DEL OLMO BASTERRECHEA, Maite (Gatzarriñe 10, 1°B Sopelana, Bizkaia, E-48600, ES)
CASTRO FEO, Maria, Begoña (Aldekoane, 128-2°D, Leioa, E-48490, ES)
INFANTE MARTINEZ, Arantza (Arkotxa 29, 3°C Algorta-Getxo, Bizkaia, 48992, ES)
ALONSO VARONA, Ana, Isabel (Sarrenebarri 1, 1°B Getxo, Bizkaia, 48992, ES)
PALOMARES CASADO, Teodoro (Beato Tomás de Zumarraga 2, 2°B Vitoria, Alava, E-01008, ES)
FONT PEREZ, Julio (Alameda de Recalde 54, 1° Dcha, Bilbao, E-48008, ES)
DEL OLMO BASTERRECHEA, Maite (Gatzarriñe 10, 1°B Sopelana, Bizkaia, E-48600, ES)
CASTRO FEO, Maria, Begoña (Aldekoane, 128-2°D, Leioa, E-48490, ES)
INFANTE MARTINEZ, Arantza (Arkotxa 29, 3°C Algorta-Getxo, Bizkaia, 48992, ES)
ALONSO VARONA, Ana, Isabel (Sarrenebarri 1, 1°B Getxo, Bizkaia, 48992, ES)
PALOMARES CASADO, Teodoro (Beato Tomás de Zumarraga 2, 2°B Vitoria, Alava, E-01008, ES)
| REINVINDICACIONES 1. Biomaterial caracterizado porque comprende una mezcla de glicosaminoglicanos (GAGs) procedentes de cordón umbilical humano, libre de membrana y vasos sanguíneos de cordón umbilical humano. 2. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia mezcla de GAGs se extrae de Ia Gelatina de Wharton presente en el cordón umbilical humano. 3. Biomaterial de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque comprende una mezcla de glicosaminoglicanos seleccionados del grupo que consiste en: ácido hialurónico, queratán sulfato, condroitin sulfato 6, heparán sulfato, condroitin sulfato 4, dermatán sulfato y heparina. 4. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque comprende ácido hialurónico en un 65-75% de Ia mezcla total de GAGs. 5. Biomaterial de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende queratán sulfato en un 5-15% de Ia mezcla total de GAGs. 6. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque comprende condroitin sulfato 6 en un 6-8% de Ia mezcla total de GAGs. 7. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque comprende heparan sulfato en un 3-7% de Ia mezcla total de GAGs. 8. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque comprende condroitin sulfato 4 en un 2-6% de Ia mezcla total de'GAGs. HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 9. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque comprende dermatán sulfato en un 1-5% de Ia mezcla total de GAGs. 10. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque comprende heparina en un 0.1-2% de Ia mezcla total de GAGs. 11. Biomaterial desarrollado a partir de cordón umbilical humano de acuerdo con Ia reivindicación 3, caracterizado porque contiene: ácido hialurónico (70%), queratán sulfato (10%), condroitin sulfato 6 (7%), heparán sulfato (5%), condroitin sulfato 4 (4%), dermatán sulfato (3%) y heparina (1%). 12. Biomaterial desarrollado a partir de cordón umbilical humano de acuerdo con las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque es un hidrogel. 13. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 12, caracterizado porque es un hidrogel inyectable. 14. Biomaterial de acuerdo con las reivindicaciones 12-13, caracterizado porque el hidrogel inyectable presenta una viscosidad de 10 a 15.000cts. 15. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 12, caracterizado porque presenta una viscosidad entre 10 y 2.000cts. 16. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 12, caracterizado porque posee una viscosidad superior a 15.000cts 17. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 12, caracterizado porque es un hidrogel sólido. 18. Biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 17, caracterizado porque posee una estructura sustancialmente porosa con un diámetro de poro de 0,5-IOOOμm. HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 19. Biomaterial de acuerdo con reivindicación 18, caracterizado porque el diámetro de poro es de 0,5-500μm 20. Biomaterial de acuerdo con reivindicaciones 1-19 caracterizado porque adicionalmente comprende células. 21. Biomaterial de acuerdo con reivindicación 20. caracterizado porque dichas células se seleccionan del grupo entre: células madre mesenquimales indiferenciadas o bien diferenciadas a otra estirpe celular y/o células madre hematopoyéticas indiferenciadas o bien diferenciadas a otra estirpe celular y/o condrocitos y/o condroblastos y/o osteoblastos y y/o osteocitos y/o queratinocitos y/o fibroblastos y/o miocítos y/o adipositos y/o neuronas y/u otras células procedentes del sistema nervioso y/o células del sistema leucocitario y/o células corneales y/o células endoteliales y/o células epiteliales 22. Procedimiento de obtención del biomaterial de acuerdo con las reivindicaciones 1-21 , caracterizado porque comprende Ia siguientes etapas: a) Obtención de un cordón umbilical humano; b) Tratamiento del cordón umbilical con una solución salina y antibióticos; c) Eliminación de toda Ia sangre de Ia superficie del cordón; d) Fragmentación del cordón en secciones de 1-2 cm; e) Limpieza de toda Ia sangre retenida en el interior; f) Eliminación de la membrana y de los vasos sanguíneos del cordón umbilical; g) Separación de Ia sustancia gelatinosa que comprende Ia gelatina de Wharton; h) Digestión enzimática de Ia sustancia gelatinosa obtenida; y i) Precipitación y aislamiento de los GAGs; 23. Procedimiento de obtención del biomaterial obtenido de acuerdo con ' las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque dicho biomaterial comprende un hidrogel HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) obtenible por disolución de los GAGs obtenidos en Ia reivindicación 22, y que posee una viscosidad de ÍO a 15.000 cts. 24. Procedimiento de obtención del biomaterial de acuerdo con las reivindicaciones 17- 19, caracterizado porque comprende un hidrogel obtenible por entrecruzamiento a partir de los GAGs obtenidos en Ia reivindicación 22, que posee una estructura tridimensional sustancialmente porosa con un diámetro de poro de 0,5-1000 μm. 25. Procedimiento de obtención de! biomaterial de acuerdo con Ia reivindicación 24, caracterizado porque el diámetro de poro es preferiblemente de 0,5-500 μm. 26. Procedimiento de obtención del biomaterial obtenido de acuerdo con las reivindicaciones 24-25, cuyo entrecruzamiento se produce por cambios de temperatura, reacciones químicas o fotopolimerización 27. Utilización del biomaterial de acuerdo con las reivindicaciones 1-26 para: remodelado, relleno o reconstrucción de tejidos blandos, tratamiento de arrugas, pliegues y cicatrices, quemaduras, úlceras, aumento de tejidos blandos, lipoartrofia facial, patologías del disco intervertebral, reparación de cartílago, lesiones musculoesqueléticas, osteoartritis y periartritis; tratamiento antitumoral, enfermedades vaginales, lesiones cerebrales, reparación medular, desórdenes neurodegenerativos, enfermedades cardiovasculares y procesos de lubricación, como analgésico y antiinflamatorio; tratamiento de quemaduras, úlceras y defectos dermo-epidérmicos, tratamiento de enfermedades oftalmológicas, como lesiones corneales, de Ia retina o cataratas; reparación del cartílago, tratamiento del sistema osteoarticular como en el caso de defectos osteocondrales, osteoartritis o defectos óseos y adjuvante en Ia resolución de enfermedades vaginales, tratamiento de Ia gingivitis y Ia periodontitis; utilización en el desarrollo de sistemas de cultivo celular. HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) |
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención hace referencia a un biomaterial, concretamente un hidrogel, formado a partir de Ia matriz extracelular del cordón umbilical para su aplicación en Medicina Regenerativa. En particular Ia invención hace referencia a un biomaterial compuesto por glicosaminoglicanos aislados exclusivamente de Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical que opcionalmente puede contener células, y también a los métodos para su producción y uso.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los biomateriales formados por polímeros juegan un papel central en medicina regenerativa ya que proporcionan anclajes temporales tridimensionales para Ia adhesión, Ia proliferación y Ia diferenciación de células trasplantadas. Este carácter tridimensional proporciona una plataforma adecuada para Ia comunicación intercelular y Ia relación de las células con los componentes del biomaterial. La biointeracción que se produce entre Ia matriz y las células en el tiempo determina Ia capacidad proliferativa de las células, su organización para Ia formación de un nuevo tejido, su diferenciación y Ia secreción de moléculas de señalización que dirigen el proceso regenerativo (Dawson et al., 2008).
Para que se puedan producir estos fenómenos es necesario que el biomaterial permanezca en el lugar de Ia aplicación durante un tiempo limitado hasta su reabsorción, conservando su estructura el suficiente tiempo para una acción celular adecuada con consecuencias regenerativas.
Un tipo de biomaterial concreto, ios hidrogeles, poseen numerosas propiedades que los hacen muy adecuados para su aplicación en Ia Ingeniería de Tejidos.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los hidrogeles son estructuras formadas por polímeros hidrofílicos de origen natural o sintético interconectados, con capacidad de contener una gran cantidad de agua en el interior de su estructura, desde el 10-20% hasta cientos de veces su propio peso. Estos geles exhiben una morfología semi-sólida cuyo entramado tridimensional se presenta como candidato ideal para formar una matriz estructural capaz de actuar como soporte. Esta estructura tridimensional puede estar formada tanto por entrecruzamiento físico como por entrecruzamiento químico. El entrecruzamiento físico da lugar a hidrogeles reversibles cuya estructura puede ser revertida en función de las aplicación final, mientras que el entrecruzamiento químico da lugar a hidrogeles permanentes cuya estructura se mantendrá a Io largo de toda Ia aplicación (Cobum et al., 2007). Por Io tanto, los hidrogeles son materiales poliméricos (de origen natural o sintético) entrecruzados en forma de red tridimensional, que se hinchan en contacto con el agua formando materiales blandos y elásticos, y que retienen una fracción significativa de Ia misma en su estructura sin disolverse.
Los hidrogeles presentan una serie de características particulares como son:
1. Carácter hidrófilo: debido a Ia presencia en su estructura de grupos solubles en agua (-OH, -COOH, -CONH2, -CONH, SO3H). Tienen un alto contenido en agua similar al que presentan los tejidos vivos (Elisseeff et al., 2005).
2. Insolubles en agua: debido a Ia existencia de una red polimérica tridimpnsional en su estructura.
3. Presentan una consistencia suave y elástica Ia cual está determinada por el monómero hidrófilo de partida y Ia baja densidad de entrecruzamiento del polímero.
Poseen Ia capacidad de hincharse en presencia de agua o soluciones acuosas, aumentando considerablemente su volumen hasta alcanzar un equilibrio químico-físico, pero sin perder su forma. Esta capacidad de hincharse proporciona un microambiente acuoso comparable al que se ven sometidas las células en tejidos blandos. La presencia
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de agua y de una estructura porosa también permite el flujo de solutos de bajo peso molecular y de nutrientes cruciales y esenciales para Ia viabilidad celular, así como el transporte de los desechos celulares fuera del hidrogel (Torres et al., 2000).
El cordón umbilical es una estructura altamente vascularizada con un componente celular importante. Las células y el sistema vascular se encuentran integradas en un tejido conectivo gelatinoso llamado Gelatina de Wharton (GW). La GW contiene una baja cantidad de células y altos niveles de matriz extracelular, compuesta principalmente por colágeno, ácido hialurónico y glicosaminoglicanos sulfatados.
Los glicosaminoglicanos (GAGs), también denominados mucopolisacáridos, son heteropolisacáridos que se encuentran en los organismos unidos a un núcleo proteico formando macromoléculas denominadas proteoglicanos. Estos se pueden hallar en las superficies de las células o en Ia matriz extracelular y desempeñan importantes funciones para las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Se encuentran en forma sulfatada y no sulfatada y Ia característica común de estas moléculas es su composición en una secuencia repetida de disacáridos formada por dos azúcares distintos: uno de ellos es habitualmente un hexuronato mientras que el otro es una hexosamina. La variación configuracional en Ia unión de los disacáridos y Ia posición de Ia sulfatación lleva a un incremento de Ia diversidad en las propiedades físicas y químicas de estas cadenas.
El elevado contenido en sulfato y Ia presencia de ácido uránico confiere una gran carga negativa a los GAGs por Io que Ia gran cantidad.de GAGs que presenta Ia GW hace que este tejido se encuentre altamente hidratado.
Existen diversos tipos de GAGs, los cuales se encuentran implicados de forma directa en las funciones celulares básicas, no solo debido a su estructura, sino porque son lugares de anclaje de diversas moléculas de señalización celular.
El ácido hialurónico es el GAG más abundante de Ia GW. Es el único miembro no sulfatado de . Ia familia de GAGs que funciona ¡n vivo como un carbohidrato libre consistiendo su estructura en sucesivas repeticiones de un disacárido: ácido D- glucurónico y (1-β-3) N-acetil-D-glucosamina (Goa et al., 1994; Laurent et al., 1992). Se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) sintetiza por varios tipos celulares y se secreta al espacio extracelular donde interactúa con otros componentes de Ia matriz extracelular para crear Ia estructura de soporte y protección que rodea a las células (Collins eí al., 2008). Es un polímero linear, grande y polianiónico, y una sola molécula puede tener un peso molecular de 100.000 a 5.10 6 Da (Toóle eí al., 2004; Bertolami eí al., 1992). Adopta una estructura enroscada que ocupa un gran volumen, dando lugar a soluciones de gran viscosidad. Las moléculas individuales de ácido hialurónico se asocian entre ellas formando redes o entramados. En los tejidos en desarrollo el ácido hialurónico es considerado Ia principal macromolécula estructural implicada en Ia proliferación y Ia migración celular.
El ácido hialurónico ha sido implicado en diversos procesos como Ia vascularización, morfogénesis, reparación y Ia integridad general de Ia matriz extracelular. Se sabe que el ácido hialurónico contenido en gran cantidad en el líquido amniótico, favorece Ia reparación de las heridas fetales (Longaker eí al., 1989). Además, se han observado variaciones en sus propiedades moleculares entre Ia piel sana y las cicatrices, siendo seguramente distinto el ácido hialurónico de las cicatrices normales y de las hipertróficas (Ueno et al., 1992).
El condroitín sulfato es un polímero lineal formado por Ia repetición de un dímero de ácido D-glucurónico y N-acetilgalactosamina. Su utilidad ha sido probada en terapias dirigidas a combatir patologías articulares, mediante Ia inhibición de Ia actividad de los enzimas responsables de Ia degradación de Ia matriz de los componentes de los cartílagos. También actuaría como un antiinflamatorio por medio de Ia inhibición del complemento y es útil en el tratamiento de desórdenes tromboembólicos, en cirugía y clínicas oftalmológicas.
El dermatán sulfato, también conocido como condroitín sulfato B, es un potente anticoagulante por su efecto inhibitorio selectivo sobre Ia trombina a través del cofactor Il de Ia heparina, siendo muy eficaz in vivo por su menor riesgo hemorrágico (Trowbridge et al., 2002). '
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los glicosaminoglicanos, en general y en particular Ia heparina, tienen Ia capacidad de modular Ia actividad de las cascadas plasmáticas potenciando Ia inhibición de Ia vía intrínseca de Ia coagulación e inhibiendo Ia vía clásica de activación del complemento en diversos puntos (Rabenstein, 2001). Otras funciones conocidas de Ia heparina son Ia inhibición de Ia angiogénesis, el crecimiento humoral y su actividad antiviral.
El heparán sulfato tiene una estructura altamente relacionada con Ia heparina. Se distribuye ampliamente en los tejidos animales y entre sus funciones destacan Ia adhesión celular y Ia regulación de Ia proliferación celular. Posee un efecto protector frente a Ia degradación de proteínas, regulando su transporte a través de Ia membrana basal e interviniendo también en su internalización (Rabenstein, 2001).
Existen varios documentos de patente que se refieren a mucopolisacáridos obtenidos de origen animal o humano. El documento US 3,887,703 se refiere a mezclas de mucopolisacáridos obtenidas a partir de tegumentos y del cordón umbilical de fetos ovinos o bovinos. El único ejemplo que utiliza un cordón umbilical es de un feto de vaca de 1-9 meses y no menciona que se elimine Ia membrana ni los vasos ya que Ia primera operación es un molido por debajo de 1O 0 C. No se mencionan los mucopolisacáridos individuales que forman las mezclas ni las cantidades presentes, se identifican los productos activos por Ia cantidad de hexosaminas que hay presentes en Ia mezcla. Con los extractos se preparan composiciones para el tratamiento del pelo y el cuero cabelludo grasiento y para las inflamaciones tanto en forma de inyectable como por ingestión oral.
El documento de patente US 5,814,621 se refiere a una composición que consiste esencialmente en un medicamento que es más soluble en una mezcla de disolvente orgánico-agua que en agua, y un mucopolisacárído que forma parte de un medicamento, en el que cristales o partículas del medicamento están distribuidas en Ia superficie de las partículas del mucopolisacárido y en el que dicho medicamento se disuelve en agua más deprisa que si estuviera solo. Dicha composición puede tener forma granular.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) En Ia solicitud de patente WO 2008/021391 A1, se describen biomateriales que comprenden. Ia membrana del cordón umbilical. Además, puede comprender adicionalmente uno o más vasos del cordón umbilical y/o gelatina de Wharton. El biomaterial es preferiblemente seco y puede ser liso, tubular o adaptado para encajar en una estructura específica. La invención también proporciona métodos de fabricación del biomaterial comprendiendo al menos una capa de Ia membrana del cordón umbilical, así como los métodos para obtener dichos biomateriales y su uso para reparar tejidos u órganos.
La descripción caracteriza el biomaterial a partir del cordón umbilical. Describen ) que Ia composición de dicho material comprende colágeno (de tipo I, III y IV siendo estos un 75-80% del porcentaje de Ia matriz del biomaterial), fibronectina y glucosaminoglicanos.
También se menciona que el biomaterial también puede comprender colágeno que no provenga de cordones umbilicales y tenga procedencia comercial o que haya sido aislado a partir de otros tejidos y métodos conocidos en el estado de Ia técnica. Además los autores añaden, que el biomaterial puede comprender compuestos no estructurales como factores de crecimiento, hormonas, antibióticos, factores inmunomoduladores, etc.
En Ia patente española ES 8600613 se describe un procedimiento para el tratamiento de tejidos corporales, para separar membranas celulares, ácidos nucleicos, lípidos y componentes citoplasmicos y formar una matriz extracelular que tiene, como su principal componente colágenos, y para hacer que el tejido corporal sea adecuado para utilizarse como injerto corporal, que comprende extractar dicho tejido con al menos un detergente al mismo tiempo que se mantiene en un tamaño y forma adecuados para su injerto en el cuerpo.
El documento de patente ES 2 180 653 T3 describe métodos para transformar materiales biológicos en sustancias que han sufrido autólisis para eliminar por Io menos el 70% de las células y métodos de tratamiento de dicho material para inhibir su mineralización posterior a Ia implantación en un ser humano o animal. Se reivindica que
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) el material biológico de partida puede ser entre otros el cordón umbilical; aunque específicamente se refieren a una válvula aórtica porcina. No obstante, Ia descripción no contiene detalle alguno respecto a Ia realización con cordón umbilical. El biomaterial resultante se utiliza para Ia creación de una válvula cardiaca bioprotésica.
El documento de patente US4,240,794 se refiere a Ia preparación de cordones umbilicales de origen humano o animal para su utilización como injerto vascular. Específicamente el documento describe una técnica de deshidratación en alcohol del cordón umbilical seguido de un método de fijación en Ia configuración deseada. Se describe que una vez que el cordón umbilical se ha limpiado de posibles restos de otros tejidos, éste se monta sobre un mandril y se sumerge en una disolución concreta de alcohol etílico durante el tiempo necesario para que se deshidrate. Tras Ia deshidratación el cordón se sumerge en una disolución al 1% de aldehido para su fijación.
El documento de patente FR2, 563,727 describe un método para producir un injerto de piel a partir de tejido conectivo desprogramado impregnado con gelatina de Wharton y conservado a temperaturas de congelación. Los autores describen un dispositivo que se ancla al tejido umbilical y Io expande mediante una cánula que inyecta aire comprimido. Se describe que después el cordón umbilical es cortado y alisado pero el producto resultante de este proceso no está compuesto por exclusivamente GW.
Existen documentos de patente que utilizan el cordón umbilical para obtener células de su interés, para Io cual llevan a cabo procesos para separar Ia gelatina de
Wharton y eliminarla, obteniendo así dichas células. Por ejemplo, el documento PCT
98/17791 describe el aislamiento de pre-condriocitos a partir del cordón umbilical, Io cuales se utilizan posteriormente de forma terapéutica para producir cartílago. De forma similar en el documento WO 2004/072273 A1 se obtienen células madre extraídas de Ia gelatina de Wharton existente en Ia zona perivascular del cordón umbilical, que utilizan para reparar tejidos humanos.
Sin embargo no existe ningún documento que mencione un biomaterial formado por los GAGs que se encuentran en Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical humano,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) sin membrana no vasos sanguíneos, que pueda formar un hidrogel que se adapte a las características necesarias de viscosidad, etc. para utilizarse en diversas patologías humanas.
Así, el biomaterial de Ia presente invención está compuesto exclusivamente por los GAGs que conforman Ia matriz extracelular del cordón umbilical denominada GW. La matriz extracelular es una sustancia biológica compleja y específica de tejido. La matriz extracelular derivada de los vasos sanguíneos de Ia vejiga urinaria es completamente diferente de Ia derivada de Ia dermis (Hiles & Hodde, 2006). De esta manera, aunque en
Ia literatura se conocen varios intentos de sintetizar matriz extracelular, no se ha conseguido por el momento obtener una composición exacta que simule las condiciones naturales de un determinado tejido.
El biomaterial desarrollado en Ia presente invención ofrece una estructura tridimensional que permite su utilización como matriz base para Ia ingeniería tisular y además aplicado de forma directa, o con células, en una patología, interviene en el proceso regenerativo ejerciendo un efecto llamada sobre las células del propio tejido y proporcionando un entorno favorable para Ia activación de los procesos celulares.
La GW se caracteriza por contener un número muy bajo de células y sin embargo una gran cantidad de matriz extracelular (colágeno y GAGs). Es decir, las células que se encuentran en Ia GW se encuentran altamente estimuladas y son capaces de producir altos niveles de matriz. Esto es debido a que en Ia GW se acumulan altas cantidades de factores de crecimiento entre los que se encuentran el factor de crecimiento transformante beta (TGF-D), el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-I), el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Estos factores de crecimiento ejercen su papel regulador de Ia actividad celular mediante Ia unión a receptores específicos, algunos de los cuales se encuentran en los diversos GAGs que componen Ia GW. Estos factores de crecimiento controlan Ia proliferación celular, diferenciación y ' Ia síntesis y remodelado de Ia matriz extracelular que forma Ia GW. La gran cantidad de matriz sintetizada proporciona una
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) gran resistencia mecánica, elasticidad y una gran capacidad de hidratación que se utiliza para prevenir Ia oclusión de los vasos sanguíneos provocado por los movimientos de contracción del útero o fetales (Sobolewski et al., 2005).
A diferencia de otros biomateriales, el biomaterial de Ia presente invención se encuentra compuesto por una combinación de distintos GAGs procedentes de Ia GW del cordón umbilical. De forma mayoritaria se encuentra compuesto por ácido hialurónico, pero además, a diferencia de otros compuestos de GAGs, contiene dermatán sulfato, heparán sulfato, heparina, queratán sulfato, condroitín sulfato 4 y condroitín sulfato 6. Esta combinación de GAGs mejora Ia bioactividad del biomaterial, puesto que cada uno de ellos ejerce funciones reguladoras del comportamiento celular. Por ejemplo, se sabe que el heparán sulfato y Ia heparina son los principales lugares de unión para el FGF y el EGF (Kanematsu et al., 2003; Ishihara et al., 2002), los cuales los protegen de Ia proteólisis y permiten concentraciones locales de estos factores en el entorno celular, creando el microambiente molecular adecuado para una gran activación celular (Malkowski et al., 2007).
La combinación de GAGs presentes en este biomaterial aportan numerosos lugares específicos de unión de moléculas de señalización que van a permitir en el lugar de aplicación, una alta activación de las células del propio tejido para Ia síntesis de altos niveles de matriz extracelular que va a regenerar y reparar el defecto tratado.
Además, el origen del biomaterial de Ia invención proporciona una estructura natural de origen humano de una zona no inmunogénica, cuya eliminación se integra en los ciclos fisiológicos normales, evita las reacciones de los biomateriales de origen animal o los efectos secundarios que pueden producir algunos biomateriales sintéticos, como puede ser Ia inflamación, induración (endurecimiento de los tejidos de un órgano), aparición de granulomas, necrosis en mucosas y complicaciones tisulares por las sustancias tóxicas empleadas en su elaboración.
En el cordón umbilical, una de las funciones más importantes de los GAGs es proporcionar fuerza, elasticidad y resistencia para proteger el sistema vascular que se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) encuentra en su interior de las agresiones externas. De hecho, Ia deficiencia en Ia síntesis de estas moléculas están implicadas en patologías importantes durante el embarazo (Gogiel et al., 2005). La obtención de un biomaterial compuesto de los 7 tipos de GAGs diferentes que forman parte del cordón umbilical, sería capaz de formar entrecruzamientos entre sus fibras simulando Io que sucede en el organismo y proporcionando de esta manera una fuerza, elasticidad, resistencia y compresión similar a Ia que confieren en el cordón.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Caracterización y cuantificación de GAGs presentes en el biomaterial de Ia invención.
El histograma de barras muestra los diferentes tipos de Gags presentes en el biomaterial de Ia invención, así como el porcentaje de cada uno de ellos en el mismo. HA: ácido hialurónico, KS: queratán sulfato, C6S: condroitín sulfato 6, HS: heparán sulfato, C4S: condroitín sulfato 4, DS: dermatán sulfato, H: heparina.
Figura 2: Comprobación de Ia presencia de GAGs en Ia muestra y de Ia ausencia de células y DNA/RNA en las mismas mediante tinciones histológicas.
En las imágenes de Ia izquierda podemos observar las tinciones histológicas de las muestras con células y en las situadas a Ia derecha, las tinciones del biomaterial solo. A 1 B: tinción hematoxilina-eosina; C, D: tinción verde de metilo pironina; E, F: tinción azul alciano.
Figura 3: Imágenes de Ia estructura tridimensional interna del biomaterial de Ia invención por microscopía electrónica de barrido.
La imagen muestra Ia estructura interna del biomaterial de Ia invención a dos aumentos diferentes (A: 10 μm y B: 5 μm), en el que se observan las unidades de GAG interconectadas entre sí, ofreciendo una estructura porosa muy homogénea.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Figura 4: Resultados del estudio de toxicidad de las células dispuestas en el biomaterial de Ia invención.
Los gráficos muestran las curvas de citotoxicidad de las células AMSC (células madre mesenquimales de tejido adiposo) (Figura A), fibroblastos de ratón (Figura B9), L929 (Figura C), osteoblastos (Figura D), condorcitos (Figura E) y queratinocitos (Figura
F). Los resultados se dan con respecto a un control (células sin biomaterial) y a un control positivo (células en un biomaterial tóxico determinado por Ia norma ISO-10993, PVC).
Como se puede observar en las gráficas, el biomaterial no produce toxicidad en ninguno de los tipos celulares testados, puesto que Ia actividad mitocondrial de las células dispuestas sobre el biomaterial no muestra diferencias con respecto a las células controles (en condiciones estándar de cultivo).
Figura 5: Imagen macroscópica del biomaterial tridimensional
En esta imagen se observa Ia estructura tridimensional macroscópica del biomaterial sólido de Ia invención tras su liofilización para Ia cual se ha utilizado como molde una placa de cultivo estándar de 24 pocilios. La imagen corresponde a Ia cantidad de biomaterial solidificada en un pocilio.
BIBLIOGRAFÍA
- Collins M. N, Birkinshaw C. 2008. "Physical properties of crosslinked hyaluronic acid hydrogels". Journal of Material Science. Materials in Medicine, 19: 3335-3343.
- Coburn J. A, Pandit A. 2007. "Development of naturally-derived biomaterials and optimization of their biomechanical properties". topics in Tissue Engineering, 3: 1-14.
- Cui F. Z, Tian W. M, Hou S. P, Xu Q. Y 1 Lee I. S. 2006. "Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering". Journal of Material Science.
Materials ¡n Medicine, 17: 1393-1401.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) - Danishefsky I, Bella Jr. A. 1996. "The sulfated mucopolysaccharides from human umbilical cord", J. of Biological Chemistry, 241 : 143-146.
- Dawson J. I, Oreffo R. 2008. "Bringing the regeneration gap: stem cells, biomaterials, and clinical translation in bone tissue engineering". Archives of Biochemistry and Biophysics, 473: 124-131.
- Elisseeff J, Ruffner M, Kim T. G, Williams C. 2005: "Cellular photoencapsulation in hydrogels". Culture of Cells for Tissue Engineering, Chapter 9.
- Goa K. L, Benfield P. 1994. "Hyaluronic acid. A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology, and its therapeutic potential in joint disease and wound healing." Drugs, 47: 536-566.
- Gogiel T, Galewska Z, Jaworski S. 2005. "Pre-eclampsia-associated alterations in Wharton's jelly proteoglycans". Acta Biochim PoI, 52: 501-507.
- Hadidian Z, Pirie N. W. 1948. "The preparation and some properties of hyaluronic acid from human umbilical cord". The Biochemical Journal, 42: 260-265.
- Hiles M, Hodde J. 2006. "Tissue engineering a clinically useful extracellular matrix biomaterial". Int Urogynecol Journal, 17: 39-43.
- lshihara M, Obara K, Ishizuka T, Fujita M, Sato M, Masuoka K, Saito Y, Yura H, Matsui T, Hattori H, Kikuchi M, Kurita A. 2002. "Controlled reléase of fibroblasts growth factors and heparin from photocrosslinked chitosan hydrogels and subsequent effect on in vivo vascularization". Journal of Biomedical Materials Research, 78: 364-371.
- Jeanloz R. W, Forchielli E. 1950. "Studies on hyaluronic acid and related substances I. Preparation of hyaluronic acid and derivatives from human umbilical cord". Journal of Biological Chemistry, 186: 495-511.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) - Kanematsu A, Yamamoto S, Ozeki M, Noguchi T, Kanatani I, Ogawa O, Tabata Y. 2003. "Collagenous matrices as reléase carriers of exogenous growth factors". Biom ateríais, 25: 4513- 4520.
- Laurent T. C 1 Fraser J. R. E. 1992. "Hyaluronan". The FASEB Journal, 6: 2397-2404
- Longaker M, Chiu E.S, Harrison M. R, Crombleholme, Langer J. C, Duncan B. W, Adzick N. S, Verrler E. D, Stern R. 1989. "Studies in fetal wound healing" Annals of Surgery, 210: 667-672.
- Mahoney D. J, Aplin R. T, Calabro A, Hascall V.C, Day A. J. 2001. "Novel methods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides of defined length".GIycobiology, 11: 1025-1033.
- Malkowski A, Sobolewski K, Jaworski S, Bankowski E. 2007. "FGF binding by extracellular matrix components of Wharton's jelly". Acta Biochím PoI, 54: 357-363.
- Moore R. D, Schoenberg M. D. 1957. "Studies on connective tissue. I. The polysaccharides of the human umbilical cord". A. M. A. Archives of pathology, 64: 39-45.
- Pieper J. S, Oosterhof A, Dijkstra PJ, Veerkamp J. H, van Kuppevelt T.H. 1999. "Preparation and characterization of porous crosslinked collagenous matrices containing bioavailable chondroitin sulphate", Biomaterials, 20: 847-858.
- Rabenstein D. L. 2002. "Heparin and heparin sulfate: structure and function". Natural producís reports, 19: 312-331.
- Rogers B. A, Murphy C. L, Cannon S. R, and Briggs T. W. R. 2006. "Topographical variation in glyeosaminoglycan contení in human articular cartilage". The Journal of Bone and Joint Surgery, 88: 1670-1674.
- Sobolewski K, Mafkowski A, Baήkowski E, Jaworski S. 2005. "Wharton's jelly as a reservoir of peptide growth factors." Placenta, 26, 747- 752.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) - Toóle B. P. 2004. "Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue". Nature Cáncer Reviews, 4, 528-539.
- Torres D. S, Freyman T. M, Yannas I. V, Spector M. 2000. "Tendón cell contraction of collagen-GAG matrices in vitro: effect of cross-linking. Biomaterials, 21, 607-619.
-Trowbridge J. M, Gallo R. 2002. "Dermatan sulfate: new functions from an oíd glycosaminoglycan". Glycobiology, 12: 117-125.
- Ueno N, Chakrabarti B, Garg H. G. Hyaluronic acid of human skin and post-burn sean heterogeneity ¡n primary structure and molecular weight". 1992. Biochem Int, 26: 787-796.
- Wissink M. J. B, Beernink R, Pieper J. S, Poot A. A, Engbers G. H. M, Beugeling T, van Aken W. G, Feijen J. 2001. "Binding and reléase of basic fibroblast growth factor from heparinized collagen matrices", Biomaterials, 22: 2291-2299.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El cordón umbilical contiene grandes cantidades de GAGs (sulfatados y no sulfatados) formando parte del tejido conectivo blando denominado GW. Entre estos
GAGs, el principal es el GAG no sulfatado denominado ácido hialurónico (Hadidian et al.,
1948; Jeanloz et al., 1950), aunque también se detectan proporciones menores de GAGs sulfatados (Danishefsky et al., 1966). Además, estudios histológicos del cordón umbilical han sugerido Ia presencia de heparina (Moore et al., 1957). Es muy probable también que el cordón umbilical posea más GAGs sulfatados minoritarios que no se han reconocido hasta el momento.
La invención que describimos en el presente documento es un hidrogel compuesto por GAGs obtenidos exclusivamente de Ia GW del cordón umbilical. Este hidrogel se encuentra completamente exento de las células presentes en Ia GW cordón umbilical
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) humano a partir del cual se obtiene el biomaterial, por Io que no presenta componentes inmunogénicos.
El biomaterial se encuentra formado por una mezcla de glicosaminoglicanos seleccionados del grupo que comprende: ácido hialurónico, queratán sulfato, condroitin sulfato 6, heparán sulfato, condroitin sulfato 4, dermatán sulfato y heparina.
El biomaterial preferentemente se encuentra formando Ia siguiente combinación y proporción de Ia mezcla de GAGs: Ácido Hialurónico (65-75%), Queratán Sulfato (5-15%), Condroitin Sulfato 6 (6-8%), Heparán Sulfato (3-7%), Condroitin Sulfato 4 (2-6%), Dermatán Sulfato (1-5%) y Heparina (0,1-2%), más preferentemente Ia combinación de GAGs es: Ácido Hialurónico (70%), Queratán Sulfato (10%), Condroitin Sulfato 6 (7%), Heparán Sulfato (5%), Condroitin Sulfato 4 (4%), Dermatán Sulfato (3%) y Heparina (1%).
La presente invención también se refiere al biomaterial compuesto por el hidrogel anteriormente descrito, que opcionalmente contiene células. De esta manera se potencia Ia acción del hidrogel en el proceso regenerativo y de reparación tisular en aquellos tejidos muy dañados o sin posibilidad de aporte celular in situ por parte del paciente, gracias a que el biomaterial presenta células sanas del mismo tipo que el tejido afectado. Las células contenidas en el biomaterial pueden ser entre otras: células madre mesenquimales ¡ndiferenciadas o bien diferenciadas a otra estirpe celular, células madre hematopoyéticas indiferenciadas o bien diferenciadas a otra estirpe celular, condrocitos y condroblastos, osteoblastos y osteocitos, queratinocitos, fibroblastos, miocitos, adipositos, neuronas u otras células procedentes del sistema nervioso, células del sistema leucocitario, células corneales, células endoteliales o células epiteliales.
La presente invención se divide en las siguientes secciones: (i) obtención de extracto de GAGs a partir de Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical (ii) elaboración de un hidrogel a partir de los GAGs aislados a partir de Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical (iii) caracterización del hidrogel obtenido y (iv) usos del biomaterial.
Obtención de extracto de GAGs de Ia GW del cordón umbilical.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) El procedimiento de obtención del biomaterial comprende Ia siguientes etapas:
a. Obtención de un cordón umbilical humano; b. Tratamiento del cordón umbilical con una solución salina y antibióticos; c. Eliminación de toda Ia sangre de Ia superficie del cordón; d. Fragmentación del cordón en secciones de 1-2 cm; e. Limpieza de toda Ia sangre retenida en el interior; f. Eliminación de Ia membrana y de los vasos sanguíneos del cordón umbilical; g. Separación de Ia sustancia gelatinosa que comprende Ia gelatina de Wharton; h. Digestión enzimática de Ia sustancia gelatinosa obtenida; y i. Precipitación y aislamiento de los GAGs;
Concretamente, para aislar los glicosaminoglicanos de Ia GW del cordón umbilical se procede de Ia siguiente manera:
Obtención de la Gelatina de Wharton.
Se recoge el cordón umbilical inmediatamente después del parto y se procesa o se mantiene a 4 0 C hasta su procesamiento, no deben transcurrir más de 24 horas en estas condiciones.
Para su procesado, el cordón umbilical se mantiene preferiblemente en condiciones estériles, en una campana de flujo laminar de nivel de bioseguridad II. Se somete a un mínimo de tres lavados sucesivos, con una solución de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) o con buffer fosfato 1X (PBS 1X) con una mezcla de antibióticos (penicilina, estreptomicina, anfotericina-B) y/o una solución tampón de lisis de eritrocitos, para eliminar por completo los restos de sangre.
Una vez limpia de sangre Ia superficie del cordón umbilical, se transfiere a una placa Petri y se fragmenta en secciones de 1-2 cm. Al cortar el cordón en fragmentos es
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) posible que se libere sangre retenida en el interior de los vasos sanguíneos del cordón umbilical por Io que será necesario en este caso limpiar a fondo los fragmentos de cordón.
El cordón umbilical consta a nivel estructural de dos arterias umbilicales y una vena umbilical, sostenidas por una matriz consistente que es Ia GW y recubierto de una fina membrana. Para obtener exclusivamente Ia GW, se procede a eliminar de forma mecánica Ia membrana y los vasos sanguíneos. Para ello, se seccionan de forma longitudinal los fragmentos de cordón umbilical y con Ia ayuda de un escalpelo y unas pinzas se retiran con cuidado tanto Ia membrana del cordón umbilical, así como los vasos sanguíneos. La sustancia gelatinosa que se obtiene como consecuencia de ésta separación mecánica es Ia GW. Generalmente, a partir de un cordón umbilical de 25 a
200 g se obtienen entre 20 y 160 g de gelatina de Wharton.
Extracción de GAGs de Ia Gelatina de Wharton
Para Ia obtención de GAGs a partir de Ia GW del cordón umbilical se utilizó, con algunas modificaciones, el protocolo descrito en Ia literatura (Rogers et al., 2006) para obtener GAGs a partir de cartílago humano mediante digestión enzimática con el enzima papaína (SIGMA, Ref: P-4762).
La GW obtenida en el punto anterior se sumerge en 10 mi de Ia solución tampón de extracción (L-Cysteína 5 mM, solución tampón Na2HPO4 100 mM, EDTA 5 mM, papaína 10 mg (14 U/mg), pH 7,5) durante 24-48 horas a 60 0 C, para su completa digestión.
Una vez digerida en su totalidad Ia GW, se centrifuga para eliminar el residuo inservible de Ia digestión. En este punto, se observa que el volumen de Ia digestión es superior al volumen de partida. Este aumento se debe a Ia disolución de los GAGs presentes en Ia GW y por Io tanto a Ia liberación del agua que éstos acumulan.
' Centrifugada Ia muestra, se transfiere el sobrenadante a otro recipiente y se procede a Ia precipitación de los GAGs presentes en Ia muestra.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Precipitación y aislamiento de GAGs de Ia GW del cordón umbilical.
Los GAGs de Ia GW se precipitaron con 5 volúmenes de etanol al 100%. Mediante este paso se precipitan los GAGs de Ia muestra así como sales presentes en ésta. La precipitación ocurre debido a que las moléculas de agua presentes en Ia muestra interactúan con las moléculas de etanol, de tal forma que las moléculas de agua no pueden interactuar con los GAGs de Ia muestra, volviéndose estos últimos insolubles en el agua, y por Io tanto precipitando. De esta manera, acto seguido de añadir el etanol y agitar el tubo, se observa un precipitado de color blanquecino. Los GAGs se dejan precipitando 12 horas a -2O 0 C. Una vez precipitados, se procede a centrifugar para eliminar el etanol al 100% y se lava el precipitado con 5 volúmenes de etanol al 75% para eliminar las posibles sales residuales que hayan precipitado en Ia muestra. Se centrifuga Ia muestra una vez más para eliminar totalmente el sobrenadante.
Una vez precipitada Ia muestra de GAGs, se deja secando el residuo sólido durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente hasta que se haya evaporado todo el etanol. Una vez evaporado el etanol, se resuspende Ia muestra de GAGs en H2O MiIi-Q y se mantiene almacenada a 4 0 C indefinidamente.
La resistencia mecánica de este tipo de materiales es baja, no están pensados para soportar cargas, a no ser que se combinen con otro tipo de materiales tipo composites o fosfatos calcicos, sino para realizar una acción bioactiva regeneradora en Ia zona dañada. Sin embargo, Ia gran afinidad que se da entre las moléculas de polisacáridos que componen este hidrogel, hace que mantengan una gran cohesión entre ellas, manteniéndose en el lugar de inyección y presentando un carácter adhesivo.
Entrecruzamiento: obtención de hidrogel
Existen otras aplicaciones terapéuticas, que requieren un biomaterial más resistente y permanente; con una estructura interna que permita su ' colonización por células procedentes bien de los tejidos adyacentes en el lugar de aplicación o por células
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) dispuestas en el biomaterial previamente a su implantación. En este caso el biomaterial de Ia invención actuaría a modo de matriz tridimensional bioactiva para inducir Ia curación y reparación de una lesión tisular.
El ácido Hialurónico, Condroitín Sulfato 6 y 4, el Queratán Sulfato, Dermatán Sulfato, el Heparán Sulfato y Ia Heparina regulan Ia actividad celular y activan Ia síntesis de nueva matriz extracelular. La gran diversidad de GAGs presentes en el biomaterial permiten Ia existencia de numerosos lugares de unión específicos para factores de crecimiento que regulan los procesos de proliferación y diferenciación celular, así como Ia capacidad de síntesis de nueva matriz extracelular y factores de crecimiento por parte de las células. Este efecto produce una mayor capacidad de respuesta en los tejidos afectados y acelera Ia regeneración e incluso permite Ia curación en el caso de zonas muy degradadas, como es el caso de úlceras crónicas.
Para que el biomaterial pueda ser utilizado como matriz tridimensional, el extracto de GAGs tiene que ser estabilizado, aumentar sus propiedades mecánicas y permitir Ia formación de una estructura tridimensional. Para conseguir estos objetivos, los GAGs pueden ser químicamente modificados o entrecruzados, para formar un material en forma de hidrogel sólido. Estas modificaciones químicas típicamente implican a grupos carboxílicos o alcohol.
Para Ia obtención de un hidrogel estable y sólido, es necesario someter a Ia muestra a una reacción de entrecruzamiento (crosslinking, polimerización). Este proceso implica que las cadenas de un polímero soluble en agua se convierten en insolubles (Elisseeff et al., 2005).
Los hidrogeles obtenidos mediante el entrecruzamiento poseen propiedades únicas que los hace potencialmente útiles para Ia Ingeniería de Tejidos: alto contenido en agua para el transporte de nutrientes o sustancias de desecho, elasticidad y Ia capacidad de encapsular o de inmovilizar células in situ en un microambiente 3D. La densidad del entrecruzamiento influye directamente en el tamaño del poro del hidrogel y por Io tanto en las propiedades físicas del mismo, como por ejemplo el contenido en agua o Ia resistencia
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) mecánica. De esta manera, un hidrogel con una densidad de entrecruzamiento grande y por Io tanto un tamaño de poro muy pequeño, absorberá menos agua y poseerá una mayor resistencia mecánica que un hidrogel con un grado menor de entrecruzamiento y con un tamaño de poro grande.
La formación de un hidrogel por entrecruzamiento se puede llevar a cabo mediante diversos métodos: cambios de temperatura, reacciones químicas y fotopolimerización.
En Ia presente invención Ia reacción de entrecruzamiento se lleva a cabo de Ia siguiente manera: se obtiene una solución acuosa del polímero a entrecruzar (en nuestro caso solución acuosa de GAGs) y se adiciona el reactivo químico que producirá el entrecruzado. En este caso para desarrollar el hidrogel se utiliza EDC (1-ethyl-3-(3- , dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) ya que el EDC activa los grupos carboxilo en soluciones acuosas. Estos grupos carboxilo activados son capaces de reaccionar con aminas primarias o grupos hidroxilo resultando en enlaces amida o ester. Una vez formado el hidrogel, se lava varias con PBS para eliminar los restos de EDC que puedan quedar. De esta manera se consigue que las moléculas de GAG absorban grandes cantidades de agua, formando un hidrogel de aspecto sólido y poroso (Pieper et al., 1999; Wissink et al., 2001).
El hidrogel con una forma y tamaño específico se solidifica durante el proceso de entrecruzamiento en el molde destinado para tal fin, de forma que adopta Ia forma y el tamaño deseado dependiendo del molde que se utilice.
Los hidrogeles sólidos, se pueden desecar mediante el proceso denominado liofilización, para obtener de esta manera una estructura porosa, debido a Ia eliminación de las moléculas de agua intercaladas entre las moléculas de GAGs y presentes en el hidrogel (Fig. 5). Además, una vez liofilizado el biomaterial, se puede caracterizar Ia estructura tridimensional del hidrogel mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (Fig. 3). Mediante Ia liofilización se congela el hidrogel sólido obtenido y una vez congelado se introduce en una cámara de vacío para que eliminar el agua por el proceso
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) denominado sublimación. Mediante diversos ciclos de congelación se consigue eliminar prácticamente Ia totalidad del agua libre contenida en el hidrogel original.
Una vez obtenido el hidrogel en su forma final, se procede a su esterilización, mediante Ia exposición a radiación ultravioleta durante un periodo de 40 minutos. Las pruebas de esterilidad realizadas sobre el hidrogel demostraron que el biomaterial se esterilizó de forma óptima.
Una vez esterilizado, el hidrogel se encuentra en formato de producto final, listo para su aplicación directa o su asociación con células.
Ensayos de asociación de células con el hidrogel de Ia invención demostraron que el biomaterial no produce efectos tóxicos sobre las células, siendo su capacidad de proliferación similar a Ia que se produce en condiciones estándar de cultivo (Fig. 4).
Usos del bioqel
El biomaterial de Ia invención bien en su forma combinado con células o bien sólo, puede ser aplicado en su forma inyectable en enfermedades del sistema articular y en tratamientos estéticos. Las células que se pueden utilizar son, entre otras: células madre mesenquimales indiferenciadas o bien diferenciadas a otra estirpe celular, células madre hematopoyéticas indiferenciadas o bien diferenciadas a otra estirpe celular, condrocitos y condroblastos, osteoblastos y osteocitos, queratinocitos, fibroblastos, miocitos, adipositos, neuronas u otras células procedentes del sistema nervioso, células del sistema leucocitario, células corneales, células endoteliales o células epiteliales.
Dependiendo de Ia aplicación a Ia que vaya destinada el hidrogel, Ia técnica de inyección será diferente y Ia viscosidad del hidrogel se adaptará al calibre del sistema de inyección. La viscosidad del hidrogel inyectable es de 10 a 15.000 cts, preferentemente entre 10 y 2.000 cts. El hidrogel entrecruzado puede poseer una viscosidad superior a
15.000 cts. La viscosidad del hidrogel del hidrogel puede ser modificado por
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) entrecruzamiento según las necesidades, pudiendo obtener viscosidades superiores a 15.000cts.
El biomaterial desarrollado en Ia presente invención puede ser aplicado preferentemente de forma inyectable en las siguientes patologías: remodelado, relleno o reconstrucción de tejidos blandos, tratamiento de arrugas, pliegues y cicatrices, quemaduras, úlceras, aumento de tejidos blandos, lipoartrofia facial, patologías del disco intervertebral, reparación de cartílago, lesiones musculoesqueléticas, osteoartritis y periartritis. Tratamiento antitumoral, enfermedades vaginales, lesiones cerebrales, reparación medular, desórdenes neurodegenerativos, enfermedades cardiovasculares y procesos de lubricación, como analgésico y antiinflamatorio.
El biomaterial de Ia invención en su forma sólida, posee una estructura sustancialmente porosa. En dicha estructura el diámetro de poro es de 0,5 - 1.000 μm, preferiblemente de 0,5 - 500 μm, pudiendo presentar viscosidad superior a 15000cts. Dicho biomaterial en su forma sólida puede ser aplicado preferentemente en las siguientes patologías: tratamiento de quemaduras, úlceras y defectos dermo-epidérmicos, tratamiento de enfermedades oftalmológicas, como lesiones corneales, de Ia retina o cataratas.. Reparación del cartílago, tratamiento del sistema osteoarticular como en el caso de defectos osteocondrales, osteoartritis o defectos óseos. Adjuvante en Ia resolución de enfermedades vaginales, tratamiento de Ia gingivitis y Ia periodontitis. Utilización en el desarrollo de sistemas de cultivo celular.
Las enfermedades condrales constituyen un importante problema socio-económico mundial. En este sentido, a pesar de Ia dificultad de registrar su incidencia, se estima que en el mundo las lesiones articulares afectan a 500 millones de personas.
Las patologías condrales se producen como consecuencia de lesiones o enfermedades que, si no son tratadas, pueden concluir en enfermedades degenerativas como Ia Osteoartritis (OA).
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La OA, es uno de los tipos más comunes de artritis que afecta a 35-40 millones de personas en EEUU y Europa. Es una enfermedad degenerativa que provoca Ia desintegración del cartílago acompañada con una reacción en el hueso. Generalmente afecta a manos, rodillas, caderas, pies y cuello y en los adultos está considerada como una de las causas más comunes de inhabilidad física.
El cartílago articular es un tejido avascular altamente especializado que protege al hueso de Ia articulación diartroidial, de las fuerzas asociadas con el peso e impactos que conducen a fricciones entre las superficies articulares. Este tejido está formado por un solo tipo celular, los condrocitos, y por una importante y rica matriz extracelular. Dicha matriz consiste en una red densa de fibras de colágeno de tipo Il (molécula predominante), y, en el interior de esta red macro-agregados de proteoglicanos, que contienen GAGs como el condroitín sulfato, queratán sulfato, ácido hialurónico y agrecán.
La especializada arquitectura del cartílago y su limitada capacidad de reparación, provocan que el tratamiento de este tipo de lesiones sea muy complicado. La ausencia de vascularización hace que su capacidad regenerativa sea muy limitada, puesto que las células progenitoras no pueden acceder a Ia zona dañada para contribuir en el proceso regenerativo.
Durante los últimos años, se están utilizando biomateriales biodegradables para el tratamiento de lesiones condrales. En este sentido, los polímeros sintéticos macroscópicos (láctico, glicólico, caprolactona...) se han convertido en el grupo de biomateriales más importante y numeroso. Sin embargo, estos materiales macroscópicos sólidos requieren el empleo de procedimientos quirúrgicos agresivos como es Ia cirugía convencional. Con el objetivo de superar estas limitaciones, en Ia actualidad se están desarrollando nuevas biomatrices capaces de ser implantadas por técnicas mínimamente invasivas como es Ia inyección o artroscopia.
Por Io tanto, una de las aplicaciones del biomaterial inyectable de Ia presente invención es Ia regeneración del cartílago articular dañado por el proceso degenerativo de Ia osteoartritis. Dicho biomaterial se puede administrar fácilmente en Ia zona a regenerar
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) mediante técnicas percutáneas como es Ia artroscopia o mediante cualquier dispositivo de inyección. Además de Ia fácil administración, el hidrogel inyectable posee Ia propiedad de formar un implante estable que se ajusta al tamaño y geometría del tejido deteriorado.
Otra aplicación del biomaterial, es Ia Utilización del biomaterial tridimensional para el tratamiento de heridas.
Las úlceras crónicas -diabéticas, decúbito, venosas- constituyen un importante problema que afecta a entre 3 y 6 millones de personas en EEUU. Esta patología afecta al 1-3% de Ia población de los países desarrollados y el 15% de los pacientes ingresados en un hospital están afectados con esta dolencia. El amplio número de pacientes que sufre estas lesiones producen importantes repercusiones socioeconómicas y sanitarias, constatándose, de este modo, un elevado costo de tratamiento, y alterando, de manera importante, Ia calidad de vida del paciente.
Las úlceras son traumatismos que tienen una gran repercusión sobre el organismo con una fisiopatología considerablemente compleja. En el lecho de una herida se produce una compleja interacción sinérgica entre fibroblastos (células de Ia dermis), queratinocitos (células de Ia epidermis), matriz extracelular y las proteínas derivadas del plasma con el fin de que se produzcan las diferentes fases de cicatrización de Ia herida, hemostasia, inflamación, reparación y remodelación.
Sin embargo, Ia cronicidad y Ia recidiva son las incidencias más relevantes en Ia evolución clínica. A pesar de Ia gran variedad de tratamientos y apositos que se disponen en Ia actualidad, el porcentaje y Ia velocidad de cicatrización siguen siendo extremadamente bajos, precisando, por Io tanto, de tratamientos más eficaces que consigan Ia rápida cicatrización de Ia lesión. El progresivo conocimiento de Ia fisiopatología de las úlceras crónicas durante los últimos años ha originado el desarrollo de nuevos apositos que pueden suponer un avance significativo en el tratamiento de esta enfermedad. Aunque, hasta el momento, no existe un aposito ideal para el cubrimiento de
Ia piel, dicho aposito debe cumplir una serie de características básicas como son Ia rápida adhesión a Ia herida, proporcionar una barrera eficaz contra Ia pérdida de líquidos, resistir
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) contra presiones mecánicas para proporcionar una estabilidad a largo plazo, fáciles de esterilizar, manejo sencillo, fácil de transportar e inocuos.
El biomaterial sólido de Ia invención posee Ia mayoría de las características necesarias para que un aposito sea eficaz en Ia curación de una úlcera crónica. En este sentido, con el fin de evaluar el efecto terapéutico en úlceras crónicas se ha llevado a cabo el estudio experimental in vivo empleando, para ello, ratones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Obtención de Ia gelatina de Wharton
Para aislar los GAGs de Ia GW del cordón umbilical se procedió de Ia siguiente manera:
Se recogió un cordón umbilical de 50 g inmediatamente después del parto, en un frasco estéril en el que se habían dispuesto previamente 300 mi de PBS a una concentración 1X (para 1 litro de H2O: NaCI 8 g, KCI 0,2 g, Na2HPO4 1,44 g, KH2PO4 0,24 g, pH=7,4 en 1 I de H2O) y 3 mi de una mezcla de antibióticos de penicilina (30.000 unidades), estreptomicina (30.000 μg) y anfotericina-B (75 μg) (LONZA, Ref: 17-745 E) a una concentración 1X. El cordón umbilical se puede guardar a 4 0 C, durante no más de 24 horas hasta su procesado, pero en este ejemplo el cordón umbilical se procesó inmediatamente tras su recepción.
Para su procesado, el cordón umbilical se mantuvo en condiciones estériles, en una campana de flujo laminar de nivel de bioseguridad Il y se sometió a sucesivos lavados para eliminar totalmente los restos de sangre que contiene. Para ello, se dispuso en un recipiente y se añadieron 300 mi de PBS 1X (Para 1 litro de H2O: NaCI 8 g, KCI 0,2 g, Na2HPO4 1,44 g, KH2PO4 0,24 g, pH=7,4 en 1 L de H2O) que contenían 3 mi de una mezcla de antibióticos de penicilina (30.000 unidades), estreptomicina (30.000 μg> y anfotericina-B (75 μg) (LONZA, Ref: 17-745 E), se agitó manualmente inclinando Ia botella verticalmente 5 veces durante 10 seg y se desechó el líquido, repitiéndose esta
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) operación un mínimo de 3 veces, hasta que se eliminó Ia mayor parte de Ia sangre. A continuación se procedió al lavado del cordón umbilical con 500 mi de una solución de lisis de eritrocitos a una concentración 1X (para 1 litro de H2O: NH4CI 8,99 g, KHCO3 1 g, EDTA 37 mg, pH 7,3) hasta Ia eliminación total de restos de sangre.
Una vez limpia de sangre Ia superficie del cordón umbilical, se transfirió a una placa Petri de 10 cm y se troceó con unas tijeras estériles en fragmentos de 1-2 cm. Como al cortar el cordón umbilical en fragmentos se liberó sangre retenida en el interior de los vasos sanguíneos, para limpiar a fondo dichos fragmentos, se añadieron 10 mi de PBS 1X conteniendo 1 mi de una mezcla de antibióticos (10.000 unidades), estreptomicina (10.000 μg) y anfotericina-B (25 μg), y se presionó Ia superficie del fragmento contra su superficie de apoyo, haciendo movimientos de desplazamiento horizontales a Io largo del fragmento con un escalpelo estéril. Este proceso se repitió hasta eliminar totalmente todos los restos de sangre de su interior. Los fragmentos del cordón umbilical, totalmente limpios, se transfirieron a un tubo estéril y se procesaron acto seguido, aunque en caso necesario se pueden crioconservar a -80 0 C indefinidamente.
A continuación se procedió a eliminar mecánicamente Ia membrana que rodea al cordón umbilical y los vasos sanguíneos que se encuentran en su interior. Para ello, se abrieron longitudinalmente los trozos de cordón umbilical y con Ia ayuda de un escalpelo y unas pinzas se retiraron tanto Ia membrana del cordón umbilical como los vasos sanguíneos. La sustancia . gelatinosa que se obtuvo como consecuencia de ésta separación mecánica fue Ia GW. Se obtuvieron 40 g de GW.
Ejemplo 2. Extracción de GAGs de Ia Gelatina de Wharton
Para Ia obtención de GAGs a partir de Ia GW del cordón umbilical se utilizó, con algunas modificaciones, el protocolo descrito para obtener GAGs a partir de cartílago humano (Rogers et al., 2006).
La GW obtenida en el Ejemplo 1 se sumergió en 10 mi de Ia solución tampón de extracción (242 μl de L-Cysteína 200 mM, 1,42 mi de buffer Na2HPO4 704 mM, 100 μl de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) EDTA 0,5 M, papaína (SIGMA, Ref: P-4762) 10 mg (14 U/mg), pH 7,5) y se mantuvo durante 24 horas a 6O 0 C, para digerir completamente Ia GW y una vez digerida se centrifugó Ia muestra a 800 rpm durante 5 min para eliminar el residuo de Ia digestión. Se observó que el volumen de Ia digestión era de 30 mi, aproximadamente 20 mi adicionales a los 10 mi de partida, por Ia disolución de los GAGs presentes en Ia GW y por Io tanto a Ia liberación del agua que éstos acumulaban.
Una vez centrifugada Ia muestra, se transfirió el sobrenadante a otro tubo y se procedió a Ia precipitación de los GAGs presentes en Ia muestra.
Ejemplo 3. Precipitación y aislamiento de GAGs de Ia GW del cordón umbilical.
. Los GAGs de Ia GW presentes en el sobrenadante se precipitaron con 5 volúmenes de etanol al 100%. Mediante este paso se precipitaron los GAGs de Ia muestra así como sales presentes en ésta, esto es debido a que las moléculas de agua presentes en Ia muestra interactúan con las de etanol, de tal forma que las moléculas de agua no pueden interactuar con los GAGs de la muestra. Los GAGs se dejaron precipitando 12 horas a -2O 0 C. Una vez precipitados, se centrifugó a 2500 rpm durante 5 min, eliminándose así todo el etanol al 100%, se lavó el precipitado con 5 volúmenes de etanol al 75% para eliminar las posibles sales residuales que hubieran precipitado en Ia muestra. A continuación, se centrifugó unos 5 min a 2500 rpm y se eliminó totalmente el sobrenadante.
Una vez precipitada Ia muestra, se dejó secando el residuo sólido durante unos
30 minutos a " F ambiente hasta que se hubo evaporado todo el etanol. La cantidad de GAGs que se precipitan partiendo de una muestra de unos 40 g de GW de puede variar entre 50 y 300 mg dependiendo del material de partida. En este caso concreto se obtuvieron 200 mg de precipitado de GAGs, que se resuspendieron en 2 mi de H2O MiIi-Q y así se mantuvo almacenada a 4 0 C hasta Ia elaboración del hidrogel.
Ejemplo 4. Elaboración de un hidroqel inyectable de GAGs de Ia GW del cordón umbilical.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) El contenido en agua del hidrogel puede llegar a ser desde un 10% hasta 100 veces su propio peso, dependiendo de Ia viscosidad que se requiera para su aplicación.
El hidrogel obtenido tras Ia resupensión de los GAGs precipitados en 2 mi de H2O se resuspendió en una solución de suero fisiológico inyectable para dar lugar a una viscosidad de 1000 cst. Posteriormente, este hidrogel se resuspendió en 8 mi de una solución de suero fisiológico inyectable para dar lugar a una viscosidad de 200 centistokes y se dejó agitando de forma moderada en un vortex hasta su completa disolución y homogeneizado, para evitar Ia degradación de Ia estructura del gel.
Una vez disuelto el hidrogel, se dejó almacenado a 4 0 C, donde puede mantenerse de forma indefinida.
Ejemplo 5. Elaboración de un hidrogel sólido de GAGS de Ia GW del cordón umbilical.
Para Ia elaboración del hidrogel sólido, se procedió según Io descrito en Ia bibliografía (Cui et al., 2006). Se preparó una solución acuosa a partir del extracto de GAGs obtenido de la GW según el Ejemplo 3. Concretamente, se preparó una solución al 1% de GAGs en H2O. Para ello, se añadieron 10 mi de H2O a los 200 mg de GAGs obtenidos tras su precipitación y aislamiento (Ejemplo 3). Se añadieron a Ia solución 1,2 g de Adipic dihydrazide (ADH) y se ajustó el pH de Ia solución con HCI 0,1 N hasta pH=3,5. Una vez ajustado este pH se añadió a Ia solución 0,6 g del fijador EDC (1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl carbodiimida hydrochloride ) (SIGMA, Ref: E6383). Se mantuvo Ia mezcla entre 30 minutos y 1 hora en agitación constante a T a ambiente hasta que se consiguió el hidrogel sólido.
Una vez formado el hidrogel sólido se lavó 3 veces con PBS 1X (para 1 litro de
H2O: NaCI 8 g, KCI 0,2 g, Na2HPO4 1,44 g, KH2PO4 0,24 g, pH=7,4 en 1 I de H2O) 5 min cada vez para eliminar el exceso de EDC. En cuanto a Ia forma física del hidrogel éste tendrá Ia forma del molde en el que solidifique, de tal manera que se pueden emplear placas de cultivo estándar de 96, 48, 24, 12 y 6 pocilios, placas Petri o cualquier otro
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) recipiente con Ia forma deseada. Adicionalmente, se puede solidificar el hidrogel en un recipiente grande como un vaso de precipitados y una vez solidificado se puede cortar el hidrogel con una forma y grosor característicos. Concretamente, en este ejemplo el hidrogel se solidificó en pocilios de placas de 24 pocilios y una vez solidificado se lavó 3 veces 5 min con 500 μl de PBS 1X.
En este caso, el hidrogel sólido entrecruzado en placas de 24 pocilios, se sometió al proceso de liofilización que consta de los siguientes pasos: se congeló el hidrogel a -8O 0 C. Se introdujeron las muestras de hidrogel congeladas en Ia cámara de vacio del liofilizador. Se sometieron las muestras de hidrogel a vacío mientras se subía Ia temperatura hasta -40 0 C a una velocidad de 0,1°C/min y se mantuvo Ia T 0 a -40 0 C durante 20 min. Posteriormente se subió Ia T 0 a -2O 0 C a una velocidad de 0,1°C/min y se mantiuvo Ia T 0 de -2O 0 C durante 15 min. Transcurrido este tiempo se subió Ia T 0 a O 0 C a una velocidad de 0,1°C/min y se mantiene Ia T 0 de O 0 C durante 15 min. Posteriormente se subió Ia T 0 a 25 0 C a una velocidad de 0,1°C/min y se mantuvo a esta T 0 durante el tiempo necesario para igualar Ia presión exterior y Ia presión interior de Ia cámara de vacío.
En este ejemplo, para Ia caracterización tridimensional del hidrogel mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), una vez liofilizado éste se procedió de Ia siguiente manera: se cortó una sección del hidrogel liofilizado y se llevó a cabo Ia desecación de esta sección al punto crítico con CO2 en un desecador AUTOSAMDRI-814 y al metalizado con oro en un SPUTTER. Se observaron las preparaciones a un voltaje 20 KV en el microscopio electrónico de barrido JEUL (JSM35).
El análisis por SEM (Figura 3) del hidrogel indicó que éste posee una estructura porosa uniforme y que contiene una red interconectada de poros. La micrografía refleja Ia existencia de una estructura tridimensional altamente porosa, con un diámetro de poro que varía entre 0,5 y 500 μm. Este rango de poros implica Ia existencia de micro y macroporosidad. Los macroporos (300-500 μm) son necesarios para que se realice una coionización celular adecuada, tanto para que se concentre un número elevado de células como para que convivan diferentes tipos celulares favoreciendo Ia formación de tejidos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) estructurados. Por ejemplo, para que se pueda formar una red vascular. Los poros intermedios permiten Ia integración celular. Los microporos (0,5-50 μn) son necesarios para Ia supervivencia celular, ya que son los responsables de que se lleve a cabo una correcta difusión de gases, nutrientes y Ia eliminación de los productos de desecho procedentes del metabolismo celular. La medida del tamaño del poro se efectúa en base a Ia escala métrica obtenida mediante el microscopio electrónico de barrido.
En este caso, a diferencia del ejemplo anterior del biomaterial inyectable, el hidrogel sólido aporta una estructura tridimensional, que constituye una matriz para el crecimiento y colonización celular en toda su estructura tanto interna como externa. Este biomaterial muestra una mayor estabilidad estructural, siendo indicado para aplicaciones en las que se busca no solamente un carácter bioactivo y de acción trófica, sino también una estructura que pueda albergar células de forma transitoria, hasta que se lleve a cabo Ia reparación tisular, como son el tratamiento de úlceras y otras enfermedades dermo- epidérmicas, reparación de cartílago y tratamientos oftalmológicos, entre otras. Las células contenidas en el biomaterial pueden ser las de los tejidos adjacentes al lugar de implantación, que han conseguido colonizarlo, o también células dispuestas ex vivo en el biomaterial previamente a su aplicación clínica, de forma que se potencia su acción regeneradora.
Este biomaterial presenta una distribución homogénea de poros cuyo tamaño se encuentra distribuido en un rango de 0.01 a 500 mieras de tamaño, determinado mediante técnicas de microscopía electrónica de barrido. Este rango de porosidad es adecuado tanto para Ia difusión de gases y nutrientes a través de toda su estructura, como para permitir Ia entrada de células en su interior.
Ejemplo 6. Caracterización v cuantificación de GAGs presentes en el biomaterial de Ia invención
• Se analizaron y cuantificaron los distintos GAG presentes en el biomaterial de Ia invención mediante Ia técnica de espectrometría de masas (ESI/MS). Dado que mediante esta técnica solamente se pueden determinar moléculas con un peso molecular de entre
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 200 y 2000 Daltons y que las moléculas de GAGs superan en gran medida este rango, se procedió en primer lugar a digerir enzimáticamente Ia muestra, para conseguir de esta manera cadenas de GAGs cuyo peso molecular se encuentre entre 200 y 2000 Da.
Como patrón para Ia identificación y cuantificación del GAGs se utilizaron compuestos comerciales estándar de cada uno de ellos de concentración conocida.
Concretamente, los estándares utilizados para llevar a cabo Ia cuantificación de GAGs fueron los siguientes: Para el Ácido Hialurónico: Hyaluronic acid potassium salt (SIGMA,
Ref: 53750) para el Condroitin Sulfato: Chondroitin sulfate sodium salt (SIGMA, Ref:
C4384), para el Dermatán sulfato: Dermatan Sulfate sodium salt (SlGMA, Ref: C3788), para el Queratán sulfato: Keratan sulfate (CHEMOS, Ref: 7295), para Ia Heparina:
Heparin sodium salt (SIGMA, Ref: H8537) y para el Heparan sulfato: Heparan sulfate sodium salt (SIGMA, Ref 51541).
Los valores de Ia cuantificación de GAGs presentes en la muestra se obtuvieron en base a los resultados obtenidos de cada estándar de GAG utilizado.
Para llevar a cabo la digestión enzimática de los GAGs se procedió según el procedimiento descrito en Ia literatura (Mahoney et al., 2001). Para ello se utilizaron los enzimas específicos para Ia digestión de cada GAG.
Para el Ácido Hialurónico se utilizó Hialuronidasa (SIGMA, Ref: H3506), para el
Condroitin Sulfato se utilizó Condroitinasa (SIGMA, Ref: C2780), para el Dermatán sulfato se utilizó Condroitinasa B (SIGMA, Ref: C8058), para Ia Heparina se utilizó Heparinasa I
(SIGMA, Ref: H2519), para el Heparan sulfato se utilizó Heparinasa I (SIGMA, Ref:
H2519), para el Queratán sulfato se utilizó Queratanasa (K2876).
Estos enzimas se prepararon resuspendiendo 440 U del enzima correspondiente en 10 mi del siguiente tampón: 2 mi de tampón fosfato 100 mM pH=7, 77, 770 μl de NaCI 1 M, 1 mg de BSA y 7,23 mi de H2O.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) El buffer de digestión enzimática con una concentración de enzima de 160 U/ml se preparó de Ia siguiente manera: 4,5 mi de Enzima (2000 U) se añadieron a 7,5 mi de buffer de digestión 1,5 mi de NaCI 1M, 0,333 mi de Acetato de sodio 3M pH = 5,2 y 5,67 mi de H2O.l_a preparación de las muestras y los estándares para ser sometidos a Ia digestión enzimática fue Ia siguiente: 500 μl de buffer de digestión (80 U de enzima) se añadieron a 500 μl de estándar de cada GAG a una concentración de 2 mg/ml, de tal manera que Ia solución final del estándar quedó a 1 mg/ml. Con Ia muestra de GAGs se procedió de Ia misma manera: 500 μl de buffer de digestión (80 L) de enzima) se añadieron a 500 μl de muestra de GAGs.
Las muestras se digirieron a 37 0 C durante 1 h, tras Io cual se inactivo el enzima mediante desnaturalización térmica a 60 0 C durante 5 min.
Una vez realizadas las digestiones se analizaron las muestras y los estándares mediante espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una metodología experimental empleada para Ia determinación de Ia relación masa/carga de determinados iones presentes en Ia muestra a analizar. El espectrómetro de masas consiste en 3 componentes básicos: fuente de iones, analizador de masas y detector. La muestra a analizar se ioniza mediante Ia fuente de iones, se separan en el analizador de masas y se detectan para producir un espectro de masas, donde los valores de masa/carga se muestran frente a Ia abundancia relativa de una especie iónica en concreto.
Concretamente, en este ejemplo Ia inyección de muestras en el espectrómetro de masas se llevó a cabo de Ia siguiente manera: 20 μl de las muestras se inyectaron, a un flujo de 0.2 ml/min directamente en el detector de masas/masas (modelo LCQ, Thermo). Se utilizó el método de ionización electrospray negativo (ESI -) y el tiempo del cromatograma se fijó en 10 minutos. Se seleccionaron los iones moleculares con un rango de ±6 Da, correspondientes según Ia bibliografía (Mahoney et al., 2001) al peso molecular de cadenas reconocidas para cada tipo de GAG. Dicho iones se mantuvieron presentes tanto en Ia muestra de GAGs estándar como en Ia muestra a analizar por Io que se demostró de ésta manera cualitativamente Ia presencia de cada GAG en Ia muestra. Para
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) asegurarse la reproducibilidad de los resultados, se inyectaron las muestras y los estándares por duplicado.
Para Ia cuantificación de los distintos GAGs, se realizó una recta patrón del estándar de cada GAG a 1 mg/ml. La recta estándar realizada constaba de los siguientes concentraciones de cada uno de los GAGs estándares (Ácido hialurónico, Condroitin sulfato, Dermatán sulfato, Heparina, Heparán sulfato y Queratán sulfato) empleados para hacer Ia recta patrón: 750 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 100 μg/ml, 0 μg/ml. Las diluciones de Ia recta estándar se llevaron a cabo con H2O y como blanco de Ia recta se utilizó una mezcla en igual proporción de buffer de digestión enzimática y de H2O.
Los resultados de Ia cualificación y las proporciones de cada GAG en el biomaterial de Ia invención son los siguientes, teniendo en cuenta que el origen del biomaterial es natural, Io que conlleva Ia existencia de pequeñas variaciones en su composición (Fig. 1):
Ácido Hialurónico 70%
Queratán Sulfato 10%
Condroitin 6 Sulfato 7%
Heparán Sulfato 5%
Condroitin 4 Sulfato 4%
Dermatán Sulfato 3%
Heparina 1%
Ejemplo 7. Estudio histológico para la determinación de la presencia de restos celulares en el biomaterial
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) El biomaterial de la invención contiene una combinación de GAGs de origen natural. Este origen natural, potencia su efecto regenerador y sobre Ia actividad celular, puesto que las estructuras de los GAGs y las interacciones entre los mismos son similares a como se encuentran en Ia matriz extracelular en condiciones fisiológicas.
El cordón umbilical a es un tipo de tejido muy poco ¡nmunogénico, de hecho se plantea en numerosos trabajos Ia utilización de las células madre que contiene Ia GW, para su utilización en tratamientos de forma heteróloga. Asimismo, existen trabajos en los que se desarrollan sistemas de arterias o venas a partir de Ia vasculatura del cordón umbilical también para uso heterólogo.
Sin embargo, para asegurar que el biomaterial de Ia invención está libre de células y de restos celulares, que puedan ser causantes de reacciones inflamatorias o de rechazo del implante, se han realizado las tinciones histológicas de hematoxilina-eosina, azul alciano y verde metilo- pironina (Fig. 2).
Hematoxilina-Eosina: es Ia tinción histoquímica más utilizada a nivel histopatológico. Permite observar células y componentes celulares. La hematoxilina presenta afinidad por los componentes ácidos de Ia célula, en especial los ácidos nucleicos y Ia eosina por las zonas básicas, permitiendo una buena observación del citoplasma celular. Se tiñeron preparaciones de Ia muestra de GAGs (Fig. 2 B) y como control positivo se utilizaron extensiones de células (Fig. 2 A).
El procedimiento que se llevó a cabo para realizar Ia tinción de Hematoxilina-
Eosina en fue el siguiente: Se extendió una muestra de GAG con Ia ayuda de un hisopo estéril, en un portaobjetos y se dejó secar la extensión un mínimo de 24 horas. Una vez secos los portaobjetos, se fijaron las extensiones con metanol al 70% durante 5 min. Transcurrido este tiempo se eliminó el fijador lavando con H2O. Se tiñeron los portaobjetos con hematoxilina durante 3 min (PANREAC, Hematoxilina de Harris solución DC). Transcurrido este tiempo se eliminó el exceso de colorante lavando con H2O. Se pasron todos los portaobjetos por H2O con HCI al 0,5% para eliminar uniones ¡nespecíficas del colorante. Se lavaron los portaobjetos con H2O. Se tiñeron los
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) portaobjetos con eosina (0,5% en H2O) durante 30 seg. Se lavaron los portaobjetos con H2O para eliminar el exceso de eosina. Sobre las preparaciones se añadieron unas gotas del medio de montaje Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01), se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron al microscopio.
Los resultados de Ia tinción con Hematoxilina-Eosina (Fig. 2, imágenes A y B) indican Ia ausencia de células en Ia muestra de GAGs analizados.
Azul Alciano: El azul alciano es uno de los principales colorantes catiónicos (contiene cargas positivas en su molécula), las cuales se unen a los sitios con cargas negativas de los polisacáridos con radicales de sulfato, fosfato o carbonato que forman parte de los proteoglicanos. Estas uniones electroestáticas dependen del pH del medio, a pH neutro el colorante se une a proteoglicanos con radicales neutros, a pH ácidos se une a proteoglicanos sulfatados y a pH básicos se une a proteoglicanos fosfatados. A pH=1, el azul alciano se une a proteoglicanos débil y fuertemente sulfatados, que contienen Condroitin sulfato, Dermatan sulfato, Heparan sulfato y Keratan Sulfato que forman parte de los GAG de Ia gelatina de Warthon. Se tiñeron preparaciones de Ia muestra de GAGs (Fig. 2 F) y como control se utilizaron extensiones de células (Fig. 2 E).
El procedimiento que se llevó a cabo para realizar Ia tinción de Azul Alciano en este ejemplo en concreto fue el siguiente:
Se extendió una muestra de GAG, con Ia ayuda de un hisopo estéril, en un portaobjetos y se dejó secar Ia extensión un mínimo de 24 horas. Una vez secos los portaobjetos, se fijaron las extensiones con metanol al 70% durante 5 min. Transcurrido este tiempo se eliminó el fijador lavando con PBS 1X. Se sumergieron los portaobjetos en
HCI 0,1 N pH=1 durante 5 min. Transcurrido ese tiempo se tiñeron con azul alciano 1% en
HCI 0,1 N pH=1 durante 2h. Se sumergieron los portaobjetos en HCI 0,1 N durante 5 min y acto seguido se lavaron con H2O para eliminar el exceso de colorante. Sobre las preparaciones .se añadieron unas .gotas del medio de montaje Fluoromount-G
(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01), se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron al microscopio.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los resultados de Ia tinción con Azul Alciano (Fig. 2, imágenes E y F) indican Ia presencia de GAGs en Ia muestra de biomaterial analizada.
Verde de metilenopironina: Empleado para Ia investigación histológica del ácido nucleico contenido en los tejidos, así como para demostrar Ia presencia de células de Ia serie linfática y células plasmáticas.También es útil en Ia identificación de células plasmáticas y RNA en secciones de tejidos y preparaciones citológicas. La pironina tiñe el citoplasma de las células plasmáticas y Ia mayoría de los nucléolos de rojo. El verde de metileno tiñe DNA de un tono verde azulado (violáceo). Se tiñeron preparaciones de Ia muestra de GAGs (Fig. 2 D) y como control se utilizaron extensiones de células (Fig. 2 C).
El procedimiento que se llevó a cabo para realizar Ia tinción de Verde metilo- pironina en este ejemplo en concreto fue el siguiente:
Se extendió una muestra de cada GAG con Ia ayuda de un hisopo estéril, en un portaobjetos y se dejó secar Ia extensión un mínimo de 24 horas. Una vez secos los portaobjetos, se fijaron las extensiones con metanol al 70% durante 5 min. Transcurrido este tiempo se eliminó el fijador lavando con H2O. Se sumergieron los portaobjetos en HCI 0,1 N pH=1 durante 5 min. Transcurrido ese tiempo se tiñeron con verde de metileno - pironina durante 5 min (verde de metileno al 0,012% en H2O, Pironina 0,01% en H2O, metanol al 0,75%) y acto seguido se lavaron con H2O para eliminar el exceso de colorante. Sobre las preparaciones se añadieron unas gotas del medio de montaje Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01), se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron al microscopio.
Los resultados de Ia tinción con Verde metilo-pironina (Fig. 2, imágenes C y D) indican Ia ausencia de ácidos nucleicos en Ia muestra de GAGs analizada.
Como se puede observar en las imágenes de Ia Figura 4, no se observan células ni restos de ácidos nucleicos en el material de Ia invención. Sin embargo, mediante Ia tinción Azul Anciano se puede observar Ia presencia de GAGs en el biomaterial desarrollado.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ejemplo 8. Toxicidad de diversos tipos celulares sobre el biomaterial de la invención.
El principal requisito para que un biomaterial pueda ser utilizado para su implantación o como matriz para Ia ingeniería tisular, es Ia ausencia total de citotoxicidad. Para comprobar que el biomaterial de Ia invención no produce efectos tóxicos, se determinó Ia citotoxicidad mediante el método MTT (Roche Diagnostics), validado por Ia
ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) de las células dispuestas sobre el biomaterial de Ia invención. Los tipos celulares empleados están relacionados con las patologías a las que va dirigido el biomaterial, como son, queratinocitos y fibroblastos de piel, osteoblastos de hueso, condrocitos de cartílago y células madre mesenquimales de tejido adiposo, así como Ia línea celular que marca Ia
ISO10993 para los ensayos de toxicidad L929.
El ensayo MTT está basado en Ia capacidad que tienen los enzimas mitocondriales de las células vivas para transformar determinados sustratos en otros metabolitos secundarios. La cantidad de compuesto formado depende de Ia actividad de
Ia deshidrogenasa mitocondrial, Io cual es un claro indicador del número de células viables que existen en el cultivo.
En concreto en este test mitocondrial, CeII Proliferation Kit I (MTT) Cat. N 0 1 465 007 Roche, se determina Ia transformación que llevan a cabo las succinatos desidrogenasas mitocondriales celulares de Ia sal de tetrazoilo (amarilla), a cristales insolubles de formazan (azul). Posteriormente las células se permeabilizan y los cristales formados son solubilizados, dando lugar a una solución coloreada que puede ser cuantificada midiendo su absorbancia en un lector de microplacas ELISA a una longitud de onda de 550 nm. Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 4.
El procedimiento a seguir es el siguiente:
1. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocilios antiadherentes con 50 μl de biomaterial en cada pocilio a una densidad de 2000-5000 células/pocilio dependiendo del tipo celular. Previamente se ha determinado Ia concentración celular apropiada para
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) cada tipo celular Los fibroblastos, osteoblastos, condrocitos y células madre meseήquimales de tejido adiposo, todas ellas de cultivo primario y de origen humano, se sembraron a una concentración de 4000 células por pocilio, Ia línea de fibroblastos de ratón L929 se sembró a una concentración de 200 células por pocilio y los queratinocitos obtenidos de piel humana en cultivo primario se sembraron a una concentración de 5000 células por pocilio.
2. El cultivo se dejó estabilizar a 37 0 C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes de iniciar los ensayos de citotoxicidad. En este ensayo se incluyeron controles positivos (células + medio + material conocido que induce citotoxidad,. en este caso se utilizó policloruro de polivinilo o PVC), control (células + medio de cultivo estándar), y células en contacto con el biomaterial de Ia invención.
3. Se dejaron incubando a 37 0 C en el incubador el periodo de tiempo indicado en el protocolo hasta Ia realización de las determinaciones, que en este caso fueron a las 24, 48 y 72 horas de contacto. 4. Finalizado el periodo de incubación, se adicionó al cultivo 10 μl de Ia solución de
MTT (0,5 mg/ml) a cada pocilio, por cada 100 μl de medio, y se incubó durante 4 horas a 37 0 C en el incubador.
5. Al finalizar Ia incubación se pueden observar los cristales de formazán en el interior de las células. Se añade 100 μl de Ia solución solubilizadora a cada cultivo o pocilio y se incuba a 37 0 C en el incubador durante toda Ia noche. De esta manera, se permeabilizan las células y se solubilizan los cristales con los 100 μl de soubilizador como está indicado, dando lugar a una solución coloreada fácilmente cuantificable.
6. Una vez solubilizados los cristales, se lee Ia placa de cultivo directamente con un lector ELISA a 550 nm. Antes de Ia lectura es conveniente limpiar Ia superficie inferior de Ia placa con etanol.
Como se puede observar en Ia Figura 4, el biomaterial de Ia invención no produjo efectos tóxicos sobre ninguna de las líneas celulares testadas, no existiendo diferencias significativas con respecto al control.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ejemplo 9. Utilización del biomaterial de Ia invención en su forma inyectable para el tratamiento de Ia osteoartritis.
Para Ia evaluación in vivo del efecto terapéutico del biomaterial de Ia invención en Ia OA, se utilizó el hidrogel obtenido en el Ejemplo 3 y se resuspendió en 8 mi de una solución de fuero fisiológico inyectable para dar lugar a una viscosidad de 200 cts. Y como modelo experimental se utilizaron conejos a los que se les ha realizado una resección del ligamento anterior cruzado en una de sus rodillas. Esta resección del ligamento se llevó a cabo mediante una artrotomía lateral. Seguidamente, con el fin de desestabilizar Ia rodilla, se esperó un periodo de semanas a meses, tiempo en el cual se produjeron erosiones en el cartílago, similares a Ia osteoartritis. Por otro lado, como grupo control se utilizaron animales sin artrotomía en Ia rodilla.
La superficie articular lesionada fue preparada mediante lavado y desbridamiento por cirugía atroscópica y las lesiones fueron recubiertas con el biomaterial inyectable de Ia invención. A las cuatro semanas después de Ia disposición del biomaterial, los animales fueron sacrificados y se les extrajo el cartílago. El cartílago obtenido se fijó en para- formaldehído al 4 % para su posterior procesado histológico. Para Ia obtención de cortes histológicos, Ia muestra fue incluida en parafina, para Io cual se mantuvo durante 5 minutos en alcoholes al 50, 70, 90 y 100%. Posteriormente se introdujeron las muestras en citrosol durante 5 minutos y se incluyeron en parafina hasta obtener un bloque sólido.
Utilizando un micrótomo se obtuvieron cortes histológicos de 5 μm en los que se llevaron a cabo las tinciones histológicas, así como de inmunomarcaje.
En los cortes histológicos se analizaron diferentes marcadores de Ia matriz extracelular del cartílago mediante técnicas inmunohistoquímicas. Las moléculas específicas de Ia matriz extracelular del cartílago y marcadores moleculares estudiados fueron el Colágeno tipo II, Keratán sulfato, Condroitín-4-sulfato y el Condroitín-6- sulfato.Los inmunomareajes fueron realizados utilizando anticuerpos monoclonales. La técnica empleada para el mareaje de Ia sección del tejido fue mediante inmunomarcaje
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) directo, utilizando, anticuerpos monoclonales marcados con un fluorocromo. La visualización del mareaje fue llevada a cabo utilizando microscopía confocal.
Los resultados obtenidos demostraron que el biomaterial indujo Ia regeneración del cartílago lesionado ya que:
- El biomaterial inyectable no produjo toxicidad una vez implantado, es decir, no se observaron fenómenos de inflamación a nivel macroscópico ni microscópico en los cortes histológicos.
- El biomaterial se ajustó a Ia geometría y tamaño de Ia lesión a reparar y se mantuvo en Ia zona de Ia implantación.
- No se observaron alteraciones en el fenotipo de las células del tejido sano anexo a
Ia zona del implante.
- La presencia de moléculas de matriz extracelular específicas del cartílago, como el colágeno tipo II, en Ia zona del implante indicó el inicio del proceso regenerativo con Ia formación de nueva matriz extracelular de Ia misma calidad que Ia del tejido nativo.
- Se visualizó Ia presencia de condrocitos en Ia zona del implante, Io que indicó Ia estimulación de Ia migración, adhesión y proliferación celular.
- Estos hechos demuestran que el biomaterial de Ia invención promueve Ia regeneración del defecto condral, a diferencia de los animales controles los cuales no presentaron ningún signo de reparación del cartílago.
Ejemplo 10. Utilización del biomaterial tridimensional para el tratamiento de heridas
El biomaterial sólido de Ia invención obtenido en el Ejemplo 5 posee Ia mayoría de las características necesarias para que un aposito sea eficaz en Ia curación de una úlcera crónica. En este sentido, con el fin de evaluar el efecto terapéutico en úlceras crónicas se ha llevado a cabo el estudio experimental in vivo empleando, para ello, ratones de Ia especie swiss albino a los que se les ha producido una abrasión térmica de unos 3 cιm 2 en
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ia zona dorsal. Como grupo control se utilizaron animales a los que se produjo el mismo tipo de lesión pero tratados con un gel de ácido hialurónico comercial.
Para Ia aplicación del biomaterial de Ia invención, Ia superficie de Ia herida inducida fue preparada -mediante lavado, desinfección y desbridamiento quirúrgico- y las lesiones fueron cubiertas y rellenas, tanto en profundidad como en superficie, con el biomaterial sólido moldeable de Ia invención. A los 15 días de Ia disposición del biomaterial, los animales fueron sacrificados y Ia zona de Ia herida fue extirpada y fijada en paraformaldehído al 4% para su posterior examen histológico. Para el procesado, Ia muestra fue incluida en parafina, para Io cual se mantuvo durante 5 minutos en alcoholes al 50, 70, 90 y 100%. Posteriormente se introdujeron las muestras en citrosol durante 5 minutos y se incluyeron en parafina hasta obtener un bloque sólido. Utilizando un microtomo se obtuvieron cortes histológicos de 5 μm en los que se llevaron a cabo las tinciones histológicas.
En los cortes histológicos se analizaron diferentes marcadores fenotípicos epidérmicos -queratina 5 y 10- marcadores de diferenciación -involucrina y loricrina-, marcador dérmico -vimentina- y componentes de Ia matriz -laminina- mediante técnicas inmunohistoquímicas. La técnica empleada para el mareaje de Ia sección del tejido fue mediante inmunomarcaje directo, con anticuerpos monoclonales marcados con un fluorocromo. La visualización del mareaje fue llevada a cabo utilizando microscopía confocal.
Los resultados obtenidos demostraron que el biomaterial resultó efectivo en Ia regeneración de Ia úlcera ya que:
- El biomaterial aplicado en Ia herida fue inmunológicamente inerte y no se presentaron signos de toxicidad.
- El biomaterial se ajustó a Ia geometría y tamaño de Ia lesión a reparar, cubriendo completamente Ia zona afectada tanto a nivel superficial como en profundidad.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) - El biomaterial promovió el fenómeno hemostático, lo que es señal de Ia iniciación del proceso de cicatrización.
- Conforme avanza el proceso de cicatrización, se produjo Ia degradación del biomaterial y su sustitución por componentes dermo-epiteliales.
- Los cortes histológicos mostraron que el biomaterial indujo Ia migración y proliferación de fibroblastos y queratinocitos, los cuales permanecieron viables en el mismo.
- El biomaterial de Ia invención indujo Ia cicatrización de Ia herida 2 veces con respecto a los animales control y además Ia calidad del nuevo tejido cicatricial fue significativamente superior a los animales sin Ia aplicación del biomaterial de Ia invención.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Next Patent: LID FOR DRINKS CANS