La presente invención se refiere al uso de compuestos derivados de 2,2- dióxidos de imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina con propiedades antichagásicas que modifican, o modulan, Ia actividad de Ia cruzipaina, directa o indirectamente, y pueden comportarse como inhibidores de Ia misma, dependiendo de los sustituyentes del sistema heterocíclico. Por tanto, Ia invención se engloba dentro del sector farmacéutico.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Chagas, también llamada Tripanosomiasis Americana es una enfermedad parasitaria causada por un protozoo flagelado llamado Trypanosoma cruzi. Este parásito es transmitido a los huéspedes vertebrados por un insecto hematófago, el Triatoma infestans, conocido como vinchuca o chinche. La enfermedad de Chagas también puede transmitirse a través de transfusiones de sangre, de madres a hijos durante el embarazo, o con menos frecuencia, a través de transplantes de órganos o alimentos contaminados. El parásito se reproduce en los tejidos internos y causa problemas en el corazón, el esófago, el colon y el sistema nervioso.

Esta enfermedad es una endemia parasitaria que afecta a unos 18 millones de personas en Latinoamérica, extendiéndose desde el sur de los Estados Unidos hasta Argentina y Chile. No existe vacuna contra Ia enfermedad de Chagas y las personas afectadas pueden volverse a infectar después de recibir tratamiento farmacológico.

Los dos únicos medicamentos comercializados hasta el momento para el tratamiento de esta enfermedad son el Nifurtimox® (Nfx; (4-([5- nitrofurfuriliden]-amino)-3-metiltiomorfolina-1 ,1 -dióxido) y el Benznidazol® (Bnz, N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida), aunque existen problemas de disponibilidad en algunos países sudamericanos. Si bien, tanto el Nfx como el Bnz, vienen siendo usados en el tratamiento de Ia enfermedad de Chagas desde su introducción en el mercado (en 1965 el Nfx y en 1971 el Bnz), el conocimiento sobre su mecanismo de acción no está completamente esclarecido.

Estos medicamentos presentan grandes inconvenientes, ya que si bien resultan efectivos en Ia forma sanguínea del parásito T. cruzi, tienen baja efectividad en Ia forma intracelular. Asimismo, presentan una elevada toxicidad Io que hace que su utilización sea inadecuada en muchas situaciones como embarazo, insuficiencia hepática y renal. Además, hay que considerar el hecho de Ia capacidad del parásito a desarrollar resistencia a estos fármacos. Es, por tanto, necesario el desarrollo de nuevos fármacos antichagásicos para el tratamiento de Ia enfermedad de Chagas.

Existen diferentes estrategias en Ia búsqueda de nuevos fármacos antichagásicos así como muy diferentes estructuras desde un punto de vista químico que se están estudiando para un mejor tratamiento de Ia enfermedad de Chagas (Cerecetto, H, González, M. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2002, 2(11 ): 1187-1213. Cerecetto H, González M. Mini Rev. Med. Chem. 2008, 8(13), 1355-83)

Una de las líneas de investigación en auge surgida como consecuencia de los estudios sobre Ia bioquímica y metabolismo del Trypanosoma cruzi es Ia que se refiere a los inhibidores de cruzaina. Dicha enzima también conocida como cruzipaina (gp 57/51 ) es una cisteín-proteasa que es responsable de Ia actividad proteolítica y, por tanto, sus inhibidores representan una interesante aproximación para el tratamiento de Ia enfermedad de Chagas (Roush, W. R., Cheng, J., Knapp-Reed, B., Alvarez-Hernandez, A., McKerrow, J. H., Hansell, E. and Engel, J. C. Bioorq Med Chem Lett. 2001 , 11 , 2759-62). Distintas estructuras, tanto de Ia cruzipaina libre como formando complejos con diferentes inhibidores han sido cristalizadas, Io que ha permitido Ia determinación de las correspondientes estructuras tridimensionales por rayos X. (Eakin, A. E., McGrath, M. E., McKerrow, J. H., Fletterick, R. J. and Craik, C. S. J Biol Chem, 1993, 268, 6115-8; Huang, L., Brinen, L. S. and Ellman, J. A.. Bioorq Med Chem. 2003, 11 , 21-9; McGrath, M. E., Eakin, A. E., Engel, J. C, McKerrow, J. H., Craik, C. S. and Fletterick, R. J., J Mol Biol. 1995, 247, 251-9). Los derivados descritos como fármacos antichagásicos son muy variados desde un punto de vista químico e incluyen diversos compuestos heterocíclicos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona derivados de 2,2-dióxido de imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina con propiedades antichagásicas. Es decir, estos compuestos inhiben el crecimiento de Trypanosoma cruzi en forma dosis dependiente con concentraciones inhibitorias (IC50) del orden de 20 micromolar o son capaces de inhibir a Ia cruzipaina. Sobre estos compuestos se realizaron ensayos in vitro donde se estudiaron los efectos de los mismos sobre el crecimiento de Ia forma epimastigota de Ia cepa Tulahuen 2 de Trypanosoma cruzi (ver ejemplos). Para verificar Ia selectividad hacia las células del parásito se estudió Ia citotoxicidad inespecífica de los compuestos más relevantes en células mamíferas, macrófagos murinos J774. Por otra parte, se ensayó Ia capacidad de esta familia de antichagásicos derivados de 2,2-dióxido de imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina de inhibir in vitro a Ia cruzipaina, una cisteína proteasa que está presente en todos los estadios del parásito. De esta forma, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) o un isómero, sal farmacéuticamente aceptable y/o solvato del mismo (a partir de ahora compuestos de Ia invención) para su uso como medicamento o composición farmacéutica,

(i) donde:

Ri y R ₂ , son iguales o distintos, y se seleccionan de Ia lista que comprende hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo, heterociclo, arilo o aralquilo; y R3 se selecciona de Ia lista que comprende, hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo, heterociclo, arilo o aralquilo.

El término "alquilo" se refiere en Ia presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n- hexilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 3 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico arilo, hidroxilo, amino, amido, éster, carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido, que a su vez pueden opcionalmente estar sustituidos.

El término "arilo" se refiere en Ia presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, pudiendo ser de anillo único ó múltiple, en este último caso con anillos separados y/o condensados. Un ejemplo, no limitante, de arilo es un grupo fenilo, naftilo, indenilo, etc.. Preferiblemente el grupo arilo es un fenilo, en donde el grupo fenilo puede contener 1 o más sustituyentes del grupo formado por alquilo, hidroxi, nitro, amino o halógeno. Preferiblemente un halógeno y más preferiblemente sustituido al menos por un átomo de cloro o flúor.

El término "aralquilo" se refiere, en Ia presente invención, a una cadena alifática en el que al menos uno de los hidrógenos se ha sustituido por un grupo arilo, con las acepciones anteriores. Como por ejemplo, pero sin limitarse, un grupo bencilo o fenetilo. Estos grupos aralquilo pueden, a su vez, estar opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo, hidroxi, nitro, amino o halógeno. Preferiblemente un halógeno y más preferiblemente sustituido al menos por un átomo de cloro o flúor.

"Cicloalquilo" se refiere a un radical estable monocíclico o bicíclico de 3 a 10 miembros, que está saturado o parcialmente saturado, y que sólo consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclopentilo, ciclohexilo o adamantilo.

El término "heterociclo" se refiere, en Ia presente invención, a un radical de cadena carbocíclica y que consiste en átomos de carbono y de al menos un heteroátomo con 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno o azufre. Esta cadena carbocíclica puede estar insaturada, saturada o parcialmente saturada. Cuando Ia cadena carbocíclica está saturada, el radical se refiere a un grupo cicloalquilo, tal y como se ha definido anteriormente, con al menos un heteroátomo en su cadena seleccionado de entre nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Un ejemplo de este tipo de grupos, pero sin limitarse, es el tetrahidrofurilo. Cuando Ia cadena esta insaturada o parcialmente saturada se denomina heteroarilo.

El término "heteroarilo" se refiere en Ia presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, pudiendo ser de anillo único ó múltiple, en este último caso con anillos separados y/o condensados, con 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Un ejemplo, no limitante, de heteroarilo es tienilo, furilo, pirrolidinilo, pirazolinilo, piridinilo, piperidinilo o piperazinilo. El grupo heteroarilo, y el grupo heterociclo en general, puede contener 1 o más sustituyentes del grupo formado por alquilo, hidroxi, nitro, amino o halógeno. Preferiblemente un nitro o amina sustituida.

En una realización preferida de los compuestos de Ia invención, Ri y/o R2 son hidrógeno, metilo, bencilo o bencilo sustituido, preferiblemente bencilo sustituido por un halógeno, más preferiblemente por un átomo de flúor o de cloro.

En otra realización preferida de los compuestos de Ia invención, R3 es un fenilo, fenilo sustituido, cicloalquilo (Cs-Cβ), bencilo, bencilo sustituido, fenetilo, fenetilo sustituido, alquilo (C ₁ -C ₃ ) o un heterociclo. El grupo fenilo bencilo o fenetilo sustituido, está preferiblemente sustituido por un halógeno, más preferiblemente por un átomo de flúor o de cloro. El heterociclo es preferiblemente piridilo, tienilo, furilo o tetrahidrofurilo.

En una realización más preferida del uso de los compuestos de Ia invención, estos compuestos se seleccionan de Ia lista que comprende:

2,2-dióxido de 4-amino-6-bencil-1/-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(5-nitro-2-furil)-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-piridil)-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(2-fluorofenil)-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-tienil)-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina, 2,2-dióxido de 4-amino-6-(4-dimetilaminofenil)-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclopentil-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclohexil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-tetrahidrofuril)-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-etil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-fenetil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1-(4-clorobencil)-6-(2-fluorofenil)-5/-/- imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-fenil-1-metil-5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1-metil-6-(3-tienil)-5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5-dibencil-6-fenilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5-dibencil-6-ciclohexilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclohexil-1 -(4-clorobencil)-5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5-bis(4-clorobencil)-6-ciclohexilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 -(4-clorobencil)-6-(2-fluorofenil)-5-(2- naftil)imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-fenil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-metil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1-bencil-6-fenil-5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 -bencil-5-(4-clorobencil)-6-fenilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina ó 2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclohexil-5-(4-clorobencil)-1- bencilimidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a los compuestos de Ia fórmula general (I) para su uso en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades parasitarias, en general, de enfermedades producidas por parásitos del género Trypanosoma, como por ejemplo Ia enfermedad de Chagas, y en particular, enfermedades asociadas con Ia actividad de Ia cruzipaina y/o susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los productos descritos en Ia presente invención, o bien de una sal, derivado, profármacos o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo.

Los compuestos de Ia presente invención representados por Ia fórmula (I) pueden incluir isómeros, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de Ia presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de Ia presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.

Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en Ia elaboración de un medicamento, como derivados farmacéuticamente no aceptables ya que éstos pueden ser útiles en Ia preparación de derivados farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del derivado farmacéuticamente aceptable no es crítica, siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable.

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos de fórmula (I). El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, esteres, incluyendo esteres de ácidos carboxílicos, esteres de aminoácidos, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de fórmula (I) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta Ia biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia Ia liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia.

Los compuestos de Ia invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de Ia presente invención. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en Ia elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en Ia preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en Ia materia.

Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.

Los compuestos de Ia presente invención de formula (I) pueden ser obtenidos o producidos mediante una vía sintética química u obtenidos a partir de una materia natural de distinto origen.

En una realización preferida de Ia presente invención el procedimiento de obtención de los compuestos de Ia invención de fórmula (I) o un isómero, sal farmacéuticamente aceptable y/o solvato del mismo, comprende los siguientes pasos de reacción, según el esquema 1 :

Esquema 1

La ruta sintética descrita en el esquema 1 comprende diferentes etapas: La preparación de los derivados N-1H, N-5H de formula general IV consiste en Ia reacción del 1 ,1 -dióxido de 3,4,5-triamino-2/-/-1 ,2,6-tiadiazina de fórmula (II) con aldehidos de fórmula general (III), donde R3 está descrito anteriormente.

El 1 ,1 -dióxido de 3,4,5-triamino-2/-/-1 ,2,6-tiadiazina fue preparado, según un procedimiento descrito en dos etapas de reacción, a partir del 1 ,1- dióxido de 3,5-diamino-4/-/-1 ,2,6-tiadiazina (Ochoa, C. and Stud, M., 1978, J. Heterocvcl. Chem.. 15, 221-224).

La preparación de los derivados N-1 sustituidos de fórmula general (Vl) consiste en Ia reacción del 2,2-dióxido de 4-amino-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina de estructura (IV) con haluros de fórmula general (V), en donde Ri está descrito anteriormente.

Finalmente, Ia preparación de los derivados N-1 , N-5 disustituidos puede realizarse mediante dos procedimientos distintos.

El primero consiste en Ia reacción de los derivados de 2,2-dióxido de 4- amino-1/-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina de fórmula general (IV) con haluros de fórmula general (V), para dar los compuestos de fórmula general (VII), donde R2 es igual a Ri en el compuesto de fórmula general (I) y Ri y R3 están definidos anteriormente.

El segundo procedimiento consiste en Ia preparación de compuestos de fórmula general (I) a partir de los derivados N-1 sustituidos de fórmula general (Vl), por reacción con los correspondientes haluros de fórmula general (VIII), donde Ri, R2 y R3 están definidos anteriormente.

Otro aspecto más de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades parasitarias, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, que comprende un compuesto, en cantidad terapéuticamente efectiva, de fórmula (I), o mezclas de los mismos, una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para Ia administración a un paciente.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia y utilizados habitualmente en Ia elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar Ia acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo Ia edad, estado del paciente, Ia severidad de Ia alteración o trastorno, y de Ia ruta y frecuencia de administración.

Los compuestos descritos en Ia presente invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de Ia misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a Ia de Ia composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida. En una realización particular, Ia administración de Ia composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.).

El uso de los compuestos de Ia invención es compatible con su uso en protocolos en que los compuestos de Ia fórmula (I), o sus mezclas se usan por sí mismos o en combinaciones con otros tratamientos o cualquier procedimiento médico.

Otro aspecto más de Ia presente invención se refiere a los compuestos de fórmula:

2,2-dióxido de 4-amino-6-bencil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(2-fluorofenil)-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-tienil)-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-piridil)-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-(4-dimetilaminofenil)-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclopentil-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclohexil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina, 2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-tetrahidrofuril)-1H,5H-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-etil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-fenetil-1 /-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1-(4-clorobencil)-6-(2-fluorofenil)-5/-/- imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-fenil-1-metil-5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1-metil-6-(3-tienil)-5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5-dibencil-6-fenilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5-dibencil-6-ciclohexilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-6-ciclohexil-1 -(4-clorobencil)-5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina

2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5-bis(4-clorobencil)-6-ciclohexilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina,

2,2-dióxido de 4-amino-1 -bencil-5-(4-clorobencil)-6-fenilimidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina ó

2,2-dióxido de 4-amino-1-bencil-6-ciclohexil-5-(4- clorobencil)imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

EJEMPLOS A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los compuestos de Ia invención.

EJEMPLO 1. Procedimiento general de obtención de 2,2-dióxidos de 4- amino-1H,5H-imidazo[4,5-c][1,2,6]tiadiazina

A una suspensión de 1 ,1 -dióxido de 3,4,5-triamino-2/-/-1 ,2,6-tiadiazina en agua ligeramente acida (HAc glacial) se adicionó, bajo agitación y en pequeñas fracciones, el aldehido correspondiente. Transcurrido el tiempo de reacción, el sólido formado se filtró a vacío, se lavó con el disolvente apropiado y se purificó por recristalización. Los tiempos de reacción, así como las condiciones y tratamientos específicos se describen a nivel individual para cada compuesto.

Ejemplo 1a.- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-6- ciclohexil-1/-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 1 ,500 g (8,5 mmol) de 1 ,1-dióxido de 3,4,5-triamino-2/-/-1 ,2,6-tiadiazina, 3,2 mi (25,5 mmol) de ciclohexanocarboxaldehido, 30 mi de H ₂ O y 4 mi de ácido acético glacial. Tiempo de Reacción: 24 h. Lavado con EtOH. Recristalizado de EtOH/H ₂ O Rendimiento: 1 ,047 g (46 %) P.f. = 263 - 265 ⁰ C. ¹ H-RMN (400 MHz, DMSO-de) δ: 11 ,82, 11 ,00 (sa, 2H, NH); 7,42 (sa, 2H, NH ₂ ); 2,67 (sa, 1 H, 1 ^' -H); 1 ,94 - 1 ,18 (m, 1OH, 2 ^' -H / 3 ^' -H / 4 ^' -H). ¹³ C-RMN (100 MHz, DMSO-de) δ: 155,8 (C-4); 152,9 (C-7a); 150,4 (C-6); 101 ,2 (C-4a); 37,2 (C- 1 ^' ); 30,9 (2C, C-2 ^' ); 25,4, 25,2 (3C, C-3 ^' / C-4 ^' ). Anal. (Ci ₀ Hi ₅ N ₅ O ₂ S) % teórico (% experimental) C: 44,60 (44,33); H: 5,61 (5,54); N: 26,00 (26,24); S: 11 ,91 (11 ,82). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 270 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 5:95, t.r. 5,80 min., 97 %.

Ejemplo 1 b.- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-6-(3- tetrahidrofuril)-1/-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 0,300 g (1 ,69 mmol) de 1 ,1-dióxido de 3,4,5-triamino-2/-/-1 ,2,6-tiadiazina, 0,49 mi (2,54 mmol) de tetrahidrofuran-3-carboxaldehido, 30 mi de H ₂ O y 2 mi de ácido acético glacial. Transcurrido el tiempo de reacción Ia mezcla se llevó a sequedad y el sólido obtenido se lavó con hexano y se filtró a vacío. Tiempo de Reacción: 48 h. Lavado con Hexano. Recristalizado de EtOH. Rendimiento: 0,181 g (41 ,2%) P.f. = 238 - 240 ⁰ C. ¹ H-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ: 11 ,97, 11 ,00 (sa, 2H, NH); 7,63 - 7,22 (sa, 2H, NH ₂ ); 3,98 - 3,74 (m, 4H, 2 ^' -H / 4 ^' -H); 3,54 - 3,45 (sa, 1 H, 1 ^' -H); 2,30 - 2,23 (m, 1 H, 5 _a ^' -H); 2,12 - 2,05 (m, 1 H, 5 _b ^' -H). ¹³ C-RMN (125 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 152,9 (2C, C-4 / C-7a); 150,3 (C-6); 101 ,9 (C-4a); 71 ,2 (C-2 ^' ); 67,4 (C-4 ^' ); 38,3 (C-T); 31 ,3 (C-5 ^' ). Anal. (C ₈ HnN ₅ O ₃ S) % teórico (% experimental) C: 37,35 (37,24); H: 4,31 (4,29); N: 27,22 (27,05); S: 12,46 (12,21 ). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 258 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 5:95, t.r. 1 ,20 / 1 ,63 min. (1 ,6: 1 ), 100 % pureza; MeCN/H ₂ O 1 :99, t.r. 1 ,23 / 2,42 min. (1 ,6: 1 ), 100 %.

Ejemplo 1c- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-6-fenetil- 1/-/,5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 0,300 g (1 ,69 mmol) de 1 ,1-dióxido de 3,4,5-triamino-2/-/-1 ,2,6-tiadiazina, 0,34 mi (2,54 mmol) de 3- fenilpropionaldeido, 12 mi de H ₂ O y 2 mi de ácido acético glacial. Transcurrido el tiempo de reacción se filtró a vacío el bruto de reacción y se lavó con hexano. Tiempo de Reacción: 24 h. Lavado con Hexano. Recristalizado de EtOH/H ₂ O. Rendimiento: 0,369 g (74,9%) P.f. = 190 - 192 ⁰ C. ¹ H-RMN (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 12,09, 11 ,96, 11 ,03 (sa, 2H, NH); 7,81 , 7,66 (sa, 2H, NH ₂ ); 7,27 - 7,17 (m, 5H, Ph); 2,99, 2,96 (2s, 4H, CH ₂ CH ₂ ). ¹³ C-RMN (125 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 154,2 (C-7a); 152,7 (C-4); 150,5 (C-6); 140,5 (C-T); 128,5 (2C, C-3 ^' ); 128,3 (2C, C-2 ^' ); 126,2 (C-4 ^' ); 101 ,5 (C-4a); 32,9 (CH ₂ CH ₂ Ph); 29,9 (CH ₂ CH ₂ Ph). Anal. (Ci ₂ Hi ₃ N ₅ O ₂ S) % teórico (% experimental) C: 49,47 (49,38); H: 4,50 (4,38); N: 24,04 (23,89); S: 11 ,01 (10,85). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 292 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 5:95, t.r. 6,72 min., 98 %. Ejemplo 2.- Procedimiento general de obtención de 2,2-dióxidos de 4- amino-5H-imidazo[4,5-c][1,2,6]tiadiazina N-1 sustituidos.

Una suspensión del N(H) derivado en acetona y en presencia de trietilamina o carbonato potásico se calentó bajo agitación y una vez alcanzado el reflujo se añadió una cantidad catalítica de ioduro potásico y el agente alquilante correspondiente. Tras observarse Ia completa desaparición del N(H) derivado de partida, se eliminó el disolvente a vacío y Ia mezcla obtenida se trató en cada caso para su purificación. Las condiciones, disolventes y medios específicos son detallados a nivel individual para cada compuesto.

Ejemplo 2a.- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-1-(4- clorobencil)-6-(2-fluorofenil)-5H-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 0,500 g (1 ,78 mmol) de 2,2-dióxido de 4-amino-6-(2-fluorofenil)-1/-/,5/-/- imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina MH, 5H, 0,740 g (3,56 mmol) de bromuro de bencilo, 100 mi de acetona y 1 mi (7,12 mmol) de trietilamina. Transcurrido el tiempo de reacción, se eliminó el disolvente a vacío y Ia mezcla obtenida se recristalizó con una mezcla acetona/H ₂ O. Tiempo de Reacción: 5 días. Recristalizado de mezcla: acetona/H ₂ O. Rendimiento: 0,158 g (39 %) P.f. = 304 - 305 ⁰ C. ¹ H-RMN (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 12,47 (sa, 1 H, NH); 8,21 , 7,96 (sa, 2H, NH ₂ ); 8,10 (t, 1 H, 6 ^' -H, J = 7,0); 7,58 - 7,37 (m, o-FPh / p- CIPh); 5,02 (s, 2H, CH ₂ ). ¹³ C-RMN (125 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 159,1 (d, C-2\ J = 250,0); 152,4 (C-4); 150,7 (C-7a); 143,4 (C-6); 136,5 (C-1 ^" ); 132,4 (d, C- 4 ^' , J = 8,2); 132,0 (C-4 ^" ); 129,8 (2C, C-2 ^" ó C-3 ^" ) 129,8 (d, C-6 ^' , J = 6,4); 128,2 (2C, C-2 ^" ó C-3 ^" ); 125,4 (C-5 ^' ); 116,5 (d, C-3 ^' , J = 22,0); 116,2 (d, C-Y, J = 11 ,9); 103,7 (C-4a). Anal. (Ci ₇ Hi ₃ CIFN ₅ O ₂ S ₂ ) % teórico (% experimental) C: 50,31 (50,30); H: 3,23 (3,35); N: 17,26 (17,05); S: 7,90 (7,65). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 354 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 5:95, t.r. 13,90 min., 100 %. Ejemplo 2b.- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-1-metil-6- (3-tienil)-5/-/-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 0,300 g (1 ,11 mmol) de 2,2-dióxido de 4-amino-6-(3-tienil)-5H-imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina, 0,7 mi (11 ,1 mmol) de ioduro de metilo, 40 mi de acetona y 0,30 mi (2,22 mmol) de trietilamina. Transcurrido el tiempo de reacción se eliminó el disolvente a vacío y se añadió H ₂ O acida. El precipitado obtenido se filtró a vacío y se purificó por cromatografía en columna empleando como eluyente CH ₂ CI ₂ :Me0H (100:1 ). Tiempo de Reacción: 4 días. Rendimiento: 0,197 g (63 %). P.f. = 305 - 308 ⁰ C. ¹ H-RMN (400 MHz; DMSO-d ₆ ) δ: 13,04 (sa, 1 H, NH); 8,00 - 7,20 (sa, 2H, NH ₂ ); 8,04 (dd, 2 ^' -H, J _{2 -H} , ₅ -- _H = 1 ,2 / J ₂ -M, ₄ - _H = 2,9); 7,70 (dd, 4 ^' -H, J _{2 -H} , _{4 -H} = 2,9 / J _{4 -H} , ₅ --H = 5,0); 7,55 (dd, 5 ^' -H, J _{2 -H} , ₅ -H = 1 ,2 / J _{4 -H} , 5 -H = 5,0). ¹³ C-RMN (100 MHz; DMSO-d ₆ ) δ: 153,7 (C-4); 149,4 (C-7a); 143,9 (C-6); 131 ,0 (C-1 ^' ); 128,6 (C-4 ^' ); 125,7 (C-5 ^' ); 125,5 (C-2 ^' ); 104,2 (C-4a). Anal. (C ₉ H ₉ N ₅ O ₂ S ₂ ) % teórico (% experimental) C: 38,15 (38,39); H: 3,20 (2,90); N: 24,72 (25,28); S: 22,63 (23,02). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 284 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 5:95, t.r. 9,42 min., 100 %.

Ejemplo 3.- Preparación de 2,2-dióxidos de 4-aminoimidazo[4,5- c][1,2,6]tiadiazina sustituidos en N-1 y N-5

Método A: A partir de 2,2-dióxidos de 4-amino-1H,5H-imidazo[4,5- c][1,2,6]tiadiazina

Una suspensión del N(H) derivado en acetona y carbonato potásico se calentó bajo agitación y una vez alcanzado el reflujo se añadió una cantidad catalítica de ioduro potásico y el haluro de alquilo correspondiente. Tras observarse Ia completa desaparición del N(H) derivado de partida, se eliminó el disolvente a vacío. Una vez eliminadas las sales en medio acuoso ácido, el bruto de reacción fue purificado por cromatografía de columna. Obtención de mezcla de productos mono N1-R y disustituidos N1- R / N5-R. Ejemplo 3a.- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-1 ,5- dibencil-6-fenilimidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 0,600 g (2,28 mmol) de 2,2-dióxido de 4-amino-6-fenil-1/-/,5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina, 0,98 mi (7,98 mmol) de bromuro de bencilo, 50 mi de acetona y 0,398 g (2,85 mmol) de carbonato potásico. El bruto obtenido se purificó por cromatografía en columna compactada CH2CI2 y empleando como eluyente Ia mezcla CH ₂ CI ₂ :MeOH (100:1 ). Tiempo de Reacción: 5 días. Rendimiento: 0.075g (8%)

P.f. = 238 - 240 ⁰ C. ¹ H-RMN (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 8,0 - 7,0 (sa, 2H, NH ₂ ); 7,63 - 7,60 (m, 2H, Ph); 7,54 - 7,50 (m, 3H, Ph); 7,39 - 7,20 (m, 10H, NI-Bn / N5-Bn); 5,53 (s, 2H, NS-CH ₂ Ph); 5,02 (s, 2H, NI-CH ₂ Ph). ¹³ C- RMN (75 MHz, CDCI ₃ ) δ: 153,7 (C-4); 152,8 (C-7a); 152,1 (C-6); 137,4 (C- 1 ^" ó C-1 ^{' "} ); 136,2 (C-1 ^" ó C-1 ^{' "} ); 130,9 (C-T); 129,6, 129,2, 129,1 , 128,5, 128,4, 128,2, 127,9, 127,5 (11C, Ph / NI-Bn / N5-Bn); 125,9 (C-2 ^' ); 105,0 (C-4a). Anal. (C ₂₄ H ₂₁ N ₅ O ₂ S) % teórico (% experimental) C: 64,99 (64,79); H: 4,77 (4,56); N: 15,79 (15,61 ); S: 7,23 (6,98). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 444 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 20:80, t.r. 12,63 min., 100 %.

Método B: A partir de 2,2-dióxidos de 4-amino-5H-imidazo[4,5- c][1,2,6]tiadiazina N-1 sustituidos.

Una suspensión del N(H) derivado en acetona y en presencia de carbonato potásico se calentó bajo agitación y una vez alcanzado el reflujo se añadió una cantidad catalítica de ioduro potásico y el agente alquilante correspondiente. Tras observarse Ia completa desaparición del N(H) derivado de partida, se eliminó el disolvente a vacío y Ia mezcla obtenida es trató en cada caso para su purificación. Las condiciones, disolventes y medios específicos son detallados a nivel individual para cada compuesto.

Ejemplo 3b.- Preparación y obtención de 2,2-dióxido de 4-amino-1-bencil-5- (4-clorobencil)-6-fenilimidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina. A partir de 0,200 g (0,57 mmol) de 2,2-dióxido de 4-amino-1-bencil-6-fenil-5/-/-imidazo[4,5- c][1 ,2,6]tiadiazina, 0,191 g (1 ,13 mmol) de bromuro de p-clorobencilo, 40 mi de acetona y 0,157 g (1 ,13 mmol) de carbonato potásico. El producto se purificó por cromatografía en columna compactada CH ₂ CI ₂ y empleando como eluyente Ia mezcla CH ₂ CI ₂ :Me0H (200:1 ). Tiempo de Reacción: 5 días. Rendimiento: 0.035g (13%).

P.f. = 245 - 247 ⁰ C. ¹ H-RMN (500 MHz, CDCI ₃ ) δ: 7,63 - 7,18 (m, 14H _arom ); 5,24 (s, 2H, NI-CH ₂ Ph); 4,90 (s, 2H, NS-CH ₂ -(P-CIPh)). ¹³ C-RMN (125 MHz, CDCI ₃ ) δ: 154,3 (C-4); 153,5 (C-7a); 152,0 (C-6); 136,6 (C-1 ^" ó C- 1 ^{' "} ); 135,5 (C-1 ^" ó C-1 ^{' "} ); 133,5 (C-4 ^'" ); 131 ,2 (C-1 ^' ); 130,6 (2C _arom ); 129,1 (2C _arom ), 129,0 (2C _arom ), 129,0 (2C _arom ), 128,4 (2C _arom ), 127,7 (2C _arom ), 126,8 (2C _arom ); 105,4 (C-4a); 49,6 (CH ₂ Ph); 47,8 (CH ₂ -(P-CIPh)). Anal. (C ₂₄ H ₂ IN ₅ O ₂ S) % teórico (% experimental) C: 60,31 (); H: 4,22 (); N: 14,65 (); S: 6,71 (). EM (ES ⁺ ) m/z (int. reí.): 478 (100%) [M+H]. HPLC: MeCN/H ₂ O 20:80, t.r. 13,58 min., 94 %.

EJEMPLO 4

Los estudios de Ia actividad antichagásica fueron realizados in vitro contra Trypanosoma cruzi, sobre Ia forma epimastigota de las cepas Tulahuen 2, (de Ia colección de cepas del Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, del Instituto de Química Biológica de Ia Facultad de Ciencias, Universidad de Ia República Oriental del Uruguay, Uruguay). Dichas cepas se cultivaron a 28 ⁰ C en un medio axénico (BHI-triptosa), complementado con 5% de suero fetal bovino. Se partió de células de un cultivo de 5-7 días (fase exponencial) que se inocularon con 50 mL de medio de cultivo fresco dando una concentración inicial de 1x10 ⁶ células/mL. El crecimiento del parásito fue seguido durante 11 días por medidas de absorbancia del cultivo a 600 nm, proporcional al número de células presentes.

Previo a Ia inoculación, se incorporó al medio una cantidad preestablecida de cada compuesto de Ia invención a ensayar, disuelto en DMSO (dimetilsulfóxido). La concentración final de DMSO en el medio de cultivo nunca excedió el 0.4%, utilizando un blanco (ausencia de producto o compuesto de Ia invención) con 0.4% de DMSO. Los compuestos se incorporaron al medio de cultivo a una concentración final de 25μM y para aquellos que resultaron más activos se disminuyó Ia dosis progresivamente hasta 1nM. El porcentaje de inhibición (Pl) de crecimiento del parásito se evaluó en comparación con el blanco, utilizando Nfx (Nifurtimox) como fármaco de referencia tripanosomicida. El Pl de crecimiento se calculó de Ia siguiente manera:

Pl= {1 - [( Ap-A _O p )/ ( A _c -A _oc )]}x100

donde: A _p =A ₆ oonm del cultivo conteniendo el producto en el día 5.

A ₀ p=A ₆ oonm del cultivo conteniendo el producto justo después de Ia adición al cultivo (día 0). Ac=A ₆ oonm del blanco en el día 5. A ₀ C=A ₆ OOrIm del blanco al día 0.

La A ₆ oonm tomada al día 5 corresponde a Ia fase exponencial tardía en Ia curva de crecimiento del cultivo.

La determinación de Ia IC ₅₀ (concentración inhibitoria del 50%) se realizó siguiendo el crecimiento del parásito en ausencia (control) y presencia de concentraciones crecientes de los correspondientes productos. Se midió Ia absorbancia al día 5 y se relacionó con el control. La IC50 (concentración inhibitoria 50) se define como Ia concentración de producto requerida para dar un Pl del 50%, cuanto más bajo es este valor, mayor es Ia potencia de los compuestos.

En Ia Tabla 1 se presentan, como ejemplos, los datos de IC ₅₀ de algunos de los derivados de 2,2-dióxido de imidazo[4,5-c][1 ,2,6]tiadiazina reivindicados en Ia presente invención. Se incluye el Nifurtimox y el Benznidazol como fármacos de referencia. Los compuestos presentan una excelente actividad tripanosomicida in vitro. Siendo Ia potencia, en algunos casos, superior a Ia de los fármacos de referencia.

Tabla 1.- Estructuras y Actividad Anti-T. cruzi de Ia forma epimastigota de Ia cepa Tulahuen 2

^a El ensayo se lleva a cabo por duplicado con un error de ± 3%.

La citotoxicidad inespecífica frente a macrófagos murinos J774 se ensayó en los productos que presentaron un porcentaje de inhibición del crecimiento, de Ia forma epimastigota de T. cruzi de Ia cepa Tulahuen 2, mayor al 50 % a 25 μM al día 5 del estudio. Para ello, se cultivaron macrófagos murinos en atmósfera de CO2 al 5% y 95% de aire a 37 ⁰ C durante 48 horas con los productos a ensayar disueltos en DMSO a tres concentraciones 100, 200 y 400 μM. La viabilidad celular se determinó en base a Ia conservación de Ia actividad mitocondrial por el método del MTT/formazan. En este ensayo se incluyeron Nifurtimox, Ketoconazol y Terbinafine como fármacos de referencias. En Ia tabla 2 se muestran a modo de ejemplo algunos resultados.

Tabla 2. Evaluación biológica de citotoxicidad inespecífica en macrófagos murinos J774.

^a Porcentaje de citotoxicidad inespecífica frente a macrófagos murinos J774. Concentración de compuesto ensayado. ⁰ ICsO concentración de compuesto que reduce el crecimiento de macrófagos en un 50 %. Los resultados son el promedio de dos evaluaciones independientes con un error menor al 3%. Se observa claramente que los derivados reivindicados en Ia presente invención poseen una selectividad hacia las células del parásito del orden o mejor que los compuestos de referencia.

Por otra parte se determinó Ia capacidad de inhibir Ia actividad de Ia enzima cruzipaína con el fin de estudiar un posible mecanismo de acción de los compuestos más activos. La capacidad de inhibir Ia enzima cruzipaína se realizó según el protocolo que se detalla a continuación: se incubó cruzipaína (10 μl_) con una mezcla de reacción que contenía una concentración final de 50 mM de solución tampón Tris-HCI, pH 7.6, 10 mM β- mercaptoetanol y 25, 50 ó 100 μM del inhibidor durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó el sustrato cromogénico Bz-Pro-Phe-Arg-p-NA, a una concentración final de 150 μM, y se siguió el incremento de absorbancia a 410 nm por 5 min a temperatura en un espectrofotómetro Beckman DU 650. Los inhibidores se adicionaron disueltos en DMSO y los controles (100% de actividad enzimática) contenían Ia misma concentración de disolvente. El volumen final del ensayo es 100 μL. Los valores representaron al menos tres ensayos independientes. A modo de ejemplo se muestran los datos obtenidos para algunos de los derivados en Ia tabla 3.

Tabla 3. Resultados de inhibición de cruzipaina.

De este estudio se demuestra que uno de las posibles mecanismos de acción a través del cual actúan los compuestos de Ia invención como antichagásicos sea Ia inhibición de Ia enzima cruzipaína ya que esta es inhibida en forma dosis dependiente.