

Validation Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI intégration ciblée par PCR

Intégration ciblée au site loxP

Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré les plasmides pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré le plasmide ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 204 (1719pb).

La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmic3 loxP. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ec SEQ ID NO : 189 et eb SEQ ID NO : 188 par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 205 (2704 pb).

Tableau 16 : liste des amorces utilisées pour la validation des clones

Amorce Séquence Amorce R Séquence

F

ea seq TUB SEQ ID NO : 187 eb seq 3utr SEQ ID NO : 188

MCS F AACCCGCGCAGAAGACATCC MCS R ATGGGGCACATGCTGCACGAA

ec CN3 SEQ ID NO : 189 eb seq 3utr SEQ ID NO : 188

AGAGGTTGACACCGACAAAG MCS R ATGGGGCACATGCTGCACGAA Intégration ciblée au site loxN

Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée l'un des plasmides. Pour valider des souches ayant intégré le plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 (1719pb) par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 204.

La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmicl loxN. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ed SEQ ID NO : 55 et eb SEQ ID NO : 54 (2366pb) par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 206.

Tableau 17 : liste des amorces utilisées pour la validation des clones

Analyse par cytométrie en flux.

Le niveau d'expression de M2eGPI SEQ ID NO : 165 a été analysé pour différentes populations de parasites recombinants suite à un marquage spécifique avec un anticorps anti M2 (anti-influenza A virus M2 Protein antibody ab5416 - Abcam). L'expression du transgène M2eGPI est similaire ou légèrement supérieur pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN au locus de miel ou mic3 ) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire. Ce résultat démontre que la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G est un vecteur d'expression optimisé pour l'expression de transgène. Exemple 5 : Construction de souches recombinantes de Toxo ts iclS KO exprimant la protéine CAT-GFP après intégration ciblée ou aléatoire du transgène cat-sfp

L'objectif de cette expérience est d'étudier le niveau d'expression du gène cat-gpf après intégration aléatoire ou ciblée au niveau du site LoxP ou LoxN du transgène.

Culture des parasites

Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fîbroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.

Construction des plasmides

Plasmide pUC 4G2 Icrel CAT-GFP LoxP SEQ ID NO : 221

Le fragment CATGFP SEQ ID NO : 222 a été amplifié par PCR avec les amorces ca SEQ ID NO :223 et cb SEQ ID NO :224 (1488 pb) sur le pCATGFP SEQ ID NO : 9. Ce fragment de PCR a été cloné avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179 a été digéré par Pmel et Notl (8372pb- remplacement de M2eGPI par CATGFP). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 18 ci-dessous.

Tableau 18 : liste des amorces utilisées pour la construction des plasmides pUC 4G2 Icrel CAT¬

GFP

Plasmide pUC 4G2 Icrel CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 225

Le fragment CATGFP SEQ ID NO : 222 a été amplifié par PCR avec les amorces ca SEQ ID NO :223 et cb SEQ ID NO :224 (1488 pb) sur le pCATGFP SEQ ID NO : 9. Ce fragment de PCR a été cloné avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184 a été digéré par Pmel et Notl (8372pb- remplacement de M2eGPI par CATGFP). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 18 ci-dessus.

Construction des souches Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP intégration ciblée ou aléatoire.

Intégration ciblée au site loxP

La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO : 221 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après F électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP loxP.

Intégration ciblée au site loxN

La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO : 225 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP loxN.

Intégration aléatoire

La souche ToxoKO miel -3 KO 2G est électroporée avec 20 μg du plasmide linéarisé purifié pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO : 221 ou pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO : 225 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont analysés pour l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 (analyse sur la population totale).

Validation Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP intégration ciblée par PCR

Intégration ciblée au site loxP

Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré les plasmides pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO :221, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16 précédemment cité. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré le plasmide ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :226 (1647pb).

La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmic3 loxP. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ec SEQ ID NO : 189 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :227 (2600 pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16.

Intégration ciblée au site loxN

Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré le plasmide pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO :225, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 10 ⁷ parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17 précédemment cité. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :226 (1647pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16.

La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus TgmicI loxN. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ed SEQ ID NO : 190 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :228 (2294 pb) . Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17. Analyse par cytométrie en flux

Le niveau d'expression de CAT-GFP SEQ ID NO : 120 a été analysé dans les différentes populations de parasites recombinants (Tableau 19). L'expression du transgène CATGFP est systématiquement légèrement supérieure pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN au locus de miel ou mic3 ) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire.

Tableau 19 : Intensité moyenne géométrique de fluorescence des souches recombinantes

CATGFP.

Ce résultat démontre que la souche Toxo tgmicl-3 KO est un vecteur d'expression optimisé pour l'expression de transgène.

Exemple 6 : Etude d'efficacité de la souche Neo ncmicl-3 KO- 2G dans la prévention de la néosporose létale dans un modèle murin

Dans cette étude, la souche vivante atténuée Neo ncmicl-3 KO- 2G a été testée comme un vaccin préventif de la néosporose. L'objectif est de déterminer si la souche vaccinale Neo ncmicl-3 KO- 2G prévient ou non, la dissémination et l'infection aiguë dans un modèle murin de létale de néosporose. Matériel et méthodes

Production de parasites Neo ncmicl-3 KO- 2G et de la souche Nc-1.

Les parasites Neo ncmicl-3 KO- 2G et Ne- inutilisés pour le challenge) sont produits sur un tapis confluent de cellules VERO (ATCC CCL81) dans un milieu complet contenant du DMEM 1.5 g/L NaHC03, 12% (v/v) SVF décomplémenté, 100UI/mL Pénicilline- 100UI/mL Streptomycine.

Avant infection du tapis cellulaire, les cellules sont entretenues indépendamment des parasites. A chaque passage de cellules VERO, le tapis est lavé trois fois avec 5 mL de HBSS, décollé avec lmL de trypsine pure, re-suspendues en milieu complet, distribuées à raison de

7,5.10 ⁵ cellules pour 25cm2 de surface de culture. Les cellules sont incubées à 37°C avec 5%

C02 et sont disponible pour l'amplification parasitaire trois jours plus tard.

A J-4, le tapis cellulaire est infecté avec 1.10 ⁶ parasites pour 25cm ² de culture cellulaire à confluence.

Les parasites vaccinaux sont récoltés 4 jours plus tard. Brièvement, le tapis cellulaire infecté par les parasites est lavé avec du milieu complet afin d'enlever les parasites extracellulaires. Le tapis cellulaire, contenant les parasites, est scrappé et passé à travers une seringue de 27G. La préparation est centrifugée 10 min à 1500 g. Le surnageant est éliminé et le culot resuspendu dans une solution de DMEM additionnée de 0.1 M Sucrose, de 0.1 M de Tréhalose, de 2.5% d'inuline, de 0.1M de GSH, de 1% de proline et de 1% d'ectoïne. La solution est préparée extemporanément le jour de la vaccination. La concentration exacte de parasites, ainsi que la viabilité sont estimées par le comptage en cytométrie en flux des parasites ayant incorporés ou non de l'iodure de propidium (P4864-10ML, Sigma). La solution finale préparée a été diluée pour contenir 2.10 ⁷ parasites par millilitre.

Design de l 'étude

Les souris ont été immunisées à J0 par voie intra-péritonéale (IP) avec une dose unique de 1.10 ⁷ tachyzoïtes de la souche Neo ncmicl-3 KO-2G. Des souris contrôles ont été inoculées par le véhicule. Deux souris de chaque fond génétique ont été inoculées par groupe, soit quatre souris par groupe.

A J60, les souris immunisées ont été infectées par voie intra-péritonéale à la dose de létale de 2.10 ⁷ tachyzoïtes de souche virulente Nc-1. Deux critères sont utilisés pour évaluer l'efficacité du vaccin, l'évaluation du taux de mortalité et la réponse humorale dirigée contre Neospora caninum à J30 post vaccination. Animaux

Huit souris C57BL/6 et Balb/C de statut EOPS (Exempt d'organisme pathogène spécifique) ont été inclus dans l'étude (Janvier Labs, ...). Elles ont été élevées en portoirs ventilés dans une animalerie A2, en toute conformité avec les normes éthiques et réglementaires européennes en vigueur.

Dosage IgG par ELISA

La production des IgG totales spécifiques de N. caninum, au niveau sérique a été déterminée par ELISA. L'extrait parasitaire total de la souche Nc-1 a été dilué dans du tampon carbonate/bicarbonate 0.05M pH9,6 afin d'obtenir une concentration finale de l(^g/mL. 100 par puits de ce mélange ont été déposés sur une plaque 96 puits à fond plat (Nunc MaxiSorp). Après une nuit à +4°C, les puits ont été lavés trois fois avec 300μΕ de tampon PBS, Tween 20 0,05% (v/v), puis saturés avec 200μί de PBS, Tween 20 0,05%, BSA 4% (p/v) pendant lh30 à 37°C. Après 3 lavages avec 300μΕ par puits de PBS, Tween 20 0.05%>, ΙΟΟμί par puits de sérum d'intérêt, préalablement dilué au l/50e dans du PBS, Tween 20 0,05%), ont été déposés sur la plaque et dilués en cascade par série de 2 en 2 (dépôt sur 11 puits/sérum d'intérêt). En contrôle, (i) un sérum, dilué de la même façon que précédemment et dont le titrage en IgG totales spécifiques est connu et important, servira de témoin de référence et (ii) un pool de sérum dilué au l/50e provenant des souris inoculées par les véhicules servira de témoin négatif. Enfin, ΙΟΟμί de PBS, Tween 20 0.05%> ont également été déposés dans 8 puits afin de servir de témoin « blanc ». Après lh d'incubation à 37°C et trois lavages avec 300μΕ par puits de PBS, Tween 20 0.05%>, ΙΟΟμί par puits de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562) et dilué au l/5000e dans du PBS-Tween 20 0.05%> ont été déposés. Après lh d'incubation à 37°C et trois lavages avec 300μΕ par puits de PBS, Tween 20 0.05%> suivi de trois lavages avec 300μΕ par puits de ΓΗ20 mQ, la révélation a été réalisée par ajout de ΙΟΟμί par puits d'une solution de para-nitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) diluée à lmg/mL dans un tampon de 1M Diethanolamine-HCl pH9.8. Après 60 min d'incubation à +24°C et à l'abri de la lumière, l'absorbance a été mesurée à avec une contre- lecture à grâce à un lecteur de plaque (Infinité M200 Pro NanoQuant, Tecam). Les valeurs de D.O. ont été retranchées à la D.O. moyenne du témoin « blanc ». Les taux d'IgG totaux sériques spécifiques de Neospora caninum ont été exprimés sous forme de titres d'anticorps. Deux méthodes ont été utilisées pour le titrage. Le titre en IgG correspond à l'inverse de la plus forte dilution du sérum d'intérêt dont la D.O. est au moins 2,5 fois supérieure à celle obtenue avec le témoin négatif, ou dont la D.O. a été de 0,2.

Résultats

L'efficacité de Neo ncmicl-3 KO-2G a été estimé sur un modèle murin létale. Signe clinique

Après vaccination, les animaux vaccinés n'ont manifesté aucun signe clinique spécifique, aucune altération du poids et aucune augmentation significative de la température corporelle, suggérant une bonne tolérance des souris vis-à-vis de la souche Neo ncmicl-3 KO-2G.

Evaluation de la réponse humorale

A J30 post vaccination, des prélèvements de sang ont été effectués et le titre en anticorps IgG spécifique a été mesuré par ELISA pour estimer la qualité de la réponse immunitaire post-vaccination. Les résultats sont présentés figure 12.

Aucune des souris non vaccinées n'a montré de titre positif en anticorps. A l'inverse, toutes les souris vaccinées, quel que soit leur fond génétique ont séroconverti et ont présenté un titre en anticorps signifîcativement différent de celui des animaux non vaccinés.

Efficacité de la vaccination sur la survie des souris

L'efficacité réelle de la vaccination est évaluée par un challenge infectieux avec une souche virulente (Nc-1). A J60 post vaccination, les souris ont été inoculées avec la souche sauvage Nc-1 à une dose létale, soit à 2.10 ⁷ tachyzoïtes par animal. Toutes les souris ayant reçu la solution contrôle sont mortes au cours de l'expérience, soit 100% de létalité. En revanche, 100 % des souris vaccinées ont survécu jusqu'à la fin de l'expérimentation, soixante jours plus tard. De plus, aucune de ces souris vaccinées n'a manifesté de signes cliniques significatifs, suggérant un effet protecteur complet, à la fois sur la morbidité et la mortalité.

Les résultats de cette expérimentation démontrent une réponse immunitaire claire et un effet protecteur du vaccin à base de la souche Neo ncmicl-3 KO-2G vis-à-vis d'un challenge létal avec une souche sauvage de Neospora caninum Nc-1. Exemple 7 : Etude d'efficacité de la souche Toxo tgmicl-3 KO- 2G dans la prévention de la toxoplasmose congénitale dans un modèle murin

Le but principal de cette étude est d'étudier l'efficacité de la souche vaccinale Toxo tgmicl-3 KO - 2G à l'encontre de la toxoplasmose congénitale dans un modèle murin.

Matériel et méthodes

Production de parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G

Les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G sont produites en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 12% de sérum de veau fœtal australien (SVF aust). Les tachyzoïtes ont été récoltés dans le surnageant. Les parasites ont été énumérés sur cellule de Malassez et dilués dans du milieu DMEM pour atteindre une concentration de 500 parasites par mL.

Design de l 'étude

La vaccination (100 tachyzoïtes dans un volume de 200 de DMEM) est effectuée sur les souris femelles à J0 par voie sous-cutanée à l'aide d'une aiguille de 27G.

Avant injection (J-2) et 28 jours post-injection, du sang veineux périphérique a été prélevé et laissé à température ambiante pour une durée minimum d'une heure. Le sérum a été obtenu par centrifugation à 5000 g durant 10 minutes. Les séra préparés ont été conservés à -20°C. Huit semaines après la vaccination, 23 souris séroconverties (pour T. gondii) par lot ont été mises aux maies puis ont été challengées à mi gestation per os avec 15 kystes de la souche T. gondii 76K. Les mères sont ensuite isolées, les mise-bas suivies. Les souriceaux sont suivis sur une période d'environ un mois puis euthanasiés. Un petit nombre de souriceaux seront analysés après sacrifice. Puis les mères seront sacrifiées, leur rate remise en culture afin d'étudier la réponse cellulaire.

Animaux

Le nombre de souris par lot nécessaire à l'étude est de 16 souris gestantes pour permettre une étude statistique. L'analyse de la réponse immunitaire chez 16 souris gestantes, nécessite de vacciner 50 souris par lot au total en prenant compte des paramètres suivants : le rendement de gestation et la potentielle mortalité liée à l'injection du parasite (la souris est un animal relativement sensible à une injection de Toxoplasma gondii et la vaccination permettant d'obtenir une séroconversion efficace peut générer de la mortalité). Ainsi les lots vaccinés contiennent 50 animaux au départ. Les souris des lots 1 et 2 n'étant pas vaccinées, 23 souris sont suffisantes pour ces lots. L'analyse est effectuée sur 16 souris gestantes par lot. Les souris surnuméraires sont sacrifiées.

Tableau 20 : Répartition des animaux dans les différents lots.

Au total 146 souris SWISS femelles de 8 semaines ont été inclues dans l'étude et sont reparties dans différents lots (tableau 20). Les animaux ont été hébergés et manipulés, dans le strict respect des normes éthiques en vigueur en France et des normes d'élevage imposées par la réglementation européenne. L'alimentation et l'eau de boisson ont été distribuées ad-libitum durant toute la durée de l'expérimentation.

Après une période de 7 jours d'acclimatation, les souris ont été identifiées individuellement et réparties aléatoirement en 4 groupes.

Dosage IgG et IgM par ELISA

Une plaque 96 puits a été adsorbée avec de l'extrait protéique de la souche RH de Toxoplasma gondii (10 μg/ml) dilué en tampon carbonate pH 9,6 pendant une nuit à 4 °C. Après 2 lavages en PBS IX/Tween 0,05% et un lavage en PBS IX, la plaque a été saturée avec du PBS 3% BSA pendant lh30 à température ambiante. Ensuite, pour le titrage, les dilutions sériées 2 de 2 en, en PBS + 3% BSA des sera murins à tester ont été déposées.

Après 1 h d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée 2 fois (PBS IX/Tween 0,05%>), puis l'anticorps secondaire (anti-mouse IgG couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562) ou anti-mouse IgM couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A9688) est ajouté et dilué au 1/30 000 en PBS ΙΧ/Tween 0,05%, avant une nouvelle incubation à 37 °C durant lh30. Après 2 lavages en PBS lX/Tween 0,05% et un lavage en PBS IX, le pNPP (4-Nitrophenyl phosphate disodium sait hexahydrate) a été utilisé à une concentration de 1 mg/ml dilué en tampon DEA-HCL pour la révélation, et la plaque a été incubée 15 à 20 minutes à température ambiante. La réaction est stoppée avec l'ajout de solution stop 3N NaOH. L'absorbance à 405 nm a été lue via le lecteur de plaque Nanoquant Infinité M200 PRO (TECAN).

Dosage par ELISA d'IFN-γ sécrété par des splénocytes stimulés in vitro

Après chaque prélèvement, la rate a été broyée sur un tamis 100 μιη placé au-dessus d'un tube

Falcon de 50 ml avec ajout de 5 ml de milieu RPMI. Le broyât a ensuite été centrifugé 10 min à 400 g. Le culot a été repris dans 300 μΐ de RPMI, puis 1 ml de tampon de lyse a été ajouté.

Le tube a été incubé 3 min à 4 °C, et la réaction a été stoppée avec ajout de PBS 1X/SVF 2% en excès, puis les cellules ont été centrifugées 10 min à 400 g. Les culots de cellules obtenus ont ensuite été repris dans 5 ml de milieu de stimulation. Les cellules ont été dénombrées sur cellule de Malassez en présence de bleu trypan qui colore les cellules mortes.

Les cellules ont été mises en culture en plaques 96 puits à raison de 5.10 ⁵ cellules/puit.

Différents stimulants ont pu être ajoutés : des extraits antigéniques de la souche RH de

Toxoplasma gondii (10 μg/ml) ou de la concanavaline A (5 μg/ml) qui servent de témoin positif. Les plaques ont été mises en culture en étuve à 37 °C, 5%> de C0 ₂ pour 72 h.

Le dosage d'IFN-γ a été réalisé sur les surnageants de culture des splénocytes en présence de ces différents stimulants. Le dosage a été effectué par un test ELISA selon le protocole du kit

« Mouse IFN-γ ELISA Ready-set-go® (Ebiosciences).

Evaluation du nombre de kystes présents dans le cerveau des souris

Le prélèvement des cerveaux des mères et des souriceaux est effectué pour déterminer la présence ou non de kystes cérébraux. Suite au sacrifice des souris, les cerveaux sont prélevés et broyés. Le nombre de kystes est alors dénombré par observation microscopique de la totalité du broyât de cerveau. Résultats

Efficacité de la vaccination sur les souris mères

Survie et signes cliniques suite à la vaccination avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Les souris sont observées quotidiennement à partir de la vaccination (J0) et jusqu' au 33eme jour post vaccination et les signes cliniques sont notés. Un score clinique global est calculé selon le tableau 21 de score des signes. Les résultats sont présentés figure 13-A.

Tableau 21 : tableau de score des signes cliniques observés pour les souris

Les souris des lots non vaccinés n'ont pas présenté de signes cliniques alors que les souris des lots vaccinés ont présenté quelques signes cliniques modérés avec un score clinique inférieur à 2. Le pic des signes cliniques a été observé à J18. Ces signes cliniques ont été observés jusqu'à J33.

Il est possible d'observer en fonction su site de l'injection et des souches parasitaires de la mortalité chez les souris SWISS. Un taux de survie de 90% (10 souris mortes/100 souris pour les lots 3 et 4) est obtenu à J30 pour une vaccination des souris avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G. Evaluation de la réponse humorale adaptative

Le dosage des IgG sériques dirigés contre les protéines de Toxoplasma gondii permet d'observer très nettement que les sera issus des souris avant injection ne produisent pas d'anticorps spécifiques de cette souche. La vaccination avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G permet une forte production d'IgG à J28 (lot 3 et 4) et J129 (lot 3). Comme attendu, le challenge (souche 76K) des souris non vaccinées (lot 2) permet également la production d'IgG. La production d'IgG pour le lot vacciné est renforcée par le challenge (lot 4 à J129). Les résultats sont présentés figure 13-B.

Evaluation de la réponse cellulaire spécifique

Afin d'évaluer la mise en place d'une réponse immunitaire cellulaire, l'IFN-γ (cytokine indiquant la mise en place d'une réponse de type Thl) sécrété dans les surnageants de culture des splénocytes suite à divers stimuli, a été dosé 72 h après la mise en culture.

Comme attendu, la concentration d'IFN-γ est augmentée après un challenge par rapport au groupe contrôle. Pour l'ensemble des souris vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G (ayant été challengées (lot 4) ou non (lot3)), des concentrations importantes d'IFN-γ sont mesurées lorsque les cellules sont stimulées avec des extraits antigéniques de la souche RH de Toxoplasma gondii, par rapport aux souris non vaccinées. Cela suggère une mise en place d'une réponse cellulaire induite par la vaccination. Les résultats sont présentés figure 13-C.

Comptage du nombre de kystes présents dans le cerveau des souris mères

Les mères ont été sacrifiées à J129. Le nombre de kystes est obtenu par observation microscopique de la totalité du broyât de cerveau (4 cerveaux par lot). Aucun kyste n'est détecté pour le lot 1 (non vacciné, non challengé) alors qu'après challenge, une moyenne de 2250,75 kystes par cerveau est obtenue pour le lot 2 (non vacciné, challengé). Dans le lot 3 (uniquement vacciné), un nombre très faible de kystes est observé (0,75 kyste par cerveau). Dans le 4eme lot (vacciné puis challengé), on observe une forte diminution du nombre de kystes par rapport au lot non vacciné (lot 2), avec une moyenne de 52 kystes par cerveau. Les souris vaccinées avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G forment très peu de kystes cérébraux suite à un challenge avec la souche T. gondii 76K. Les résultats sont présentés figure 13-D. Efficacité de la vaccination sur les souriceaux

Efficacité sur la prolifération et le sex-ratio

Une prolifïcité similaire a été obtenue pour tous les groupes montrant que la vaccination et/ou le challenge n'a pas affecté le nombre de souriceaux par portée. En revanche, un changement du sex-ratio après une infection à T. gondii a déjà été décrit (Kankova et al, parasitology 2007). Nous observons un nombre réduit de mâles dans le groupe contrôle après challenge alors que cela n'est pas observé pour le groupe vacciné, suggérant que la vaccination prévient le changement du sex-ratio. Les résultats sont présentés figures 13-E et 13-F.

Efficacité sur la mortinatalité et la mortalité

La mortinatalité et la mortalité ont été augmentées suite au challenge en absence de vaccination (lot 2 par rapport au lot 1). Pour le lot uniquement vacciné (lot 3), la mortinatalité et la mortalité sont à un niveau très faible, proche du groupe témoin (lot 1). Le groupe vacciné et challengé (lot 4) présente une réduction significative du nombre de la mortinatalité et la mortalité par rapport au groupe non vacciné challengé (lot 2). La vaccination des mères protège donc la descendance d'une augmentation de la mortinatalité et la mortalité suite à un challenge. Les résultats sont présentés figures 13-G et 13-H.

Efficacité sur la survie des souriceaux

Les souriceaux ont été suivis sur une période de 32 jours afin d'étudier l'efficacité de la vaccination.

La survie des souriceaux diminue signifîcativement pour le lot dont les mères ont été challengées mais non vaccinées. Les autres groupes présentent un taux de survie proche de celui obtenu pour le lot contrôle (lot 1). La vaccination des mères augmente donc le taux de survie des souriceaux suite à un challenge au cours de la gestation. Les résultats sont présentés figure 13-1.

Efficacité sur les signes cliniques des souriceaux.

Les souriceaux sont observés quotidiennement pendant 30 jours et les signes cliniques sont notés. Un score clinique global est calculé selon le tableau de score des signes (voir ci-après, tableau 22). Mobilité Score 2

Normal 0

Limitée 1

Immobile 2

Isolement Score -1

Pas d'isolement 0

Isolement de la mère/ du nid/ des souriceaux 1

Croissance Score ^; 1

Normal 0

Croissance ralentie 1

Tableau 22 : tableau de score des signes cliniques observés pour les souriceaux

Les souriceaux issus du groupe challengé (lot 2) présentent un score clinique plus élevé que les souriceaux du groupe témoin (lot 1). Ce score clinique est notamment dû à une croissance ralentie des souriceaux dans ce groupe. Pour les autres lots (vacciné ou vacciné puis challengé), le score clinique est similaire au groupe témoin. La vaccination des mères a permis d'éviter le retard de croissance induit par le challenge chez les souriceaux. Les résultats sont présentés figure 13-J.

Evaluation de la réponse humorale immature : IgM

Les IgM ne peuvent passer la barrière placentaire mais pourrait passer à la descendance via le lait maternel. Comme l'IgM a une demi vie de 5 jours, le dosage d'IgM à 32 jours reflète l'immunité des souriceaux développés en réponse à T. gondii (souche vaccinale ou souche de challenge) transmis par la mère. La réponse humorale développée par les souriceaux (en réponse à la vaccination ou le challenge de la mère) est donc évaluée par dosage ELISA de l'immunoglubuline IgM à 32 jours d'âge. Les résultats sont présentés figure 13-K.

Le titre en IgM est augmenté pour les souriceaux du groupe issu des souris challengées (lot 2) en comparaison avec ceux issu des souris non challengées (lot 1). Pour le groupe seulement vacciné (lot 3), le titre en IgM est proche du seuil de détection, ce qui indique une absence de transmission verticale de la souche aux souriceaux. Pour le groupe vacciné et challengé (lot 4), le titre d'IgM dosé pour les souriceaux est signifîcativement réduit en comparaison du titre obtenu pour les souriceaux issus du groupe challengé (lot 2). La vaccination des souris a ainsi permis de réduire la transmission verticale de la souche de challenge aux souriceaux. La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a ainsi permis la mise en place chez les souris d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre le parasite T. gondii. La vaccination des souris avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a permis une diminution significative de la charge parasitaire cérébrale observée après un challenge avec la souche virulente 76K. De plus la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a une bonne innocuité. Enfin la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a permis de protéger la descendance d'une toxoplasmose congénitale (après un challenge avec la souche virulente 76K à mi- gestation) avec une diminution de la mortinatalité et de la mortalité, un meilleur score clinique pour les souriceaux.

Exemple 8 : Etude d'innocuité et d'immunogénicité des souches Toxo tgmicl-3 KO- 2G exprimant l'antigène M2eGPI du virus Influenza dans un modèle murin

L'objectif de cette expérimentation est de déterminer si la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant l'antigène M2eGPI du virus Influenza permet l'obtention d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire envers le vecteur Toxoplasma gondii et contre l'antigène viral ciblé.

Matériel et méthode

Production de parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant l'antigène M2eGPI du virus Influenza

Les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant l'antigène du virus Influenza (Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN et Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI population totale-insertion aléatoire - exemple 4) sont produites en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et lOO U/mL de streptomycine. Les tachyzoïtes ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Les parasites ont été énumérés sur cellule de Malassez et dilués dans du milieu DMEM pour atteindre une concentration de 500 parasites par mL. Animaux

Au total 45 souris SWISS femelles de 6 semaines ont été inclues dans l'étude. Les animaux ont été hébergés et manipulés, dans le strict respect des normes éthiques en vigueur en France et des normes d'élevage imposées par la réglementation européenne. L'alimentation et l'eau de boisson ont été distribuées ad-libitum durant toute la durée de l'expérimentation.

Après une période de 15 jours d'acclimatation, les souris ont été identifiées individuellement et réparties aléatoirement en 5 groupes.

Lot 1 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G (n=10)

Lot 2 : Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP (n=10)

Lot 3 : Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN (n=10)

Lot 4 : Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI population totale-insertion aléatoire (n=10)

Lot 5 : naïf (n=5)

A JO, 100 tachyzoïtes ont été injectés en intra-péritonéal dans un volume de 200 de DMEM. Les animaux ont ensuite été suivis et sacrifiés 5 semaines post-injection (J35) et les rates ont été prélevées. Avant (J-l) et 34 jours post-injection, du sang veineux périphérique a été prélevé et laissé à température ambiante pour une durée minimum de 30 minutes. Le sérum a été obtenu par centrifugation à 3 000 g durant 10 minutes. Les séra préparés ont été conservés à -20°C.

Dosage IgG par ELISA

Une plaque 96 puits a été adsorbée avec un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 μg/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion saglM2eGPÏ ou de l'extrait protéique de Toxo tgmicl-3 KO - 2G (10 μg/ml) dilué en tampon carbonate pH 9,6 pendant une nuit à 4 °C. Après lavages en PBS IX/Tween 0,05%, la plaque a été saturée avec du PBS IX/Tween 0,05% - BSA 4% pendant lh30 à 37 °C. Ensuite, pour le titrage, les dilutions sériées 2 de 2 en, en PBS IX/Tween 0,05%> des sera murins à tester ont été déposées. Après 1 h d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée, puis l'anticorps secondaire (IgG anti-mouse IgG couplé à la phosphatase alcaline) est ajouté et dilué au 1/30 000 en PBS IX/Tween 0,05%>, avant une nouvelle incubation à 37 °C durant lh30. Après lavages, le pNPP a été utilisé à une concentration de 1 mg/ml dilué en tampon DEA-HCL pour la révélation, et la plaque a été incubée 1 h à 37 °C. L'absorbance à 405 nm de chaque puits avec une contre lecture à 620 nm a été lue via le lecteur de plaque Nanoquant Infinité M200 PRO (TECAN). Dosage par ELISA d'IFN-γ sécrété par des splénocytes stimulés in vitro

Après chaque prélèvement, la rate a été broyée sur un tamis 100 μιη placé au-dessus d'un tube Falcon de 50 ml avec ajout de 5 ml de milieu RPMI. Le broyât a ensuite été centrifugé 10 min à 400 g. Le culot a été repris dans 300 μΐ de RPMI, puis 1 ml de tampon de lyse a été ajouté. Le tube a été incubé 3 min à 4 °C, et la réaction a été stoppée avec ajout de PBS 1X/SVF 2% en excès, puis les cellules ont été centrifugées 10 min à 400 g. Les culots de cellules obtenus ont ensuite été repris dans 5 ml de milieu de stimulation. Les cellules ont été dénombrées sur cellule de Malassez en présence de bleu trypan qui colore les cellules mortes.

Les cellules ont été mises en culture en plaques 96 puits à raison de 5.10 ⁵ cellules/puit. Différents stimulants ont pu être ajoutés : des extraits antigéniques de Toxo tgmicl-3 KO - 2G (10 μg/ml), un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 μg/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion saglM2eGPI ou de la concanavaline A (5 μg/ml) qui sert de témoin positif. Les plaques ont été mises en culture en étuve à 37 °C, 5% de C0 ₂ pour 72 h.

Le dosage d'IFN-γ a été réalisé sur les surnageants de culture des splénocytes en présence de différents stimulants. Le dosage a été effectué par un test ELISA selon le protocole du kit « Mouse IFN-γ ELISA Ready-set-go® (Ebiosciences).

Résultats

Survie et signes cliniques

La plupart des souris présentent des signes cliniques tels que le poil ébouriffé, un gonflement de l'abdomen et une prostration à l'exception des souris n'ayant pas reçu de souches parasitaires.

Evaluation de la réponse humorale adaptative envers le vecteur Toxo tgmicl-3 KO - 2G Le dosage des IgG sériques dirigés contre les protéines de Toxo tgmicl-3 KO - 2G permet d'observer très nettement que les sera issus des souris avant injection ne produisent pas d'anticorps spécifiques de cette souche. Concernant les sera prélevés 34 jours après l'injection, une forte augmentation de l'absorbance synonyme de la séroconversion des souris suite à la vaccination par Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou une des souches dérivées est observée. Une grande majorité des souris sont séroconverties pour la toxoplasmose. Evaluation de la réponse humorale adaptative envers l'antigène M2e d'Influenza

À la suite de l'injection des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant M2eGPL on observe une production d'anticorps spécifique de l'antigène M2e exprimé par les souches Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN et Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI population totale-insertion aléatoire, mais pas de production d'anticorps spécifique de l'antigène M2e pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

L'expression du transgène M2eGPI étant similaire ou légèrement supérieur pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire (exemple 4), une réponse humorale adaptative envers l'antigène similaire ou légèrement supérieure est obtenue pour les souches Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire.

Evaluation de la réponse cellulaire spécifique de Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou l'antigène M2e d'Influenza

Afin d'évaluer la mise en place d'une réponse immunitaire cellulaire, l'IFN-γ (cytokine indiquant la mise en place d'une réponse de type Thl) sécrété dans les surnageants de culture des splénocytes suite à divers stimuli, a été dosé 72 h après la mise en culture.

Pour l'ensemble des souris vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI (insertion ciblée en loxP, loxN ou intégré de manière aléatoire), des concentrations importantes d'IFN-γ sont mesurées lorsque les cellules sont stimulées avec des extraits antigéniques de Toxo tgmicl-3 KO - 2G , par rapport aux souris non vaccinées.

Concernant les cellules restimulées avec M2e, aucune production d'IFN-γ n'est détectable pour l'ensemble des souris, qu'elles soient naïves, vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI (insertion ciblée en loxP, loxN ou intégré de manière aléatoire).

Il a donc été observé la mise en place d'une réponse immunitaire humorale vis-à-vis de la construction M2eGPI et une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre le vecteur Toxo tgmicl-3 KO - 2G.