Die Erfindung betrifft neue kationische bzw. polykationische Amphiphile, welche zur Aggregatbildung mit Makromolekülen, insbesondere mit DNA oder RNA befähigt sind, und deren Einschleusung in prokaryotische oder eukaryotische Zellen.

Amphiphile (z.B. Tenside, Detergenzien) spielen allgemein schon seit einiger Zeit eine Rolle im täglichen Leben. Kationische Amphiphile haben dagegen erst durch die Pio¬ nierarbeiten von Feigner in letzter Zeit größere Beachtung gefunden, da man mit ihrer Hilfe DNA und RNA in Zellen einschleusen und diese somit transfizieren kann (P.L. Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA £4, 7413-7417 ( 1987); P. Hawley-Nelson. WO 94/05624 et al., J.P. Behr, EP 0394111).

Die dabei verwendeten Reagenzien sehen im einzelnen sehr verschieden aus. Dies liegt zumeist daran, daß sie empirisch gefunden wurden. Man konnte also keine Verbindung gezielt für die hier zur Rede stehende Anwendung bereitstellen. Zudem läßt sich durch die Tatsache, daß es Verbindungen gibt, die nur im Gemisch mit anderen Reagenzien eine Wirkung zeigen, die ganze Komplexizität der Transfektion erkennen. Ein Über¬ blick der meisten bislang gefundenen Reagenzien gibt Behr (Bioconjugate Chem., 5, 382-389 (1994) und darin angegebene Referenzen). Generell gilt jedoch, daß die über¬ wiegende An Zahl der Reagenzien Liposomen bilden können.

Der Mechanismus der Transfektion mittels kationischer Amphiphile ist noch wenig ver¬ standen. Daß die Liposomen durch ihre positive Ladung mit der DNA einen noch posi¬ tiv geladenen Komplex bilden und dieser sich an die negativ polarisierte Zellmembran anlagert, erscheint noch plausibel (P.L. Feigner, Nature HZ, 387-388 (1989)). Wie die Durchdringung der Zellmembran und der Transport zum Zellkern geschieht, ist jedoch ungewiß.

Trotzdem lassen sich für neue Reagenzien neben der Transfektionseffizienz noch eine Reihe anderer Anforderungen formulieren:

- für die Effizienz sollten keine Vorbehandlungen der Zellen wie z.B. Peπneabilisie- rung der Zellmembran durch DMSO. einem Detergenz wie z.B. Digitonin oder An¬ kratzen vonnöten sein.

- die Reagenzien sollten möglichst keine Toxizitat zeigen, insbesondere nicht bei der effektivsten Konzentration und vorzugsweise biologisch abbaubar sein.

- sie sollten auf alle in Frage kommenden Zellen gleichermaßen verwendet werden können.

- sie sollten auf alle in Frage kommenden Zellen gleichermaßen verwendet werden können.

- sie sollten keine Spezifität gegenüber bestimmten DNA-Molekülen haben.

- sie sollten auch in vivo anwendbar sein. Dies bedeutet, daß neben der Toxizitat auch die Verträglichkeit mit Serum eine bedeutende Rolle spielt. Gerade hier hat sich häufig eine drastische Abnahme der Transfektionseffizienz gezeigt.

Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, entsprechende Reagenzien, die diesen Anforderungen gleichermaßen genügen, zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird durch bestimmte kationische, lipidische Amphiphile gelöst, mit deren Hilfe sich anionische Verbindungen, wie z.B. DNA in Zellen einschleusen lassen, und die dabei überraschend verbesserte Eigenschaften im Hinblick der oben aufgeführten Anforderungen zeigen.

Insbesondere dienen als Amphiphile Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

wobei

R] eine gesättigte oder ungesättigte C(O)-C _1-23 oder gesättigte oder ungesättigte C _1-24 - Gruppe darstellt,

A _! eine O-R ₂ -Gruppe, wobei R ₂ die für R] angegebene Bedeutung hat und gleich oder von R] verschieden sein kann,

A ₂ einen NR ₃ X- oder einen N ⁺ R ₃ R ₄ R ₅ Y ^" -Rest, wobei

R ₃ , R ₄ , die untereinander gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine (CH ₂ ) _n -OH- oder eine (CH ₂ ) _n - NH ₂ -Gruppe mit n = 2-6 bedeuten,

R ₅ , welcher gleich oder verschieden von R ₃ oder R ₄ sein kann, Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine (CH ₂ ) _n -OH-, eine (CH ₂ ) _n - Halogenid-, oder eine ((CH ₂ ) _m NH) ₀ -(CH ₂ ) _n -NH ₂ -Gruppe bedeuten, wobei m eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist und gleich oder verschieden von n oder o sein kann, wobei n eine Zahl von 2 bis 6 und o eine ganze Zahl von 0 bis 4 sein kann,

X zusätzlich zu der Bedeutung für R ₅ , folgende Bedeutung haben kann: eine amidisch gebundene Aminosäure, ein amidisch gebundenes Peptid bzw.

R _Ö ein -(CH ₂ ) _m -NR ₇ R ₈ -, ein -(CH ₂ ) _m -N ⁺ (R ₇ ) ₂ R ₈ oder ein -(CH ₂ ) _m -N ⁺ (R ₇ ) ₃ -

Rest und m eine Zahl von 1 bis 5 sein kann,

R ₇ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen,

R ₈ eine -(CH ₂ ) _n -N(R ₇ ) ₂ - oder -(CH ₂ ) _n -N ⁺ (R ₇ ) ₃ -Gruppe, wobei n eine Zahl von 2 bis 4 ist und R ₇ die oben angegebene Bedeutung haben kann und

Y ein pharmazeutisch akzeptables Anion ist,

B, ein NH[C(O)-(CH ₂ )p -NH]q - Z -Rest, wobei p eine Zahl von 1 bis 6 und q eine Zahl von 0 bis 2 ist,

Z eine amidisch gebundene Aminosäure, ein amidisch gebundenes Peptid bzw. Polypeptid eine -C(O)-CHR ₆ N (R ₇ ) ₂ -, eine -C(O)-CHR<N ⁺ (R ₇ ) ₃ -, eine C(O)-CHR _Ö N ⁺ (R ₇ ) ₂ R _g - oder eine -C(O)-CHR ₆ NR ₇ R ₈ -Gruppe dar¬ stellen und Rg bis R _g und m die oben angegebenen Bedeutungen haben, und

B ₂ die für Aj angegebene Bedeutung haben kann und die Bedeutung von A, nur mit B _b die von A ₂ nur mit B ₂ gilt.

Bevorzugt sind dabei solche Verbindungen, bei denen die Reste R, und A _! Alkylreste mit 10 bis 20 C-Atomen aufweisen. Darüber hinaus sind solche Verbindungen, in denen A ₂ die Bedeutung NR ₃ X aufweist, bevorzugt, und zwar insbesondere solche, wobei R ₃ Wasserstoff und X eine amidisch gebundene Aminosäure, ein geeignetes Aminosäure¬ derivat, ein Peptid bzw. Polypeptid bedeuten.

Als pharmazeutisch akzeptables Anion, Y, kommen insbesondere Halogenide, Mono- methylsulfat, Acetat, Trifluoroacetat und Phosphat in Betracht.

Als besonders geeignet haben sich folgende erfindungsgemäßen Verbindungen er¬ wiesen:

2-(6-Carboxyspermyl)- 1 ,3-dioleoyloxy-propylamid, 2-(N,N,N,N',N',N'-Hexamethyl- ornithyl)- 1 ,3-dioleoyloxy-propylamid, 1 -(6-Carboxyspermyl)-2,3-dioleoyloxy-pro- pylamid und/oder 2,3- Dioleoyloxy-N-(N-(sρermyl)-glycyl)-aminopropan sowie ent¬ sprechende Derivate hiervon. Aber auch 2-(6-Carboxyspermyl)-l,3-dimyristoyloxy- propylamid, 2-(l, 1,1, 5,5, 10,10,14,14, 14-Decamethyl-6-carboxyspermyl)-l,3- dioleoyloxy-propylamid und/oder 2-( N.N,N,N',N',N'-Hexamethyllysyl)-1,3- dioleoyloxy-propylamid haben sich als geeignet erwiesen.

Des weiteren betrifft die vorliegende Anmeldung die Herstellung von Reagenzien mit Transfektionseigenschaft. Dabei können die neuen Reagenzien gleichermaßen als Lö¬ sung in einem wasser-mischbaren Lösungsmittel oder als wäßrige, liposomale Formu¬ lierung angewendet werden. Bei der Erprobung ihrer Transfektionsefϊizienz fiel auf,

V sung in einem wasser-mischbaren Lösungsmittel oder als wäßrige, liposomale Formu¬ lierung angewendet werden. Bei der Erprobung ihrer Transfektionseffizienz fiel auf,

- daß sie in Serum-freiem Medium bereits eine meistens bessere Effizienz zeigen als andere kommerziell erhältliche Produkte,

- daß sie in Serum-freiem Medium überraschenderweise ein breiteres Plateau des DNA/Reagenz- Verhältnisses bei ähnlicher Transfektionseffizienz zuließen,

- daß sie überraschenderweise die gleiche oder eine bessere Effizienz in Serum- haltigen Medium zeigten,

- daß sich die Effizienz durch liposomale Formulierung noch steigern ließ,

- daß sich überraschenderweise die Verbindungen als weitaus weniger toxisch er¬ wiesen als Verbindungen mit ähnlicher Transfektionseffizienz im Serum-freien System.

In den Abbildungen 1 und 2 sind die Transfektionseffizienzen einiger ausgewählter Verbindungen im Vergleich zu bekannten Reagenzien dargestellt.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt nach dem für den Fachmann üblichen Methoden (J. March: Advanced Organic Chemistry; John Wiley & Sons, 1985 und M. Bodanszky; Principles of Peptide Synthesis; Springer Verlag, 1984), wobei die Endprodukte ggf. chromatographisch insbesondere durch Ionenaustauscherchromatogra¬ phie gereinigt werden. Entsprechende Reaktionsschemata sind in den Abbildungen 3 bis 7 angeführt.

Voraussetzung für die Herstellung neuer Transfektionsreagenzen war, daß die entspre¬ chenden Verbindungen kationisch und zur Aggregatbildung geeignet sind, da bislang vor allem solche geladenen Reagenzien zur Transfektion führten (es gibt Beispiele, bei welchen die DNA mittels ungeladener Reagenzien in die Zelle transponiert werden kon¬ nte. Hierzu müssen sie dann aber in Liposomen eingeschlossen sein, bei deren Darstel¬ lung das zu befördernde Molekül (z.B. DNA) u.U. geschädigt werden kann. Generell wurden durch solche Komplexe keine hohen Effizienzen erzielt (siehe z.B. A. Cudd, C. Nicolau in Liposome Technology (Gregoriadis Ed.), (1984) CRC Press Inc. Boca Raton, FL; S.F. Alino, M. Bobadilla, M. Garcia-Sanz, M. Lejarreta, F. Unda, E. Hilario in Bio¬ chem. Biophys. Res. Commun. 122, 174 (1993)).

Ein weiterer Ansatzpunkt war, daß die Verbindungen dazu imstande sein sollten, Lipo¬ somen zu bilden. Es ist dabei nicht klar, warum fast ausschließlich Liposomen-bildende Verbindungen zur Transfektion geeignet sind. Wie neueste Erkenntnisse (H. Gershon, R. Ghirlando. S.B. Guttman, A. Minsky in Biochemistry 22. 7143 (1993) und B. Stern¬ berg, F.L. Sorgi, L. Huang in FEBS Letters 356. 361 (1994) zeigen, tragen sie zur Aus¬ bildung von sog. Meatball-Spaghetti-Strukturen bei, welche zur Transfektion benötigt werden. Ob dies für alle Reagenzien gleichermaßen gilt und in welcher Form diese zum Passieren der Zellmembran beitragen, ist bis heute ungeklärt.

-r

Aus diesen Überlegungen heraus resultierten die folgenden de novo-Synthesen, welche in den Schemata gemäß der Abbildungen 3 bis 7 dargestellt sind.

Für die Bereitstellung von entsprechenden Reagenzien wie beispielsweise pharmazeu¬ tischen Formulierungen stehen generell mehrere Methoden gemäß dem Stand der Tech¬ nik zur Verfügung. Insbesondere werden liposomale und ethanolische Formulierungen verwendet, wobei sich bereits die verschiedenen Liposomen-Arten in ihrer Effizienz un¬ terscheiden können (Zur Darstellung von Liposomen siehe z.B. H. Schreier in Pharma¬ zie in unserer Zeit il, 97 (1982)).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können jedoch nicht nur als Liposomen, sondern auch in Form anderer Aggregate für die Transfektion verwendet werden. Sowohl bei der Liposomen- wie auch bei der Aggregatbildung können neben den erfindungsgemäßen Verbindungen zusätzlich andere lipidische Verbindungen zugegen sein. Hier sind bei¬ spielsweise Verbindungen aus der Klasse der Phospholipide geeignet; aber auch weitere dem Fachmann an sich bekannte Verbindungen können hier zum Einsatz kommen.

Es ist ebenso als überraschend anzusehen, daß sich bei den erfindungsgemäßen, hier erstmals beschriebenen Verbindungen des Typs 3, 6, 12 oder 15 (s. Beispiele 3, 6, 12 und 15) Liposomen erzeugen lassen.

Die Transfektionen wurden exemplarisch an HeLa-Zellen mit pSV2-CAT-Plasmid (Gorman, CM. et al., Mol. Cell. Biol. 2,1044-1051 (1982)) durchgeführt. Die Trans¬ fektionseffizienz wird durch den CAT-ELISA-Kit (Boehringer Mannheim GmbH) be¬ stimmt und ist in den Abbildungen 1 und 2 im Vergleich zu bekannten Reagenzien dar¬ gestellt.

Wegen ihrer geringen Toxizitat lassen sich diese Verbindungen (selbst oder in Verbin¬ dung mit anderen lipidischen Verbindungen) auch in vivo anwenden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1

Synthese von 2-(lS-tert. -Buty loxy carbonyl-L-alanyl)-l,3-dihydroxy propylamid 1

In einem Rundkolben mit Blasenzähler wurden 756 mg (4 mmol) Boc-L-alanin und 600 μl (4.3 mmol) Triethylamin, gelöst in 10 ml abs. THF, vorgelegt und auf- 10 °C abgekühlt. Nun wurden 320 μl (4 mmol) Chlorameisensäuremethylester zugegeben und 30 min bei 0 °C gerührt. Nach Zugabe von 456 mg (5 mmol) 2-Amino-l,3-propandiol wurde soviel Wasser zugesetzt, bis sich eine homogene Lösung bildete und noch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des THF wurden 50 ml Ethylacetat zugege¬ ben. Die organische Phase wurde mit ges. NaHCO ₃ -Lösung und ges. NaCl-Lösung ge¬ waschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels erhielt man 332 mg (32 %) eines farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 1.32 (d; 3 H; J=7.1 Hz; CH-CH ₃ ); 1.40 (s; 9 H; C(CH ₃ ) ₃ ); 3.55-3.85 (m; 4 H; CH (CH ₂ OH) ₂ ); 3.85- 4.0 (m; 1 H; NH-CH); 4.0- 4.5 (m; 3 H; NH¬ CH, 2 x OH); 5.6-5.8 (m; 1 H; NH-CH (CH ₂ OH) ₂ ); 7.0-7.35 (m; 1 H; OOC-NH-CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 18.4 (CH-£H ₃ ); 28.2 (C(CΗ ₃ ) ₃ ), 52.2 (NH-CH-CO); 52.4 (£H(CH ₂ OH) ₂ ); 61.8 (CH(C_H ₂ OH) ₂ ); 80.2 (C_(CH ₃ ); 155.7 (NH-COO); 173.8 (CH-£O- NH).

Beispiel 2

Synthese von 2 (N-ter-.-ButyloxycarbonyI-L-alany-)-l,3-dioleoyloxy propylamid 2

In einem Rundkolben wurde eine Lösung von 598 mg (2.28 mmol) 1, 1.610 g (5.70 mmol) Ölsäure 1.176 g (5.70 mmol) DCC und 28 mg (0.23 mmol) Dimethyl- aminopyridin in 40 ml abs. CH ₂ C1 ₂ über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschlie¬ ßend wurde filtriert und das Filtrat einrotiert. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchro¬ matographie (Kieselgel, CH ₂ C1 ₂ : MeOH = 30:1) gereimgt. Man erhielt 1.450 g, (80 %) eines farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.87 (t; 6 H; J=6.6 Hz; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.15-1.5 (m; 43 H; CH- CH ₃ , 2 x CO-(CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.43 (s; 9 H; C(CH ₃ )3; 1.5-1.7 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ ); 1.9-2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.30 (t; 4 H; J=7.6 Hz; 2 x CO-CH ₂ ); 4.0-4.25 (m; 5 H; NH-CH, 2 x CH ₂ OOC); 4.35-4.5 (m; 1 H; NH-CH); 4.9- 5.0 (m; 1 H; NH-CH-CH ₂ ); 5.25-5.45 (m; 4 H; 2 x CH=CH); 6.5-6.65 (m; 1 H; OOC- NH-CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(18)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.7 (2 x C(3)H ₂ ); 27.0, 27.1, 28.98, 29.04, 29.2, 29.4, 29.56, 29.62 {2 x [C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , C(12)H ₂ - c(16)H ₂ ]}; 28.1 (C(£H ₃ ) ₃ ); 31.8 (2 x C(2)H ₂ ); 33.87, 33.88 {2 x [C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ]}; 47.2 (£H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 62.4 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 129.6, 129.9 (2 x CH=CH); 172.4 (CH-£O-NH); 173.4 (CH ₂ -£OO).

β Beispiel 3

Synthese von 2-L-Alanyl-l,3-dioleoyloxy-propylamid 3

In einem Rundkolben mit Blasenzähler wurden 702 mg (0.89 mmol) 2, gelöst in 6 ml abs. CH ₂ C1 ₂ , vorgelegt und 2 ml (26.12 mmol) TFA zugegeben. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in einem Scheidetrichter überführt und 50 ml CH ₂ C1 ₂ sowie 28 ml 1 NNaOH zugegeben. Die organische Phase wurde mit 10 ml ges. NaHCO ₃ -Lösung gewaschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 599 mg (97 %) eines fast farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.75-0.9 (m; 6 H, 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.1-1.4 (m; 43 H; CH-CH ₃ , 2 x CO-(CH ₂ ) ₂ (CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.4-1.7 (m; 6 H; NH ₂ , 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ ); 1.85- 2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.30 (t; 4 H; J=7.5 Hz; 2 x CO-CH ₂ ); 3.35-3.55 (m; 1 H; NH-CH); 4.0-4.25 (m; 4 H; 2 x CH ₂ OOC); 4.3-4.5 (m; 1 H; NH-CH); 5.2-5.4 (m; 4 H; 2 x CH=CH); 7.5-7.65 (m; 1 H; CO-NH-CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(18)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.7 (2 x C(3)H ₂ ); 27.0, 27.1, 28.9, 29.0, 29.2, 29.4, 29.5, 29.6, {2 x [C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ]}; 31.7 (2 x C(2)H ₂ ); 33.9 {2 x [C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ]}; 46.7 (CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 62.5 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 129.5, 129.8 (2 x CH=CH); 173.3 (CH-£O-NH); 173.4 (CH ₂ - £OO).

Beispiel 4

Synthese von 2-(N,N'-Di--'f?rJ'.-butyloxycarbonyI-L-ornithyl)-l,3-dihydro xy- propylamid 4

In einem Rundkolben mit Blasenzähler wurden 2.000 g (6 mmol) Boc-L-ornithin und 900 μl 6.45 mmol) Triethylamin gelöst in 25 ml abs. THF, vorgelegt und auf -10 °C abgekühlt. Nun wurden 480 μl (6 mmol) Chlorameisensäuremethylester zugegeben und 30 min bei 0 °C gerührt. Nach Zugabe von 684 mg (7.5 mmol) 2-Amino-l,3-propandiol wurde soviel Wasser zugesetzt, bis sich eine homogene Lösung bildete und noch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurden in Ethylacetat auf¬ genommen, mit ges. NaHCO ₃ -Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 1.987 g (82 %) 4 als farblose Kristalle.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 1.42 (s; 9 H; C(CH ₃ ) ₃ ); 1.4-1.95 (m; 4 H; CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -NH); 3.0-3.2 (m; 2 H; CH ₂ NH); 3.6-3.8 (m; 4 H; CH(CH ₂ OH)2); 3.9-4.05 (m; 1 H; NH-CH,) 4.05-4.6 (m; 3 H; NH-CH, 2 x OH); 5.2-5.4 (m; 1 H; NH-CH); 5.8-6.05 (m; 1 H; NH¬ CH); 7.35-7.5 (m; 1 H, NH-CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 26.1 (£H ₂ -CH ₂ -CH ₂ -NH); 28.4 (C(£H ₃ ) ₃ ); 28.5 (C(£H ₃ ) ₃ ); 30.1 (£H ₂ -CH ₂ -NH); 40.0 (CH ₂ -NH); 52.9 (£H(CH ₂ OH) ₂ ); 54.4 (NH-£H-CO); 61.8 (CH(£H ₂ OH) ₂ ); 79.3 (£(CH ₃ ) ₃ ); 80.1 (£(CH ₃ ) ₃ ); 156.1 (NH-£OO); 156.5 (NH-£OO); 173.3 (CH-£O-NH).

Beispiel 5

Synthese von 2-(N,N'-Di-ι'er-'.-butyloxycarbonyI-L-lornithyl)-l,3-dioleo xy- propylamid 5

In einem Rundkolben wurde eine Lösung von 1.898 g (4.68 mmol) 4, 3.305 g (11.7 mmol) Ölsäure, 2.414 g (11.7 mmol) DCC und 57 mg (0.47 mmol) Dimethyl- aminopyridin in 50 ml abs. CH ₂ C1 ₂ über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschlie¬ ßend wurde filtriert und das Filtrat einrotiert. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchro¬ matographie an Kieselgel (CH ₂ C1 ₂ : MeOH = 30:1) gereinigt. Man erhielt 1.678 g (38%) des Produktes als farblosen, wachsartigen Feststoff Smp. 52 - 54 °C.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.75-0.9 (m; 6 H, 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.05-1.5 (m; 40 H; 2 x CO- (CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.42 (s; 18 H; 2 x C(CH ₃ ) ₃ ); 1.45-1.85 (m; 8 H; CH ₂ - CH ₂ -CH ₂ -NH, 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ ); 1.85-2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.2-2.35 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ ); 3.0-3.35 (2 m; 2 H; CH ₂ -NH); 4.0-4.25 (m; 5 H; NH-CH, 2 x CH ₂ OOC); 4.35-4.5 (m; 1 H, NH-CH); 4.7-4.8 (m; 1 H; NH-CH); 5.1-5.2 (m; 1 H, NH¬ CH); 5.2-5.4 (m; 4 H; 2 x CH=CH); 6.65-6.8 (m; 1 H; OOC-NH-CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(18)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.6 (2 x C(3)H ₂ ); 26.2, (£H ₂ -CH ₂ -CH ₂ -NH); 27.0, 27.1, 28.97, 29.04, 29.2, 29.4, 29.56, 29.61, {2 x [C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ] und £H ₂ -CH ₂ -NH}; 28.1, 28.3 (2 x C(£H ₃ ) ₃ ); 31.7 (2 x C(2)H ₂ ); 33.85, 33.86 {2 x [C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ]}; 47.2 (£H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 62.3 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 129.6, 129.8 (2 x CH=CH); 156.3 (NH-£OO); 173.30, 173,33 (CH- £O-NH, 2 x CH ₂ -£OO).

// Beispiel 6

Synthese von 2-L-Ornithyl-l,3-dioleoyloxy-propylamid 6

In einem Rundkolben wurden 421 mg (0.451 mmol) 5, gelöst in 3 ml abs. CH ₂ C1 ₂ , vorgelegt und 1 ml (13.06 mmol) TFA zugegeben. Nach 30 min. Rühren bei Raumtem¬ peratur wurde die Reaktionsmischung mit 200 ml CH ₂ C1 ₂ verdünnt, zweimal mit ges. NaHCO ₃ -Lösung gewaschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lö¬ sungsmittels erhielt man 296 mg (89 %) eines fast farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.86 (t; 6 H; J-6.7 Hz; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1-1-1-45 (m; 40 H; 2 x CO-(CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.45-1.7 (m; 8 H; CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ , 2 x CO- CH ₂ -CH ₂ ); 1.9-2.1 (m; 8 H; CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.30 (t; 4 H; J = 7.5 Hz; 2 x CO-CH ₂ ); 2.6-3.1 (m; 4 H; 2 x NH ₂ ); 3.15-3.55 (m; 2 H; CH _r NH ₂ ); 3.55-3.75 (m; 1 H; NH-CH); 4.0-4.25 (m; 4 H; 2 x CH ₂ OOC); 4.3 - 4.5 (m; 1 H; NH-CH); 5.2-5.4 (m; 4 H; 2 x CH=CH); 7.65-7.75 (m; 1 H; CO-NHCH).

¹³ C-NMR (CDCI ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(l 8)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.7 (2 x C(3)H ₂ ); 26.99, 27.04, 29.1, 29.3, 29.5, 29.6 {2 x [C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ], £H ₂ -£H ₂ - CH ₂ NH}; 31.7 (2 x C(2)H ₂ ); 33.9 (2 x [C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ]); 46.7 (£H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 54.6 (NH ₂ -£H-CO); 62.5 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 129.5, 129.8 (2 x CH=CH); 173.31, 173.6(CH-£O-NH, 2 x CH ₂ -£OO); 174.7 (CH-£O-NH).

/2 Beispiel 7

Synthese von N-i ^, -?#"_--Butyloxycarbonyl-l,3-dihydroxy-propylamin 7

In einem Rundkolben wurde eine Lösung von 1.07 ml (5 mmol) Boc ₂ O, 697 μl (5 mmol) Triethylamin und 456 mg (5 mmol) 2-Amino-l,3-propandiol in 10 ml THF/Wasser (1:1) über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des THF am Rotationsverdampfer wurden 50 ml Ethylacetat und 10 ml ges. NaCl-Lösung zu¬ gegeben. Die organische Phase wurde mit 10 ml ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels erhielt man 589 mg (62 %) 7 als farblose Kristalle. Smp. 83 - 85 °C.

'H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 1.44 (s; 9 H; C(CH ₃ ) ₃ ); 3.4-3.85 (m; 7 H; CH(CH ₂ OH) ₂ ); 5.3- 5.45 (m; 1 H; NH-CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 28.4 (C(£H ₃ ) ₃ ); 53.3 (£H(CH ₂ OH) ₂ ); 62.6 (CH(£H ₂ OH) ₂ ); 79.9 (£(CH ₃ ) ₃ ); 156.5 (NH-£OO).

Beispiel 8 Synthese von N-/-?rt.-Butyloxycarbonyl-l,3-dioleoyloxy-propylaπιin 8

In einem Rundkolben wurde eine Lösung von 478 mg (2.5 mmol) 7, (1.695 g) (6 mmol) Ölsäure, 1.28 g (6 mmol) DCC und 12 mg (0. 1 mmol) Dimethylaminopyridin in 25 ml abs. CH ₂ C1 ₂ über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde filtriert und das Filtrat einrotiert. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Hexan: Ethylacetat = 5:1) gereinigt. Man erhielt 1.482 g (82 %) des Produktes als farbloses Öl.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.86 (t; 6 H; J=6.6 Hz; 2 x CH ₂ CH ₃ ); 1.1-1.5 (m; 40 H; 2 x CO-(CH ₂ ) ₂ )-(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.43 (s; 9 H; C(CH ₃ ); 1.5-1.7 (m; 4 H; 2 x CO- CH ₂ -CH ₂ ); 1-9-2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.30 (t; 4 H; J=7.5 Hz; 2 x CO- CH ₂ ); 3.95-4.25 (m; 5 H; NH-CH, 2 x CH ₂ OOC); 4.7-4.85 (m; 1 H; OOC-NH-CH); 5.25-5.45 (m; 4 H; 2 x CH=CH).

^I3 C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(18)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.7 (2 x C(3)H ₂ ); 27.0, 27.1, 28.96, 29.02, 29.2, 29.4, 29.55, 29,62 {2 x [C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , C(12)H ₂ - C(16)H ₂ ]}; 28.2 (C(£H ₃ ) ₃ ); 31.8 (2 x C(2)H ₂ ); 33.9 {2 x [C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ]}; 48.4 (£H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 62.8 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 79.8 (£(CH ₃ ) ₃ ); 129.6, 129.8 (2 x CH=CH); 154.9 (NH-£OO); 173.3 (CH ₂ -£OO).

w

Beispiel 9

Synthese von l,3-Dioleoyloxy-2-propylamin 9

In einem Rundkolben wurden 720 mg (1 mmol) 8, gelöst in 3 ml abs. CH ₂ C1 ₂ , vorgelegt und 1 ml ( 13.06 mmol) TFA zugegeben. Nach 30 min Rühren wurde die Reaktionsmi¬ schung mit 50 ml CH ₂ C1 ₂ verdünnt, mit 10 ml ges. NaHCO ₃ -Lösung gewaschen und über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 589 m (95 %) eines farblosen Öls.

'H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.87 (t; 6 H; J=6.6 Hz; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.1-1.5 (m; 40 H; 2 x CO-(CH ₂ ) ₂ )-(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.35-1.5 (m; 2 H; CH-NH ₂ ); 1.5-1.7 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ ); 1.85-2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.32 (t; 4 H; J=7.5 Hz; 2 x CO-CH ₂ ); 3.2-3.35 (m; 1 H; CH-NH ₂ ); 3.95-4.15 (m; 4 H; 2 x CH ₂ OOC); 5.25-5.45 (m; 4 H; 2 x CH=CH).

^I3 C-NMR (CDCI ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(18)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.8 (2 x C(3)H ₂ ); 27.0, 27.1, 28.96, 28.99, 29.03, 29.2, 29.4, 29.55, 29.63 {2 x [C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , C(12)H ₂ - C(16)H ₂ ]}; 31.8 (2 x C(2)H ₂ ); 34.0 {2 x [C(8)H ₂ , C(11)H ₂ ]}; 49 {£H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ }; 65.7 {CH(£H ₂ O,C-R) ₂ }; 129.6, 129.9 (2 x CH=CH); 173.4 (CH ₂ -£OO).

Beispiel 10

Synthese von 2-(N,N',N",N ^, "-Tetra-/er/'. -butyloxy carbonyl-6-carboxy-spermyl)-l, 3- dihydroxy-propylamid 10

Zu einer Lösung von 202 mg (312 μmol) Tetra-Boc-spermin und 47 μl (335 μmol) Triethylamin in 2 ml abs. THF wurden bei - 10 °C 25 μl (312 μmol) Chlorameisen¬ säuremethylester zugegeben und 30 min bei 0 °C gerührt.

Nach anschließender Zugabe von 36 mg 390 μmol) 2-Amino-l,3-propandiol wurde so¬ viel Wasser zugesetzt, bis sich eine homogene Lösung bildete und danach noch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurden ca. 30 ml Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde mit ges. NaHCO ₃ -Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Na ₂ S0 ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 208 mg (93 %) eines farblosen, schaumigen Feststoffs.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 1.3-1.47 (m; 36 H; 4 x C(CH ₃ ) ₃ ); 1.5-2.05 (m; 8 H, 2 x N- CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -N, N-CH-CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -N); 2.85-3.4 (m; 10 H; 5 x N-CH ₂ ); 3.65-3.8 (m; 4 H; 2 x CH ₂ -OH); 3.8-4.5 (m; 4 H; 2 x -CH-, 2 x CH ₂ -OH); 4.8-5.1 (s(breit); 1 H; CH ₂ -NH); 5.25-5.4 (s(breit); 1 H; CH ₂ -NH); 7.05-7.15 (s(breit); 1 H, NH-CO).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 25.0, 29.5 (N-CH-£H ₂ -£H ₂ -CH ₂ -N); 28.0, 28.2, 28.3 (4 x C(£H ₃ ) ₃ ); 38.0, 38.1 (2 x N-CH ₂ -£H ₂ -CH ₂ -N); 42.9, 45.0, 47.0 (übrige Spermyl-CH ₂ - Kohlenstoffe); 52.4 (£H(CH ₂ -OH) ₂ ); 59.8 (CH-CO); 63.1 (CH(£H ₂ -OH) ₂ ); 79.3, 79.5, 81.1 (4 x CO-O-£)CH ₃ ) ₃ ); 156.0, 156.1 (4 x £O-O-C(CH ₃ ) ₃ ); 171.1 (£O-NH).

Ib Beispiel 11

Synthese von 2-(N,N',N",N"'-Tetra-i'er/'.-butyloxycarbonyl-6-carboxy-sper myI)-l,3- dioleoyloxy-propylamid 11

In einem geschlossenen Rundkolben wurde eine Lösung von 208 mg (289 μmol) 10, 204 mg (72 μmol) Ölsäure, 149 mg (723 μmol) DCC und 4 mg (29 μmol) Dimethyl¬ aminopyridin in 6 ml abs. CH ₂ C1 ₂ über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Danach wurde filtriert, mit Hexan/Ether (3:1) nachgewaschen und das Filtrat einrotiert. Nach Säulenchromatographie an Kieselgel (CH ₂ Cl ₂ /MeOH = 20:1) erhielt man 160 mg (44 %) eines farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.8-0.95 (m; 6 H; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.2-1.4 (m; 40 H; 2 x CO- (CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ CH ₃ ); 1.4-1.55 (m; 36 H; 4 x C(CH ₃ ) ₃ ); 1.55-1.75 (m; 10 H; 3 x (-CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -) _sperrn , 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ -); 1.85-2.05 (m; 10 H; (-CH-CH ₂ -CH ₂ - ) _sperm , 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.25-2.35 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ ); 3.0-3.35 (m; 10 H; 5 x N-CH ₂ ); 4.0-4.4 (m; 6 H; 2 x CH-N, (CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 4.5-5.1 (s(sehr breit); 1 H; NH-CH ₂ ); 5.25-5.35 (m; 4 H; 2 x CH=CH); 6.8-7.0 (s(breit); 1 H; NH-CO).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.4 (2 x C(18)H ₃ ); 23.0 (2 x C(17)H ₂ ); 25.2 (2 x C(3)H ₂ ); 27.6 (C(8)H ₂ , C(11)H ₂ ; 29.5, 29.6, 29.7, 29.9, 30.1, 32.3 ((CH-£H ₂ -£H ₂ -CH ₂ -) _sperm , 2 x N-CH ₂ -£H ₂ -CH ₂ -N, 2 x C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , 2 x C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ); 28.7, 28.8 (4 x C(CH ₃ ) ₃ ); 34.0 (2 x C(2)H ₂ ); 38.5, 44.6, 46.8, 47.6 (2 x N-£H ₂ -CH ₂ -£H ₂ -N, (CH-CH ₂ - CH ₂ -£H ₂ -) _sperm , £H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 59.5 (CO-£H); 62.8 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 79.5, 80.1, 81.5 (4 x CO-O-£(CH ₃ ) ₃ ); 130.07, 130.37 (2x £H=£H); 156.3 (4 x £O-O-C(CH ₃ ) ₃ ); 173.7 (£O-NH, 2 x CH ₂ £OO).

n

Beispiel 12

Synthese von 2-(6-Carboxy-spermyl)-l,3-dioleoyloxy-propylamid 12

In einem Rundkolben mit Blasenzähler wurden 85 mg (68 μmol) 11 in 1 ml abs. CH ₂ C1 ₂ gelöst und mit 400 μl TFA versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 45 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit ca. 20 ml CH ₂ C1 ₂ versetzt, mit ges. NaHCO ₃ -Lösung gewaschen über Na ₂ SO ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungs¬ mittels erhielt man 56 mg (97 %) eines farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.8-0.95 (m; 6 H; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.15-1.4 (m; 40 H; 2 x CO- (CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.5-1.9 (m; 12 H; 3 x (-CH2-CH ₂ -CH ₂ -) _sperm , 2 x CO- CH ₂ -CH ₂ -, (-CH-CH ₂ -CH ₂ -) _sperm ); 1.9-2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.2- 2.35 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ ); 2.45-3.3 (m; 10 H; 5 x N-CH ₂ ); 4.0-4.59 (m; 12 H; 2 x CH-N, (CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ , 2 x NH ₂ , 2 x NH _sperm ); 5.25-5.45 (m; 4 H; 2 x CH=CH; 7.6-7.9 (s(breit); 1 H; NH-CO).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (2 x C(18)H ₃ ); 22.5 (2 x C(17)H ₂ ); 24.7 (2 x C(3)H ₂ ); 27.0, 27.1 (C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ); 29.0, 29.1, 29.2, 29.4, 29.60, 29.61, 31.8 ((CH-£H ₂ -£H ₂ - CH _r ) _sperm , 2 x N-CH ₂ -£H ₂ CH ₂ -N, 2 x C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , 2 x C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ); 33.9 (2 x C(2)H ₂ ); 41.0, 47.3, 48.8 (2 x N-£H ₂ -CH ₂ -£H ₂ -N, (CH-CH ₂ -CH ₂ -£H ₂ -) _sperm , £H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 62.0, 62.9 (CO-£H, CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 129.5, 129.9 (2 x £H=£H); 173.4, 174.2 (CO-NH, 2 x CH ₂ £OO).

W

Beispiel 13

Synthese von 2-Dimethylamino-l,3-propandioI 13

In einem Rundkolben wurden 456 mg (5 mmol) 2-Amino-l,3-propandiol vorgelegt und unter Eiskühlung 1.13 ml (25 mmol) Ameisensäure (85 %, d = 1.20)versetzt. Anschlie¬ ßend wurden 895 μl (12 mmol) Formaldehyd (37 %) zugefügt und die Mischung für 10 h im Wasserbad auf 80 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 3 ml 2 N Salzsäure zugesetzt. Die Isolation des Produktes erfolgte durch Chromatographie über 25 g sauren Ionenaustauscher (DOWEX). Das so erhaltene Rohprodukt wurde durch Kurzwegde¬ stillation im Ölpumpenvakuum gereinigt. Man erhielt 253 mg (42 %) eines farblosen Öls. Sdp. _lmbar = 105 °C

1H-NMR (DMSO-d ₆ ): δ = 2.25 (s; 6 H; N(CH ₃ ) ₂ ); 2.31-2.45 (m; 1 H; CH(CH ₂ OH) ₂ ); 3.35-3.55 (m; 4 H; CH(CH ₂ OH) ₂ ); 4.24 (s(breit); 2 H; CH(CH ₂ OH) ₂ ).

¹³ C-NMR (DMSO-d ₆ ): 5 = 41.8 (N(£H ₃ ) ₂ ); 58.7 (CH(£H ₂ OH) ₂ ); 66.7 (£HCH ₂ OH) ₂ ).

13

Beispiel 14

Synthese von 2-Dimethylamino-(l,3-dioleoyloxy)-propan 14

Eine Lösung von 183 mg (1.54 mmol) 13, 1.088 g (3.85 mmol) Ölsäure, 795 mg (3.85 mmol) DCC und 18 mg (154 μmol) Dimethylaminopyridin in 20 ml abs. CH ₂ C1 ₂ wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde filtriert, mit Hexan/Ether (3:1) nachgewaschen und das Filtrat einrotiert. Nach Säulenchromatographie an Kiesel¬ gel, (CH ₂ Cl ₂ /MeOH 30:1 ) erhielt man 444 mg (45 %) des Produkts als farbloses Öl.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.85-0.95 (m; 6 H; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.2-1.4 (m; 40 H; 2 x CO- (CH ₂ ) ₂ )-(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.55-1.7 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ -); 1.95-2.05 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CH-CH ₂ ); 2.3-2.35 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ -); 2.39 (s: 6 H, N(CH ₃ ) ₂ ); 2.9-3.0 (m; 1 H; CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 4.1-4.3 (m; 4 H, CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 5.3- 5.4 (m, 4 H, 2 x CH=CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.4 (2 x C(18)H ₃ ); 23.0 (2 x C(17)H ₂ ); 25.3 (2 x C(3)H ₂ ); 27.55, 27.6 (C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ); 29.50, 29.53, 29.67, 29.7, 29.8, 29.9, 30.06, 30.14, 32.3 (2 x C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , 2 x C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ); 34.7 (2 x C(2)H ₂ ); 42.4 (N(£H ₃ ) ₂ ); 61.6, 61.9 (£H(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 130.09, 130.36 (2 x £H=CH); 173.9 (2 x CH ₂ £OO).

Beispiel 15

Synthese von N-[2-(l,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamnιoniummethy lsul- fat l5

Zu einer Lösung von 200 mg (309 μmol) 14 in L55 ml Ethylacetat/Hexan (1:1) wurden bei 0 °C 66 μl (696 μmol) Dimethylsulfat zugefügt und die Reaktionsmischung für 24 h bei 4 °C gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel entfernt. Man erhielt 213 mg (89 %) eines farblosen Öls.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.75-0.9 (m; 6 H; 2 x CH ₂ -CH ₃ ); 1.05-1.4 (m; 40 H; 2 x CO- (CH ₂ ) ₂ )-(CH ₂ ) ₄ , 2 x (CH ₂ ) ₆ -CH ₃ ); 1.4-1.65 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ -); 1-8-2.1 (m; 8 H; 2 x CH ₂ -CH=CHCH ₂ ); 2.25-2.4 (m; 4 H; 2 x CO-CH ₂ -CH ₂ -); 3.3-3.45 (s(breit); 9 H; N(CH ₃ ) ₃ ); 3.61 (s; 3 H; CH ₃ -O-S); 4.1-4.2 (m; 1 H; CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 4.4-4.65 (m; 4 H; CH(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 5.2-5.4 (m; 4 H; 2 x CH=CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 13.8 (2 x C(18)H ₃ ); 22.4 (2 x C(17)H ₂ ); 24.4 (2 x C(3)H ₂ ); 26.9, 27.0 (C(8)H ₂ , C(l 1)H ₂ ); 28.8, 28.9, 29.0, 29.05, 29.3, 29.46, 29.5, 31.6 (2 x C(4)H ₂ -C(7)H ₂ , 2 x C(12)H ₂ -C(16)H ₂ ); 33.6 (2 x C(2)H ₂ ); 53.0, 54.0 (N(£H ₃ ) ₃ , £H ₃ -O- S); 58.7 (CH(£H ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 69.8 (£H(CH ₂ O ₂ C-R) ₂ ); 129.4, 129.8 (2 x £H=£H); 172.3 (2 x CH ₂ £OO).

-ij

Beispiel 16

N,N',N",N'"-Tetra-i ^, -7rι'.-butyloxycarbonyl-6-carboxy-spermyl-2,3-dihydro xy-l- propylamid 16

Eine Lösung von 300 mg (0.47 mmol) Tetra-BOC-carboxyspermin in 4 ml Dichlor¬ methan wurde nacheinander mit 59 mg (0.51 mMol) Hydroxysuccinimid gelöst in 2 ml Dichlormethan/THF (1:1) und 106 mg (0.51 mMol) Dicyclohexyl-carbodumid gelöst in 2.2 ml Dichlormethan ersetzt und 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Essigsaureethylester aufgenommen, filtriert und aus dem klaren Filtrat das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand (335 mg (0.45 mMol) Tetra-BOC-Carboxyspermin-hydroxy-succinimidylester) wurde in 2.18 ml Dimethylformamid aufgenommen und mit 41 mg (0.45 mMol) (±)-l-Amino-2,3-pro- pandiol und 61.5 μl (0.45 mMol) Triethylamin versetzt. Nach 3tägigem Rühren ent¬ fernte man das Lösungsmittel und verteilte den Rückstand zwischen Ether und Wasser. Die organische Phase wird getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhielt man ein öliges Produkt, das direkt weiterverwendet werden kann.

1-2. Beispiel 17

N,N',N",N'"-Tetra-ι'eι ^H -'.-butyloxycarbonyl-6-carboxy-spermyI-2.3-dioleoyloxy -l- propylamid 17

Eine Lösung von 252 mg (0.35 mMol) 16 in 1.4 ml Tetrachlorkohlenstoff wurde mit 218 mg (0.77 mMol) Ölsäure, 180 mg (0.87 mMol) Dicylohexylcarbodiimid und einer katalytischen Menge Dimethylaminopyridin versetzt. Es wurde über Nacht gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand chromatographiert (Kiesel¬ gel, Dichlormethan mit bis zu 10 % ansteigendem Methanolanteil). Man erhielt 392 mg (90 % d. Th.) eines Öls.

¹³ C-NMR: δ = 173.8, 173.3 (Ölsre.-C=O), 156 (C(=O)-N, 130.0, 129.7 (Ölsre. C=C), 80.97, 79.67, 78.94 (quart.-BOC), 70.3 (Glyc. sn2), 62.6 (Glyc. snl), 59.1 (Sperm.-), 46.5, 44.3, 43.7, 43.1 (Sperm. N-CH ₂ ), 39.5 (Glyc. sn3), 38.2 (Sperm. N-CH ₂ ), 34.9 (Ölsre. C-2), 31.9 (Ölsre. C-16), 29.8-29.1 (Ölsre.-CH ₂ ), 28.4 (BOC-CH ₃ ), 27.2 (Ölsre. C-8,11) 25.0 (Ölsre. C-3), 22.7 (Ölsre. C-17), 14.1 (Ölsre. C-18).

Beispiel 18

(6-Carboxy-spermyl)-2,3-dioleoyloxy-l-propylamid 18

Eine Lösung von 195 mg (0. 16 mmol) 17 in 5 ml Dichlormethan wurde bei Raumtem¬ peratur mit 5 ml TFA versetzt. Nach 20 min. Rühren wurde mit 100 ml Dichlormethan verdünnt und mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft. Man erhielt 134 mg (99 %) eines zähen Öls.

1H-NMR (500 MHz, CDCl ₃ /CD ₃ COOD 5:1) δ = 5.33 (Ölsre. 9, 10-H), 5.16 (Glycerin 2-H), 4.25 und 4.06 (Glycerin 1-H), 4.15 (Spermin- -H), 3.55 und 3.33 (Glycerin 3-H), 3.18 und 3.05 (Spermin N-CH ₂ ), 2.31 (Ölsre. 2-H), 2.21 (Spermin -CH ₂ ), 2.01 (Ölsre. 8, 11-H), 1.98 (Spermin- ), 1.83 (Spermin CH ₂ ), 1.57 (Ölsre. 3-H), 1.30 (Ölsre. 4-7, 12-17- H), 0.87 ppm (Ölsre. 18-H).

¹³ C-NMR: δ = 173.82 und 173.53 (Ölsre. C-l), 154.06 (C(=O)-N), 130.17 u. 129.81 (Ölsre. C-9 u. C-10), 70 (Glycerin C-2), 63.2 (Glycerin C-l), 39.8 (Glycerin C-3), 34.25, 34.05, 33.97 (Ölsre. C-2), 32.70, 31.93 (Ölsre. C-16), 30.82; 29.79, 29.57 u. 29.35 (Ölsre. CH ₂ ), 27.25 (Ölsre. C-8, 11) 25.64, 25.53, 25.32, 24.97 (Ölsre. C-3), 24.71, 22.70 (Ölsre. C-l 7), 14.13 ppm (Ölsre. C-l 8). MS (FAB): MH ⁺ : 848.6 (Ber. 848.8).

Beispiel 19

Synthese von N-((N-Boc)-Glycyl)-aminopropan-2,3-diol 19

10.00 g (36.73 mmol) Boc-Gly-OSu (Bachern) wurden zusammen mit 3.35 g (36.77 mmol) l-Amino-2,3-propandiol in 50 ml DMF gelöst und 18 h gerührt. Das Produkt wurde durch Flashchromatographie (CH ₂ ,Cl ₂ /MeOH; 95:5 v/v) gereinigt. Man erhielt 8.94 g (98 %) 19 als farbloses Öl.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 1.45 (s; 9 H; CH ₃ ); 3.28 (m; 1 H; CH ₂ -OH); 3.39 (m: 1 H; CH ₂ -OH); 3.35 (m; 1 H; CH ₂ -N _Aminoprop. ); 3.38 (m; 1 H; CH ₂ -N _Aminoprop. ); 3.78 (s; 3 H; CH-OH; CH ₂ -NH _G , _y ); 4.41 (br s; 1 H; OH); 4.67 (br s; 1 H; OH); 6.04 (tr; 1 H; NH); 7.45 (tr; 1 H; NH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 28.4 (CH ₃ ); 42.2 (CH ₂ -N _Gly ); 44.0 (CH2-N _Amminoprop. ); 64.0 (CH ₂ -OH); 70.8 (CH-OH); 80.3 (quart. C _Boc ); 156.6 (NCO ₂ ); 174.5 (NCO).

Beispiel 20

Synthese von 2,3-DioleoyIoxy-N-((N-Boc)-glycyl)-aminopropan 20

8.90 g (35.85 mmol) 19 wurden zusammen mit 22.70 g (110.02 mmol) DCC und 26.60 g (94.17 mmol) Ölsäure in 50 ml DMF gelöst. Dazu wurden 0.42 g (3.44 mmol) DMAP gegeben und 2 d gerührt. Danach wurde abfiltriert, einrotiert und das Produkt chromatographisch (CH ₂ ,Cl ₂ /MeOH; 99:1 v/v) gereinigt. Ausbeute: 19.25 g 20 als farbloses Öl (69 %).

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.89 (tr; 6 H; CH _{3> olsäure} ); 1.30 (br s; 40 H; C-CH ₂ -C); 1.45 (br s; 9 H; CH _{3 Boc} ); 1.62 (m; 4 H; CH ₂ -CH ₂ ^' c=O); 2.03 (m; 8 H; CH ₂ -CH=CH); 2.32 (tr; 4 H; CH ₂ C=O); 3.42-3.57 (m; 2 H; CH ₂ -N _Aminoprop ); 3.75 (d; 2 H; CH ₂ -N _Gly ); 4.12 (dd; 1 H; CH ₂ -O _Aminoprop .); 4.27 (dd; 1 H; CH ₂ -O _Aminoprop .); 5.08 (m; 1 H, CH-O); 5.20 (s; 1 H; NH); 5.34 (m; 4 H; CH=CH); 6.58 (tr; 1 H; NH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (CH _{3, 01säure} ); 22.7 (CH _{2, 01säure} ); 24.9 (CH ₂ . _01säure ); 27.2

(CH ₂ , _Ö lsäure) 27.2 (CH ₂ , oisäure); 28.3 (CH ₂ . ölsäure)^ 29.2 (CH ₂ . oisäure); 29.3 (CH _{3 Boc} ); 29.5 (CH ₂ oisäure); 29.8 (CH ₂ oisäure); 31 -9 (CH ₂ oisäure); 34.0 (CH ₂ oisäure); 34.2 (CH ₂ . oi _säu r _e ); 39.7 (CH ₂ -N _Gly ); 44.5 (CH ₂ -N _Aminoprop .); 62.7 (CH ₂ -O _Arnmoprop. ); 70.2 (CH- 0 _Am i _noProp. ); 80.3 (quart. C _Boc ); 129.7 (CH=CH); 129.7 (CH=CH); 130.0 (CH=CH) 130.0 (CH=CH); 156.1 (NCO ₂ ); 169.8 (NCO); 173.2 (CO _olsäure ); 173.4 (CO _olsäure ).

2b Beispiel 21

Synthese von 2,3-Dioleoyloxy-N-(glycyl)-aminopropan 21

15.20 g (19.56 mmol) 20 wurden in 200 ml CH ₂ C1 ₂ /TFA (3:1 v/v) aufgenommen und 30 min gerührt. Danach wurde die Lösung mit 200 ml CH ₂ C1 ₂ verdünnt und mit 200 ml ges. NaHCO ₃ -Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über MgSO ₄ getrock¬ net und einrotiert. Ausbeute: 11.64 g (88 %) 21 als Öl.

1H-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 0.88 (tr; 6 H; CH ₃ ); 1.29 (br s; 40 H; C-CH ₂ -C); 1.62 (m; 4 H; CH ₂ -CH ₂ C=O); 1.82 (s; 2 H; CH ₂ -N _Gly ); 2.01 (m; 8 H; CH ₂ -CH=CH); 2.32 (tr; tr; 4 H; CH ₂ C=O); 3.36 (s; 2 H; NH ₂ ); 3.43-3.62 (m; 2 H; CH ₂ -N _Ammoprop ); 4.12 (dd; 1 H; CH ₂ - 5.14 (m; 1 H; CH-O _Ammoprop ); 5.34 (m; 4 H;

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ ): δ = 14.0 (CH ₃ ); 22.6 (CH _{2, 0} . _säUre ); 24.8 (CH _{2, 01säure} ); 24.8 (CH _2,

Oisäure); 27.1 (CH ₂ , oisäure); 29.0 (CH _{2 01saure} ); 29.1 (CH ₂ . oisäure); 29.2 (CH _2; oisäure); 29.4

(CH _{2 01säure} ); 29.6 (CH _{2 0} ι _saure ); 31.8 (CH _{2 0} ι _saure ); 34.0 (CH _{2 0} ι _saure ); 34.2 (CH _{2 01saure} ); 39.1 (CH ₂ -N _Gly ); 44.5 (CH ₂ -N _Ammoprop ); 62.7 (CH ₂ -N _Ammoprop ); 129.6 (CH _01saure ); 129.9 (CH ₀ , _saure ); 173.1 (NCO); 173.1 (CO ₀ , _säure ); 173.3 (CO _olsäure ).

Beispiel 22

Synthese von 2,3-Dioleoyloxy-N-(N-(N,N'N",N'"-Tetra-fer/. -buty loxycarbonyl-6- carboxy-spermyl)-glycyl)-aminopropan 22

100 mg (0.15 mmol) 21 wurden zusammen mit 102 mg (0.16 mmol) (Boc) ₄ -Speπnyl COOH und 39 mg (0.19 mmol) DCC in 1 ml CH ₂ C1 ₂ gelöst und 18 h gerührt. Danach wurde von ausgefallenem DCH abfiltriert. Das Einengen und chromatographischer Auf¬ reinigung (CH ₂ Cl ₂ /MeOH, 97:3) erhielt man 123.1 mg (63 %) 22 eines farblosen Öls.

'H-NMR (CDCl, + 0.1 ml CD ₃ COOD): δ = 0.88 (tr; 6 H; CH _{3 0} ι _Säure ); 1 -28 (br s; 40

H; C-CH ₂ -C _01säure ); 1.46 (br s; CH _{3, Boc} ; CH _{2> Spermyl} ); 1.62 (m; 4 H; CH ₂ CH ₂ C=O); 2.03 (m; 8 H; CH ₂ -CH=CH); 2.32 (m; 4 H; CH ₂ C=O); 3.00-3.33 (m; 10 H; CH _{2 Spermyl} ); 3.33-3.62 (m; 2 H; CH ₂ -N _Aramoprop ); 3.95 (m; 2 H; CH ₂ -N _Gly ); 4.10 (m; 1 H; CH ₂ -O); 4.28 (m; 1 H; CH ₂ -O); 4.30 (br s; 1 H; CH _Spermyl ); 5.12 (m; 1 H; CH _Ammoprop ); 5.35 (m; 4 H; CH=CH).

¹³ C-NMR (CDC1 ₃ + 0.1 ml CD ₃ COOD): δ = 14.1 (CH _{3, 0} , _Sau.e ); 22.8 (CH _2, oi _säure ); 25.0 (CH ₂ , oisäure); 27.3 (CH _2? oisäure); 27.3 (CH _2ι oisäure); 28.4 (CH _{3 ) Bθ} c); 28.5 (CH _{3 Boc} ); 29.3 (CH _2, oi _säure ); 29.3 (CH _{2, 01säure} ); 29.4 (CH _{2, 01säure} ); 29.7 (CH _{2, 01säure} ); 29.9 (CH ₂ , ₀ , _säure ); 32.0 (CH ₂ , oisäure); 34.2 (CH ₂ , _01Säu re); 39.7 (CH ₂ -N _Gly ); 43.1 (CH ₂ - N _Ammoprop ); 63.0 (CH ₂ -O); 70.2 (CH-O); 79.6 (quart. C _Boc ); 80.2 (quart. C _Boc ); 80.9 (quart. C _Boc ); 81.5 (quart. C _Boc ); 129.8 (CH=CH); 130.1 (CH=CH); 155-158 (NCO ₂ ); 173.6 (COO); 173.8 (COO).

2-?

Beispiel 23

Synthese von 2,3-Dioleoyloxy-N-(N-(6-carboxy-spermyl)-glycyl)-aminopropan 23

1.00 g (0.77 mmol) 22 wurden in 100 ml CH ₂ C1 ₂ /TFA (3:1) gelöst und 30 min gerührt. Anschließend wurde vom Lösungsmittel befreit. Man erhielt 1.03 g (98.80 %) 23 als wachsartiges Produkt.

1H-NMR (d ₆ -DMSO): δ = 0.85 (tr; 6 H; CH ₃ oi _säure ); 1-23 (br s, 44 H, C-CH ₂ - Cö _.säure/ s _Perm v.); 1-50 (m; 4 H; CH ₂ CH ₂ C=O); 1.67 (m; 2 H; C-CH ₂ -C _Spermyl ); 1.83 (m; 2 H; C-CH ₂ -C _Sperrnyl ); 1.95 (m; 8 H; CH ₂ -CH=CH); 2.23 (m; 4 H; CH ₂ C=O); 2.82-3.30 (m; 10 H; N-CH _{2, Spermy} .); 3.26 (m; 1 H; CH ₂ -N _Amιnoprop ); 3.36 (m; 1 H, CH ₂ -N _Aminoprop ); 3.74-3.88 (m; 2 H, CH ₂ -N _Gly ); 3.93 (br s; 1 H; CH _Spermyl ); 4.01 (m; 1 H, CH ₂ -O); 4.24 (m; 1 H; CH ₂ -O); 5.02 (m; 1 H; CH _Ammoprop ); 5.31 (m; 4 H; CH=CH); 8.10 (br s; 6 H; NH); 8.33 (tr; 1 H; NHC=O); 8.98 (br s; 2 H, NH); 9.04 (tr; 1 H; NHC=O); 9.15 (br s; 1 H; NH); 9.50 (br s; 1 H; NH). ^l3 C-NMR (d ₆ -DMSO): δ = 13.8 (CH _{3 olsäure} ); 20.9 (CH ₂ . _Sper ); 22.1 (CH ₂ . _01saure ); 23.8, 23.9 (CH _{2ι Sper} ); 24.4, 26.6 (CH ₂ , Oisäure ); 26.9 (CH _{2) Sper} ); 28.5-29.1 (CH ₂ , OlsäureΛ ^{J l} - ^J

(CH ₂ . ₀ , _saure ); 33.4, 33.6 (CH _{2, 01säure} ); 36.2 (CH _{2, Sper} ); 38.7 (CH _{2, Sper} ); 41.8 (CH ₂ -N _Gly ); 43.0 CH ₂ -N _Aminoprop. ); 43.9, 46.2 (CH _{2, Sper} ); 58.8 (CH _Sper ); 62.8 (CH ₂ -O); 129.5 (CH=CH); 129.6 (CH=CH); 167.4, 168,5 (NCO _Sper/Gly ); 172.2 (COO); 172.4 (COO).

Beispiel 24

Transfektion von adhärenten HELA-Zellen mit CAT-Plasmid

1 Ausgangsmaterial

1. Medium für die Stammkultur HELA (ATTC-Nr. CCL 2): MEM (with EARL's Salts), 10 % FCS, 2 mM Pyruvat, 2 mM Glutamin, 1 x n.e. Aminosäuren.

Für Transfektion gleiches Medium mit 5 % FCS und gleiches Medium ohne FCS ansetzen.

2. pSV2-CAT-Plasmid, in TE-Puffer, Konzentration: 1 mg/ml, 5 kb. (Gorman CM. et al., Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051 (1982)).

3. Neue Transfektionsreagenzien: in MES (MES, 20 mM; NaCl, 150 mM; pH 6.2), Konzentration 1.0 mg/ml, beschallt (Branson-Sonifier) und sterilfiltriert oder in 99.8%igem EtOH, Konzentration 2.5 mg/ml (nicht beschallt und nicht steril filtriert)

4. HEPES: Hepes, 20 mM; NaCl, 150 mM, pH 7.4, steril

5. PBS, BM-Ident.-Nr. 210 331 (10 mM Puffer, 150 mM Salz), steril und nicht steril

6. NaCl, 150 mM

7. Lysispuffer: MOPS, 10 mM; NaCl, 10 mM, EGTA, 1 mM, Triton-X-100, 1 %, pH 6.5.

3o 2. Transfektionsansatz

Einen Tag vor Transfektion werden die Zellen in 6 cm Petrischalen umgesetzt: Dazu Zellen abtrypsinisieren und auf 2 x 10 ⁵ Zellen/ml (Zellzahlbestimmung mit der Neubauer-Zählkammer) in 5 % FCS-haltigem Medium verdünnen. 5 ml pro Schale. Inkubation im Brutschrank (bei 37 °C, 5 % CO ₂ ).

Ansatz pro Schale für wäßrige Lösungen des Transfektionsreagenzes (TR):

1. 5 μg Plasmid (= 5 μl) mit HEPES ad 100 μl versetzen, vortexen.

2. 10 - 40 μg TR (= 10 - 40 μl) mit HEPES ad 100 μ versetzen, vortexen.

3. Lösungen aus 1. und 2. vereinigen, vorsichtig schütteln. 10 bis 15 min bei RT stehen lassen.

4. Während der Inkubationszeit Mediumwechsel in den Testschalen: Altes Medium absaugen und durch 3 ml Medium f5% FCS-haltig oder falls ohne FCS. Zellen 2 x mit PBS waschen) ersetzen.

5. Plasmid-TR-Gemisch aus 3. (200 μl) direkt ins frische Medium (mit oder ohne FCS) geben und durch vorsichtiges Schwenken der Schale gleichmäßig verteilen.

6. 6 h im Brutschrank (bei 37 °C, 5 % CO ₂ ) inkubieren.

7. Dann das Medium auf eine Endkonzentration von FCS von 5 - 10 % aufstocken. Mediumendvolumen 6 ml.

8. 19 h im Brutschrank inkubieren.

9. Dann Ansatz komplett absaugen und durch 5 ml Medium mit 5 - 10 % FCS er¬ setzen.

Ansatz pro Schale für ethanolische Lösungen des TR:

A Ohne FCS im Medium:

1. 5 μg Plasmid (= 5 μl) + 500 μl Medium ohne FCS, vortexen.

2. 10 - 40 μg TR (= 4 - 16 μl) + 500 μl Medium ohne FCS, vortexen.

3. Zellen FCS-frei waschen: 5 ml Medium absaugen und 2 x mit PBS waschen; absaugen.

4. Lösungen aus 1. und 2. vereinigen, vorsichtig schütteln.

5. Plasmid-TR-Gemisch aus 4. (ca. 1020 μl) auf die gewaschenen Zellen geben und durch vorsichtiges Schwenken der Schale gleichmäßig verteilen.

6. 6 h im Brutschrank (bei 37 °C, 5 % CO ₂ ) inkubieren.

3/

7. Dann das Medium auf eine Endkonzentration von FCS von 5 - 10 % aufstocken. Mediumend

8. 18 h im Brutschrank inkubieren.

9. Dann Ansatz komplett absaugen und durch 5 ml Medium mit 5 - 10 % FCS ersetzen.

B Mit FCS im Medium:

1. 5 μg Plasmid (= 5 μl) + 150 μl NaCl, vortexen.

2. 10 - 40 μg TR (= 4 - 16 μl) + 150 μl NaCl, vortexen.

3. Lösungen aus 1. und 2. vereinigen, vorsichtig kurz schütteln. 15 min bei RT stehen lassen.

4. Während der Inkubationszeit Mediumwechsel in den Testschalen: Altes Medium absaugen und durch 1.5 ml Medium (10 % FCS-haltig) ersetzen.

5. Plasmid-TR-Gemisch aus 3. (ca. 320 μl) ins frische Medium geben und durch vorsichtiges Schwenken der Schale gleichmäßig verteilen.

6. 6 h im Brutschrank (bei 37 °C, 5 % CO ₂ ) inkubieren.

7. Dann das Medium auf eine Endkonzentration von FCS von 5 - 10 % aufstocken. Mediumendvolumen 6 ml.

8. 18 h im Brutschrank inkubieren.

9. Dann Ansatz komplett absaugen und durch 5 ml Medium mit 5 - 10 % FCS ersetzen.

3. Zell-Lyse

1. Absaugen des Mediums und -3 maliges Waschen der Zellen mit eiskaltem PBS.

2. Restflüssigkeit sorgfältig absaugen und 1 ml Lysispuffer pro Schale zugeben. Inkubation 30 min bei RT. Schalen ohne Schütteln stehen lassen.

3. Abnehmen des Zell-Lysates mit der Pipette und Überführen in 1 ,5 ml Eppendorftubes.

4. Abzentrifugieren der Lysate in der Tischzentrifuge, 3 min.

5. Überstand abnehmen und in ein frisches Gefäß überführen. Pellet verwerfen.

4. Proteinbestimmung der Lysate

Die Proteinbestimmung wird im Anschluß an die Lyse durchgeführt.

Analysiert wird mit der Proteinbestimung nach Bradford (M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)).

Für die weitere Untersuchung werden die Lysate eines Versuchsansatzes mit Samplebuffer (aus CAT-ELISA-Kit, Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 1363727) auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellt (ca. 250 μg/ml).

5. Ermittlung der Transfektionseffizienz

Untersuchung der Lysate im CAT-ELISA (Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 1363 727). Es werden je 200 μl der auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellten Lysate im ELISA eingesetzt.

Vergleich der Extinktionen ergibt Aufschluß über die Transfektionseffizienz.

Rekonstitution der Kit-Bestandteile und Verdünnen auf Arbeitskonzentration:

1. CAT-Standard, Flasche 1

Zu einer Flasche Lyophilisat 0,5 ml bidest. Wasser geben und durch Schütteln lösen. Die Konzentration (ng/ml) wird dem Etikettenaufdruck entnommen.

Arbeitsverdünnung :

Gelöstes Lyophilisat (Konzentration siehe Flaschenetikett) mit Probenverdün¬ nungspuffer (Flasche 7) auf 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312, 0 ng/ml dünnen.

2. PAK <CAT> Dig, Flasche Z

Zu einer Flasche Lyophilisat 0,5 ml bidest. Wasser geben und durch Schütteln lösen ( Konzentration = 0.2 mg/ml).

Arbeitsverdünnung :

Das gelöste Lyophilisat (0.2 mg/ml) mit Probenverdünnungspuffer (Flasche 7) auf 2 μg/ml verdünnen.

3. PAK<Dig>POD, Flasche 3

Zu einer Flasche Lyophilisat 0.5 ml bidest. Wasser geben und durch Schütteln lösen (Konzentration = 20 U/ml).

Arbeitsverdünnung :

Das gelöste Lyophilisat (20 U/ml) mit Probenverdünnungspuffer (Flasche 7) auf 150 mU/ml verdünnen.

4. Waschpuffer, Flasche 6

Gebrauchsfertiger Waschpuffer wird durch mischen von 1 Teil 10 x Wasch¬ puffer (Fl. 6) mit 9 Teilen bidest. Wasser hergestellt. Der 1 x Waschpuffer wird für alle Waschschritte benötigt.

5. Probenverdünnungspuffer, Flasche 7

Im Wasserbad Flasche-Nr. 7 auf RT bringen. Ready to use.

6. POD-Substrat, Flasche 4

ABTS- 1 -Komponentensubstrat (Flasche Nr. 4), Ready to use, auf RT temperieren.

3H

Durchführung

Die nachfolgende Tabelle bezieht sich auf die o. g. Puffer und Arbeits Verdün¬ nungen. Die MTP-Module werden nach jedem Waschschritt auf mehrfachen Cellulosepapierschichten ausgeklopft.

Für die Inkubationsschritte bei 37 °C wird die Platte mit einer MTP- Abdeck¬ folie beklebt.

Die Ergebnisse sind in Abbildungen 1 und 2 dargestellt.