B e s c h r e i b u n g

Die Bildung neuer Blutkapillaren (Angiogenese) läuft in einer geordneten Folge von Schritten ab: an einem Punkt, an dem ein neuer Gefäßsproß auszuwachsen beginnt (meist im Bereich post- kapillärer Venulen), bauen Endothelzellen lokal die Basalmem- bran ab, wandern in Richtung auf die Quelle eines die Angio¬ genese stimulierenden Faktors, wachsen und teilen sich, bil¬ den ein Gefäßlumen und treffen auf andere Gefäßsprosse oder bestehende Kapillaren, so daß ein neuer Kapillarabschnitt entsteht, der sich schließlich mit einer neu gebildeten Ba- salmembran umgibt.

Bei erwachsenen Individuen ist im Normalfall die angiogeneti- sche Aktivität fast vollständig gehemmt. Lediglich bei der Wundheilung und beim weiblichen Geschlecht im Zusammenhang mit dem ovariellen Zyklus laufen intensivere Angiogenese- Vorgänge ab. Im allgemeinen ist jedoch die Umsatzrate der Endothelzellen im Organismus gering. Die vollständige Er¬ neuerung einer bestehenden Endothelzellen-Population dauert Jahre, wobei jedoch ausgeprägte organ- und gewebespezifische Unterschiede vorkommen (Folkman, Medicine 29 (1985), 10-36).

Die strenge Kontrolle, unter der die Angiogenese normalerwei¬ se steht, ist beim Wachstum von soliden Tumoren aufgehoben. Für das Wachstum von Tumoren bei einem Durchmesser von über 1 bis 2 mm ist eine starke Angiogenese absolut erforderlich. Avaskuläre Tumoren bleiben nämlich durch die beschränkte Diffusion bei der Zufuhr von Gasen und Nährstoffen und bei der Entfernung von Abfallstoffen auf eine sehr geringe Größe beschränkt. Die mangelnde Fähigkeit von festen Tumoren, in Abwesenheit einer erfolgreichen Induktion der Angiogenese auf eine klinisch signifikante Größe zu wachsen oder Metastasen zu bilden, hat ein großes Interesse bei der Erforschung von Verbindungen hervorgerufen, welche die Angiogenese inhibie¬ ren.

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Die gewerbliche Anwendbarkeit solcher Inhibitoren liegt bei der Hemmung des Tumorwachstums im allgemeinen, insbesondere bei der Hemmung von auf Endothelzellen basierenden Tumoren wie Kaposi-Sarkom und Hämangiomen. Darüber hinaus ist auch eine therapeutische Anwendbarkeit bei sonstigen Krankheiten gegeben, die auf einem übermäßigen Kapillarwachstum beruhen. Insbesondere zu nennen sind hierbei die diabetische Retinopa- thie und retrolentale Fibroplasie, beides Augenerkrankungen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit besteht bei der Wundbe¬ handlung, wobei ein Inhibitor der Angiogenese zur Regelung der Wundheilung eingesetzt werden kann, d.h. bei der Verzöge¬ rung der Neubildung von Blutgefäßen. Weiterhin besteht auch die Möglichkeit, einen Angiogenese-Inhibitor im Rahmen der Behandlung der rheumatoiden Arthritis einzusetzen. Bei dieser Erkrankung wird eine Vaskularisierung der Knorpel (wie gene¬ rell bei jeder Entzündung in diesem Bereich) beobachtet, die mit einem Angiogenese-Inhibitor unterdrückt werden könnte.

Es wurde aus avaskulären Geweben eine Reihe von die Angioge¬ nese hemmenden Extrakten hergestellt (siehe D'Amore und Braunhut, in Endothelial Cells, Vol. II, herausgegeben von U.S. Ryan, CRC Press, Boca Raton, Florida, 13-37). Auch ent¬ zündungshemmende Wirkstoffe unterdrücken die Angiogenese (Robin et al., Arch. Ophthamol. 103 (1985), 284-287; Polverini und Novak, Biochem. Biophys. Res. Comm. 140 (1986) , 901-907) , wie z.B. Protamin (Taylor und Folk an, Nature 297 (1982), 307-312), angiostatisc e Steroide (Cru et al., Science 230 (1985) , 1375-1378) , ein plazentaler RNAse-Inhibi- tor (Shapiro und Vallee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) , 2238-2241) und eine Reihe von Verbindungen, welche die Matrixsynthese und Beständigkeit beeinflussen (siehe z.B. Ingber und Folkman, Lab. Invest. 59 (1988), 44-51). Bei eini¬ gen dieser Inhibitoren wurde eine Hemmung des Tumorwachstums oder eine Rückbildung in vivo festgestellt, jedoch nicht bei allen Tumoren. Weiterhin bleibt auch die Toxizität dieser Angiogenese-Inhibitoren ein Problem.

Von Rastinejad et al. (Cell 56 (1989), 345-355) wurde ein Angiogenese-Inhibitor in einem Medium mit Hamsterzellen und Hamster-menschlichen Hybridzellen gefunden, der die Neovasku- larisation in vivo unterdrückt. Bei dieser Verbindung handelt es sich offenbar um ein Glykoprotein mit 140 kDa Molekularge¬ wicht. Allerdings zeigt dieser Inhibitor nur eine geringe Stabilität, insbesondere ist er nicht hitzestabil.

Die DE 40 06 609 offenbart ein Protein, das als Inhibitor der Proliferation von Endothelzellen wirkt, erhältlich aus Baby- hamster-Kidney-Zellen, das bei Gelfiltration unter nativen Bedingungen ein Molekulargewicht von ca. 60 bis 100 kDa be¬ sitzt und eine größere Hitzestabilität zeigt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, weitere Angiogene- se-Inhibitoren bereitzustellen, die als Alternative und Er¬ gänzung von bereits bekannten Inhibitoren therapeutisch ein¬ gesetzt werden können.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Anreicherung von Inhibitoren der Proliferation von Endo¬ thelzellen aus dem Gewebe von Wirbeltieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) das als Ausgangs aterial gewählte Gewebe homogenisiert und anschließend zentrifugiert,

(b) den Gewebeextrakt auf einen Kationenaustauscher gibt und die an den Kationenaustauscher bindenden Substanzen einer Fraktionierung unterwirft,

(c) die aktiven Fraktionen aus Schritt (b) gelfiltrations- chro atographisch auftrennt, und

(d) die aktiven Fraktionen aus Schritt (c) über HPLC-Reverse Phase reinigt.

Das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren gewählte Gewebe von Wirbeltieren kann sowohl embryonalen als auch adulten Ursprungs sein. Vorzugsweise verwendet man em-

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bryonales Gewebe aus Vögeln oder Säugern, besonders bevorzugt Gewebe aus Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial. Weiterhin ist es bevorzugt, adultes Hirngewebe aus Vögeln oder Säugern, insbesondere adultes Rinderhirn als Ausgangsmaterial zu ver¬ wenden. Es soll jedoch darauf hingewiesen werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch auf menschliches Gewebe (so¬ wohl embryonalen als auch adulten Ursprungs) übertragbar ist.

Verwendet man Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren, so lassen sich dadurch zwei Sub¬ stanzen anreichern, die als Inhibitor der Proliferation von Endothelzellen wirksam sind. Diese beiden Substanzen werden als EMBIN .1 und ANEMIN bezeichnet. Verwendet man adultes Rinderhirn als Ausgangsmaterial, so erhält man bei analoger Durchführung des Anreicherungsverfahrens ebenfalls zwei inhi¬ bitorisch wirksame Substanzen, die in ihrem biochemischen Charakter und ihrem Molekulargewicht nach SDS-Gelelektropho- rese den beiden Inhibitoren aus Hühnerembryonen entsprechen. Es konnte bisher noch nicht geklärt werden, ob die Substanzen aus den verschiedenen Ausgangsmaterialien miteinander iden¬ tisch sind, oder ob sie nur sehr nahe chemisch miteinander verwandt sind. Es soll jedoch klargestellt werden, daß diese Substanzen bzw. deren jeweilige speziesspezifische Analoga auch, aus anderen Wirbeltieren, insbesondere Vögeln und Säu¬ gern erhältlich sind.

Der als EMBIN I bezeichnete Inhibitor der Proliferation von Endothelzellen, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, zeichnet sich dadurch aus, daß er bei Gel¬ elektrophorese im SDS-Polyacryla idgel eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 2,5 bis 6,2 kDa ergibt.

EMBIN I zeigt auch nach einer 60-minütigen Inkubation bei 90*C eine unverminderte Inhibition der Endothelzell-Prolife-

ration. Somit erweist sich EMBIN I als eine sehr hitzeresi- stente Verbindung, wenn man zugrundelegt, daß nur sehr wenige Proteine eine derartige Behandlung unter Beibehaltung ihrer Aktivität überstehen können.

Weiterhin wurde festgestellt, daß EMBIN I gegen eine Reihe von verschiedenen Proteasen resistent ist. Dabei wurden fol¬ gende Proteasen getestet: Trypsin, S. aureus V8 Protease, Clostripain, Thermolysin, Subtilisin, Pronase E, Proteinase K, Carboxypeptidase Y, Papain, Pepsin (Sigma) , Chy otrypsin, •Pyroglutamat-Aminopeptidase, Endoproteinase Arg-C, Endopro- teinase Lys-C (Boehringer Mannheim) , Prolin spezifische Endo- peptidase (Seikagaku Kogyo, Japan) . Bei diesen Versuchen wurden die getesteten Proteasen in den jeweils für sie erfor¬ derlichen Puffern gelöst und mit einem Aliquot von EMBIN I unter den für das betreffende Enzym vom Hersteller angegebe¬ nen Bedingungen inkubiert. In keinem der Experimente ergab sich eine Veränderung der inhibitorischen Aktivität oder des Wanderungsverhaltens von EMBIN I im Gel.

Um die Möglichkeit zu überprüfen, ob EMBIN I als ein mit Nukleinsäuremolekülen assoziiertes Peptid vorliegt, was z.B. für den Angiogenesefaktor "Angiotropin" zutrifft (Wissler et al., Protides Bio.Fluids. 34 (1986), 525-536), wurde EMBIN I sowohl mit DNAse als auch mit RNAse inkubiert. Es wurde keine Veränderung im Wanderungsverhalten während der Gelelektropho¬ rese gefunden.

Aufgrund der Überlegung, daß es sich bei EMBIN I um ein Gly- copeptid handeln könnte, wurden Verdauungen mit glycolyti- schen Enzymen durchgeführt. Hierfür wurde EMBIN I einer sequenziellen Verdauung zuerst mit Neuraminidase und danach mit ß-Galactosidase unterworfen. Weiterhin wurde EMBIN I mit Glycopeptidase F behandelt. Weiterhin wurde untersucht, ob EMBIN I eine Reaktion mit dem "Glycan Detection Kit" der Firma Boehringer Mannheim zeigt. Bei keinem dieser Experimen-

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te konnte jedoch das Vorhandensein einer Glycosylierung nach¬ gewiesen werden.

Lipidextraktionen von EMBIN I und ANEMIN brachten bislang auch keine Hinweise auf das Vorhandensein von Lipidanteilen.

Zur Prüfung der Frage, ob es sich bei AMBIN I um eine Sub¬ stanz mit Proteincharakter handelt, wurde eine Inkubation mit Diethylpyrocarbonat durchgeführt. Diethylpyrucarbonat rea¬ giert mit freien α-Aminogruppen oder mit den e-Aminogruppen von Lysin unter Bildung eines N-Carboxyderivats. Bei Behand¬ lung von EMBIN I mit Diethylpyrocarbonat wurde festgestellt, daß die inhibitorische Aktivität vollständig aufgehoben wird. Dies spricht dafür, daß die inhibitorische Aktivität von EMBIN I auf einer oder auf mehreren funktionell wichtigen Aminogruppen beruht. Die Tatsache, daß auch bei einer Behand¬ lung mit Phenol die inhibitorische Aktivität von EMBIN I aufgehoben werden kann, ist ein weiterer Hinweis auf den Peptid-Charakter dieser Substanz. Weiterhin wurde auch fest¬ gestellt, daß EMBIN I mit dem Ninhydrinsprühreagenz (das zum Nachweis von Aminogruppen dient) angefärbt werden kann.

Einen weiteren Hinweis darauf, daß es sich bei EMBIN I um ein Peptid handeln kann, ist, daß eine Proteinbestimmung nach der Methode von Lowry (Lowry et al., J.Biol.Chem. 193 (1951), 265-275) möglich ist.

Durch eine Aminosäureanalyse von EMBIN I (Hydrolyse mit 6N HCl und anschließende Derivatisierung mit 4-Dimethylaminoazo- benzol-4*-sulfonylchlorid nach Knecht und Chang, Anal.Chem. 58 (1986) , 2375-2379) konnten die Aminosäuren ASX (Asn oder/und Asp) , GLX (Gin oder/und Glu) , Pro, Val, Leu, Lys und His nachgewiesen werden. Ebenso wurden charakteristische Peaks von Ser, Thr, Arg, Gly, Ala, Ile, Phe und Tyr gefunden, wobei die gefundenen Mengen zu gering waren, so daß ihr Vor¬ handensein nicht eindeutig bestätigt werden konnte.

Die bisherigen Ergebnisse der Charakterisierung von EMBIN I weisen darauf hin, daß es sich um ein kleines basisches Pep¬ tid handelt, wobei aber andere Möglichkeiten noch nicht aus¬ geschlossen werden können. Setzt man voraus, daß EMBIN I ein Peptid ist, so scheint der N-Terminus des Moleküls blockiert zu sein, denn eine Sequenzierung von EMBIN I nach der Methode von Edman, für die eine freie α-Aminogruppe des Peptids not¬ wendig ist, war bisher nicht möglich.

Eine weitere ungewöhnliche Eigenschaft von EMBIN I ist der Unterschied im Wanderungsverhalten während der Gelfiltration einerseits und der SDS-PAGE andererseits. Die EMBIN I-Aktivi- tät wird auf einer Gelfiltrationssäule an einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 500 bis 1000 Da entspricht. Bei Untersuchung der aktiven Fraktionen durch SDS-PAGE findet man jedoch die Bande von EMBIN I im Bereich zwischen etwa 2,5 und 6,5 kDa, unabhängig vom verwendeten Elektrophorese-System.

Auch der andere durch das erfindungsgemäße Verfahren erhält¬ liche Inhibitor ANEMIN zeigt diesen Unterschied im Wande- rungsverhalten während der Gelfiltration und der SDS-PAGE. Bei ANEMIN wird in der SDS-PAGE eine Bande etwa im Bereich von 16 bis 20 kDa gefunden, während nach Gelfiltration das Molekulargewicht weniger als 1000 Da betragen sollte. Wie EMBIN I weist auch ANEMIN eine sehr hohe Stabilität und eine Resistenz gegen Proteasen auf.

Obwohl weder die Struktur von EMBIN I noch von ANEMIN im Detail aufgeklärt ist, können sie durch das erfindungsgemäße Verfahren nacharbeitbar als Reinsubstanzen hergestellt wer¬ den, da beide Inhibitoren im SDS-Gel als Einzelbanden ohne nennenswerte Verunreinigungen nachgewiesen werden können.

ERSAT ^"

Im weiteren sollen die einzelnen Schritte des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens näher erläutert werden. Schritt (a) ist die Homogenisierung und Zentrifugation des als Ausgangsmaterial gewählten Gewebes. Vorzugsweise verwendet man als Ausgangsma¬ terial adultes Rinderhirn oder 4 bis 10 Tage alte Hühnerem¬ bryonen. Es sind jedoch auch andere Gewebearten, insbesondere Embryonalgewebe oder Hirngewebe von anderen Spezies geeignet. Durch Homogenisierung des Gewebes und anschließende Zentrifu¬ gation erhält man einen Gewebeextrakt, welcher den weiteren Verfahrensstufen zugeführt werden kann. Die Schritte der Homogenisierung und Zentrifugation können nach üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden und sind für das er indungsgemä e Verfahren nicht besonders kritisch.

Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man den Gewebeextrakt auf einen Kationenaustauscher gibt und die an den Kationenaustauscher bindenden Substanzen einer Fraktionierung unterwirft. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren sind in der Lage, bei etwa neutralen pH-Bedingungen und Salz¬ konzentrationen von bis zu 100 mmol/1 an einen Kationenaus¬ tauscher zu binden, während ein Großteil der im Gewebeextrakt enthaltenen Substanzen nicht dazu in der Lage ist. Die Elu- tion der erfindungsgemäßen Substanzen von der Austauschersäu¬ le kann z.B. durch Erhöhung der Salzkonzentration auf 700 mmol/1 erfolgen. Als geeigneter Kationenaustauscher hat sich etwa eine CM-Sepharose-Matrix (Pharmacia/LKB) erwiesen. Es können jedoch auch andere Kationenaustauscher verwendet werden.

Fraktionen aus dem Kationenaustauscher-Eluat, die bei einem in vitro-Aktivitätstest (infra) eine Inhibition der Prolife¬ ration von Endothel-Zellen zeigen, können gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens gelchromatographisch aufge¬ trennt werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß man nach der Fraktionierung über den Kationenaustauscher die aktiven Frak¬ tionen zuerst noch über eine Hydroxylapatitsäule gibt und

dann den Durchlauf der Hydroxylapatitsäule einer Ultrafiltra¬ tion unterwirft. Bei der Chromatographie an Hydroxylapatit wird nur ein sehr kleiner Proteinanteil nicht von der Hydro- xylapatitmatrix gebunden. Da sich die erfindungsgemäßen Inhi¬ bitoren im Durchlauf der Säule befinden (d.h. sie binden nicht) , wird ein guter Reinigungseffekt durch diesen Schritt erreicht.

Um das Volumen der nach der Hydroxylapatitchro atographie vorliegenden aktiven Proteinfraktion vor dem Gelfiltrations¬ schritt zu verringern, wurde eine Ultrafiltration durchge¬ führt. Die Konzentrierung erfolgt aufgrund des geringen Molekulargewichts der Inhibitoren über einer 500 Da-Membran. Man findet danach die inhibitorisch wirkenden Substanzen im Retentat wieder, das Filtrat hat keinerlei inhibierende Wir¬ kung auf die Endothelzellen-Proliferation.

Die Ultrafiltration kann darüber hinaus zur weitgehenden Entsalzung der Probe mittels zweier Diafiltrationsschritte benutzt werden. Das Volumen der Probe beträgt danach etwa 1/6 bis 1/10 des Ausgangsvolumens. Eine weitere Konzentrierung kann durch anschließende Lyophilisation der Probe und Aufnah¬ me des Lyophilisats in einem minimalen Volumen 0,2 M Essig¬ säure erzielt werden. Mit diesem Puffer kann auch die Gelfil¬ trationssäule, auf die die Probe anschließend aufgetragen wird, äquilibriert werden.

Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine gel- chromatographische Auftrennung der bisher erhaltenen aktiven Fraktionen. Als geeignetes Material für die Gelfiltration hat sich Biogel P2 erwiesen, das eine nominelle Ausschlußgröße von etwa 1,8 kDa aufweist. Die inhibitorisch wirksamen Sub¬ stanzen werden unter den gewählten Bedingungen nicht im Aus¬ schlußvolumen der Säule eluiert. Folglich sollten die inhibi¬ torisch wirksamen Substanzen ein Molekulargewicht von weniger als 1800 Da aufweisen. Andererseits besteht die Möglichkeit,

ERSATZBLATT

daß starke spezifische Wechselwirkungen mit der Matrix zu einer ungewöhnlich starken Retardierung der Substanzen und damit zur Vortäuschung eines zu geringen Molekulargewichts führen. Nach Auftrennung von Aliquots aus aktiven Fraktionen der Gelfiltration durch SDS-PAGE und anschließender Silber¬ färbung konnten mehrere Banden sichtbar gemacht werden, deren Molekulargewichte zwischen 2,5 und 20 kDa liegen. Anhand dieses Bandenmusters werden für den weiteren Gang der Isolie¬ rung die Fraktionen zusammengefaßt, die eine breite Bande zwischen 2 und 6 kDa - auf die der Begriff EMBIN I fortan bezogen wurde - aufweisen. Ebenso wurden die Fraktionen zu¬ sammengefaßt, die eine breite Bande im Bereich zwischen 14 und 20 kDa zeigten. Die mit diesen Fraktionen verbundene Inhibitionswirkung wurde mit der Bezeichnung ANEMIN belegt und im folgenden getrennt von EMBIN I aufgereinigt.

Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Anreicherung der inhibitorisch wirksamen Substanzen ist eine Reinigung über Reverse-Phase-HPLC. Dafür wurden unterschiedlich belegte Säulenmatrizes verschiedener Hersteller für die Reverse- Phase-HPLC und ein Trifluoressigsäure/Acetonitrilgradient als Elutionsmittel eingesetzt. Die inhihitorisch wirksamen Sub¬ stanzen konnten jedoch bei dieser Verfahrensweise nicht an die Säule gebunden werden, sondern fanden sich regelmäßig im Anteil der ungebundenen Substanzen. Aus gelelektrophoreti- schen Analyse der einzelnen Fraktionen wurde ersichtlich, daß in der inhibitorisch wirksamen Fraktion eine breite Bande mit einem Molekulargewicht im Bereich von 2,5 bis 6,5 kDa (EMBIN I) vorhanden war.

Aufgrund der guten pH-Stabilität der Polyvinylmatrix der Asahipak ODP50 Säule konnte eine Chromatographie im alkali¬ schen Milieu ohne den bei Verwendung von anderen Silicamate- rialien notwendigen Zusatz von Alkylammoniumionen durchge¬ führt werden. Bei Durchführung der Reverse-Phase-HPLC bei einem pH-Wert von 12,5 wurde eine Bindung von EMBIN I an die

Säulenmatrix gefunden. Bei Analyse der inhibitorisch wirksa¬ men Fraktionen im Polyacrylamidgel wurde gefunden, daß eine breite Bande im Molekulargewichtsbereich von 2,5 bis 6,2 kDa vorhanden ist.

Weiterhin hat es sich auch als günstig erwiesen, die HPLC- Reinigung in Gegenwart eines sauren Ionenpaarbildners durch¬ zuführen. Als saure Ionenpaarbildner sind organische Sulfon- säuren, insbesondere Alkyl- oder Arylsulfonsäuren geeignet. Diese Sulfonsäure oleküle können einerseits über ihren hydro¬ phoben Alkylanteil mit den hydrophoben Gruppen der Säulen¬ matrix wechselwirken, während sie gleichzeitig über ihre Sulfonsäuregruppierung positiv geladene Substanzen binden können. Die Konzentration der Sulfonsäure beträgt günstiger¬ weise zwischen 0,1 und 50 mmol/1, besonders bevorzugt zwi¬ schen 1 und 10 mmol/1.

Tatsächlich wurde festgestellt, daß EMBIN I an eine mit 5 mmol/1 Heptansulfonsaure, pH 3,5 aquilibrierte Asahipak ODP 50 Säule bindet und sich in einem linearen Gradienten wieder eluieren läßt.

Auch die ANEMIN-enthaltenden Fraktionen der Gelchromatogra¬ phie können durch Reverse-Phase-HPLC, z.B. in Gegenwart von Heptansulfonsaure als Ionenpaarbildner analog zu EMBIN I weiter aufgereinigt werden. Bei Elektrophorese in Polyacryl¬ amidgel findet man die Bande für ANEMIN im Bereich zwischen 16 und 20 kDa.

Durch das erfindunsgsge äße Verfahren lassen sich die als EMBIN I bzw. ANEMIN bezeichneten Inhibitoren für die Prolife¬ ration von Endothelzellen als Reinsubstanzen herstellen, wobei Gewebe aus Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial verwen¬ det wurde. Verwendet man adultes Rinderhirn als Ausgangsmate¬ rial, so gelingt es mit identischen Verfahrensschritten zwei entsprechende Substanzen zu erhalten, die bei Elektrophorese

ERSATZBLATT

im Polyacrylamidgel die Mobilitätseigenschaften von EMBIN I und ANEMIN aufweisen.

Die Aktivität der inhibitorisch wirksamen Substanzen wurde in vitro durch den BAEC-Test und in vivo durch den CAM-Test analysiert, die im folgenden Beispiel 1 detailliert darge¬ stellt sind.

Die erfindungsgemäßen Substanzen können bei der Behandlung aller Krankheiten, bei denen eine gesteigerte Angiogenese stattfindet und die oben bereits erwähnt wurden, verwendet werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Substanzen zur Hemmung des Tumorwachstums, wie von Kaposi-Sarcomen. oder Hämangiomen, zur Behandlung von Augenerkrankungen, bei wel¬ chem gesteigertes Kapillarwachstum auftritt, insbesondere der diabetischen Retinopathie und der retrolentalen Fibroplasie, sowie bei der rheumatoiden Arthritis oder zur Regelung der Wundheilung eingesetzt werden.

Die vorzugsweise verwendete Dosis des erfindungsgemäßen Sub¬ stanzen pro kg Körpergewicht dürfte in der Größenordnung μg bis maximal mg liegen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung in Verbinung imt der Zeichnung verdeutlichen. In der Zeichnung zeigen:

Abb. 1: eine Gelfiltrationschromatographie des Gewebeex¬ trakts aus Hühnerembryonen,

Abb. 2: die Hemmung der Endothelzellproliferation der Frak¬ tionen aus der Gelchromatographie,

Abb. 3: das Proteinmuster der Fraktionen 11-17 aus der Gelfiltration

Abb. 4: das Elutionsprofil von EMBIN I bei RP-HPLC in TFA/Acetonitril,

Abb. 5: das Elutionsprofil von EMBIN I bei RP-HPLC bei pH 12,5,

Abb. 6: das Elutionsprofil von EMBIN I in Gegenwart von

Heptansulfonsaure, Abb. 7: das Elutionsprofil von ANEMIN bei der RP-HPLC in

Gegenwart von Heptansulfonsaure, Abb. 8: eine SDS-PAGE von ANEMIN.

Beispiel 1

Nachweis von inhibitorischer Aktivität im Proliferationstest

Präparation von Retina-Faktor

Retinafaktor ist ein wäßriger Extrakt aus Rinderretinae, der als Endothelzellmitogen im wesentlichen bFGF enthält (basic fibroblast growth factor; Mascarelle et al. 1987). Die Retinae aus 25 - 50 Rinderaugen wurden herauspräpariert und mit dem gleichen Volumen an PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) bis zum nächsten Tag bie 4°C inkubiert (D'A ore et al., J.Cell.Biol. 99 (1984), 1545-1549). Die Präparation wurde mehrmals vorsichtig aufgerührt. Die festen Bestandteile wurden zuerst durch eine zehnminütige Zentrifu¬ gation bei 1000 Up (Heraeus) entfernt, der Überstand wurde anschließend nochmals 30 min lang bei 45000 g zentrifugiert (Sorvall, SS34). Der Überstand der zweiten Zentrifugation wurde aliquotiert und bei -20°C eingefroren. Vor Gebrauch wurden die Aliquots sterilfiltriert (0,2 oder 0,45 μ Poren¬ größe) .

BAEC-Test

Für den Nachweis der Hemmung der Endothelzellproliferation wurden Endothelzellkulturen verwendet, die aus Rinderaorten gewonnen worden waren (BAEC; bovine aortic endothelial cells; Passage 6-17). Für den Aktivitätstest wurden zu Beginn (Tag 1) in einer Zellkulturschale mit 24 Vertiefungen (Costar) 10-15000 BAEC pro Vertiefung in Dulbecco's modifiziertem Minimalmedium (DMEM), das 5 % fötales Kälberserum (FCS)ent¬ hielt, ausgesät, die sich innerhalb der nächsten 6-8 h auf der Plastikunterlage anhefteten.

_A darauffolgenden Tag (Tag 2) wurden nicht adhärierende Zellen zusammen mit dem alten Nährmedium entfernt und gegen DMEM mit 5 % FCS und 40 μl/ml Retinafaktor ausgetauscht. Durch den Zusatz von Retinafaktor zum Medium wird die Proli- feration der Endothelzellen stark simuliert. Nach dem Wechsel des Mediums erfolgte die Zugabe der auszutestenden Proben (bis zu 40 μl/well) . Die Zellen wurden weitere 3 Tage bei 7,5 % C0 ₂ und bei 37 ° C inkubiert, danach (Tag 5) wurde die Zellzahl im Coulter Counter bestimmt. Durch diese Konzeption der Versuche wurden die untersuchten Proben auf den Gehalt an Substanzen überprüft, die die Proliferation von Endothelzel¬ len, sogar in Gegenwart von Mitogenen, hemmen können.

Bestimmung der Zellzahl

Nach der 72-stündigen Inkubationsperiode wurden die Zellen mit Ca- und Mg-freie PBS gewaschen, durch Trypsinierung von der Unterlage abgelöst (0,5 ml 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA- Lösung, Gibco) und in 9,5 ml Isoton-Lösung überführt. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte in einem Coulter Counter, Industrial D (Attenuation: 2; Aperture Gurrend: 0,0093; Threshold: 12; Kapillarbohrung: 200 μm) . Die graphische Aus¬ wertung der gewonnenen Daten wurde mit den Programmen "Cricket Graph" und "Kaleidagraph" auf Computern der Fa. Apple durchgeführt.

SMC- und 3T3-Tests

Die Proliferationstests mit glatten Muskelzellen (SMC; smooth muscle cells) und NIH 3T3-Fibroblasten wurden nach der glei¬ chen Methode durchgeführt. Im Gegensatz zu BAEC ist die Sti¬ mulation der Proliferation von SMC und 3T3-Fibroblasten in Gegenwart von 10 % FCS im Kulturmedium ausreichend und der Zusatz von Retinafaktor erübrigt sich.

In vivo Test (CAM-Test) auf Inhibition

Bruteier der Fa. Hölzl (Wasserburg am Inn) wurden in einem Eierinkubator mit automatischer Wendung der Eier nach jeweils 6 h bei 37 ^β C und 70-80 % Luftfeuchtigkeit bebrütet. Am Tag E3 wurden Fenster mit einem Durchmesser von ca. 1 cm in die Schale befruchteter, drei Tage alter Hühnereier ge¬ schnitten, damit später die in Methylcellulose eingebetteten Faktoren auf die CAM appliziert werden konnten. Hierzu wurde auf die Oberseite der Eierschale zunächst ein Stück Scotch- Klebestreifen aufgeklebt. An der spitzen Seite des Eies wur¬ den dann mit Hilfe einer 10 l-Spritze und einer kräftigen Kanüle 2-3 ml Eiweiß entnommen, um den Embryo, der oben auf dem Eidotter schwimmt, etwas abzusenken. Nun wurde mit einer spitzen Schere in der Mitte des Klebestreifens ein Loch in die Eierschale geschnitten. Auf diese Weise wird das Herab¬ fallen von Eierschalenbruchstücken auf die CAM weitgehend vermieden. Diese Schalenbruchstücke können selbst eine der Angiogenese ähnliche Reaktion hervorrufen. Das Loch in der Eierschale wurde daraufhin mit einem zweiten Streifen Scotch- Klebeband verschlossen und die Eier weitere 3-4 Tage unter denselben Bedingungen bebrütet.

Die zu testenden Fraktionen wurden mit dem gleichen Volumen einer sterilen 1 %igen Methylcellulose-Lösung (4000 cpi; Sigma) im Verhältnis 1:1 gemischt. Jeweils 10 μl wurden auf die geglättete Schnittfläche von Teflonstäbchen (d = 3 mm) pipettiert und unter der Sterilhaube getrocknet. Mit einer feinen Pinzette konnten die Methylcellulose-Scheibchen von den Teflonstäbchen abgezogen und vorsichtig am Entwicklungs¬ tag E6 oder E7 auf die CAM aufgelegt werden. Nach 48 oder 72 h wurden die Bereiche der CAM in der Umgebung der Methylcel¬ lulose-Scheibchen unter dem Binokular auf Angiogeneseinhibi- tion untersucht. Zur Kontrastierung des Gefäßnetzes wurde den Embryonen mittels einer Glaskapillare etwa 20 μl einer Lösung von 40 % Luconyl-Blau (Hoechst) in PBS in eine Allantoisvene injiziert.

ERSATZBLATT

Pro Methylcelluloseplättchen (n = 39) wurden -240 ng EMBIN I eingesetzt. Am Rand von 4 Plättchen konnte eine avaskuläre Zone beobachtet werden, unter 6 Plättchen war eine nur schwa¬ che Blutgefäß eubildung zu erkennen. Bei den restlichen Em¬ bryonen konnte keine Veränderung im Gefäßmuster beobachtet werde .

Beispiel 2

Methoden zur Anreicherung von EMBIN I und ANEMIN

Ausgangsmaterial

Als Ausgangsmaterial wurden Bruteier der Fa. HÖlzl (Wasser¬ burg am Inn) eingesetzt. 4-10 Tage nach Beginn der Bebrütung der Eier wurden diese über einer großen Petrischalge geöffnet und die Embryonen entnommen. Von den Embryonen wurde die Amnionhaut und vor allem die Allantois möglichst vollständig abpräpariert, um Einflüsse aus der Allantoisflüssigkeit, die den embryonalen Harn darstellt, auszuschalten. Die Embryonen wurden bis zur Extraktion bei -20°C eingefroren aufbewahrt und vor Beginn der Präparation über Nacht bei 4°C angetaut.

Präparation des Extraktes

2500-3500 Hühnerembryonen der Entwicklungstage E4 bis E10, entsprechend einem Naßgewicht von 1,8 bis 3 kg wurden in Portionen von 300 g mit insgesamt 1,5 bis 2 1 Extraktionspuf¬ fer (20 M MOPS pH 6,8/ 100 M NaCl/2 mM PMSF) in einem Kü- chenmixer der Fa. Braun homogenisiert. Das Homogenat wurde anschließend 30 min bei 4°C unter Rühren extrahiert und die unlöslichen Bestandteile durch 90-minütige Zentrifugation bei 22000 g abgetrennt (Sorvall, GSA-Rotor) .

Kationenaustauschchromatographie an CM-Sepharose Fast Flow Der im ersten Schritt gewonnene Extrakt wurde auf eine CM- Sepharose-Säule (Pharmacia/LKB, Freiburg; 50 x 250 mm) ge¬ pumpt, die mit Auftragspuffer (20 mM MOPS pH 6,8/100 mM NaCl)

äquilibriert worden war. Die Flußrate lag bei 500 ml/h. Nach dem Auftragen des Extraktes wurde die Säule mit Auftragspuf¬ fer so lange gewaschen, bis die Absorption bei 280 n ein Minimum erreicht hatte. 86 % des gesamten Proteins befanden sich im Durchlauf. Die an die Säule gebundenen Proteine, darunter auch die inhibitorisch wirksamen Substanzen EMBIN I bzw. ANEMIN, wurden daraufhin in einer Stufe mit 700 mM NaCl in 20 mM MOPS pH 6,8 eluiert.

Chromatographie an Hydroxylapatit

Das Gelbett hierfür wurde mit einer Flußrate von 50 ml/h gepackt, nachdem das trockene Hydroxylapatitpulver (Bio-Gel HTP, Fa BioRad, München) im Auftragspuffer (20 mM MOPS, pH 6,8) genügend gequollen war. Das Eluat aus der Kationenaus- tauschchromatographie wurde dann direkt in 2-3 Portionen mit 40 ml/h auf die in 20 mM MOPS pH 6,8 aquilibrierte Hydroxyl- apatit-Säule (25 x 100 mm) aufgetragen, die anschließend so lange mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen wurde, bis die Absorption bei 280 nm minimal war. Nur ein sehr kleiner Pro¬ teinanteil (darunter die inhibitorisch wirksamen Substanzen) wurde von der Hydroxylapatit-Matrix nicht gebunden und befand sich im Durchlauf der Säule.

Das reversibel an die Hydroxlapatit-Matrix gebundene Material konnte duch 0,4 M Kaliumphosphat-Puffer pH 6,8 eluiert wer¬ den. Dieses Eluat wurde anschließend gegen 2 x 5 1 20 mM MOPS-Puffer pH 6,8 oder gegen 0,5 x PBS pH 7,2 dialysiert. Dabei wurden in der Regel Visking-Dialyseschläuche verwendet, die eine nominelle Trenngrenze von 10-15 kDa haben.

Entsalzen und Konzentrierung durch Ultrafiltration

Das nicht an Hydroxylapatit gebundene Material wurde über einer YC05-Ultrafiltrationsmembran (Amicon GmbH, Witten, nominelle Ausschlußgrenze: 500 Da) in einer Ultrafiltra¬ tionszelle (Amicon GmbH, Witten; Typ 8400) auf ca. ein Zehn¬ tel des Ausgangsvolumens eingeengt. Die Entsalzung der Lösung erfolgte in der gleichen Kammer durch Diafiltration mit dest. Wasser.

ERSATZBLATT

Gelfil ^' tration

Das weitgehend entsalzte Konzentrat aus der Ultrafiltration wurde zur weiteren Reduktion des Lösungsvolumens lyophili- siert. Für die Gelfiltration der in jeweils ca. 4-6 ml 0,2 M Essigsäure aufgenommenen Lyophilisate wurde eine Bio-Gel P2 Säule (Fa. BioRad, München; 200-400 esh; nominelles Aus¬ schlußgewicht: 1800 Da) verwendet, die in 0,2 M Essigsäure äquilibriert worden war. Die Probe wurde mittels einer Peri- staltikpumpe (LKB/Pharmacia) auf die Säule aufgetragen und die Gelfiltration durch Aufpumpen des Laufmittels auf die Säule bewerkstelligt. Die Flußrate während der Gelfiltration betrug 6 ml/h, die Detektion der aufgetrennten Proteine und Peptide erfolgte bei 280 nm. Der Säulendurchlauf wurde frak¬ tioniert gesammelt (UltroRac; LKB; 40 min/Fraktion) . Abb. 1 zeigt die Gelfiltrationschromatographie auf einer Biogel P2-Säule. Der größte Teil der aufgetragenen Proteine und Peptide wird im AusSchlußvolumen der Säule eluiert (Frak¬ tionen 5-10). Die Fraktionen 17 - 20 enthalten das noch vor¬ handene Salz und markieren zugleich die untere Ausschlußgren¬ ze der Säule. Die Fraktionen der Gelfiltration wurden zur Entfernung der Essigsäure lyophilisiert und in jeweils 4 ml H ₂ 0 bidest. aufgenommen. Abb. 2 zeigt die Hemmung der Endo- thelzellproliferation in den Fraktionen nach der Gelfiltra¬ tion. (S) und (M) geben die Zellzahlen zum Zeitpunkt des Probenauftrags und nach der maximalen Proliferation wieder. Die durch Aliquots aus den Fraktionen 5 - 24 ausgelöste Wir¬ kung auf die Endothelzellproliferation ist durch die entspre¬ chende Säulenhöhe dargestellt.

Abb. 3 zeigt eine Auftrennung von Aliquots aus den Fraktionen 11 - 17 durch SDS-PAGE und anschließende Silberfärbung. Es sind mehrere Banden sichtbar, deren Molekulargewichte zwi¬ schen 2,5 und 20 kDa liegen. Anhand des Bandenmusters werden für den weiteren Gang der Isolierung die Fraktionen 11 - 13 zusammengefaßt, die neben einer breiten Bande zwischen 2 und 6 kDa (EMBIN I) eine prominente Bande bei 13 kDa und mehrere

schwächere Banden aufwiesen. Ebenso wurde mit den Fraktionen 14 und 15 verfahren, die neben einer Bande bei 13 kDa eine breite Bande im Bereich zwischen 14 und 20 kDa (ANEMIN) zeig¬ ten.

Reversed Phase Chromatographie

Sämtliche Reversed Phase Chromatographieschritte wurden auf einer HPLC-Anlage der Fa. Kontron (Eching) mit 2 HPLC-Pumpen vom Typ 420, einem Detektor 430 und dem Datensystem 450 durchgeführt. Das Datensystem 450 besteht aus einem AT-Rech- ner mit implementierter Steuerungssoftware, sowie Software zur Aufnahme und Verarbeitung der registrierten Daten. Die Detektion der aufgetrennten Substanzen erfolgte in der Regel simultan bei zwei Wellenlängen (im Bereich der Absorption der Peptidbindung bei einer Wellenlänge zwischen 214 und 220 nm, sowie bei 280 nm, dem Absorptionsmaximum von Tyrosin) .

Reversed Phase (RP) Chromatographie im TFA/Acetonitril- Lösungs ittelsystem

Fertig gepackte RP-Säulen mehrerer Herteller wurden hinsicht¬ lich ihrer Eignung für die weitere Reinigung von EMBIN I unter Verwendung des TFA/Acetonitril-Lösungsmittelsystems untersucht. Die Säulen wurden in Puffer A (0,1 % TFA; Rathburn, Schottland) äquilibriert und durch lineare Gradien¬ ten mit ansteigender Konzentration von Lösung B (0,09 % TFA in 95 % Acetonitril; Rathburn, Schottland) eluiert. Eine Zusammenfassung der Experimente ist in Tabelle I gegeben.

Tabelle I

Zusammenfassung der Chromatographie im Reversed Phase Modus zur Isolierung von EMBIN I. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die

Fraktionsgröße 1 min. Die Absorption wurde bei 214 und 280 nm registriert.

ERSATZBLATT

Säulentyp/Größe (in mm)

Vydac 214 TP/4,6 x 250 Aquapore 300/4,6 x 100 Asahipak ODP50/6 x 150 Spherisorb ODS2/4,6 x 250

Abb. 4 zeigt das Elutionsprofil einer RP-HPLC am Beispiel der Asahipak ODP50-Säule (C18-Belegung) . Aus der gelelektrophore- tischen Analyse "der einzelnen Fraktionen wurde ersichtlich, daß die inhibitorisch wirksame Aktivität sich in Fraktion 3 ■ (schraffiert dargestellt) befindet. Eine gelelektrophoreti- sche Analyse zeigt eine Bande mit einem Molekulargewicht von 2,5 bis 6,5 kDa, bei es sich um EMBIN I handelt.

Reversed Phase Chromatographie unter alkalischen Bedingungen

Puffer A: 10 mM Tris, mit 5N NaOH auf pH 12,5 eingestellt Puffer B: 10 mM Tris pH 10/80 % Acetonitril

Nachdem die Asahipak ODP50-Säule in 5 % Puffer B äquilibriert worden war, wurden 500 μl des YC05-Konzentrats von EMBIN I mit dem gleichen Volumen des Äquilibrierungspuffers versetzt und auf die Säule aufgebracht (1 ml/min; 1 min/Fraktion; Detektion bei 220 und 280 nm) . Die Elution der unter diesen Bedingungen gebundenen Substanzen erfolgte innerhalb von 25 min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer B. Die Fraktionen wurden im Vakuumkonzentrator vom Lösungsmittel befreit und in jeweils 250 μl H ₂ O bidest. aufgenommen.

Abb. 5 zeigt die Elution einer EMBIN I-haltigen Probe bei pH 12,5. Die aktive Fraktion (Bestimmung durch den BAEC-Test) ist schraffiert dargestellt. Bei Elektrophorese im Polyacryl- amidgel zeigte die inhibierende Fraktion die EMBIN I-Bande im Molekulargewichtsbereich von 2,5 bis 6,2 kDa.

Reversed Phase Chromatographie unter Einsatz eines Ionenpaar- bildners

Der letzte Reinigungsschritt von EMBIN I wurde auf einer 6 x 150 mm großen Asahipak ODP C18-Säule durchgeführt (Asahi Chemical Industry, Japan). EBMIN I-haltige Fraktionen aus der Gelfiltration wurden in einem Vakuum-Konzentrator getrocknet und in 5 mM Heptansulfonsaure pH 2,5 aufgenommen (Regis Chemical Company, Morton Grove, Illinois, oder Fluka Chemika¬ lien, Ulm). 1 ml-Aliquots wurden auf die Säule (in 5 mM Hep¬ tansulfonsaure pH 2,5 äquilibriert) aufgetragen, die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % 5 mM Heptansulfonsaure pH 2,5 in 90 % Acetonitril während 35 min. Das fraktionierte Eluat wurde in einem Vakuum-Konzentrator vom Lösungsmittel befreit und die Rückstände wurden in bi- dest. Wasser für die weitere Analyse aufgenommen.

Abb. 6 zeigt das Elutionsprofil einer EMBIN I-haltigen Probe bei der RP-HPLC in Gegenwart von Heptansulfonsaure als Ionen- paarbilder. Die im Aktivitätstest positiven Fraktionen (als schraffierte Fläche dargestellt) zeigten bei gelelektrophore- tischer Auf rennung die EMBIN I-Bande.

-Abb. 7 zeigt das Elutionsprofil von ANEMIN bei der RP-HPLC mit Heptansulfonsaure. Die im BAEC-Aktivitätstest positiven Fraktionen sind als schraffierte Fläche dargestellt. Dazu wur¬ den die lyophilisierten Fraktionen 14 und 15 aus der Gelfil¬ tration in 2 ml des Äquilibrierungspuffers aufgenommen und ^• unter den gleichen Bedingun-gen wie oben aufgetrennt. In die¬ sen Fraktionen waren neben ANEMIN auch noch EMBIN I vorhanden.

Abb. 8 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel der Fraktionen 22 - 37 aus der RP HPLC von ANEMIN. Aliquots aus jeder Fraktion wur¬ den auf einem Gel aufgetrennt und die Peptidbanden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Die ANEMIN-Bande im Bereich zwischen 16 und 20 kDa war demnach in den Fraktionen 25 bis 29 enthalten, während EMBIN I noch in den Fraktionen 31 und 32 sichtbar war.

ERSA

Beispiel 3

Biochemische Charakterisierung von EMBIN I

Ther ostabilität

Jeweils 100 μl eines Kationenaustauschereluates mit inhibie¬ render Wirkung auf die Proliferation von Endothelzellen wur¬ den 2, 5, 10 und 60 min lang in einem Wasserbad auf 90"C erhitzt. Danach wurden die Proben auf Eis gestellt und nach Sterilisation im Proliferationstest auf ihre noch verbliebene hemmende Eigenschaft untersucht.

Protease-Resistenz

Für die Untersuchung der Inaktivierbarkeit von EMBIN I durch die Behandlung mit verschiedenen Proteasen wurde als Substrat das diafiltrierte YC05-Retentat vor oder nach der Gelfiltra¬ tionschromatographie auf BioGel P2 eingesetzt. Mit folgenden Proteasen wurde die Inaktivierung der inhibitorischen Aktivi¬ tät von EMBIN I versucht:

Trypsin, S. aureus V8 Protease, Clostripain, Thermolysin, Subtilisin, Pronase E, Proteinase K, Carboxypeptidase Y, Papain, Pepsin (Ξigma) ; Chymotrypsin, Pyroglutamat-Aminopep- tidase, Endoproteinase Arg-C, Endoproteinase Lys-C (Boehrin¬ ger) ; Prolin spezifische Endopeptidase (Seikagaku Kogyo, Japan) .

Die Proteasen wurden in den für die jeweils erforderlichen Puffern gelöst und in einem Aliquot des EMBIN I-Substrats unter den für das betreffende Enzym angegebenen Bedingungen inkubiert. Zur Kontrolle der Proteaseaktivität wurden BSA oder Lysozym in Parallelversuchen mit den Proteasen inkubiert und die Degradation der Proteine durch SDS PAGE überprüft. Am Ende der Inkubationszeit wurdne die Proteasen durch Erhitzen des Ansatzes für 5 min auf 95 ° C inaktiviert, dieser steril¬ filtriert und auf die Inaktivierung von EMBIN I im BAEC-Test überprüft.

Als Positivkontrolle wurde ein entsprechendes Aliquot an EMBIN I ohne Enzym, aber mit den in den verschiedenen Ansät¬ zen verwendeten Volumen an Verdaupufer unter den gleichen Bedingungen inkubiert und im BAEC-Test getestet.

Resistenz gegenüber RNase und DNase

Je 20 μl des diafiltrierten YC05-Retentats wurden zunächst mit 1 μl einer 1 M Tris/HCl-Lösung pH 7,5 versetzt, der DNase-Ansatz zusätzlich mit 1 μl einer 0,1 M Magnesiumchlo¬ rid-Lösung. Nach der Zugabe von jeweils 1 μl des Enzyms (Boehringer Mannheim) wurde 30 min bei 37*C inkubiert, der Verdau anschließend durch Zugabe von 10 μl Probenpuffer abge¬ brochen und die Gemische gelelektrophoretisch untersucht.

Sequentieller Verdau mit Neura inidase und ß-Galactosidase 500 μl des entsalzten YC05-Retentats wurden mit 29 μl eines 700 mM Natriumacetat-Puffers auf pH 5,0 eingestellt und mit 1 U Neuraminidase (Typ X; Sigma) 24 h bei 37*C verdaut. Nach Lyophilisation in der "Speedvac" wurde der Rückstand in 500 μl 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,3 aufgenommen und mit Mag- nesiumchlorid versetzt (10 M Endkonzentration) . 250 μl davon wurden für die gelelektrophoretische Analyse und den Proliferationstest entnommen, der Rest wurde mit 10 U ß- Galactosidase (Sigma) 18 h lang bei 37*C inkubiert. Nach der Lyophilisation erfolgte die Aufnahme in 250 μl dest. Wasser und die Überprüfung der Probe im Proliferationstest.

Inkubation mit Glycopeptidase F

20 μl eines YC05-Retentats wurden in der "Speedvac" getrock¬ net, danach in dem gleichen Volumen des Verdaupuffers aufge¬ nommen (20 mM Kaliumphosphat pH 6,8; 10 M EDTA pH 8; 0,2 % Triton X 114;; 0,1 % SDS und 1 % Mercaptoethanol) . Zu diesem Ansatz wurden 3 μl einer Glycopeptidase F-Lösung (Glycopepti- de-N-glycosidase; Boehringer Mannheim) pipettiert und über Nacht bei 37*C inkubiert. Der Verdau wurde durch die Zugabe von SDS-Probenpuffer abgebrochen und mit Hilfe der SDS PAGE analysiert.

ERSATZBLATT

Detektion von Zuckeranteilen durch den Einsatz des "Glykan- Detection Kit"

Als alternatives Nachweissystem für den Nachweis von N- oder O-glycosidisch gebundenen Glycanresten im EMBIN I-Molekül wurde das von der Fa. Boehringer (Mannheim) vertriebene "Gly- can Detection Kit" eingesetzt, das die Detektion von bis zu 1 ng Glycoprotein erlaubt.

10 und 20 μl einer durch RP-HPLC gereinigten EMBIN I-Probe wurden nach den Angaben des Herstellers für die Derivatisie- rung und den Immunoblot-Nachweis eingesetzt, ebenso 10 μg Transferrin als Kontrollprotein. Die Auftrennung der Digoxi- geninderivate erfolgte in einem 1,5 % SDS-Gel nach der Laemmli-Methode. Der Transfer auf Nitrocellulose (0,45 μm; Schleicher und Schuell) wurde nach der Methode von Bjerrum et al. (in: Electrophoresis, S 315 ff (1986) , Weinheim, Verlag Chemie) durchgeführt. Der Teil des SDS-Gels, in dem die Mar¬ kerproteine und die unbehandelte EMBIN I-Probe aufgetrennt worden waren, wurde mit Silber angefärbt.

Phenolextraktion

1 ml einer inhibitorisch aktiven Fraktion nach Chromatogra¬ phie an Hydroxylapatit wurde mit dem gleichen Volumen einer mit Wasser gesättigten und mit Tris/HCl-Puffer auf pH 7,5 eingestellten Phenollösung versetzt, gründlich gemischt und zur vollständigen Phasentrennung kurz zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde daraufhin dreimal mit dem gleichen Volu¬ men Chloroform ausgeschüttelt, um Reste von Phenol zu entfer¬ nen und zur Phasentrennung wiederum kurz zentrifugiert. Alle drei Phasen (Wasser, Phenol, Chloroform) wurden in der "Speedvac" getrocknet und für den BAEC-Test in jeweils 1 ml 20 M MOPS-Puffer pH 6,8 aufgenommen.

Lipidextraktion

20 μl einer nach der Gelfiltration auf BioGel P2 inhibito¬ risch wirksamen Fraktion wurden mit einem Gemisch aus 50 μl Methanol und 25 μl Chloroform versetzt, gründlich gemischt

und über Nacht bei 4°C extrahiert. Am nächsten Tag erfolgte zur Einleitung der Phasentrennung die Zugabe von 40 μl eines Wasser/Chloroform-Gemisches (1:1, v:v) . Nach kurzer Zentrifu¬ gation wurden beide Phasen getrennt, in der Speedvac" einro¬ tiert und für die Gelelektrophorese im Ausgangsvolumen aufgenommen.

Inaktivierung durch Diethylpyrocarbonat

100 μl des diafiltrierten YC05-Retentats wurden mit 1 μl Diethylpyrocarbonat (Sigma) versetzt, gründlich gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde im Vakuumkonzentrator getrocknet und der Rückstand im ursprüng¬ lichen Volumen dest. Wasser aufgenommen. Ein unlösliches Präzipitat wurde duch Zentrifugation entfernt. Der Überstand der Zentrifugation wurde sterilfiltriert und im Prolifera¬ tionstest getestet.

Als Kontrollansatz wurden 100 μl PBS genauso behandelt und ebenfalls auf den BAE-Zellen ausgetestet.

Aminosäureanalyse von EMBIN I

Die Analyse der Aminosäurezusammenεetzung wurde mit einigen Modifikationen nach der von Knecht und Chang beschriebenen Methode durch Vorsäulenderivatisierung der Aminosäuren im Hydrolysat mit 4-Dimethylaminoazobenzol-4'-sulfonylchlorid (Dabsylchlorid) durchgeführt (Chang et al., Biochem.J. 199 (1981), 547-555; Knecht und Chang, Anal.Chem. 58 (1986), 2375-2379) .

Dabsylchorid der Fa. Pierce wurde mit einer Konzentration von 1,3 mg/ml in Acetonitril gelöst, aliquotiert und bei -20 ^β C gelagert. Dabei kristallisierte ein Teil des bei RT gelösten Dabsylchorids aus, der durch vorsichtiges Erwärmen kurz vor Gebrauch wieder in Lösung gebracht werden konnte.

Hydrolyse

Hierfür wurden jeweils 40 μl der zu bestimmenden Probne in eine ausgeglühte Glasampulle der Fa. Wheaton (Whetaon,

ERSATZBLATT

Millville, New Jersey) mit 2 ml Fassungsvermögen pipettiert und im Vakuumkonzentrator getrocknet.

Nach der Zugabe von jeweils 200 μl 6N HCl (Sigma; constant boiling) in jede Ampulle wurden diese im Wasserstrahlvakuum zugeschmolzen. Die Hydrolyse der Proben fand in einem Ölbad bei 110*C statt. In der Regel wurde 24-60 Stunden hydroly- siert. Zur Berücksichtigung der Verluste bei einzelnen Amino¬ säuren, die während der Hydrolyse teilweise zerstört werden, wurden in jedem Experiment 5 μl eines standardisierten Amino¬ säuregemisches (Sigma) unter den gleichen Bedingungen hydro- lysiert und derivatisiert.

Derivatisierung

Nach dem Abkühlen wurden die Hydrolysate in 1,5 ml Eppendorf- gefäße überführt und im Vakuumkonzentrator getrocknet. Die . Rückstände wurden in 100 μl 0,1 M Natriumhydrogencarbonat- Puffer pH 8,3 aufgenommen. Zu jedem Derivatisierungsansatz wurden nun 250 μl der Dabsylchlorid-Lösung pipettiert, wobei ein hellroter Niederschlag auftritt. Bei der darauffolgenden Erwärmung auf 70°C im Wasserbad (12 min) geht dieses Präzipi¬ tat wieder in Lösung, und es ist ein Farbumschlag von hellrot, über orange nach gelb zu beobachten. Im Anschluß an diese eigentliche Kopplungsreaktion, nach der die Aminosäuren in den Hydrolysaten als chromogene Derivate vorliegen, wurden die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend durch Zugabe von 650 μl 50 mM Kaliumphosphat/Ethanol-Puffer pH 7,0 (1:1, v:v) auf ein Endvolumen von 1 ml eingestellt. Kleinere, flockige Präzipitate, die in einzelnen Proben vor¬ handen waren, wurden durch 5-minütige Zentrifugation in einer Beckmann-Tischzentrifuge entfernt.

HPLC-Analyse der Aminosäurederivate

Die chromatographische Auftrennung der derivatisierten Amino¬ säuren wurde auf einer HPLC-Anlage der Firma Kontron mit 2 HPLC-Pumpen vom Typ 420, einem Detektor 430 und dem Datenver¬ arbeitungssystem 450 durchgeführt. Die Detektion der A ino-

säurederivate erfolgte bei 436 nm. Das Volumen der instal¬ lierten Probenschleife betrug 75 μl. Als Trennsäule fand eine C18 Ultrasphere ODS-Säule (4,6 x 250 mm oder 4,6 x 150 mm) der Fa. Beckmann Verwendung, die mit 5 μ-Partikeln gepackt ist.

Die Zusammensetzung der mobilen Phasen A und B erfolgte in Anlehnung an die von der Fa. Beckmann für ihr "Dabs-Amino Acid Kit" herausgegebene Arbeitsvorschrift. Ausgehend von einer Zitronensäure-Stammlösung mit 1 Mol/1 wurde zunächst eine 0,1 M Stammlösung hergestellt, der pH-Wert mit 5 N NaOH auf 6,5 eingestellt wurde.

Die Puffer wurden wie folgt angesetzt: A: 150 ml 0,1 M Natriumeitrat pH 6,5

40 mi Dimethylformamid (DMF)

810 H ₂ 0

B: zu 300 ml von Puffer A wurden langsam und unter ständi¬ gem Rühren 700 ml einer 4 % igen Lösung von DMF in Ace- tonitril gegeben.

Die Auftrennung der Aminosäuren erfolgte durch Elution der Trennsäule mit einem multilinearen Gradienten bei einer Flu߬ rate von 1,4 ml/min:

ER

Von jeder zu analysierenden Probe wurden 10 μl eingesetzt. Die quantitative Auswertung erfolgte nach Kalibrierung mit dem gleichen Volumen des Aminosäurestandards automatisch durch das Datensystem 450.

Das Ergebnis der Aminosäureanalyse der EMBIN I-Probe wurde mit dem einer Kontrollprobe verglichen, die nur den zur RP- HPLC eingesetzten Puffer (5 mM Heptansulfonsaure; 0,04 % TFA) enthielt. Diese Kontrollprobe sollte eine eventuelle Kontami¬ nation des Laufpuffers mit Aminosäuren aufzeigen.

Die gefundenen Mengen an Aminosäuren liegen an der Erfas¬ sungsgrenze dieser Methode. Beispielsweise sind die charakte¬ ristischen Peaks von Serin, Threonin, Arginin, Glycin und Alanin im Chromatogra m vorhanden, ebenso die Peaks von Iso-

leucin, Phenylalanin und Tyrosin. Dennoch wurden sie vom Integrator aus dem oben erwähnten Grund nicht identifiziert. Aus den vorhandenen Chromatogrammen konnten darüberhinaus keine Hinweise auf das Vorkommen seltener Aminosäuren gewon¬ nen werden.

ERSATZBLATT