L'invention concerne essentiellement un nouveau dérivé organique d'un métal à structure phospholipidique, l'utilisation de ce dérivé comme agent biomédiateur, un procédé d'isolement de ce dérivé et des compositions pharmaceutiques le contenant. Dans l'état actuel de la technique, on a réalisé diverses formulations du vanadium en vue de le rendre biodisponible dans le cadre du traitement de l'hyperglycémie. Les formulations réa-Usées jusqu'à présent sont encore très insuffisantes par le ^' fai.t que leur biodisponibi Lité est très faible, voire inexistante. Par ailleurs, il est connu d'utiliser divers extraits de plantes comme agents thérapeutiques. Par exemple, dans le document EP-A-0 266 468 (Natura Médica), il est décrit une composition thérapeutique comportant un extrait organique de plante de la famille des résédacées utile comme agent anti-inflammatoire. De même, dans le document FR-A-2 611 502 (Natura Médica ⁾ , il est décrit un extrait de racine d'ombeLLifere obtenu par extraction hydro-alcoolique et son utilisation comme agent thérapeutique ayant une activité diurétique, cardio-vasculai re, antalgique ou anti¬ inflammatoire. Egalement, il est décrit dans Le document FR-A-2 624 737 (Natura Médica), un extrait de feuille de cassis obtenu par extraction hydro-alcoolique et son utilisation comme agent thérapeutique ayant une activité antalgique et anti- infLammatoi re.

Ces extraits de plantes décrits dans ces documents sont très intéressants mais ils ne permettent pas de traiter effica- cernent des affections qui nécessitent l'emploi de métaux possédant une valence au moins égale à 3. Or, dans l'état actuel de la technique, les propositions de formulation de métaux possédant une valence au moins égale à 3 en vue de les rendre biodisponibles ont échoué car leur biodisponibilité est faible et leur toxicité élevée.

La présente invention a donc pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle formulation de métaux, de préférence de métaux possédant une valence au moins égale à 3, présentant une excellente bio- disponibilité ainsi qu'une très faible toxicité.

De préférence, cette nouvelle formulation doit être simple à préparer et être suffisamment stable dans le temps pour permettre l'utilisation thérapeutique dans les meilleures conditions. La présente invention résoud les problèmes techniques énoncés ci-dessus d'une manière extrêmement simple, en fournissant La formulation d'un métal, de préférence d'un métal de valence au moins égale à 3, qui présente une biodisponibilité remarquable, ainsi qu'une très faible toxicité et une excellente stabilité dans le temps.

Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un nouveau dérivé organique d'un métal, caractérisé en ce qu'il est constitué par un dérivé d'un métal, de préférence de valence au moins égale à 3, avec un composé organique comprenant au moins un phospholipide conférant une hydrosolubilité ou hydro- miscibi lité au dérivé organique dudit métal.

Selon une variante de réalisation avantageuse, le métal précité est lié à la fonction phosphate du phospholipide.

Selon une autre variante de réalisation, le métal précité est lié à un groupe porphyrine.

Selon un mode de réalisation avantageux, le phospholipide comprend au moins un acide gras insaturé, de préférence en position oc ou β par rapport à l'acide phosphorique.

Selon un mode de réalisation avantageux, cet acide gras insaturé est un acide gras poly-insaturé, de préférence sans conjugaison des liaisons éthyléniques. Avantageusement, cet acide gras poly-insaturé sans conjugaison des liaisons éthyléniques a une chaîne en C _1R à C_ _n et est choisi parmi l'acide 9, 12-linoléique, l'acide 9, 12, 15-linolénique, l'acide 5, 8, 11, 14-arachidonique. Encore de préférence, il s'agit de l'acide α-linolénique ou γ-linolénique.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le phopholipide précité comprend au moins une fonction acide phosphorique, de préférence conjuguée avec une insaturation de la chaîne phospholipidique. Cette fonction acide peut être soit sous forme libre, soit sous forme liée à un groupement ammonium quaternaire non substitué ou substitué, ou- alkylamine dans lequel le groupe alkyle est un groupe alkyle inférieur en C..-C ₅ , de préférence en C_j-C,.

Selon une autre variante de réalisation particulièrement avantageuse, le substituant alkylamine est lié par sa fonction a iné à un phénol ou un acide phénolique de préférence de la série ^' des acides caféiques. Comme acide caféique particulièrement préféré, on citera l'acide caféique, férulique, chlorogénique, salicylique ainsi que ses dérivés tels que l 'aldéhyde' sali c lique, le salicylate d'alkyle inférieur en C.-C,., en particulier le salicylate de méthyle, le monotropitoside, le spiréoside, l ' hyperoside, le salicoside ou le salicine.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, le substituant alkylamine peut être lié à un phénol ou un acide phénolique lui-même lié à un sucre en C _r ou C,, en z> o particulier Le annitol ou Le mannose.

La chaîne phospholipidique est de préférence au maximum de 60 atomes de carbone.

Le métal précité, de préférence de valence au moins égale à 3 est avantageusement fixé à une fonction phosphate ou à un groupe porphyrine. Les métaux M de valence au moins égale à 3 sont de préférence choisis parmi Se, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Ge, Sb, Sn, In, Pd, Rh, Ru, Te, Mo, Nb, Zr, Y, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Tl, Pb, Bi, Po. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, une deuxième fonction acide de l'acide phosphorique peut être salifiée par un ion de valence inférieure à 3 plus léger que les métaux précédents et choisis, par exemple, parmi le Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg et Ag. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le dérivé organique d'un métal est

caractéri sé en ce qu' i l présente la formule chimi que généra le suivante :

C - R, i ' C - R-, i <-

C - R,

dans laquelle :

R 1- = soit un acide gras en C-Io, à C__,_u _n ayant avantageusement un faible degré d' insaturation, en particulier une double liaison), = soit un noyau porphyrine lié à un métal M. ayant une valence supérieure ou égale à 3 telle que précédemment définie, = soit un groupe X-OH dans lequel X = (CH ₂ ) _n , n étant égal à 0, 1 ou 2.

R_ 2. = soit un acide g ^a ras insaturé de C„16. à C2 _n 0 de préférence ayant au moins 2 degrés d'insaturation, = soit une fonction phosphate de formule :

0 ₃

- 0 - P - 0, - R,

?1

M 2

R.. = soit un acide gras insaturé en C-, à C _2n tel que défini pour R. ou R , = soit un groupe phosphate de formule :

0 il - 0 - P - 0 - R.

I 4

0 i

^M 2

à la condition que R- et R, ne peuvent pas être simultanément un groupe phosphate.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

R, = soit H, soit un groupe ammonium quaternaire (non substitué ou substitué, en particulier avec un groupe ionique positif lui-même lié à R5, dans lequel Rς égale un composé organique en C_- minimum de préférence choisi parmi un sucre, un acide phénolique) ; soit un groupe alkyl en C.-C---amino libre ou lié à Rr ; dans la formule précédente, une fonction acide libre du groupe phosphate de R^ ou R, peut être salifiée par un métal M-, de valence inférieure ou égale à 2, en particulier choisi parmi le Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg et Ag ; M _? étant l'hydrogène ou un métal similaire à M^ . Dans le cas d'une substitution en R- par un noyau porphy¬ rine, ce cycle est caractérisé par la formule générale suivante :

dans laquelle A_., A^, A-,, A,, Aç, A,, A-,, A„ sont choisis indépen¬ damment parmi les substituants usuels des chloroph lles, en particulier l'hydrogène, un alkyle inférieur en _,-C _c à chaîne droite, ramifiée ou cyclique, un radical vinyle, formyle et ses esters, acétyle et ses esters, propionyle et ses esters, acrylyle et ses esters, et cyclopentanoyles,

M_. étant un métal de valence au moins égale à 3, tel que précédemment défini, et l'un au moins parmi A_. à Ag étant obligatoirement un substituant phospholipidique tel que précédemment défini.

Les substituants précités usuels de la chlorophylle sont en particulier ceux décrits par Hendry et Jones dans la revue Journal of Médical Genetics, 1980, 17, 1-14, et en particulier au tableau 1, page 5. De préférence, la valence d'au moins un métal M. ou M-, ^{est égale à 3} . FEUIL E DE REMPLACEMENT

Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le nouveau dérivé organique de métal selon l'invention tel que précédemment défini est isolé à partir d'une plante, de préférence issue des familles suivantes : - Légumineuses, en particulier le soja, la fève, le pois, le pois chiche, la luzerne, l'avoine ;

- les Plantaginées, en particulier les plantains,

- les Crucifères, en particulier le colza, le chou, le cresson, - les Salsolacées, en particulier l'épinard,

- les Urticacées, en particulier les orties dioica, urens et les pariétaires ;

- les Oπbellifères, en particulier angelica archan elica et angelica sinensis, et foeniculum dulce ; - les Résédacées, en particulier Réséda, phyteuπa, lutea, alba, luteola.

Selon un second aspect, la présente invention concerne un procédé d'isolement du nouveau dérivé organique d'un métal, tel que précédemment défini, caractérisé en ce qu'il comorend : a) l'extraction d'une plante aporooriée connue pour contenir l'un des métaux Drécités, par macération dans un solvant hydro-alcoolique pendant une durée suffisante pour extraire ledit dérivé organique de métal, en obtenant ainsi un extrait brut ; b ⁾ on élimine le solvant de l'extrait brut DOUΓ obtenir un produit pulvérulent brut contenant ledit dérivé organique de métal ; c) le produit pulvérulent brut obtenu est redissous dans un minimum d'e.au non ionisée, ou distillée, puis soumis à une précipitation par un solvant organique, de préférence choisi parmi des solvants miscibles à l'eau, et sélectionné en fonction de l' hydrophi licite du composé métallique recherché ; d) et éventuellement, le précipité ODtenu contenant le dérivé organique de métal recherché à l'état pur, est soumis à un échange métallique pour obtenir le sel d'un nouveau métal différent de celui contenu initialement dans la plante. Selon une variante de réalisation préférée, pour laquelle la fonction acide phosphorique est liée à un second métal

(M,), de valence inférieure ou égale à 2, de préférence choisi parmi le groupe consistant du calcium, du strontium, du zinc, du lithium, magnésium ou argent, le produit pulvérulent brut est soumis à une précipitation à l'aide d'une solution saturée en chlo- rure de cadmium pour obtenir un précipité qui est séparé par cen- trifugation, puis redissous dans une solution carbonatée, par exemple de carbonate d'ammonium, puis reprécipité avec un solvant organique miscible à l'eau, de préférence un alcool ou une cétone, en particulier un alcool inférieur tel que le méthanol, l'éthanol ou le propanol. On peut améliorer la purification de manière clas¬ sique par plusieurs étapes de précipitation au solvant organique - dissolution dans l'eau.

Le dernier précipité contient le dérivé organique du métal selon l'invention, recherché, à l'état pur, éventuellement mélangé avec de faibles proportions d'autres métaux.

Selon un mode de réalisation particulier de ce procédé, lorsqu'on désire changer le métal lié au phospholipide, le produit précipité obtenu est redissous dans une solution aqueuse contenant Le métal que l'on souhaite incorporer, puis on réalise une nouvelle précipitation au solvant organique miscible à l'eau précité, qui permet d'obtenir le dérivé organique du métal souhaité, selon l ' invention.

Selon une autre variante de réalisation du procédé selon l'invention, le solvant d'extraction utilisé pour obtenir l'extrait brut de la plante est avantageusement choisi parmi les mélanges eau/alcool inférieurs en C.-C,, de préférence choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le n-butanol ou l'iso-butanol. En particulier, la proportion eau/alcool est avantageusement comprise entre 75 et 99% d'eau/1 à 25% d'alcool, en poids.

L'identification du dérivé organique du métal selon l'invention peut être réalisée par une technique de chromatographie sur couche mince de gel de silice qui est bien connue à l'homme de l'art, en particulier à l'aide des trois solvants ci-dessous : - chloroforme/méthanol à 90/10 en volume

- isopropanol/eau 95/5 en volume

- éther éthylique/ éthanol 50/50 en volume

Le chromatogra me est ensuite révélé à la ninhydπ ^' ne. On observe normalement une seule tâche.

Selon une autre variante d'identification du nouveau dérivé organique de métal selon l'invention, on redissout tout d'abord le dérivé organique de métal purifié tel qu'obtenu selon le procédé précédemment décrit, dans une solution aqueuse qui est ensuite additionnée à part égale avec une solution d'acide chlorhydrique 2N puis à l'étuve à 80 C pendant plusieurs heures, en particulier environ 8 h.

La solution obtenue est ensuite soumise à des techniques habituelles d'identification des composés recherchés.

Par exemple, les acides gras sont identifiés par chroma- tographie en phase gazeuse ; - les phénols et acides phénoliques sont identifiés par chromatographie liquide à haute performance et détection dans l'ultraviolet ;

- les sucres et les glycérides sont identifiés par HPLC et détection par un appareillage capable de mesurer un nombre de particules après élimination du solvant par vaporisation, par exemple un appareil commercialisé par T0UZART et MATIGNON, ayant la dénomination commerciale SEDEX 45 ;

- La porphyrine est identifiée par chromatographie sur couche mince selon les techniques classiques d'identification de la porphyrine,

- le métal est identifié par spectroscopie d'absorption atomique et torche à plasma, l'appareil étant naturellement réglé en fonction du métal à identifier, par exemple appareil de Applied Research Laboratories, USA, modèle 3 580 0ES. Le nouveau dérivé organique de métal selon l'invention précédemment décrit, peut naturellement être préparé par voie de synthèse à partir des constituants correspondants que l'on fait réagir dans des conditions opératoires connues de l'homme de l'art.

On observera que des sources aisément accessibles à la préparation de ce nouveau dérivé organique de métal selon l'invention sont constituées non seulement par les plantes

précitées, mais également par des parties issues des biotechno¬ logies comme la culture in vitro des végétaux, ou des cultures dites de cals, c'est-à-dire des blocs de cellule différenciés, multipliés à partir de cellules riches en complexe ou fraction de complexe, ou des parties d'organes animaux. Ces diverses parties d'organes ou organismes cellulaires sont soumises à des traitements d'extraction spécifiques. Comme il résulte de la discussion précédente, dans le cadre de l'invention, seuls les extraits réalisés à partir d'un solvant présentant une polarité par rapport à la silice du même ordre que celle d'un solvant préparé à base d'eau et d'éthanol dans les proportions précédemment indiquées de 75 à 99% d'eau et de 1 à 25% d'éthanol, permet d'obtenir un dérivé organique de métal brut qui permet d'isoler directement ou indirec¬ tement le nouveau dérivé organique de métal selon l'invention. Selon un troisième aspect, l'invention couvre également une utilisation du dérivé organique de métal selon l'invention, présentant de préférence une valence au moins égale à 3, comme agent biomédiateur ou comme principe actif pour la fabrication de produit à usage thérapeutique. En effet, les dérivés organiques de métal selon l'invention, présentent une activité immunomodulatrice et peuvent dans ce cadre être utilement utilisés pour traiter toutes les déficiences immunitaires, y compris Le sida, ou une activité neuro-- modulatrice, ou une activité anti-inflammatoire ou encore une activité antirhumatismale, en particulier pour lutter contre la polyarthrite rhumatoîde.

Ainsi, selon un quatrième aspect, La présente invention couvre encore une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre d'ingrédient actif, au moins un dérivé organique d'un métal selon l'invention tel que précédemment défini. Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, cette composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition pharmaceutique à activité immunomodu¬ latrice ou neuro-modulatrice, ou anti-inflammatoire ou anti- rhumatismale, en particulier anti-polyarthrite rhumatoîde ou à activité hypoglycémianté ou anti-sclérose en plaque.

Des composés particulièrement préférés sont un dérivé organique d'un métal selon l'invention dans lequel un atome d'or est lié à un phospholipide ayant une activité anti rhumatoîde, en particulier contre 'la polyarthrite rhumatoîde. Un autre dérivé particulièrement préféré est un dérivé d'un métal selon l'invention dans lequel le métal est l'aluminium lié à un phospholipide, dont l'acide gras est l'acide α-linolénique tandis qu'un groupement ferrulique choline est lié en haut de chaîne phosphorique ou phospholipide, ce composé étant extrait à partir de Réséda phyteu a et ayant une activité anti-inflammatoire marquée.

Un autre composé préféré selon l'invention est un composé dont le métal est Sb ou un couple Sb/Sn de préférence ^• obtenu à partir de l'espèce Angelica, en particulier Angelica archangelica, et Angelica sinensis ayant une activité immuno-modulatrice particu¬ lièrement efficace notamment contre le virus HIV.

Encore un composé particulièrement préféré de l'invention est un composé dont le métal est le vanadium, obtenu à partir d'urtica dioica, ayant une activité hypoglycémiante rémanente. Les doses d'utilisation du nouveau dérivé organique d'un métal selon l'invention sont de 100 à 300 g d'un lyophilisât final contenant au plus 5% du dérivé organique de métal selon l'invention, pour une gélule gastro-résistante. Habituellement, une dose de 200 mg de produit pulvérulent purifié, par exemple sous forme de lyophilisât, a une teneur en métal inférieure à 1 mg.

Ce produit pulvérulent, purifié, par exemple sous forme de lyophilisât peut être dissous dans un solvant aqueux à la dose de 5% de façon à réaliser des formes galéniques injectables, ou instillable ou permettant par exemple une utilisation en aérosol. Une des voies d'administration préférée est celle des voies muqueuses (perlinguale, pernasale, suppositoire, collyre).

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention.

Dans les exemples les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire.

Exemple 1 Dérivé organique de Sb à partir d'Angelica archangelica

La plante Angelica archangelica est cueillie entière à la maturité des graines puis séchée dans les règles de l'art et grossièrement broyée puis agitée mécaniquement pendant 4 à 6 jours dans un mélange à 60 C de dix fois son poids d'eau et une fois son poids d'éthanol à 95% en volume.

Après refroidissement à la température ambiante, on réalise une filtration tangentielle dans un filtre ayant .un diamètre de pore à 0,2 μm, puis on concentre en moyenne dix fois par osmose inverse. On procède enfin à l'enlèvement total du solvant hydro¬ alcoolique par lyophilisation, en obtenant ainsi un extrait brut sous forme de lyophilisât.

On redissout l'extrait brut dans un minimum d'eau distillée, à raison de 5 g pour 10 ml. Après dissolution complète dans l'eau, on soumet la solution aqueuse obtenue à une précipitation par l'éthanol ou le méthanol. Et on sépare le précipité. On recommence trois fois et le dernier précipité, constitue le dérivé organique de ^• Sb selon l'invention. Ce dérivé organique comprend en pratique un mélange de

Sb/Sn en quantité sensiblement égale.

Les caractéristiques de ce produit purifié ainsi obtenu sont les suivantes : produit huileux noirâtre, miscible à l'eau dans lequel on peut identifier après digestion nitrique le métal, soit par la réaction à la Rhodamine B bien connue du chimiste ana¬ lyste, soit par spectrographie d'émission atomique.

Exemple 2

Dérivé organique d'aluminium à partir de Réséda phyteuma En partant de la plante Réséda phyteuma, on procède comme décrit à l'exemple 1, mais le dernier précipité est ensuite dissous

dans une solution diluée d'acide minéral tel que l'acide chlorhy- drîque 2N puis précipité par le solvant organique ayant permis sont extraction, par exemple l'éthanol ou l'acétone.

Ce précipité constitue le dérivé organique de l'aluminium selon l'invention, ayant principalement l'aluminium fixé par une liaison phosphate à une structure phosphatidylcholine, elle-même liée à l'acide ferrulique.

Ce dérivé organique d'aluminium selon L'invention présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes : produit gras de couleur verte, miscible à l'eau et présentant les réactions de la choline, de L'aluminium et dans lequel on peut mettre en évi¬ dence le phospholipide par chromatographie sur couche mince.

Exemple 3 Dérivé organique de vanadium à partir d'Urtica dioica

On procède comme décrit à l'exemple 1 en partant de la plante Urtica dioica, jusqu'à l'obtention du dernier précipité.

Celui-ci constitue le dérivé organique de vanadium selon l'invention, dans lequel le vanadium, sous forme V , est inclus soit dans le cycle porphyrinique qui est Lui-même substitué par un phospholipide salifié par un ion vaπadyle.

Les caractéristiques physico-chimiques de ce dérivé organique de vanadium selon l'invention sont les suivantes : poudre cristalline brune, soluble à L'eau, dont La solution présente une activité hypoglycé iante, la poudre ne présente pas de point de fusion mais se décompose.

Exemple 4

Dérivé organique d'or à partir de Ribes nigru On procède comme décrit à l'exemple 1 en partant de la plante Ribes nigrum jusqu'au dernier précipité qui constitue le dérivé organique d'or selon l'invention qui comprend principalement de l'or souuss llaa ffoorrmmee AAuu ffiixxéé ssuurr llee pphhoosspphhoolliippiiddee.. Ce dérivé oorganique d'or présente les caractéristiques suivantes :: ffoorrmmee AAuu ,, ppoouuddrree bbrrun vert, soluble à l'eau, pas de point de fusion mais se décompose.

Exemp le 5

Dérivé organique d'un métal ayant une valence au moins égale à 3 inclus dans un cycle porphyrinique

On peut obtenir un dérivé organique de Se, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Ge, In, Pd, Rh, Ru, Te, Mo, Nb, Zr, Y, Hf, Ta,

W, Re, Os, Ir, Pt, Tl, Pb, Bi, Po, en partant du dérivé organique de métal selon l'invention tel qu'obtenu à l'un quelconque des exemples 1 à 4, en procédant ensuite de la manière suivante.

Le dérivé organique de métal selon l'invention purifié obtenu en fin de procédure de l'un quelconque des exemples 1 à 4, est dissous dans une solution faiblement acide d'acide minéral tel que l'acide chlorhydrique 2N puis précipité par un .solvant organique ayantpermis son extraction, par exemple l'éthanol ou le méthanol. Ce précipité après centrifugation est redissous dans.une solution aqueuse contenant le métal que l'on souhaite incorporer à la porphyrine. Une dernière précipitation par ledit solvant organique permet d'obtenir le dérivé organique de métal selon l'invention présentant au minimum 50% de la dose théorique en métal souhaitée, possédant une valence au moins égale à 3. Exemple 6

Préparation d'un dérivé organique de métal selon l'invention comportant une fonction alkylamine

Le lyophilysat obtenu après extraction de Reseda Phyteuma selon la technique décrite à l'exemple 1 est repris par de l'eau distillée puis reprécipité par de l'acétone en proportion volumique

1/1.

Le précipité huileux est isolé par centrifugation, lavé par de l'acétone pure, repris par un volume d'eau distillée, puis lyophilysé en présence de 10 % de maltodextrine (poids/volume).

Après identification et dosage du métal par absorption atomique selon la technique d'absorption atomique classique à l'aide de l'appareil commercialisé par la société Américaine Applied Research Laboratories, modèle 3 580 OES. La poudre liophylisée obtenue peut être utilisée directe¬ ment à des fins thérapeutiques, comme décrit plus loin.

Exemp le 7

Préparation d'un dérivé organique de métal selon l'invention, com¬ portant une fonction alkylamine liée à un acide phénolique' choisi parmi les acides ferruliques, caféiques, ou chlorogéniques. A partir du dérivé de l'exemple 6 précédent comportant une fonction alkylamine, la fonction aminé peut être liée à un acide phénolique de la manière suivante.

Le lyophilisât obtenu à partir de Spirea ulmaria est remis en solution dans 2 parties d'eau distillée, puis reprécipité au moyen d'acétone en quantité suffisante.

Le précipité séparé par centrifugation est solubilité dans une solution d'acide chlorhydrique 2N, puis reprécipité à nouveau par une solution d'éthanol à 95 % en volume en quantité suffisante. Après centrifugation, un échantillon de la masse obtenue est repris par de l'eau distillée, puis on titre à froid par une solution éthanolique d'acide ferrulique à 0,1 % en quantité suffisante jusqu'à apparition d'un trouble, ou à l'aide d'un poten- tiographe, en vérifiant le point d'inflexion.

La concentration en acide ferrulique à rajouter au reste du précipité est déduite du dosage ci-dessus.

On procède de manière similaire avec l'acide caféique, ou l'acide chlorogénique.

Exemple 8 Préparation d'un dérivé organique de métal selon l'invention lié à une fonction alkylamine elle-même liée à un dérivé de l'acide salyci ligue

On procède de la même manière qu'à l'exemple 7, on obtient un produit amorphe, blanc jaunâtre, soluble à l'eau à odeur très caractéristique.

Exemple 9

Exemple de formulation d'agent biomédiateur selon l'invention

Selon une première variante de réalisation, un agent biomédiateur selon l'invention est formé par le produit obtenu directement à l'état brut dans l'un quelconque des exempLes 1 à 9.

Selon une autre variante de réalisation avantageuse, l'extrait brut obtenu à l'un quelconque des exemples 1 à 9, sous forme de produit sec, est mélangé avec 5% de son poids de malto- dextrine jusqu'à parfaite homogénéité, puis stocké. Ce mélange constitue le principe actif d'une composition pharmaceutique selon l'invention tel que formulé par exemple dans les exemples suivants. ^'

Exemple 10

Composition pharmaceutique selon l'invention Exemple de spécialité de gélule gastrorési.tance

Le produit obtenu selon l'un quelconque des exemples 1 à 9, est additionné de son poids de stéarate de magnésium et de dix fois son poids de cellulose microcristalline puis intimement homogénéisé, le mélange obtenu est réparti au moyen d'un équipement adapté de répartition en gélule de gélatine module 2 à raison de 240 mg par unité.

Les gélules ainsi dosées à 25 mg d'extrait sont enrobées au moyen d'un appareil de gomme arabique, d'ester de cellulose et d'oxyde de titane. Après séchage, les gélules obtenues sont gastro- résistantes et conditionnées sous blister en plaquettes de 15 regroupées en étui de 2.

Exemple 11

Composition pharmaceutique selon l'invention Spécialité de soluté nasale

Le produit obtenu à l'un quelconque des exemples 1 à 9 est dissous en raison de 5 mg par ml dans un excipient à usage de nébulisation nasale à base de sérum physiologique, de glycérine de monoéthyléther de diéthyleneglycol. La préparation est conditionnée en flacon polyéthylène de 30 ml équipé d'une canule de pulvérisation nasale délivrant 0,1 ml par pression.

Exemp le 12

Essai pharmacologique A - Recherche d'une activité immuno-modulatrice Le dérivé organique d'un métal Sb/Sn obtenu à l'exemple 1 est soumis à des essais de mise en évidence d'activité immuno- modulatrice, selon la procédure suivante.

1 - Protocole

Les effets recherchés seront testés in vitro sur les cellules impliquées dans la réponse i mune (lymphocytes - monocytes et macrophages).

I. Cellule (cellules humaines) :

Paramètres et fonctions cellulaires étudiés : - Marqueurs membranai res,

- Activation lymphocytaire et prolifération ly phocytai re,

- Métabolisme oxydatif des monocytes.

1. Marqueurs membranaires : L'expression d'antigènes membranaîres sera étudiée en cytomètre de flux en présence et en absence de chacun des produits.

Protocole utilisé :

A partir du sang périphérique prélevé sur EDTA ou hépa- rine, séparation de la population lymphocytaire.

Marqueurs étudiés :

- CD3 - CD4 - CD8 - B4 pour les lymphocytes,

- M02 pour les monocytes Ces marqueurs sont repérés par les anticorps monoclonaux correspondants qui, après fixation, sont visualisés par un anti¬ corps anti-Igl humain conjugué à un fluochrome (GAM-FITC) .

L'étude de la répartition des cellules portant les marqueurs est faite au cytomètre de flux dont dispose le labora- toire (COULTER Epies profile).

- les doses testées : Di lut i ons f i na les 1 /20 - 1 / 100 * durée d ' i ncubat i on : . courte TO-730 mi n - T60 mi n . longue TO 18 h - 24 h .

Matériel nécessaire :

- cytofluomètrie de flux ⁽ COULTER epics profile),

- incubateur à C02,

- réactifs : . milieu RPMI

. marqueurs lymphocytai res :

* anticorps monoclonaux anti CD3 ,

* anticorps monoclonaux anti CD4

* anticorps monoclonaux anti CD8 * anticorps monoclonaux anti B4

* anticorps anti M02

* GAM FITC.

2. Activateur et prolifération lymphocytaire Les lymphocytes humains sont recueillis du sang péri¬ phérique par centrifugation sur gradient de Ficoll.

2.1 Activation

L'activation est testée dans deux circonstances : - effet d'activation directe du produit sur les cellules,

- effet modulateur du produit vis-à-vis de l'activation par des substances activatrices = PHA - conA - PMA (phorbo myπ ^' state acétate).

Dans les deux cas, l'activation est appréciée par l'appa- rition des marqueurs membranaires de l'activation des lymphocites :

- CD25 (ou récepteur de l'I12),

- antigène HLA-DR : 12.

Ces deux marqueurs sont évalués en cytomètπ ^' e de flux.

Protocole :

Les cellules sont :

- d'une part mises en présence des 2 doses de chaque produit pen¬ dant 24 h et testées ensuite par comparaison avec des cellules non traitées,

- d'autre part, cultivées en présence de PHA, de conA et PMA avec ou sans produit pendant 24 h.

L'incubation à lieu à 37 C en atmosphère humide avec 5 % de C02. Les résultats sont appréciés au cytomètre de flux.

Matériel nécessaire : - cytofluoπ ^' mètre de flux,

- incubateur à C02,

- milieu RPMI,

- milieu Ficoll-hypaque,

- Réactifs :

* phytohémagglutinine

* PMA

* anticorps onoclonal anti CD25

* anticorps monoclonal anti 12

2.2 Prolifération

Les lymphocytes activés peuvent, ou non, proliférer sous l'effet de certaines drogues.

Comme l'activation, la prolifération sera testée dans les 2 circonstances :

- prolifération directe sous l'effet du produit,

- modulation par chaque produit de la prolifération obtenue par les mitogέnes PHA et conA.

Le protocole est le même que ci-dessus. g La prolifération est évaluée au 4 jour d'incubation par incorporation dans le noyau des cellules proliférantes de pré¬ curseur radioactif du DNA (thymidine tritiée) : l'importante proli¬ fération est indiquée par la radioactivité appréciée dans l'extrait cellulaire obtenue au 5 jour de l'incubation.

Matériel nécessaire :

- incubateur à C02,

- extracteur d'ADN type SKATRON,

- compteur isotypique à scintillation liquide,

- Réactifs :

* mi lieu RPMI

* Ficoll hypaque

* sérum foetal de veau * PHI

* thymidine tritiée

3. Métabolisme oxydatif des monocytes : .

L'activation des monocytes macrophages stimule leur méta- bolisme oxydatif qui peut facilement être étudié par cytomètrie- de flux en mettant à profit l'oxydation du dichlorofluorescéine dont seule la forme oxydée est fluorescente, donc seule les cellules activées deviennent fluorescentes et sont repérées par le cytomètre de flux. Par ce moyen, il sera donc possible d'étudier :

- l'activation directe des cellules par le produit,

- l'effet modulateur du produit sur leur activation par PMA.

Protocole Les leucocytes séparés du sang périphérique sont d'abord mises en contact avec DCF puis :

- soit avec seulement le produit : à différentes concentrations des cellules non traitées par PMA de témoins positifs,

- soit avec le produit et PMA les contacts sont faits en bain-marie thermostaté en agitation continue et les lectures sont faites au cytomètre de flux toutes les 5 min et jusqu'à 1 h 30, le burst oxydatif n'excédant pas cette durée.

Les cinétiques d'activation sont ensuite comparées :

Matériel nécessaire :

- cytofluori ètre de flux.

- bain-marie thermostaté à agitation continue,

Réactifs :

* Ficoll hypaque * dichlorofluorescéine,

* PMA.

2 - Résultat

2-1 Effet du dérivé de Sb/Sn de l'exemple 1 sur le marqueur d'acti- vation CD25 récepteur d'IL2 : Le produit de l'exemple 1 (500 μg^ incubé avec les lym¬ phocytes séparés par gradient de Ficoll et activés par la PHA (Phyto hémagglutinine) pendant 24 h, montre un effet inhibiteur sur l'apparition des récepteurs d'IL2.

Résultats exprimés en % de récepteurs d'IL2 (CD25)

2-2 Effet de Sb/Sn de l'exemple 1 sur la prolifération des lympho¬ cytes mis en culture avec la lectine PHA pendant 72 h :

Le produit de l'exemple 1, en solution à 5 g pour 100 ml, mis en contact avec les lymphocytes séparés par gradient de Ficoll et cultivés avec la lectine PHA pendant 72 h, montre une inhibition importante de la prolifération lymphocytaire.

Après incorporation de thy idine tritiée, les résultats sont exprimés en nombre de coups par minute (cpm).

2-3 Effet de Sb/Sn de l'exemple 1 sur l'expression des Ag membra- naires lymphocytai res : Le produit de l'exemple 1 (500 μg) incubé pendant 1 h avec les lymphocytes séparés par gradient de Ficoll, ne donne pas de modification significative au niveau de l'expression des Ag lym¬ phocytai res des 2 sujets étudiés.

Résultats exprimés en pourcentage

2-4 Effet de Sb/Sn de l'exemple 1 sur le métabolisme oxydatif des leucocytes humains, étudié en cytomètrie de flux :

L'étude cinétique des leucocytes humains, en présence de dichloro fluorescine, marqueur de IΗ202 intracellulaire, et sti¬ mulés par le Phorbol myristate acétate, montre un métabolisme oxy¬ datif diminué au cours du temps lorsque le produit de l'exemple 1 leur est ajouté, comme cela résulte des courbes de la figure 5. A la figure 5, les courbes •—•, •—•, •...• représentent La réponse immunitaire à l'action de stimulation causée par Le Phorbol myristate acétate seul, respectivement pour les polynucléaires, les monocytes et les lymphocytes, tandis que les courbes A—A, A—' ^• A, A...A représentent Les réponses immunitaires respectivement causées par Le Phorbol myristate acétate en présence du produit de l'inven¬ tion Sb/Sn de l'exemple 1.

On constate une diminution très significative de la réponse immunitaire.

B - Activité anti-inflammatoire

On recherche une activité anti-inflammatoire avec Le dérivé organique d'aluminium selon l'invention obtenu à l'exemple 2, selon La procédure suivante basée sur l'oedème au kaolin.

Oedème au kaolin - technique de Winter modifiée (1 ⁾ Introduction

L'injection de kaolin sous L'aponévrose plantaire de la patte postérieure du rat provoque une réaction inflammatoire aiguë qui peut être réduite par Les substances anti-infLammatoi res. Cette réaction inflammatoire se traduit par un oedème d'installation rapide et persistant 48 h ce qui permet d'obtenir une cinétique d'activité des anti-inflammatoires.

Matériel et méthodes

1 - Animaux

Des rats mâles de couche Wistar (12 par lot) provenant du centre d'élevage de Montpellier ont été utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus en observation pendant 4 jours avant le début des essais. En début d'essai les animaux pèsent en moyenne 90 g. Pendant La période d'observation les animaux, répartis par cage de 5, reçoivent nourriture et eau de boisson ad libitum et sont soumis à une température comprise entre 21 et 23 C et a un cycle jour/obscurité de 12 h.

2 - Produits

- Dérivé organique d'aluminium de l'exemple 2,

- Indometacine (INDOCID^ 250),

- Kaolin tamisé, - Excipients,

- sérum physiologique.

3 - Protocole

Les animaux sont mis à jeun de nourriture La veille. Le jour du test les rats sont anesthésiés à l'éther. Une incision est pratiquée dans la partie supérieure de l'abdomen et le nebulisat

injecté dans l'anse duodénale à l'aide d'une seringue. La paroi musculaire est ensuite saturée et La peau refermée a l'aide de 2 agrafes. La suspension de kaolin est injectée 1/2 h après (0,1 ml - solution 10g% dans du sérum physiologique) dans le coussinet plantaire de la patte postérieure droite. Un lot d'animaux témoins sert de contrôle et reçoit l'excipient. Pour chaque dose de substance, Les concentrations des suspensions utilisées sont ajustées de manière à administrer exactement 1 ml par 100 g de poids corporel. Les mesures pléthysmographiques (2) sont faites avant

1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h après l'adminis ration de la suspension de kaolin. ^:' -

4 - Doses uti li sées

Du dérivé organique de l'aluminium de l'exemple 2,

- 100 rng/kg voie intra-α ^' uodénale. Indoπétacinε

- 5 πα/ α voie intra-duodénale.

Exoression ces résultats

Le pourcentage d'augmentation du volume de la patte est obtenu oour chaque animal selon la formule suivante :

Volume mesuré - Volume initial x 100

Volume initial

Les pourcentages d'enflure sont analysés par les tests F de SNEDEC0R et t de Stuα ^' ent (3). L'activité anti-inflammatoire est exprimée par le pourcentage de réduction de L'oedème chez les rats traités par rapport aux témoins selon la formule suivante :

% Enflure témoins - % Enflure traités % = x 100

Enflure témoins

Résultats

Les résu ltats sont consignés dans le tableau II et la figure 2.

Tableau II

% d ' i nhibi ti on par rapport aux témoi ns

1 h 2 h 3 h 4 h 5h 6 h INDOMETACINE 0 48 35 35 32 . 25 5 mg/kg

Dérivé d'aluminium 2 42 30 28 27 20 de l'exemple 2

100 mg/kg

Conclusion

L'examen des résultats montre dans nos conditions expérimentales, que Le dérivé d'aluminium de l'exemple 2 à la dose de 100 mg/kg présente une activité anti-inflammatoire marquée. Cette activité est maximale dès la deuxième heure et reste significative durant 5 h. L'efficacité du dérivé d'aluminium est , d'autre part comparable à celle obtenue avec 5 mg/kg d'indométacine.

Compte tenu de son activité et de sa faible toxicité le dérivé d'aluminium présente donc un réel intérêt thérapeutique.

Bibliographie

(1) WINTER C.A. RISLEY. E.A. et NUSS. G.W. 1962

Carrageenin induced oedema in hind paw of the rat as an assay for anti-inflam atory drugs. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1 : 1 : S44-547 (2) LENCE. P. 1962 A new device for plethysmographic easuring of small objects. Arch. Int. Pharmacodyn. 36 : 237-241

(3) SCHARTZ. D. Méthodes statistics à l'usage des médecin et biologiste. Edition Flammarion.

C - Détermination d'un effet hypoglycémiant

A L'aide du dérivé organique de vanadium obtenu à l'exemple 3 on détermine la présence d'une activité hypoglycé- miante, selon la procédure suivante :

Animaux

Des rats mâles de souche istar (12 par lot), provenant du centre d'élevage de Montpellier ont été utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus en observation pendant 4 j avant Le début des essais. En début d'essai, Les animaux pèsent en moyenne 140 g. Pendant la période d'observation les animaux, répartis par cage de 5, reçoivent nourriture et eau de boisson ad Libitum et sont soumis à une température comprise entre 21 et 23 C et à un cycle jour/obscurité de 12 h.

2 - Produits

- Dérivé porphyrinométallique (Va) selon l'exemple n 3

- Streptozotocine

- Excipients - tampon citrate pH 4,5 - sérum physiologique

3 - Protocole

20 animaux d'un poids moyen de 190 g sont anesthésiés à L'éther. Une injection intraveineuse de streptozotocine est pratiquée au niveau de la veine du pénis ; une glycémie de contrôle est effectuée 48 h après l'administration de La streptozotocine.

Seuls les animaux présentant une glycémie supérieure ou égale à 2 g sont sélectionnés et soumis au traitement par la substance testée. L'administration du dérivé selon L'exemple 3 a été biquotidienne (8-18 h) pendant 3 j, puis quotidienne (18 h). Le contrôle de la glycémie est effectué Le matin à 9 h, moment de La journée où la glycémie des rats diabétiques témoins ou traités, soumise à de grandes variations durant la journée, est la plus élevée. Des rats diabétiques ne reçoivent que l'excipient (sérum physiologique) et servent de témoins diabétiques.

Enfin, des rats "témoins blancs" de même poids, n'ayant par reçu d'injection de streptozotocine sont conservés à .fin de comparaison des consommations d'eau et de nourriture.

Résultats

Le contrôle quotidien de la glycémie ne nous a pas permis de mettre en évidence d'effet hypoglycemiant durant les 2 premiers jours du traitement. Une chute importante et significative de la glycémie par rapport à celle des rats témoins apparaît dès le troisième jour et se maintient les jours suivants. Celle-ci est accomDagnée d'une réduction également signif cat e de la prise de poids, de la polyphagie et de la polydipsie, les conso!τ.marions de nourriture et d'eau recouvrant des valeurs tenαant à se raop ^' rocher de celle des rats témoins non diabétiques - 1/ Evolution du poids des animaux témoins, diabétiques et des animaux truites durant les 12 jours de traitement (en g ⁾ .

JOURS J00 03 J05 J07 J10 J12

TE OI S 189 215 225 233 255 271

DIA3ETIGUES 191 199 218 226 232 246

TRAITES ex. 3 171 194 198 215 220 227

- 2/Evolution de la glycémie des animaux témoins, diabétiαues et des animaux traités durant les 12 j de traitement ⁽ mg/100 ni).

JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12

TEMOINS 104 106 104 98 100 96

DIABETIQUES 368 460 437 474 560 610

TRAITES 330 366 256 272 267 250

- 3/Consommation moyenne de nourriture (g).

JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12

TEMOINS 20,8 19,7 20,1 24,1 20 25

DIABETIQUES 21,9 30 34,2 38,2 34,2 32,6

TRAITES ex. 3 18,9 14 25 26 20,3 20,5

- 4/Consommation moyenne d'eau de boisson (ml).

JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12 TEMOINS 40 40 43,3 46,6 41,7 41,7 DIABETIQUES 88,6 128 141 164 136 150

TRAITES ex. 3 75 55 87,5 75 66 43

Les figures 1 à 4 rapportent l'évolution pondérale ⁽ figure 1), l'évolution de la glycémie (figure 2), la consommation de nourriture (figure 3) et la consommation d'eau (figure 4), sur la base des indications précédentes émettent clairement en évidence les effets indiqués ci-dessous.

En regard des quatres paramètres objectifs ci-dessus, ainsi qu'en regard des paramètres subjectifs, tels l'aspect et le comportement des animaux, il apparaît que le traitement, dans les conditions opératoires retenues, a eu un effet hypoglycemiant, et que celui-ci est majeur. Il a pu également être observé un effet thérapeutique rémanent même après l'arrêt du traitement.

D - Activité anti-polyarthrite

Par le test à l'adjuvant de Freund

On détermine La présence d'une activité anti-polyarthrite avec le dérivé organique d'or obtenu à l'exemple 4, de la manière suivante :

Introduction

L'injection d'une suspension de mycobactérium butyricum chez le rat, entraîne Le développement d'une polyarthrite chronique expérimentale d'origine antigénique dont les caractéristiques sont proches de La pathologie de La polyarthrite rhumatoîde chez l'homme. Elle évolue de façon chronique avec des poussées au cours desquelles se constitue des destructions articulaires génératrices de déformations ; la destruction articulaire est La conséquence d'une synovite proliférante, siège d'une inflammation chronique d'origine immunologique. En L'absence de traitement, l'évolution est irréversible et se traduit par une tuméfaction diffuse.

régulière, effaçant les reliefs articulaires et localisées aux pattes postérieures ; l'atteinte des pattes antérieures est également pssible.

L'impotence articulaire se traduit par une limitation des mouvements actifs, voire une fixation de la jointure dans sa position de relâchement.

Enfin, d'autres signes comme la présence de nodules sur la queue et Les oreilles, un érythème localisé sur les zones tuméfiées en particulier Les articulations, une conjonctivite ou une atteinte génitale sont autant de signes révélateurs de

L'évolution de l'arthrite vers laa chronicité.

Certaines substances anti-infLammato res peuvenr enrayer l'aggravation de l'arthrite, voire même entraîner Le retour à une morphologie articulaire normale.

Matériel et méthodes

1 - Animaux

Des rats mâles de souche Wistar (12 car Lot ⁾ , provenant du centre d'élevage de Montpellier ont été utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus en observation pencant 4 j avant le début des essais. En début d'essai les animaux pèsent en moyenne 180 g. Pendant la période d'observation les animaux, répartis par cage de 5, reçoivent nourriture et eau de boisson ad libitum et sont soumis à une température comprise entre 21 et 23 C et a un cycle jour/obscurité de 12 h.

2 - Produits -

- Dérivé d'or de l'exemple 4,

- Indométacine sous forme de gélules (INDOCID ® 250), - Suspension de mycobactérium butyrique DIFC0 ,

- Excipients,

- sérum physiologique,

- eau gommeuse à 3%,

- eau pour préparation injectable, - huile de paraffine.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

3 - Protocole

Induction de l'arthrite

Une suspension dans la paraffine de bactéries de la souche mycobactérium tuberculosis est injectée dans le tiers inférieur de la queue de rat. Le 21 jour suivant l'injection, les rats sont triés en fonction des signes morphologiques de l'atteinte arthritique qu'ils présentent. Seul les animaux présentant une tuméfaction unilatérale ou bilatérale des pattes postérieures sont retenus.

Constitution des lots

Une mesure des voLumes des pattes postérieures droite et gauche est réalisée à l'aide d'un piethismometre sur les rats précédemment sélectionnés. Des Lots homogènes en ^' poids et en % d'augmentation des volumes des pattes postérieures droite et gauche sont ensuite constitués.

Traitement ème Le traitement débute le 21 jour après la constitution des Lots et se poursuit durant 13 jours à raison d'une adminis¬ tration quotidienne. La dernière mesure (J14) est effectuée 24 h après la dernière administration.

Nature des lots Cinq lots de 9 animaux chacun ont été constitués selon l'ordre suivant :

- un lot arthritique témoin

- un lot arthritique traité indométacine 3 mg/kg

- un lot arthritique traité 803 200 mg/kg - un lot arthritique traité 803 400 mg/kg

- un Lot non arthritique ne recevant aucun traitement.

Evaluation de L'arthrite

Le volume des pattes postérieures fait l'objet d'une évaluation avant et pendant toute la durée du traitement parai-

lèlement à un examen morphologique ; cet examen permet d'évaluer et de quantifier :

- L'impotence qui traduit une limitation voire la disparition des déplacements de L'animal lorsqu'il est placé sur une surface plane est créditée d'un indice de 0 à 3.

. 0 pas d'impotence

. 1 impotence moyenne

. 2 impotence forte

. 3 impotence totale.

- L'ankylose traduit La Limitation ou la disparition du mouvement articulaire des pattes postérieures est créditée d'un indice de 0 à 2 pour chacune des pattes.

. 0 pas d'ankylose . 1 ankylose moyenne

. 2 ankylose totale.

- L'oedème des pattes antérieures qui traduit une extension de l'arthrite est crédité des indices 0 et 1. . 0 absence d'oedème

. 1 présence d'un oedème.

- Présence éventuelle de nodules sur les oreilles. . 0 absence . 1 présence

- Présence de nodule sur La queue localisé au point initial d'injection de L'adjuvant.

. 0 absence . 1 présence

- Atteinte génitale. . 0 absence

. 1 présente.

- Atteinte oculaire se traduisant par la présence d'une conjonctivite unilatérale ou bilatérale.

. 0 absence

. 1 présence. Résultats

1 - Homogénéité des lots avant traitements

Tableau III

Volume des pattes postérieures

Lots Moyenne Ecart ^"

TEMOINS 76,38 h-5,3

INDOMETACINE 76,05 + 4,6

3 puis 1,5 mg/kg

Or - 200 mg/kg 71,66 _+ 4,4

Or - 400 mg/kg 78,33 + 5,0

* Dérivé d'or de l'exemple 4

Tableau IV

% d'enflure par rapport au lot témoin absolu

Lots % d'enflure

TEMOINS 58,33

INDOMETACINE 57,35

3 puis 1,5 mg/kg

Or* - 200 mg/kg 48,11

Or* - 400 mg/kg 61,90

Une analyse de variance du volume des pattes postérieures ainsi que du poids des animaux des différents lots ne met en évidence aucune différence significative avant traitement.

Evolution oondérale

Tableau V

Lots J0 J4 J9 J14

TEMOINS 231 +_ 5,6 240 +_ 5,5 249 _* 9,5 262 +_ 10

INDOMETACINE 234 + 9,2 240 * 11 261 + 19 296 + 16

3 puis 1,5 mg/kg

Or - 2C3 mg/kg 234 + 7,3 236 + 7,2 247 - 9,6 259 + 9,7

Or*- 4C0 r-.g/kα 243 + 6,5 23S - 5,7 251 * 8,6 271 + 16

FAS DE IFFΞRΞT.'CΞ SIGNIFICATIVE ENTRE LES LOTS

* [)ό. -.nâ. __'^ c ^Λ L' x _^ mDL _^ 4

-.r) r* r, 1 ' i f hrT ^ ~" ^, r ^* 3πî" ' ^f* !". ^nr " ⁰ PT

Tableau VI 1-1-1 Evolutio du volume ce la D__tre n mm ce Hg ^"

Lots J_) J4 J9 J14

TE OINS 76,33 ^ 5,3 82,83 +_ 6,3 85,66 +_ 7,3 89,94 +_ 10 I.;DCλ_ ^' ".Cir.'Ξ 76,25 ^_ 4,6 53,00 +_ 2,7**58,40 _+_ 2,5 ^* * 56,00 +_ 2,2** J b_ • 3

1,5 r.q/ s

Or* ex. - 2C3 r. l kg 71,66 4,4 71,83 +.4,2 71,05 _+ 4,0 73,11 +.5,5

Or* ex. - iCO πg/ kg 73,23 +_ 5,0 69,11 ^ 4,9 64,61 ^ 4,5 58,77 ^ 3,4**

DIFFERENCE SIGNIFICATIVE PAR RAPPORT AUX TEMOINS Les volumes sont exprimés en mm de mercures.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

3-1-2 Evolution du volume de la patte en % du volume de base.

Le volume de base est le volume des pattes postérieures mesuré au jour 0, avant traitement.

5 Tableau VII

Lots J4 J9 J14

TEMOINS + 8,5 + 12,14 + 17,75

10 INDOMETACINE - 23,73 ** - 23,20** - 26/36 **

3 puis 1,5 mg/kg

Or*- 200 mg/kg + 2,3 - 0,3 + 2,C0

Or*- 400 mg/kg - 11,77 - 17,51 - ^4,v7

* ^» DIFFÈRE:. ¹ SIGNIFICATIVE PAR RAPPORT AUX T .'l'J HO

* Dérivé d '"or de l'exemple 4 i

3-1-3 Pourcentage de protection.

Le courceπtage ce protection est déterminé car raccort su volume ces pattes oosréπ ^' eures des animaux témoins.

20

Tableau VIII

J4 J9 J14

25 INDOMETACINE 30,00 31,82 37,73

3 cuis 1,5 mg/-'

Or*- 200 mg/kg 13,83 17,C5 18,71

Or*- 400 mg/kg 16,61 24,57 34,65

* Dérivé d'or de l'exemple 4

30

3-1-4 Evaluation de l'efficacité du traitement.

L'efficacité du traitement est évalué en pourcentage , _ς d'enflure des pattes postérieures des lots traités (animaux patho-

FEUILLE DE REMPLACEMENT

logiques traités) par rapport au volume des pattes postérieures du lot témoins absolus chez lesquelles l'arthrite n'a pas été conduite (animaux sains).

Tableau IX

Lots Volume à J14 % d'enflure

TEMOINS

ABSOLUS 49

TEMOINS

ARTHRITIQUES 89,94 53,55.

INDOMETACINE

3 puis 1,5 "g/' g 56,C0 14,23

Or*- C -g/kg 73,11 49,23

OOrr**-- 44CC --gα//kkgα 5 588,,7777 19,93

* Dérivé d'or de l'exemple 4 3-2 Evc-ution ce L'imcotence et de l'anκ lc

Tableau X

Traitements I ;cot. ;nc An> -,ylose

JO J18 ._ι<«n__ J18

TEMOINS 2,25 2,40 1,C5 1,39

Or* - 200 -g/kg ^' 2,33 2,00 1,35 1,44

**

Or* - 400 -g/kg 2,11 1,44 1,41 0,99

INDOMETACINE

**

3 puis 1,5 mg/kg 2,00 1,30 1,44 0,99

DIFFERENCE SIGNIFICATIVE A J18 PAR RAPPORT A JO

FEUILLE DE REMPLACEMENT

35

3-3 Evolution des facteurs secondaires : présence d'oedème sur les pattes avant, de nodule sur la queue et Les oreilles, atteinte génitale et conjonctivite.

A l'exception de la présence ou de l'absence d'oedème sur 5 les pattes antérieures, l'exploitation des autres facteurs n'a pas donné d'indications significati es quant à l'efficacité des traitements.

Evolution de l'oedème des pattes avant durant le traitement : 0 Les fractions indiquent le no ore d'animaux atteint d'cedέre des pattes avant sur le nomore total α'aninaux dans craque lot.

Ta leau XI 5

Traitemen.t JO J13

TEMOINS 5/9 6/?

Or*- 2C0 r-g/ 4/9 4/9 0 O Orr*- -<->Cϋ0 -3j//kkαg 7 7//99 4/9

INDOMETACINE 4/9 1/9

* Dérivé d'or de l'exemple 4

Analyse ces résultats - discussion

25 Témoins arthriticues : le volume ceε nattes postérieures passe de 76 à 90 mm de Kg ce oui reorésente une aggravation de 18%. D'autre oart,- le % c'enflure par raccort aux animaux témoins absolus évolue de 58,23 ⁽ JO ⁾ à 83,55 ⁽ J14 ⁾ ; i l y a donc, en l'absence du traitement, aggravation de l'arthrite. Cette

30 constaticn se trouve confirmé par la progression de l'impotence (2,25 à 2,40), de l'ankylose ⁽ 1,05 à 1,39) et de l'extension de l'arthrite aux membres antérieurs ⁽ 5/9 à 7/9) traduisant dans l'ensemole une évolution en phase chronique.

35 0r, ex 4, - 200 mg/kg - voie intrapéritonéale : nous constatons une stabilisation de l'évolution de l'arthrite ; le

volume des pattes postérieures reste aux environs de 72 π de Hg ; le % d'enflure par rapport animaux témoins absolus reste également stable (48%). Enfin, l'impotence (2,33 à 2,00), l'ankylose (1,35 à 1,44) et l'atteinte des membres antérieures (4/9 à 4/9) confirment également cette stabilité.

A cette dose Le dérivé de l'invention de l'ex. 4 présente donc une efficacité comparable à celle d'un traitement de fond.

Or, ex. 4 - 400 mg/kg - voie intrapéritonéale r nous notons une régression significative de l'oedème ; le volume des pattes postérieures passe de 78 à 59 mm de Hg (soit - 5Λ par rapport au volume initial) ; Le % d'enflure par rapport aux animaux témoins absolus n'est plus que de 19,93% en fin de traitement. L'impotence (2,11 à 1,44), l'ankylose (1,41 à 0,99) régresse de façon significative. Le nombre d'animaux présentant une atteinte des pattes antérieures est réduit (7/9 à 4/9). Le % d'enflure par rapport au Lot témoin absolu passe de 61,9 (J0) à 19,9 (J14). Enfin le % de protection par rapport au lot témoin arthritique est de 34,65% (J14).

Indométacine - 3 puis 1,5 mg/kg - voie intragastrique : Les résultats obtenus sont quantitativement similaires à ceux du lot précédent ; diminution significative dès J4 du volume des pattes postérieures (76 à 56 mm de Hg) soit - 26%. Le % d'enflure par rapport aux animaux témoins absolus est de 14,28% en fin de traitement. L'impotence (2,00 à 1,30), l'ankylose (1,44 à 0,99) et l'oedème des pattes antérieures (4/9 à 1/5) diminuent de façon significative. Le % d'enflure par rapport au lot témoin absolu passe de 57,35 (J0) à 14,28 (J14). Le % de protection par rapport au lot témoin arthritique est de 37,73% (J14).

L'activité du dérivé d'or est donc, sur deux semaines d'observations, globalement similaire à celle de L'indométacine. Si Les doses, 3 mg pour L'indométacine contre 400 mg/kg pour Le 803, sont sans communes mesures, il est à souligner que L' indomé¬ tacine a provoquée la mort par perforation gastrique de 4 animaux

dès Le quatrième jour de traitement nous contraignant à ramener la dose à 1,5 mg/kg.

Le dérivé d'or de l'invention, dans nos conditions expérimentales, n'a pas présenté de signe apparent de toxicité si ce n'est un léger ballonnement abdominal en fin de traitement : bien que l'analyse statistique n'ait laissé apparaître aucune différence significative, le lot indométacine présente une évolution pondérale plus favorable. La progression pondérale limitée des animaux traités par Le dérivé d'or peut s'interpréter par l'administration intra-péritonéale d'une quantité importante de substance dont La résorption peut présenter problème et expliquer Le ballonnement signalé plus haut.

Conclusion L'analyse des résultats montre que, dans nos conditions expérimentales, le dérivé d'or selon l'invention présente une efficacité significative dans le modèle de L'arthrite à l'adjuvant de FREUND. Aux doses utilisées son activité est comparable à celle de L' indométacine.