La présente invention a trait à un nouveau support pour des tests biologiques in vitro, notamment tests d'immuno- fluorescence, tests ELISA, radio-immunodosages, etc... ainsi qu'aux applications de ce support. Le développement des techniques d'immunofluorescen¬ ce a fait largement progresser la sérologie pour la détection d'antigènes ou d'anticorps avec une sensibilité accrue. On utilise actuellement, pour sa mise en oeuvre, des lames de verre recouvertes sur une face par un mince revêtement hydro- phobe, tel que notamment du silicone, laissant apparaître des plages circulaires hydrophiles non revêtues destinées à être sensibilisées, c'est-à-dire à fixer une certaine quanti¬ té d'antigènes, dans le cas de tests pour la détection d'anti¬ corps ou, inversement, fixer des anticorps dans le cas de détection d'antigènes.

En raison du nombre croissant de prélèvements à tester, il serait souhaitable de développer l'automatisa¬ tion des différentes étapes de tests. Cependant, les supports en verre actuellement utilisés ne se prêtent pas à l'automati- sation en raison notamment des difficultés de manutention, du long temps de séchage et des difficultés de repérage.

Il en est de même pour les tests immunoenzymati- ques, dits tests ELISA, lesquels utilisent des ensembles de cupules en matière synthétique difficiles à manier, longs à laver et d'un prix de revient très élevé.

La demande de brevet européen 0 018 435 décrit un dispositif de micro-analyse comprenant une plaquette infé¬ rieure rigide de grande épaisseur en matière plastique qui reçoit une substance de test, ainsi qu'une plaque supérieure avec des moyens complexes pour maintenir les deux plaques à distance constante l'une de l'autre. Ce dispositif est com¬ pliqué et ne se prête pas à des tests en série.

La demande de brevet allemand publiée 2 541 031 décrit des plaques en matière plastique de grande épaisseur revêtues d'une couche perforée d'une substance hydrophobè, à savoir du polyfluoréthylène. Un tel dispositif est peu prati¬ que et constitue un simple équivalent des plaques de verre déjà utilisées.

La demande de brevet européen 0 063 810 décrit des dispositifs pour tests et analyses comprenant des feuilles d'une matière poreuse telle que la nitrocellulose poreuse ou d'autres matières plastiques poreuses. La substance de test est absorbée dans la masse poreuse et l'ensemble de la masse poreuse est imprégné d'une protéine neutre par rapport à la substance à tester, telle que l'albumine _/ de façon à satu¬ rer les possibilités d'absorption. La réalisation de tels supports est particulièrement complexe et coûteuse et les technologies mettant en oeuvre ces supports sont d'une nature tout à fait différente de celle qui intéresse la présente invention.

La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un nouveau support pour tests biologiques in vitro qui présente, par rapport aux supports connus, les avantages suivants : - possibilité d'utilisation automatique en con¬ tinu ou en discontinu,

- suppression des opérations de nettoyage et re¬ cyclage des supports,

- gain de temps important, notamment au niveau du montage, du séchage, de la lecture et de la disponibilité immédiate,

- gain de réactifs,

- innocuité,

- transmission à la lumière U,V. supérieure à celle du veçre,

- gain de poids très important,

- diminution du risque d'erreur de repérage,

- stockage et conservation facilités,

- possibilité d'adaptation di ensionnelle, - possibilité de fabrication simple,

- manutention facilitée pour la mise en place des réactifs et produits à tester, comme le lavage, le sé¬ chage, la lecture etc,

- facilité de transport pour l'utilisation sur le terrain.

La présente invention a pour objet un nouveau suppor en matière plastique pour tests biologiques in vitro et notam¬ ment i munologiques, caractérisé en ce qu'il comporte une feuille de matière plastique sensiblement transparente portant sur l'une de ses faces, un revêtement hydrophobe laissant subsister une ou de préférence plusieurs plages

hydrophiles non revêtues, de préférence de forme circulaire.

Par matière plastique, dans le sens de la présente invention, on entend une matière synthétique susceptible d'être produite facilement sous forme de feuilles, de rubans ou de nappes et présentant soit spontanément, soit après traitement, un caractère hydrophile permettant les opérations de sensibili¬ sation, c'est-à-dire de mise en place, sur la surface de la feuille, de molécules complexes ou particules, telles qu'an¬ tigènes ou anticorps, ainsi que le recueil et la répartition de milieux liquides tels que par exemple de sérums ou de sang, et ceci sans absorption.

De préférence, les matières plastiques selon l'inven¬ tion sont réalisées en feuilles ou films d'acétate de polyviny- le ou de polyester tels que par exemple les films vendus sous la dénomination 63610 DT2 par la société STAEDTLER, NURNBERG, R.F.A.

Les feuilles selon l'invention peuvent être plus ou moins souples en fonction de leur nature et de l'épaisseur choisie. Elles doivent être relat-ivement souples tout en ayant tendance sensiblement à se maintenir sans s'effondrer lors¬ qu'elles sont tenues par un bord. De préférence, l'épaisseur est comprise entre 0,05 mm et 0,5 mm. Selon l'invention, les films utilisés peuvent avoir subi un traitement anti-thermique et/ou anti-statique tels que, par exemple, les films commercia- lises sous la dénomination 63610 DT2 par la société STAΞDTLER.

Le revêtement hydrophobe peut être par exem¬ ple un revêtement siliconé. Ceci peut être effectué par exemple en disposant des gouttes de glycérol sur la feuille disposée horizontalement aux emplacements des futures zones hydrophiles et en vaporisant un aérosol de siliconé sur l'ensemble de la feuille, l'emplace¬ ment de la goutte restant hydrophile alors que son pourtour devient hydrophobe. Ce procédé peut être automatisé en utilisant,

pour le dépôt des gouttes, un distributeur automatique de réactif.

Cependant, conformément à un perfectionnement particulièrement avantageux de l'invention, le revêtement peut être obtenu par un simple procédé de photocopie uti¬ lisant par exemple la xérographie ou des techniques simi¬ laires. Il suffit alors de réaliser un modèle imprimé sur papier ordinaire et d'en faire des photocopies sur les feuilles plastiques sus-mentionnées, permettant la forma- tion d'un revêtement carboné hydrophobe.

Ce perfectionnement de l'invention permet en outre d'obtenir rapidement et à coûts particulièrement bas, un grand nombre de supports avec toutes les disposi¬ tions spatiales souhaitées, ces supports pouvant présenter en outre directement d'une part toutes les inscriptions nécessaires au repérage des différentes zoneshydrophiles, d'autre part toutes les mentions utiles, telles que dates, nature du ou des antigènes déposés, etc.

Le diamètre des plages hydrophiles est, confor- mément' à l'invention, compris en-tre 2 et 20 mm.

Le support en feuilles selon la présente inven¬ tion peut se présenter selon des dimensions extrêmement diverses. Ainsi, il peut se présenter sous forme de lames de petites dimensions, comparables aux lames de verre porte-objets, ou de feuilles de grandes dimensions suscep¬ tibles, le cas échéant, d'être découpées en sous-ensembles utilisés séparément ou encore sous forme de ruban continu enroulable se prêtant particulièrement à un traitement au¬ tomatique en continu. D'autres matières plastiques peuvent également être utilisées parmi lesquelles polychlorure de vinyle, polyvinyle, polystyrène, polyéthylène, polycarbonate, Cellophane (marque déposée) et dérivés de ces polymères.

L'invention a également pour objet l'application de ces supports aux tests d' immunofluorescence, caractéri-

¹ 6 sée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophiles d'un support à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel (par exemple tam- pon phosphate), que l'on sèche le support, de préférence en le laissant flotter dans un flux d'air chaud en le maintenant à une extrémité, que l'on applique sur ladite ou lesdites plages une goutte de sérum ou substance à tester et une goutte de conjugué fluorescent avec répétition des opéra- tions de lavage et séchage susmentionnées et qu'on effec¬ tue la ou les lectures au microscope à U.V. après avoir déposé sur la ou les plages une goutte d'huile recouverte d'une feuille de matière plastique transparente, pouvant être notamment constituée du même matériau que le support. De préférence, on utilisera un support com¬ prenant une pluralité de plages en rangées et colonnes au pas des appareils de distribution de gouttes déjà connus prévoyant des moyens d'avancement automatiqu ^* e des supports selon l'invention. L'automatisation peut d'ailleurs être pratiquement totale en prévoyant, entre différents postes de distribution de gouttes, des moyens de lavage et de séchage automatiques.

L'invention a également pour objet l'application de ces supports aux tests ELISA, caractérisée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophiles d'un support à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel (par exemple tampon phosphate) , que l'on sèche le support, de préférence en le laissant flotter dans un flux d'air chaud en le maintenant à une extrémité, que l'on applique sur ladite plage une goutte de sérum ou substance à tester et une goutte d'un chro¬ mogène, de préférence d'un type se polymérisant pendant qu'il se colore, avec répétition des opérations de lavage

et de séchage susmentionnées, après quoi l'on effectue une mesure colorimétrique de la ou desdites plages.

De préférence, le chromogène utilisé est la diami- nobenzidine lorsque l'enzyme utilisée pour le conjugué est la peroxydase.

Dans cette application, on peut automatiser la totalité du test, y compris la lecture et la mesure colo¬ rimétrique.

L'invention a également pour objet l'application de ces supports aux tests radioimifiunologiques, caractérisée en ce que l'on sensibilise une ou plusieurs plages hydrophi¬ les à l'aide d'un antigène ou anticorps contenu dans une goutte liquide, que l'on lave le support avec une quantité réduite d'un tampon usuel (par exemple tempon pH 7,2), que l'on sèche le support, que l'on applique sur ladite plage une goutte de l'antigène à titrer auquel on ajoute une quantité connue du même antigène marqué par un isotope radioactif. Après répétition des opérations de lavage et séchage susmentionnées, on effectue une mesure de radio- activité de la ou desdites plages. Cette dernière opération peut être effectuée de deux manières différentes : 1) soit par contact parfait entre le support et un film sensible (autoradiographie) , 2) soit en découpant chacune des plages et en effectuant un couplage de radioactivité dans des fioles appropriées.

Cette méthode de titrage d'antigène est dite par compétition.

L'application du support aux tests radio-immuno- logiques peut être également étendue aux titrages suivant un procédé analogue à celui de 1'ELISA sus-mentionné. D'autres avantages et caractéristiques de l'inven¬ tion apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif et se référant au des¬ sin annexé dans lequel :

La figure 1 représente une vue d'un support selon une première forme de réalisation de l'invention.

La figure 2 représente une vue d'un support selon une deuxième forme de réalisation de l'invention. 5 La figure 3 représente une vue d'un support selon une troisième forme de réalisation de l'invention.

La figure 4 représente une vue d'un support selon une quatrième forme de réalisation de l'invention.

La figure 5 représente une vue d'un support con- 10 tinu sous forme de ruban.

La figure 6 représente une vue d'un ensemble de supports lorsque le test est prêt pour la lecture des ré¬ sultats au microscope U.V. (supports recouverts de liquide de montage et de lamelle couvre-objet). 15 La figure 7 représente une vue d'un support adapté à l'utilisation du déplacement micrométrique de la platine d'un microscope.

En se référant -à la figure 1 , on voit un support selon l'invention comportant une feuille de matière .plas- 20. tique 1, plus précisément en polyester, ayant une épais¬ seur de 0,1 mm et des dimensions de 100 x 150 mm. Sur cette feuille transparente 1 , on a matérialisé six zones revêtues, de forme rectangulaire,, numérotées 1 à 5 et pourvues chacune de dix plages circulaires non revêtues 25 formant les plages hydrophiles, référencées 102 et ayant un diamètre 6 mm. Ces plages sont réparties sous forme de deux colonnes de cinq plages 102.

En dehors desdites zones de revêtement, de réfé¬ rences 1 à 6, le support présente encore une inscription 30 ("P. Falciparum") qui désigne l'antigène avec lequel, dans l'exemple décrit, on sensibilise les plages 102 une fois le support réalisé. La fabrication du support selon l'in¬ vention s'effectue en préparant une matrice ou original en papier ayant un aspect identique à celui représenté et en 35 faisant défiler les feuilles de plastique dans une machine

à photocopier usuelle du type d'une machine de xérographie de façon à appliquer le revêtement apparaissant en noir, revêtement constitué par l'encre séchée du procédé xérographique. On comprend que l'on peut fabriquer à très bas prix de revient un grand nombre de supports et ceci sous toutes les formes voulues et à la demande.

En se référant à la figure 2, on voit un support présentant, sur une feuille rectangulaire 103 de même na- ture que la feuille 101, deux zones de chaque fois quaran¬ te plages 104 disposées en huit rangées de cinq plages référencées 1 à 8 et 9 à 1b. Le pas des plages 104 est adapté au pas d'un distributeur automatique de goutte¬ lettes. Sur la figure 3» on a représenté un autre sup¬ port comprenant une feuille 105 avec une zone unique de revêtement de quatre-vingt-seize plages 106 disposées sur une matrice rectangulaire de huit lignes et douze colonnes référencées a à h et 1 à 12. Un tel support est particulièrement intéressant pour effectuer un balayage en immuno luorescen'ce après un clonage de cellule productrice d'anticorps monoclonaux. On se référé maintenant à la figure 4. On voit un support présentant la même conforma- tion que le support de la figure 3 mais dans lequel on a appliqué sur la feuille 107 une zone 108 siliconée laissant des plages 109. Des repères ou d'autres ' indica¬ tions peuvent être mis en place par exemple par xérogra¬ phie. Pour réaliser la zone 108, on dispose tout d'abord, par exemple à l'aide d'un distributeur de gouttes du genre "autodrop" vendu par la société FLOW LABORATORIES, une pluralité de gouttes de glycerol diluées au 1/4 dans de l'eau distillée ayant un volume de 13 μl au pas des plages souhaitées. On pulvérise ensuite sur la feuille un aérosol de soufre siliconé. Ensuite on lave la feuille pour éli-

miner le glycerol et, le cas échéant, on applique des ins¬ criptions, par exemple par xérographie ou par tout autre procédé, par exemple par impression.

Bien entendu, différentes autres techniques d'application de revêtements sont possibles. Ainsi, le revêtement par xérographie peut être remplacé par d'autres types de revêtement soit utilisant des principes simi¬ laires ^" mais avec des encres spéciales, soit encore par imprimerie ou sérigraphie. Une fois réalisés les supports tels que ceux qui ont été décrits, on sensibilise les plages hydrophiles telles que 102, 104, 106 et 109-

En se référant à la figure 5, on voit un support se présentant sous forme d'un ruban de polyester ou de polyvinyle ayant une épaisseur de 0,1 mm sur lequel on a appliqué, par sérigraphie ou de toute autre manière, un certain nombre de zones 111 laissant des plages hydrophi¬ les 112. Des lignes graphiques de séparation 113 peuvent être prévues éventuellement. Différentes inscriptions peuvent bien entendu être portées. Pour réaliser un tel support, on utilise de préférence un film d'acétate de po¬ lyvinyle ayant -une épaisseur de 0,1 mm permettant de réa¬ liser un enroulement du ruban.

Les différents supports selon l'invention peuvent être conditionnés sous forme stérile dans des sachets ou autres emballages en papier ou en matière plas¬ tique. Ils se prêtent au transport par la poste et peuvent donc être utilisés pour le prélèvement sur le terrain et l'envoi au centre ou laboratoire pratiquant les tests. Un exemple d'utilisation de ces supports va maintenant être décrit :

On prépare une suspension liquide d'antigène de Plasmodium falciparum de la façon suivante :

On utilise un support tel que celui représenté sur la figure 3. Ce support est placé sous un distributeur

automatique de gouttes du type "autodrop" qui distribue, au milieu de chacune des plages hydrophiles circulaires, une goutte d'antigène. La sensibilisation dure 16 heures à température ambiante. On effectue ensuite un lavage dans du tampon phosphate à pH 7,2 pendant une durée de 10 mn.

Après ce lavage, on réalise le séchage, par exemple en maintenant le support par l'un des bords de la feuille à l'intérieur d'un courant d'air chaud, par exemple en provenance d'un ventilateur, la feuille flottant librement dans le courant d'air. En moins de deux minutes, la feuille est sécnée.

Un prélèvement sanguin d'une personne suspectée d'être parasitée est effectué et ce prélèvement subit les dilutions suivantes : 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320. On applique une goutte de chacune des dilutions sur les différentes plages. On laisse incuber pendant une durée de 30 mn à l'étuve à 37°C. On répète les opérations de lavage et de séchage sus-mentionnées. On applique une goutte de conjugué fluorescent an i-iramunoglobulines hu- • aines, préalablerient porté à sa dilution optimale d'emploi. On répète les opérations d'incubation, de lavage et de séchage sus-.mentionnées.

La lecture peut être visuelle ou, le cas échéant, rendue automatique par des moyens d'analyse op¬ tique sensibles à la variation d'intensité lumineuse en fonction des agglutinations réalisées.

Pour une lecture au microscope, on étend sur les différentes plages, par exemple à l'aide d'un distributeur de gouttes, ou bien directement sur l'ensemble -de la ou des zones comprenant les plages du support, un liquide de montage usuel (glycérine tamponnée à pH 7,2 par exemple) et on recouvre ensuite immédiatement le support avec son liquide de montage d'une seconde feuille transparente de polyester ne portant . aucun revêtement. Il se forme ainsi une lamelle de liquide de montage entre les deux feuilles

d'acétate de polyester permettant la lecture aisée au microscope. On a. représenté sur la figure 6 un support 114 muni de huit zones, 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, de deux rangées de cinq plages hydrophiles 115, chaque zone ayant été recouverte de liquide de montage puis d'une lamelle 116 de taille légèrement supérieure. Ces lamelles se trouvent collées par le liquide de montage qui sèche progressivement. La lecture au microscope peut s'effectuer de façon usuelle. Le cas échéant, les supports peuvent être fixés sur la platine du microscope pour être adaptés au déplace¬ ment micrométrique de la platine, par exemple comme repré¬ senté sur la figure 7 sur laquelle on voit une feuille rec¬ tangulaire de faible largeur de matière plastique 117 munie de deux trous pour le passage des vis de la platine

118. Grâce à une feuille de matériau auto-adhésif usuel

119, on peut solidariser un support 120 selon l'invention (dont on ne voit qu'une partie dépourvue de revêtement), cette feuille pouvant ensuite être facilement séparée par enlèvement de la bande adhésive 119.

L'invention se prête aux tests par immunofluores- cence de pratiquement tous les antigènes, anticorps ou autres éléments susceptibles d'être contrôlés par ce genre de tests et notamment 1 ' im unofluorescence indirecte. Parmi ces applications, on peut citer notamment les affections suivantes : toxoplasmose, rubéole, syphilis, trypanosomoses, amibiase, paludisme, maladies virales, hydatidose, bilharzioses et autres maladies parasitaires, aspergilloses et autres maladies fongiques. L'invention n'est cependant pas limitée aux techniques d' immunofluorescence mais peut également s'é¬ tendre à d'autres techniques de tests. Ainsi, à titre d'exemple, l'invention peut être utilisée pour des tests de radio-immunodosage en remplaçant le marqueur d'immuno-

fluorescence par un marqueur radio-actif usuel. Une fois que la substance à tester est placée, aux dilutions conve¬ nables, sur les plages hydrophiles, il suffit d'appliquer étroitement, contre la feuille constituant le support, un film sensible. Le film sensible étant ainsi mis en contact parfait avec le support, on obtient alors un film impressionné fournissant immédiatement le résultat du test sans être obligé d'utiliser le lourd appareillage de comptage de radio-activité actuel, du fait que, grâce au contact immédiat du film, on élimine la zone de flou latéral due à l'émission du rayonnement. .ans un dosage parfaitement quantitatif, on découpe chacune des plages hydrophiles et on effectue un couplage en les éluant dans un liquide de comptage approprié. Dans le cas d'une application aux tests du type

ELISA, on utilise un conjugué marqué par une enzyme (telle que peroxydase, phosphatase, p -galactosidase) et une seule dilution du sérum est suffisante, la lecture s'effectuant par détermination avec la concentration en anticorps réa- gissants.

On a constaté que l'on peut utiliser les suports selon l'invention en mettant en oeuvre un chromogène qui polymέrise sur la plage du support au fur et à mesure qu'il se colore par oxydation (par exemple diamino- benzidine en tampon Tris HC1 + eau oxygénée). Par exemple dans le cas d'un sérum réagissant avec un antigène Kyste hydatiq e, on obtient une coloration brune sur la plage hydrophile du support.

Bien entendu, l'invention s'applique également aux tests indirects ou inverses avec sensibilisation ini¬ tiale d'anticorps sur les plages hydrophiles du support.

Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien en¬ tendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter diverses modifications de forme ou de matériau

sans pour cela s'éloigner ni de son cadre, ni de son esprit.