技术领域

本发明属于生物化工领域， 具体涉及一种纤维化纤维微细菌菌株及其 应用。

背景技术

许多天然具有活性化合物往往以糖苷的形式存 在于自然界中， 将其糖 基去除后， 便可释放出有活性的化合物。 如抗癌药物紫杉醇， 其主要存在 于红豆杉植物的树皮中。 而在红豆杉的枝叶中则大量存在着木糖苷化的 紫 杉醇前体或其相同母核的类似物（称之为紫杉 烷类化合物)，如 7-木糖紫杉 醇和 7-木糖 -10去乙酰紫杉醇（10DAXT), 其在如中华、 云南及南方红豆 杉的枝叶中的累积量可高出紫杉醇 10倍以上，将 7-位木糖基水解后再经一 步乙酰化即可转化为紫杉醇。

另外一种典型的天然产物如来自名贵中草药人 参的人参皂苷。 人参皂 苷是公认人参中的主要活性成分， 其基本骨架主要是原人参二醇 （PPD) 和原人参三醇 （PPT)。 其中含量高的如 Rbl、 Rb2、 Rb3、 Rc、 Rd、 Re Rgl 等， 都是基本骨架被高度 "糖基化" 了的化合物， 其所含糖基从一个 到五个不等， 而具有很好抗肿瘤和抑菌活性的却是人参中一 些含量很少的 稀有人参皂苷如 Rhl、 Rh2、 Rg3、 Rg5、 CK、 PPT、 PPD等， 这些化合物 往往含糖基较少， 或直接是不带有任何糖基的苷元， 是上述高含量人参皂 苷去糖基化后的产物（J Pharm Pharmacol. 1998 Oct; 50(10): 1155-60.)。 日 本公开特许 58-131999 (JPO) 58-131999公布了 20 (S) -原人参二醇、 20 (R) -原人参二醇、 20 (S) -原人参三醇、 20 (R) -原人参三醇都具有抑 制肿瘤生长的活性， 其中 20 (S) -原人参二醇 （PPD) 的活性最强。 进一 步的研究表明 20 (S) -PPD可以通过增强机体免疫和直接的细胞毒作� �杀 死肿瘤细胞， 还可以抑制肿瘤间质血管生成， 阻止肿瘤细胞的生长； 在神 经系统方面， 20 (S) -PPD可以抗癫痫、 抗抑郁、 增强学习能力等， 是一 个非常具有开发价值的化合物 （Front Pharmacol. 2012; 3: 25. Chinese Medicine 2010， 5:20)。

此外， 还有很多天然化合物都存在类似情况， 如黄芪甲苷， 红链霉素 糖苷， 异槲皮苷， 大豆皂苷， 红景天苷， 天麻苷， 山慈菇苷 A， 薯蓣皂苷， 亚麻木酚素， 哈巴俄苷及哈巴苷等等。

由于人们往往对其苷元更感兴趣， 但这类化合物一般骨架复杂， 化学 方法断裂糖苷键的选择性差， 副产物多， 环境污染等原因， 制备相应苷元 十分困难。 相比之下生物转化方法由于具有高度的选择性 和专一性， 几乎 没有副产物， 反应条件温和， 环境友好， 成为制备此类化合物相应苷元的 首选。 目前已有很多关于酶法水解糖苷类化合物的报 道， 如韩国研究者公 布了利用针尾曲霉水解红参中人参皂苷以提高 其中人参皂苷苷元的含量 (J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 53(5), 553-558 (2010)) , Kohada报道以 G-Rbl Rb2、 Rb3、 Rc和 Rd为原料， 用醋酸水解脱去 C-20位上的糖， 再 用粗橙皮苷酶等水解脱去 3位上的糖，制得 20 (S) -PPD (JPO 58-131999), 中国专利 CN03101549.2 公开了利用乳酸菌或肠道细菌生物转化制备人 参 组合物的方法，中国专利 CN 102703329公开了一株能够高效转化黄姜中皂 苷生产薯蓣皂苷元的菌株， Hanson RL ( 1997) 利用细菌 Moraxella sp.、 Bacillus macerans、 Bacillus circulans和 Micrococcus sp.将 C-7 木糖紫杉 垸转化为 C-7羟基紫杉烷，中国专利 CN 102296053公开了一种来自真菌的 β-木糖苷酶也具有水解 C-7木糖紫杉垸的能力， 并实现其在酵母中的胞内 表达等， 但往往存在使用菌体转化、 产酶及转化效率低的情况， 尤其对于 一些水溶性差、 空间位阻大的化合物， 如 10DAXT, 普通糖苷酶往往难以 水解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纤维化纤维微细菌 菌株及其应用， 该菌株 可将含木糖苷键或葡糖苷键的化合物水解而获 得相应的苷元。 本发明使用 一种纤维化纤维微细菌菌株或该菌株所产生的 酶接触含有至少一种木糖苷 键或葡糖苷键的黄芪皂苷类、 人参皂苷类、 紫杉烷木糖苷类、 红链霉素糖 苷、 异槲皮苷、 大豆皂苷类化合物， 并水解相应的糖苷键。 该方法可以制 备至少一种上述糖苷化合物的苷元， 也可以制备在转化上述苷元的过程中 所产生的具有药理活性的中间产物。

本发明提供了一种纤维化纤维微细菌菌株， 该菌株为纤维化纤维微细 菌 （Cellulosimicrobium cellulans) 菌株 F16， 菌种保藏号为 CCTCC M 2013201 , 保藏日期为 2013年 5月 14日， 保藏单位为中国典型培养物保藏 中心， 保藏地址为中国武汉大学。

本发明还提供了所述纤维化纤维微细菌菌株的 应用， 该菌株应用于糖 苷化合物苷元的制备。

本发明提供的所述纤维化纤维微细菌菌株的应 用， 该菌株或其发酵产 生的水解酶， 接触含糖苷键的糖苷化合物， 将糖苷键水解， 得到的产物是 相应的苷元或中间体。

本发明提供的所述纤维化纤维微细菌菌株的应 用， 所述糖苷键为葡萄 糖苷键和 /或木糖苷键。

本发明提供的所述纤维化纤维微细菌菌株的应 用， 所述糖苷化合物结 构如下：

异槲皮苷类

R为木糖基、 葡糖基、 龙胆二糖基、 槐糖基或新橙 皮糖基

大豆皂苷

R为木糖基、 葡糖基、 龙胆二糖基、 槐糖基或新橙 皮糖基

本发明菌株制备的相应苷元结构是:

苷元名称 结构式

环黄芪醇

原人参醇

R为 H时， 化合物为 20 (S ) -原人参二醇； R

-原人参三醇

为 H或 _R1 '又 o 紫杉垸 ^R1 " δΗ

R3为 H或酰氧基； Rl '和 Rl "为 H, 或芳基、 芳烷基、 链烃基， 或上述三种烃基的取代物， 取代基包括羟基、 C1至 C8的垸氧基、 縮醛、 缩酮、 ¾素、 硝基或氨基 红链霉素

OH OH 0

0 OH 异槲皮素 ^Hc yyU >H

大豆皂苷苷元

本发明提供的菌株的水解方法已考虑到具有 上述分子结构的化合物的 手性中心的所有立体构型， 这些立体异构体或单独被水解， 或与其它立体 异构体混合在一起被水解。

本发明提供的菌株实用价值在于： 环黄芪醇， 原人参醇， 紫杉烷类化 合物， 红链霉素， 异槲皮素和大豆皂苷苷元， 在药物制备领域有重要的应 用价值。 从植物中提取出的上述化合物通常是连接有大 量糖基的糖苷化合 物， 且多为混合物， 其中大部分糖苷化合物带有的是木糖基或葡糖 基， 而 去糖基后的苷元才是最终想要的产品。 一个或多个含有至少一种木糖苷键 或葡糖苷键的黄芪甲苷、 人参皂苷、 紫杉烷木糖苷、 红链霉素糖苷、 异槲 皮苷或大豆皂苷， 在菌株 F16或其发酵产生的水解酶的作用下被水解， 得 到相应苷元； 所得化合物可以是具有药理活性的苷元， 如环黄芪醇， 原人 参醇， 紫杉烷类化合物， 红链霉素， 异槲皮素或大豆皂苷苷元， 或其类似 物， 也可以是制备上述苷元的过程中所产生的未完 全水解的中间体。

本发明提供的菌株使得被水解的黄芪甲苷、人 参皂苷、紫杉烷木糖苷、 红链霉素糖苷、 异槲皮苷和大豆皂苷的立体构型优先保留于产 品中， 所得 相应苷元或其水解中间产物的糖苷键的绝对立 体构型与原糖苷化合物的糖 苷键绝对立体构型相同。

本发明提供的菌株用于从带有木糖苷键或葡糖 苷键的黄芪甲苷、 人参 皂苷、 紫杉垸木糖苷、 红链霉素糖苷、 异槲皮苷或大豆皂苷制备相应的苷 元或其水解中间产物时十分有效。 用本发明提供的方法可以水解一种带有 木糖苷键或葡糖苷键的上述糖苷化合物， 也可以连续性地或同时水解不同 上述糖苷化合物的混合物。 由植物材料提取的人参皂苷混合物、 紫杉垸木 糖苷和大豆皂苷混合物用本发明提供的方法水 解， 效果很好。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发 明。

起始材料：

本发明所采用的起始材料可以是任何带有木糖 苷键或葡糖苷键的黄芪 甲苷、 人参皂苷、 紫杉垸木糖苷、 红链霉素糖苷、 异槲皮苷或大豆皂苷类 化合物。 带有木糖苷键或葡糖苷键的上述糖苷化合物可 以是自然形成的， 也可以是化学半合成或全合成所得。

酶与微生物：

本发明水解方法中使用的酶或微生物可以是下 面描述的任何能催化酶 水解反应的酶或微生物。 这些酶或微生物材料， 不管其来源或纯度， 都可 在游离状态下使用，或者将其用物理吸附或诱 捕方法固定在支持物上使用。 生物学纯的纤维化纤维微细菌 CeUuhsimicrobium ceUu m 菌株 F16是新 发现的同时产 β-木糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶的微生物。 这种微生物的突变体， 例如经化学的， 物理的（如紫外辐射）或生物学方法（如分子 生物学技术) 改造以用于水解反应的突变菌株， 也在本发明的考虑范围内。

纤维化纤维微细菌 ( CeUuhsimicrobium ceUulans 菌株 F16分离自大连 市甘井子区西山水库的土壤之中， 其特征为： 革兰氏阳性， 可在好氧条件 下生长， 菌落呈圆形， 直径 0.9〜2mm， 黄白色突起， 反光， 边缘整齐。 在 显微镜下观察菌体为棒状， 随着培养时间的延长逐渐转化成短杆， 甚至球 形。

本发明应用的酶是水解酶， 尤其是葡萄糖苷酶和葡聚糖酶， 以及木糖 苷酶和木聚糖酶。 本发明提供的菌株生产这些酶， 可用提取和纯化的方法 分离它们。 本发明提供的微生物可以以完整湿细胞的形式 ， 或者以冻干， 喷雾干燥或加热干燥的形式， 或者以经破碎抽提后的形式被应用于水解反 应。

本发明提供的水解方法可以在微生物发酵后进 行， 也可以与发酵同时 进行。

将菌株接种于含诱导剂的培养基中， 好氧条件下发酵培养后， 离心收 集上清液， 即为粗酶液。 培养基 pH在 4-7之间， 培养温度 20-40°C之间。 水 解反应进行 0.5-72小时， 直至目的产品的产量达最大。 水解反应时， pH保 持在 6-9， 其中 pH 7-8效果最好。

产物的分离：

应用本发明提供的方法所产生的六类苷元或其 未完全水解的中间产 物， 可被分离纯化， 根据水解产物的特征， 可用提取， 蒸馏， 结晶， 柱层 析或多种分离技术结合的方法进行纯化。

应用：

应用本发明提供的水解方法所获得的化合物如 紫杉醇， 是很好的抗癌 药。 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇经本发明提供的方法水解后� �得 10-去乙酰紫 杉醇， 此化合物再经 10位乙酰化， 即可得到紫杉醇。

应用本发明提供的水解方法所获得的化合物如 人参二醇， 具有非常好 的抗肿瘤活性， 同时还可以抗癫痫、 抗抑郁、 增强学习能力等， 是一个非 常具有开发价值的化合物， 近些年被各国研究者进行改造， 希望能够将其 开发为一种新的抗肿瘤药。

实施例 1: 粗酶液的制备

使用含 1%淀粉， 0.2%蛋白胨， 0.2%酵母提取物， 0.2%磷酸氢二钾的 培养基 （灭菌前 pH 7.0)作为种子培养基。

将上述种子培养基 20ml 分配到 100ml锥形瓶中， 在 120度下灭菌 15min,将纤维化纤维单胞菌 F16菌株的琼脂斜面培养物接种到其中，并在 30度下振荡培养 2天作为种子液。

500ml Erlenmeyer培养瓶中放入 100ml含 1%桦木木聚糖， 0.2%酵母浸 膏， 0.2%氯化铵， 0.1% NaH ₂ PO ₄ 和 0.1% Na ₂ HPO ₄ 的培养基， pH 7， 高压 灭菌 121度 30min。 将 lml种子液接种于此培养基， 150rpm， 30°C摇瓶培 养 5天。 离心收集上清液， 即为粗酶液。

实施例 2: 黄芪甲苷 IV的水解粗醵液的制备

在 0.9ml实施例 1中的粗酶液中加入 lml 50mM Tris-HCl缓冲液 （pH 7.5)，再加入 0.1ml黄芪甲苷 IV的甲醇溶液 (浓度为 10 mg/ml)。100rpm，35'C 孵育 8小时后， 以环黄芪醇标准品作对照， TLC分析， 黄芪甲苷 IV几乎全 部转化为环黄芪醇。

实施例 3: 人参皂苷 Rbl水解制备化合物 CK

在 0.9 ml实施例 1中的粗酶液中加入 1 ml 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5)，再加入 0.1 ml 人参皂苷 Rbl的甲醇溶液（浓度为 10 mg/ml)。 lOOrpm, 35°C孵育 4小时。加入 2ml甲醇终止反应， 15000转 /分离心 20分钟取上清 液进行 UPLC分析。 反应液中人参皂苷 Rbl几乎完全转化， 产生化合物 K (即 CK, 产率 75%)， 未完全水解的中间产物以及少量终产物 PPD。

UPLC方法：

色谱柱： Kromasil ODS (2.1x150 mm, 3 μηι)

流动相： 乙腈:水 (0→30 min: 20:80→95:5梯度洗脱）

流速： 0.4 ml/min

柱温： 室温

检测波长： 203 nm

实施例 4: 人参皂苷 Rbl水解制备原人参二醇（PPD)

在 0.9 ml实施例 1中的粗酶液中加入 1 ml 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5),再加入 0.1 ml人参皂苷 Rbl的甲醇溶液（浓度为 10 mg/ml)。 lOOrpm, 35°C孵育 12小时。 加入 2ml甲醇终止反应， 15000转 /分离心 20分钟取上 清液进行 UPLC分析， 方法同实施例 3。 反应液中人参皂苷 Rbl几乎完全 转化为终产物原人参二醇 （PPD)， 产率 90%。

实施例 5: 人参皂苷 Re水解制备原人参三醉（PPT)

在 0.9 ml实施例 1中的粗酶液中加入 l ml 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5)， 再加入 0.1 ml人参皂苷 Re的甲醇溶液（浓度为 10 mg/ml)。 lOOrpm, 35°C孵育 8小时。加入 2ml甲醇终止反应， 15000转 /分离心 20分钟取上清 液进行 UPLC分析， 方法同实施例 3。反应液中人参皂苷 Re几乎完全转化 为终产物原人参三醇 （PPT), 产率 93%。

实施例 6: 7-木糖紫杉醇水解制备紫杉醇

在 0.9ml实施例 1中的粗酶液中加入 1ml 50mM Tris-HCl缓冲液 （pH 7.5)， 再加入 0.1ml 7-木糖 -紫杉醇的甲醇溶液 （浓度为 5 mg/ml)。 lOOrpm, 30'C孵育 5小时。加入 2ml甲醇终止反应， 15000转 /分离心 20分钟取上清 液进行 HPLC分析。 反应液中无 7-木糖-紫杉醇残留， 并产生 0.41mg紫杉 醇 （产率 94%)。

HPLC方法：

色谱柱： Kromasil ODS (4.6x200 mm, 5 μιη)

流动相： 甲醇:水 （60:40)

流速： lml/min

柱温： 室温

检测波长： 227 nm

实施例 7: 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇水解制备 10-去乙酰紫杉醇

将 10ml 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液（浓度为 5mg/ml)加入到 90ml实施例 1所述的粗酶液中， lOOrpm, 30°C下反应 20小时后，加入 20ml 乙酸乙酯萃取， 共萃取 3次， 合并上层有机相， 减压蒸干， 获得固体物质 102mg, 上硅胶柱（20g)并用氯仿:甲醇 (98:2)进行洗脱， 得到 39 mg 10-去 乙酰紫杉醇 （总收率 91%)。 实施例 8: 7-木糖紫杉烷混合物的水解

将 200 ml含有 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇，7-木糖 -10-去乙酰三尖杉宁碱， 7-木糖 -10-去乙酰紫杉醇 C的混合物（从天然红豆杉提取物中分离，含� �分 别为 65%， 9.9%, 3.3%) 的甲醇溶液（5mg/ml)加入到 2000ml如前所述 的粗酶液中， lOOrpm, 35 'C下反应 8小时。 反应液用乙酸乙酯萃取三次， 每次 200ml， 合并有机相蒸干溶解于 100ml甲醇中， 用实施例 6中 HPLC 方法进行定量检测， 发现其中无三种带木糖基的底物残留， 得到的产物中 10-去乙酰紫杉醇， 10-去乙酰三尖杉宁碱， 10-去乙酰紫杉醇 C的含量分别 504mg, 75mg, 28mg, 回收率达到 90%。

实施例 9: 红链毒素龙胆二糖苷的水解

在 0.9 ml实施例 1中的粗酶液中加入 1 ml 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5), 再加入 0.1 ml红链霉素龙胆二糖苷的甲醇溶液 （浓度为 12 mg/ml)。 lOOrpm, 35 ^e C孵育 4.5小时。 加入 2ml甲醇终止反应， 15000转 /分离心 20 分钟取上清液进行 UPLC分析。 反应液中无红链霉素龙胆二糖苷残留， 并 产生 0.52 mg红链霉素（产率 95%)。

UPLC方法：

色谱柱： Kromasil ODS (2.1x150 mm, 3 μιη)

流动相： 乙腈:水（0→10 min: 20:80→95:5梯度洗脱）

流速： 0.4 ml/min

柱温： 室温

检测波长： 278 nm

实施例 10: 异槲皮苷的水解 在 0.9 ml实施例 1中的粗酶液中加入 1ml 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5)，再加入 0.1 ml异槲皮苷的甲醇溶液（浓度为 7 mg/ml)。 100 rpm, 35°C 孵育 4小时后， 以异槲皮素标准品作对照， TLC分析， 异槲皮苷几乎全部 转化为异槲皮素。

实施例 11: 大豆皂苷的水解

在 0.9 ml实施例 1中的粗酶液中加入 1ml 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5)，再加入 0.1 ml大豆皂苷的甲醇溶液（浓度为 5 mg/ml)。 100 rpm，35°C 孵育 12小时后， 以大豆皂苷苷元标准品作对照， TLC分析， 大豆皂苷几乎 全部转化为其苷元。