La présente invention a trait à de nouvelles souches d'Escherichia coli excrétrices de phosphatase alcaline (PA) ainsi qu'à un procédé d'obtention de ces souches .

L'invention a également trait à l 'application de ces souches à la production de phosphatase alcaline et de protéines hybrides dérivées de la phosphatase alcaline , lesquelles protéines peuvent être scindées pour l'obtention de protéines normales .

On sait que le gène de structure , pho A , qui code pour la phosphatase alcaline , et qui est local isé à la minute 8 , 5 de la carte génétique d'E. coli fait partie d'un système de régulation complexe , le régulon phosphate (pho) qui n'est qu' imparfaitement connu et qui se trouve décrit dans : TOMMASSEN J . , LUGTENBERG B . , 1 982 , Pho - regulon of Escherichia coli K 12 : a minireview , Ann. Microbiol. ( I nst. Pasteur) 133 A , 243-249. Dans ce régulon l 'expression d'un gène tel que pho A dépend du contrôle positif exercé par une protéine activatrice Pho B codée par le gène régulateur pho B . L'expression de ce dernier gène est placée sous le contrôle de plusieurs protéines régulatrices dont Pho M et Pho R . La protéine Pho M exerce uniquement un rôle positif tandis que la protéine Pho R joue un rôle négatif ou positif selon que la croissance a lieu en présence ou en l'absence de phosphate.

Chez la souche "sauvage" l'expression des différents gènes de

structure appartenant au régulon pho est réprimée en présence d'un excès de phosphate dans le milieu de culture et déréprimée en carence de cet ion . Une grande partie de la phosphatase alcaline ainsi synthétisée est exportée dans le péripiasme inter-membranaire situé entre la membrane interne et la membrane externe , la phosphatase alcaline , pas plus qu'aucune autre protéine , n'étant d'ailleurs libérée dans le milieu de culture par cette bactérie.

On sait qu'il est possible d'obtenir une synthèse de phosphatase alcaline même en présence d'un excès de phosphate chez des mutants dont le gène pho R est modifié, ce qui a également été observé chez les mutants de type pho S , pho T , pho U ou pst qui portent une mutation dans ces gènes dont les produits interviennent dans l'un des deux systèmes de transport du phosphate.

Par ailleurs , on sait que le taux de synthèse de la phosphatase alcaline peut être augmenté après amplification du gène pho A porté par un plasmide multicopies .

Cependant , bien que l'on dispose ainsi d'un certain nombre de données qui permettent d'accroître notablement la synthèse de la phosphatase alcaline chez E. coli , cet enzyme reste localisé dans le péripiasme intermembranaire , et n'est pas excrété.

11 est certes possible d'induire l'excrétion de la phosphatase alcaline en utilisant des mutants exe ou Iky récemment isolés par les inventeurs et décrits dans FOGN I N I-LEFEBVRE, N . , PORTALIER R. 1984 , Isolation and preliminary characterization of B - lactamase excretary mutants of Escherichia coli k-12 , FEMS Microbiology Letters 21_, 323-328 et LAZZARON I , J-C . PORTALIER, R. , 1981 , Genetic and biochemical characterization of periplasmic-leaky mutants of Escherichia coli K-12 , J . Bacteriol . , 1 5 , 1351 -1358. Ces mutants se caractérisent par un phénotype d'excrétion pléïotrope libérant simultanément plusieurs types de protéines périplasmiques , de sorte que pour produire de la phosphatase alcaline purifiée il faut mettre en oeuvre plusieurs étapes de séparation protéique .

La présente invention possède un avantage évident sur la méthode précédente et se propose de fournir de nouvelles souches d'E. coli excrétrices spécifiques de phosphatase alcaline.

I l est ainsi possible d'obtenir de la phosphatase alcaline dans

le milieu de culture et , par des opérations de purification simple , d'isoler l'enzyme totalement purifié.

Un autre objectif de l'invention est de fournir des souches capables d'excréter de façon sélective des protéines hybrides phosphatase alcaline - dans lesquelles la protéine peut être avantageusement une hormone , un antigène, un anticorps etc.

L'invention a pour objet de nouvelles souches d'E. coli excrétrices spécifiques de phosphatase alcaline ou de protéines hybrides phosphatase alcaline - protéine caractérisées en ce qu'elles comportent une mutation du régulon pho dans la région pho (S ,T , U ) , et notamment une mutation de pho S et / ou pstB , et sont transformées par un plasmide recombiné possédant un fragment d'ADN d'E. coli correspondant à la région de la minute 8 ,5 de la carte génétique , incluant le gène de structure pho A , ainsi qu'un système participant à l'excrétion de la phosphatase alcaline.

De façon avantageuse la mutation pho S ou pst B est portée par le chromosome bactérien .

Des souches conformes à l'invention ont été déposées auprès de la col lection de l' Institut Pasteur sous les numéros suivants : l— 375 ( LEA 768 ) , I-376 ( LEA 768 transformée ) _; i-377 ( LEA S 65) et I-378 (LEA S 65 transformée) .

Si les mutants excréteurs pléïotropes de type exe ou iky sont caractérisés par une résistance accrue à l'égard de certaines colicines (E. , E_ , E_ , A) ou de bactériophages ( Tula , Mel ) et par une sensibilité exaltée vis-à-vis d'agents toxiques comme l'acide cholique ou l'EDTA connus pou r inhiber la croissance des bactéries , les souches LEA 768 ou LEA S 65 transformées par le plasmide pJC 719 ne manifestent aucun de ces phénotypes et se comportent comme ia souche parentale Iky LEA 145. Les essais comparatifs montrent que l'absence soit de la mutation pho S ou pst , soit du plasmide tel qu'il est défini ne permet pas d'obtenir une bactérie excrétant la phosphatase alcaline.

Le plasmide mis en oeuvre dans l'invention est du type défini , à titre d'exemple , par le plasmide pJC 719 qui a été récemment décrit ( LAZZARON I J . C . , PORTALIER R. C. , 1982 , Production of extracellular alkaline phosphatase by Escherichia coli K-12 periplasmic-leaky mutants

carrying pho A plasmids , Eur. J . Appl . Microbiol . Biotechnol . 16 , 146-150) .

Les souches portant ce plasmide ont été déposées auprès de la collection de l ' Institut Pasteur sous les n°s I-376 et 1-378. La fraction chromosomique d'E. coli portée par le plasmide pJC 719 a été analysée. Elle correspond à la région de la minute 8 ,5 de la carte génétique et la présence des marqueurs suivants a été démontrée à l'aide de souches hôtes déficientes pour ces marqueurs :

+ + + + pho A ,pro C . Par contre les marqueurs lac et tsx situés à l'extérieur et de part et d'autre du segment pho A - pro C en sont absents.

Pour identifier la nature des gènes dont la présence sur le plasmide amplifié est une condition nécessaire ou suffisante à l'induction de l'excrétion de la PA chez la souche LEA 768 , on a entrepris une analyse génétique en amplifiant spécifiquement un fragment de restriction .

Les résultats présentés dans le tableau 3 montrent que l'amplification du seul gène pho A ne suffit pas à déclencher l'excrétion de la PA chez les souches LEA S 65 ou LEA 768. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de ces souches , ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on prépare une bactérie possédant la mutation chromosomique pho (S , T , U ) , ou pst, ou que l'on choisit une telle bactérie lorsqu'el le est connue, et en ce que l'on introduit le plasmide recombiné dans la bactérie . L'invention a également pour objet l'application de ces souches à la production de phosphatase alcaline par culture desdites souches dans des milieux convenables , notamment par croissance en mi lieu à pH basique.

L'invention a également pour objet les souches ainsi définies dans lesquelles le gène pho A est fusionné avec le gène de structure ou l 'ADN complémentaire d'une seconde protéine d'origine bactérienne , virale ou eucaryotique , telle qu'une hormone , un anticorps ou un facteur plasmatique, par exemple , ainsi que l'application de ses souches à la synthèse et à l'excrétion spécifique d'une protéine hybride possédant l'extrémité NH_ - terminale de la phosphatase alcaline et la fraction - COOH terminale de la seconde protéine.

L'invention sera maintenant décrite plus en détail à propos de formes de réalisations particulières non limitatives.

1) Obtention d'une bactérie E. coli LEA 768 transformée.

La souche parentale est la souche E. coli K 12 LEA 145 (F~proC34, trp, lac, xyl, mtt, rpsL1Q9, thi I).

La mutation spontanée pstB 768 a été obtenue par sélection de clones résistant à l'arséniate selon la technique décrite dans : YAGIL E., BEERI H., 1977, Arsenate-resistant alkaline. phosphatase constitutive mutants of Escherichia coli, Molec. Gen. Genêt. 154, 185-189. En effet, les produits des gènes phoS, phoT, phoU et pstB jouent un rôle dans le transport du phosphate et de ses analogues structuraux comme l'arséniate, inhibiteur de la croissance cellulaire par son action découplante sur la phosphorylation oxydative. Des mutants spontanés ont été sélectionnés sur un milieu contenant de l'arséniate (10mM), du glucose et une faible concentration de phosphate apportée sous forme d'α- glycérol-phosphate (0,5mM), qui possède un système de transport indépendant. 50 % des mutants résistants à l'arséniate synthétisent la phosphatase alcaline de façon constitutive. La mutation 768 isolée a été identifiée comme affectant le gène pstB et retenue (pstB768) . Cette mutation est .co-transductible avec le marqueur ilvA comme le sont les gènes pho S, pho T, pho U ou pst.

Le plasmide pJC 719, porteur du gène de structure pho A codant pour la phosphatase alcaline est porté par une souche mâle F et est introduit dans une souche femelle F , la bactérie LEA 768 par conjugaison à haut rendement et sélection de conjugants Pro C .

2) Obtention de la souche E. coli LEA S 65 transformée.

La souche LEA S 65 a été construite en laboratoire par transduction à l'aide du bactériophage P1kC (voir MILLER J.M., 1972, in Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, N.Y.) à partir de la même souche parentale E _j coli K-12 LEA 145. Les lysats de bactériophage P1 sont préparés en infectant une souche sensible avec une multiplicité d'infection de 1

_3 phage/10 bactéries, en présence de CaCI2 (5.10 M). Le plasmide pJC 719 est introduit dans la souche également par conjugaison dans les souches F~ et sélection de conjugants Pro C

comme précédemment.

3) Culture

La culture est effectuée successivement en milieu riche L (MILLER 1972) et synthétique T (WORCEL A., BURGl E. , 1974,

Properties of a membrane-attached For of the folded chromosome of

Escherichia coli, J. Mol. Biol., 8_2, 91-105) additionné de protéose peptone Difco à 0,2 % et équilibré à pH 8,3, à température de 37°C.

Les bactéries ont été cultivées pendant huit heures en milieu L additionné de colicine E 1 ou d'ampicilline. Après centrifugation des cellules, ces précultures sont utilisées comme inoculum (ensemencement au 1/10) pour les cultures en milieu synthétique ajusté étroitement aux besoins des bactéries, notamment le milieu T.

On voit, sur le tableau 1, que lorsque les souches LEA 768 transformées ou non sont cultivées à un pH proche de la neutralité- (7,2 - 7,3) aucune excrétion de phosphatase alcaline n'est observée. Par contre le taux maximum d'excrétion est observé lorsque le pH initial du milieu T est ajusté à la valeur basique 8,3. Les quantités excrétées sont également à leur valeur maximale à ce pH. On voit également sur ce tableau une diminution corrélative de l'activité spécifique de la phosphatase alcaline et du taux d'excrétion de la souche LEA 768 transformée, lorsque la concentration en phosphate augmente dans le milieu T.

Enfin on voit que, quel que soit le pH, aucune excrétion n'est présente lorsque la culture s'effectue en milieu riche BL composé de solutions complexes d'hydrolysats de protéines, de vitamines et de cofacteurs.

Des résultats similaires ont été obtenus avec les souches LEA S 65 et LEA S 65 transformée.

4) Dosage enzymatique

On a utilisé les méthodes standard pour doser les activités phosphatase alcaline (TORRIANI A. M., 1960, Influence of inorganic phosphatase in the formation of phosphates in Escherichia coli, Biochim. Biophys. Acta 3 , 460-469) et glucose-6-phospha te déshydrogénase (MALAMY M. H., MORECKER B.L. , 1961, The

localization of aikaline phosphatase in Escherichia coli K-12 , Biochem. Biophys. Res. Comm . 5 , 104-108) . La gIucose-6-P déshydrogénase a été utilisée comme marqueur cytoplasmique de référence . Une unité de phosphatase alcaline est définie comme la quantité d'enzyme qui hydrolyse une nanomole de substrat par minute et par ml d'extrait. Une unité de glucose-6-phosphate déshydrogénase correspondant à la réduction d'une micromole de substrat par heure et par ml d'extrait. Les activités spécifiques sont exprimées en unité par mg de poids sec bactérien . 5 ) Synthèse et compar timentation de la phosphatase alcaline dans les différentes souches isogéniques d'E coli étudiées

Les propriétés des souches transformées LEA 768 et LEA S 65 ont été comparées à celles des mêmes souches non transformées , c'est-à-dire ne contenant pas le plasmide pJ C 719 , ainsi qu'aux souches (non transformées et transformées) suivantes : parentale LEA 1 5 , mutante pho R 69 , mutante, pho U 35 ( les souches pho R 69 et pho U 35 ont été construites par transduction à l'aide du bactériophage P1 kC) , et mutante LEA 145-207.

On se réfère au tableau 2. On a effectué dans ce" tableau une comparaison de la production et de l'excrétion de la phosphatase alcaline dans les différentes souches indiquées. Pour chaque souche on a étudié les activités enzymatiques d'une pa rt pou r la souche haploïde et d'autre part pour la souche transformée c'est-à-dire contenant le plasmide pJ C 719.

Comme cela est connu , la présence du plasmide a pour conséquence une augmentation de la quantité de phosphatase alcal ine synthétisée .

Chez la souche parentale LEA 1 45 (pho ) , la synthèse de la phosphatase alcaline est normalement réprimée après croissance en présence d'un excès de phosphate , et ce , indépendamment de la présence ou l'absence du plasmide pJC 71 9 qui porte le gène pho A . Après croissance en milieu bas phosphate , la phosphatase alcaline est synthétisée et son taux de synthèse est multiplié par un facteur 8 lorsque le plasmide est présent. L'excrétion reste limitée à une valeur très faible .

Chez les dérivés portant les mutations pho R ( LEA R 69) , pho S 65 (LEA S 65), pho U ( LEA U 35) ou pst B768 ( LEA 768) , la phosphatase alcaline est synthétisée après croissance , que ce soit en milieu bas ou haut phosphate , et la présence du plasmide provoque un accroissement de l'activité spécifique de l'enzyme , à l'exception de la souche LEA U 35. Chez les souches LEA R 69 et LEA U 35 , l'excrétion est très faible.

Par contre on constate que les souches LEA S 65 et LEA 768, qui sous forme haploïde ne possèdent qu'un taux d'excrétion faible , du même ordre que la souche parentale , excrètent de façon spécifique la phosphase alcaline avec un pourcentage respectivement de 44 et 82 % de la quantité totale d'enzyme synthétisée, dans le milieu de culture. Ce phénomène ne s'accompagne pas d'une lyse cellullaire significative ainsi qu'en atteste l'absence d'activité extra-ceilullaire de la glucose-6-phosphate déshydrogénase qui a été prise comme marqueur cytoplasmique de référence.

On obtient ainsi des taux d'excrétion comparables à ceux de la souche isogénique LEA 145-207 portant la mutation Iky 207 et connue pour sa propriété d'excrétion pléïotrope de protéines périplasmiques et notamment de phosphatase alcaline , la présence du plasmide pJC 719 se traduisant simplement par une amplification de la synthèse et non par une excrétion spécifique .

Afin de démontrer l'importance de la présence dans le plasmide participant aux nouvelles souches selon l'invention , d'un système autre que celui du gène de structure pho A , pour obteni r l'excrétion de la phosphatase alcaline , on a représenté , sur le tableau 3 , les résultats de cultures dans lesquelles tes souches haploïdes LEA 145 , LEA R 69 , LEA S 65 , et LEA 768 ont été respectivement transformées par le plasmide pJC 2431 , porteu r du seul gène de structure pho A et qui porte un fragment Hind l l-Xho 1 de 2 ,7 Kb provenant du plasmide pJC 721 ( LAZZARON ! and PORTALI ER , 1982) et sous-cloné dans le gène kanamycine du plasmide pACYC 177 selon BERG (BERG P.. , 1981 , Cloning and characterization of the Escherichia coli gène coding for alkaline phosphatase , J . Bacteriol . 146, 660-667) . On voit que ce plasmide amplifie la synthèse , comme prévu , dans toutes les bactéries considérées , mais ne provoque aucune excrétion

importante malgré l'augmentation de la synthèse .

En se référant à la figure 1 on voit les résultats de l'analyse électrophorétique de la composition protéique d'un surnageant de culture obtenu à partir de la souche haploïde LEA 768 qui montrent qu'aucune protéine n'est excrétée durant la croissance (puits 1 ) . Des résultats analogues caractérisent les souches LEA 145 et LEA S 65.

Le puits 2 correspond à la souche LEA 768 transformée et l'on voit que cette souche excrète la phosphatase alcaline de façon très spécifique. Le puits 3 correspond à la souche mutante LEA 145 Iky 207 dont le mode d'excrétion est largement aspécifique .

TABLEAU 1

I NFLUENCE DU MI LIEU DE CULTURE SU R LA PRODUCTION

ET L'EXCRETION DE PHOSPHATASE ALCALINE , PAR LA

SOUCH E LEA 768 (transformée ou non )

Milieu Souches

: : LEA 768 LEA 768 / pJC 719 : : Nature pH ÇO. :

4

: M : Phosphatase alcaline :

: : Activité Excrétion Activité Excr tion : : : spécifique % spécifique

7,3 10 560 3 815

BL 7,3 £10 20 12 456

BL 8,3 ≡IO 18 300

Les bactéries ont été cultivées durant 16 h . à 37°C.

11

TABLEAU 2

PRODUCTION ET EXCRETION DE LA PHOSPHATASE ALCALINE CHEZ DIFFERENTES SOUCHES D'E. coli

-/+ : absence ou présence du plasmide

/ : non estimé ; ND : non détectable

- Les bactéries ont été cultivées durant 16 h. en milieu T (pH 8,3) à 37°C.

- Les pourcentages d'excrétion sont calculés sur la base du rapport : activité totale extracellulatre x 100 activité totale intra plus extracellulaire

Les augmentations des taux de synthèse sont calculées sur la base du rapport activité spécifique de la souche transformée activité spécifique de la même souche haploïde

TABLEAU 3

+ EFFET DE L'AMPLIFICATION DU GENE pho A ^" SUR LA SYNTHESE ET L'EXCRETION DE LA PHOSPHATASE ALCALINE

Les bactéries ont été cultivées durant 16 h. en milieu T. (pH 8,3) à 37°C.