Derartige Enzyme gehören zur Klasse der Endo-1, 3-1, 4-ß-D-glucan-4-glucanohydrolasen (EC 3.2.1.73 ; Lichenasen) oder der Endo-1,3-ß-D-glucosidasen (EC 3.2.1.39 ; Laminarinasen). Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein solches Enzym hier als ß- Glucanase oder Beta-Glucanase bezeichnet.

Polymere Mischglucane der oben genannten Art sind in unterschiedlichen Anteilen in praktisch allen Getreideprodukten enthalten. Enzyme, welche diese zu spalten vermögen, werden vor allem in der Nahrungsmittel-, Getränke-und Futtermittelindustrie, der Textilindustrie und der Stärkeverarbeitung benötigt (R. Borriss,"ß-Glucan-spaltende Enzyme", in H. Ruttloff,"Industrielle Enzyme", Kapitel 11.5, Behr's Verlag, Hamburg, 1994). Eine der wichtigsten Anwendungen von ß-Glucanasen liegt im Bereich der Getränke-und Brauindustrie, wo derartige Enzyme zum Abbau von Malz-und Gersten-ß- Glucan eingesetzt werden. Die hierfür zum Einsatz kommenden Enzyme stammen üblicherweise aus Bacillus subtilis, wie zum Beispiel in der deutschen Patentschrift DD 226 012 Al beschrieben, oder Bacillus amyloliquefaciens, doch sind auch ß- Glucanasen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise Achromobacter lunatus, Athrobacter luteus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Disporotrichum dimorphosporum, Humicola insolens, Penicillium emersonii, Penicillium funiculosum oder Trichoderma reesei, bekannt. Ein handelsübliches Produkt wird zum Beispiel unter der Bezeichnung Cereflo (Hersteller : Novo Nordisk A/S) zum Einsatz in der Brauereiindustrie angeboten.

Bisher bekannte ß-Glucanasen weisen pH-Optima im schwach sauren bis neutralen Bereich auf, so daß ihre Verwendung auf Verfahren beschränkt ist, die bei diesen pH- Werten durchgeführt werden. Die Anmelderin hatte sich zum Ziel gesetzt, das Anwendungsgebiet der ß-Glucanasen zu erweitern und eine ß-Glucanase zu entwickeln, die im Hinblick auf eine Verwendung in technischen Prozessen, die im alkalischen Milieu stattfinden, eine ausreichende Stabilität auch unter diesen Bedingungen aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 erhältliches Enzym, welches die eingangsgenannte glucanolytische Aktivität aufweist, der eine ß-Glucanase erzeugende Mikroorganismus Bacillus alkalophilus DSM 9956 und das für die ß-Glucanase aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 kodierende Gen, das im Rahmen der Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, identifiziert und sequenziert (SEQ ID-NO. : 2) worden ist. Dieses Gen kann gewünschtenfalls in im Prinzip bekannter Weise in anderen Bakterien kloniert und dort die ß-Glucanase exprimiert werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher auch durch im wesentlichen mikrobiologische Verfahren erhältliche Wirtsorganismen, welche das genannte Gen enthalten. Die aus der Sequenz des ß-Glucanase-Gens aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 abgeleitete Aminosäuresequenz der aus diesem Mikroorganismus erhältlichen erfindungsgemäßen ß-Glucanase (SEQ ID-NO : 1) ist in Fig. 1 im Ein-Buchstaben-Code wiedergegeben. Die ß-Glucanase aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 einschließlich des Signaleptids, das nach dem Transport durch die Zellwand des Mikroorganismus durch eine Signalpeptidase abgespalten wird und das nach Vergleich mit literaturbekannten Daten [M. E. Louw, S. J. Reid, Watson, Appl. Microbiol. Biotech. 39 (1993), 507-513] vermutlich 31 Aminosäuren umfasst, besteht aus 308 Aminosäuren. Der entsprechende Mikroorganismus ist Grarn-positiv, seine Zellform ist stäbchenförmig (Breite ca.

0,7 um bis 0,9 m, Länge ca. 2,5 um bis 4,0 um) ; er ist von der Patentanmelderin am 13.4.1995 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig hinterlegt worden und hat die Hinter- legungsnummer DSM 9956 erhalten.

Vorzugsweise weist eine erfindungsgemäße ß-Glucanase eine Homologie von über 70 %, insbesondere 75 % bis 99 % zur ß-Glucanase aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 auf.

Entsprechendes gilt für das zugrundeliegende Gen.

Ein bevorzugtes Einsatzgebiet für das erfindungsgemäße Enzym liegt in der Lebensmittelindustrie, insbesondere der Getränke-und Brauereiindustrie und ist insbe- sondere die Entfernung von Glucan und/oder Lichenan bei der Reinigung von Membranen und sonstigen Vorrichtungen dieser Industriezweige.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Entfernung von Glucan und/oder Lichenan bei der Reinigung von Membranen und sonstigen Vorrichtungen der Lebensmittelindustrie, insbesondere der Brauereiindustrie unter Einsatz einer erfindungsgemäßenß-Glucanase.

Beispiele Beispiel 1 Chromosomale DNA aus Bacillus alkalophilus C/M2-3 wurde mit Sau3A partiell verdaut und eine Fraktion von 4 bis 8 kb großen Fragmenten gelelektrophoretisch isoliert. Nach Ligation in die BamHl-site des Plasmids pMK4, eines E. coli-Bacillus shuttle-Vektors [M. A. Sullivan et al., Gene 29 (1984), 21-26], wurde in kompetente E. coli DH5a-Zellen transformiert. Rekombinante Klone mit ß-Glucanaseaktivität wurden durch Congo-Rot- Färbung auf LB-Platten mit 0,2 % Lichenin (pH8.5) identifiziert.

Die ß-Glucanase wurde aus dem Zellüberstand eines Klons in E. coli DH 5 a pmK4 aufgereinigt. Nach Dialyse des zellfreien Überstands gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) wurde das Dialysat auf Q-Sepharose (Pharmacia) gebunden und mit einem linearen Gradienten von 0-l MNaCl in 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5 oder pH 9,0) eluiert.

Der Nachweis und die Bestimmung der glucanolytischen Aktivität beruht auf Modi- fizierungen des von M. Lever in Anal. Biochem. 47 (1972), 273-279 und Anal. Biochem.

81 (1977), 21-27 beschriebenen Verfahrens. Dazu wird eine 0,5 gewichtsprozentige Lösung von ß-Glucan (Sigma no. G6513) in 50 mM Glycinpuffer (pH 9,0) eingesetzt.

250 Ill dieser Lösung werden zu 250 Ll einer Lösung, die das auf glucanolytische Aktivität zu testende Mittel enthält, gegeben und 30 Minuten bei 40 °C inkubiert.

Anschließend werden 1,5 ml einer l gewichtsprozentigen Lösung von p- Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH) in 0,5 M NaOH, die 1 mM Bismutnitrat und 1 mM Kaliumnatriumtartrat enthält, zugegeben und die Lösung wird 10 Minuten auf 70 °C erwärmt. Nach Abkühlen (2 Minuten 0 °C) wird bei Raumtemperatur die Absorption bei 410 nm (zum Beispiel unter Verwendung eines Photometers Uvikon (b 930) unter Verwendung einer Glukose-Eichkurve gegenüber einem Blindwert bestimmt.

Als Blindwert wird eine Lösung herangezogen, die wie die Meßlösung vorbereitet wurde mit dem Unterschied, daß man die Glucan-Lösung erst nach der Zugabe der PAHBAH- Lösung zugibt. 1 U entspricht der Enzymmenge, die unter diesen Bedingungen 1 pmol Glucose pro Minute erzeugt.

Die spezifische Aktivität des so erhaltenen Enzyms lag bei 4390 mU pro mg Protein, wohingegen die Ausgangslösung eine um den Faktor 152 geringere Aktivität aufgewiesen hatte. Das Enzym wurde als homogene Bande in der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese angefärbt (Silberfärbung).

Mit Hilfe von Markerproteinen (Cytochrom c, Pferde-Myoglobin, Chymotrypsinogen, Ovalbumin, Rinderserumalbumin) als internem Standard wurde mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese das Molekulargewicht der ß-Glucanase aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 zu ca. 30 000 abgeschätzt.

In der isoelektronischen Fokussierung (pH 3 bis 9) wurde der isoelektrische Punkt der ß- Glucanase mittels Aktivitätsanfarbung zu pH 5,2 bestimmt.

Beispiel 2 : pH-Profil Die Bestimmung der glucanolytischen Aktivität bei verschiedenen pH-Werten erfolgte in einem Davies-Universalpuffer (21,01 g Zitronensäure H2O, 13,61 g KH2P04,19,07 g Na2B407 10 H2O, 12,11 g Tris und 7,46 g KCl in l l dest. Wasser ; 50 ml dieser Stammlösung werden mit 0,4 N NaOH auf den gewünschten pH eingestellt und mit dest.

Wasser auf 200 ml aufgefüllt) bei 40 °C und 30 minütiger Inkubation. Wie aus dem in Fig. 2 wiedergegebenen pH-Profil (Auftragung der relativen glukanolytischen Aktivität, rel. A., gegen den pH-Wert) deutlich wird, ist das Enzym am aktivsten im Bereich zwischen pH 6 und pH 10,5. Das Optimum liegt bei pH 9.

Beispiel 3 : Temperatur-Profil Die Temperaturabhängigkeit der glucanolytischen Aktivität der aus Bacillus alkalophilus DSM 9956 gewonnenen ß-Glucanase wurde in Glycin/NaOH bei pH 9 mit 15 minütiger Inkubation gemessen. Der pH-Wert der Testlösung wurde angepasst, da der Puffer eine Temperaturabhängigkeit von ca. pH 0,033 pro °C aufweist. Das Maximum der glucanoly- tischen Aktivität liegt bei 60 °C, wie man aus Fig. 3 erkennt, in der die relative glukanolytische Aktivität (rel. A.) des Enzyms in Abhängigkeit von der Temperatur (T) aufgetragen ist.

SEQUENZPROTOKOLL ALLGEMEINE ANGABEN : ANMELDER : NAME : Cognis Gesellschaft für Biotechnologie mbH STRASSE : Henkelstraße 67, Gebäude Y 20 ORT : Düsseldorf BUNDESLAND : Nordrhein-Westfalen POSTLEITZAHL : 40589 TELEFON : 0211-7976763 TELEFAX : 0211-7987607 BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG : Neue Beta-Glucanase aus Bacillus ANZAHL DER SEQUENZEN : 2 BRIEFADRESSE : ADRESSAT Cognis Gesellschaft für Biotechnologie mbH STRASSE : Henkelstraße 67, Gebäude Y 20 ORT : Düsseldorf BUNDESLAND : Nordrhein-Westfalen POSTLEITZAHL : 40589 COMPUTERLESBARE FASSUNG : DATENTRÄGER : Diskette COMPUTER : IBM PC-kompatibel BETRIEBSSYSTEM : MS-WINDOWS SOFTWARE : MS WORD 97 ANGABEN ZU SEQ ID-NO : 1 : SEQUENZ-CHARACTERISTIKA : LÄNGE : 308 Aminosäuren ART : Aminosäure TOPOLOGIE : unbekannt ART DES MOLEKÜLS : Protein HYPOTHETISCH : NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID-NO : 1 : Met Lys Arg Lys Thr Phe Val Leu Phe Ser Leu Phe Thr Leu Leu Ile 1 5 10 15 Gly Met Phe Ser Thr Gly Phe Ala Asn Thr Gly Val Val Gln Ala Glu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Met Gly Ser Thr Phe His Glu Thr Phe Asp Thr Phe 35 40 45 Asn Thr Asp Arg Trp Ser Thr Ala Gly Val Trp Thr Asn Gly Ala Met 50 55 60 Phe Asn Ala Thr Trp Tyr Pro Glu Gln Val Thr Ile Ser Asp Gly Lys 65 70 75 80 Met Lys Leu Gln Ile Asp Lys Glu Asp Asp Glu Asp Ala Thr Pro Glu 85 90 95 Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr Asn Gln Phe Tyr Gln Tyr Gly Leu 100 105 110 Phe Glu Val Asn Met Lys Pro Ala Lys Ser Thr Gly Thr Val Ser Ser 115 120 125 Leu Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Trp Asp Trp Asp Asn Asp Pro Trp Asp 130 135 140 Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Arg Val Gln Phe 145 150 155 160 Asn Tyr Phe Thr Asn Gly Val Gly Asn Asn Glu His Tyr His Glu Leu 165 170 175 Gly Phe Asp Ala Ser Glu Ser Phe Asn Thr Tyr Ala Phe Glu Trp Arg 180 185 190 Pro Glu Ser Ile Ser Trp Tyr Val Asn Gly Glu Leu Val Tyr Thr Ala 195 200 205 Thr Glu Asn Ile Pro Gln Thr Pro Gln Lys Ile Met Met Asn Leu Trp 210 215 220 Pro Gly Ile Gly Val Asp Gly Trp Thr Gly Val Phe Asp Gly Glu Asp 225 230 235 240 Thr Pro Val Val Thr Glu Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr Pro Leu Glu 245 250 255 Glu Leu Asp Asn Asn Gly Glu Gln Pro Lys Pro Val Val Pro Gly Lys 260 265 270 Pro Glu Lys Pro Gly Lys Pro Gly Lys Asn Gln Lys Asn Gln Glu Asn 275 280 285 Gln Glu Asn Gln Lys Asn Gln Glu Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ile Arg 290 295 300 Lys Thr Ser Ser 305 308 ANGABEN ZU SEQ ID-NO : 2 : SEQUENZ-CHARACTERISTIKA : LANGE : 927 Basenpaare ART : Nukleinsäure STRANGFORM : Doppelt TOPOLOGIE : linear ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA HYPOTHETISCH : NEIN ANTI-SENSE : NEIN URSPRÜNGLICHE HERKUNFT : STAMM : Bacillus alkalophilus DSM 9956 SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID-NO : 2 : ATG AAA AGG AAG ACA TTT GTA TTA TTT TCT TTA TTT ACG TTG TTA 45 ATT GGT ATG TTC TCA ACA GGG TTT GCA AAT ACA GGT GTG GTT CAG 90 GCA GAA GAT GGG AGA CCA ATG GGG TCG ACG TTT CAT GAA ACG TTT 135 GAT ACC TTT AAT ACG GAC CGC TGG TCA ACA GCT GGG GTA TGG ACA 180 AAT GGA GCA ATG TTT AAT GCG ACA TGG TAT CCA GAA CAG GTG ACC 225 ATT TCA GAT GGG AAA ATG AAG TTG CAA ATT GAC AAG GAA GAT GAT 270 GAA GAT GCA ACC CCA GAA TAT AAG GCT GGG GAA TTA AGA ACG AAT 315 CAG TTT TAT CAA TAC GGG TTG TTT GAA GTC AAT ATG AAG CCA GCG 360 AAA TCA ACA GGA ACC GTC TCT TCA CTC TTT ACA TAT ACG GGT CCA 405 TGG GAT TGG GAT AAT GAT CCT TGG GAT GAA ATC GAT ATT GAG TTC 450 CTT GGA AAG GAT ACA ACA AGA GTC CAA TTT AAC TAT TTT ACT AAC 495 GGA GTA GGA AAC AAT GAA CAT TAC CAC GAA TTA GGG TTC GAT GCA 540 TCA GAA TCT TTT AAT ACG TAT GCT TTT GAA TGG AGA CCA GAA TCA 585 ATT AGT TGG TAC GTA AAC GGA GAA TTA GTA TAT ACA GCA ACA GAA 630 AAT ATC CCG CAA ACA CCA CAA AAA ATT ATG ATG AAC TTA TGG CCT 675 GGA ATT GGA GTG GAT GGA TGG ACA GGC GTT TTT GAC GGA GAA GAC 720 ACT CCA GTT GTA ACG GAG TAT GAT TGG GTA AGG TAC ACT CCA CTA 765 GAG GAA TTA GAT AAT AAC GGA GAA CAA CCG AAA CCT GTA GTG CCA 810 GGA AAA CCA GAA AAA CCA GGA AAA CCA GGG AAA AAC CAG AAA AAC 855 CAG GAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC 900 CAA AAA ATC AGA AAA ACC AGT AGT TGA 927