Le domaine de la présente invention est, de manière générale, celui de l'emploi de complexes de coordination carbonyl s comme biosondes froides en utilisant la propriété unique des complexes des métaux carbonyles, à savoir : l'existence de bandes IRV extrêmement intenses dans la région 2 100-1 850 cm , en fait dans la "fenêtre" laissée libre dans les protéines. Cette particularité rend, en conséquence, les dérivés ainsi marqués utilisables pour toute analyse de mélanges de composés naturels. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-FT), convenabl¬ ement adaptée, trouve idéalement à s'appliquer dans ce type de problème. Le développement de la méthode spectrale par IR-FT exige la syn _t hèse spécifique de bioréactifs organométalliques présentant les meilleures spécifications de bioréactifs possibles.

A cet effet, la demande de brevet français n° 82 16024 proposait des complexes d'oestrogène de métaux carbonyles comme biosondes froides ou traceurs pour le dosage de récepteurs hormonaux par IR-FT.

La présente invention offre de nouveaux types de biosondes froides à base de complexes de coordination carbonyl s présentant des vibrateurs CO intenses par l'in- troduction de petits ciusters alcynes-métal carbon le sur le réactif à doser. On obtient ainsi des dérivés organo¬ métalliques par al ylation régiosélective à l'aide de carbocations dérivés d'alcynes complexés par un complexe de métal carbonyle (ou métaux carbonyles) . Les complexes obtenus avec ces clusters alcynes- étaux carbonyles sont plus stables que ceux obtenus par σomplexation directe sans alkylation et surtout s'appli¬ quent maintenant à d'autres substances que les complexes d'oestrogène, en fait toute substance possédant des struc- tures compatibles avec cette chimie organométallique.

Cette stabilité accrue permet en effet, désormais, comme on le verra plus loin, la synthèse d'antigènes tra¬ ceurs porteurs d'entité alcyne-métal carbonyle comme élé¬ ment de marquage. Ainsi _r selon la présente invention, s'ouvre un nouveau champ d'application de ces dérivés organométal- liques avec, notamment, la détection et le dosage i muno- logique d'anticorps ou d'antigènes.

A titre d'exemple, les nouveaux types de biosondes froides selon l'invention s'appliquent aux composés d'oestrogènes, comme dans la demande de brevet n° 82 16024 avec le dosage de récepteurs hormonaux, mais encore à la détection et au dosage immunologique notamment de toxines et substances anabolisantes. Bien entendu, les oestrogènes synthétisés peuvent également servir d'antigènes dans le cadre de dosages immunologiques.

Parmi ces substances possédant des structures compatibles avec une chimie organométallique se trouvent, en effet, les mycotoxines alimentaires, en particulier celles de la série des zéranol, zéralone, zéaralénol, zéaralénone. Ces substances souffrent de la limite des méthodes analytiques actuelles, soit en raison de seuils de détection trop élevés, soit de limitations légales liées à l'usage de la radioactivité.

Le zéranol est un anabolisant utilisé pour la croissance des animaux dont la CEE prévoit la prochaine interdiction. L'efficacité d'une telle mesure dépend des moyens de contrôle dont on pourra disposer pour vérifier que ces mesures d'interdiction sont réellement appliquées. L'utilisation de l'IR-FT peut constituer une méthode originale, simple et efficace si l'on sait fabriquer les antigènes organométalliques susceptibles d'être "reconnus" par des anticorps anti-anabolisants. Ces dosages requièrent des marquages judicieux de ces substrats par alkylation sélective à l'aide de cations organométalliques.

Le cas de la zéaralénone et de ses dérivés illustre également parfaitement les considérations ci-dessus. Ce produit présente une basse toxicité aiguë. Il est utilisé avec ses dérivés dans l'élevage d'animaux à cause de ses effets oestrogeniques et anabolisants. En raison de sa persistance et de son transport dans la viande, cet usage de la zéaralénone et de ses analogues est source de préoccupations. De plus, la détection aussi bien que le dosage souffrent de sensibilités trop basses (2 000 ng/kg dans le maïs et le blé, 10 000 ng/kg dans le lait concentré) qui rendent difficile le contrôle.

La zéaralénone ( a) et le zéaralénol (b) présentent respectivement les structures suivantes :

Tandis que la zéaralénone (a) pollue naturellement les céréales humides, le zéaralénol (b) anabolisant oestrogène autorisé, est obtenu par réduction catalytique de cette mycotoxine (a). L'emploi du zéaralénol dans les élevages de veaux, d'agneaux et de poulets doit être réglementé en France et dans la CEE où des commissions ont pour objectifs de déterminer les seuils d'action toxique et hormonale de ce produit et de proposer des méthodes analytiques de contrôle ; la finalité étant la santé du consommateur.

Un dosage radio-immunologique est envisageable pour mesurer les taux de zéaralénol sérique chez des enfants atteints de maturité sexuelle précoce à la suite d'une alimentation ainsi contaminée. Le seuil de détection actuel étant de 0,5 mg/ml, il est souhaitable d'atteindre 25 pg/ml, mais la méthode radio-immunologique nécessite pour la détection de traces l'utilisation d'anticorps et de traceurs radioactifs à haute activité spécifique difficile d'accès.

C'est pourquoi la présente invention propose donc un nouveau dosage de _t rès faibles quantités de substances d'intérêt biologique telles que, par exemple, du zéaralanol atteignant cette sensibilité et évitant l'appel à la radioactivité dont les inconvénients ont été énumérés plus haut. La chimie des métaux carbonyles apporte une réponse inédite à ce problème.

Le but est de réaliser à moindre coût, avec de meilleures sensibilité et répétabilité, un dosage simple par exemple du zéaralanol dans le sérum, les tissus animaux et les aliments . Cette démarche est directement transposable aux autres antigènes et notamment aux autres mycotoxines alimentaires .

L ' introduction de clusters alcynes- étal carbonyle permet de synthétiser des bioréactifs organométalliques présentant , outre une très bonne stabilité , un pouvoir de reconnaissance spécifique par rapport aux anticorps dans le cas d ' infrarouge "immuno-ass y" (IR-IA) ou aux récep¬ teurs dans le cas de dosages hormonaux, ainsi que des vibra- teurs CO intenses par alkylation sélective .

Ces clusters offrent, par exemple, la possibilité d ' une alkylation sélective sur des fonctions éthers d ' énols , par rapport à un noyau aromatique activé par des substi¬ tuants donneurs , notamment en utilisant un cation organo- métallique complexé en présence d ' hexaméthyldisilazane et , partant, la possibilité de déprotection finale de la fonc- tion phénol .

En outre , ces clusters offrent la possibilité de décoraplexation de précurseurs alcynes -cobalt carbonyle , ce qui permet d\ accéder , ^" à partir du dérivé acétylénique libre, à d' autres complexes de métaux carbonyles des groupes VI, VII , VIII , IX du Tableau Périodique et donc d' utiliser ces biosondes froides en analyse .

L ' invention a donc d 'une manière générale pour objet des complexes de bioréactifs alkylé s -complexé s par

un composé organométallique qui, selon la caractéristique essentielle de l'invention, comporte un ciuster alcyne de métal carbonyle.

Avantageusement, l'alcyne consiste en un déri- vé propargyle, celui-ci donnant des cations particulière¬ ment alkylants et stables.

On entend dans la présente demande par "bio- réactif toute substance d'intérêt biologique.

On peut citer plus particulièrement comme bioréactifs des composés biologiques comportant notamment au moins un noyau aromatique phénolique et/ou au moins une fonction cétone ou hydroxy libre sur un carbone aliphatique et/ou au moins une fonction a iné,thiol ou carbox . En effet, à titre d'exemple, on indique que l'alkylation-complexation peut avoir lieu, notamment

- sur un noyau phénolique en α de la fonction hydroxy protégée ou

- sur un carbone aliphatique en α d'une fonction cétone ou hydroxy ou

- sur un carbone aliphatique portant une fonction hydroxy ou une fonction cétone ou

- sur une fonction aminé, thiol ou carboxy.

Outre les oestrogènes et dérivés d'oestrogène, notamment choisis parmi les oestradiols, oestrones et leurs dérivés de formules :

On peut également citer, à titre d'exemple de bioréactifs appropriés à l'invention, des toxines et particulièrement les zéranol, zéralone, zéaralénone, zéaralanol et leurs dérivés de formules I, II, III et IV respectivement :

(I) ⁽ II)

dans lesquelles R et R' représentent l'hydrogène ou un radical protecteur tel qu'un groupement hydroxalcox .

Comme cela a été indiqué précédemment, il est possible d'utiliser des dérivés de ces composés. En particulier, il est possible, si cela est nécessaire, de protéger certaines des fonctions hydroxy afin d'améliorer la stabilité des composés, par exemple par éthérification à l'aide de dériv és de type silane ou par des groupements alkyle ou aikoxy en C , à C ₇ , plus particulièrement en C , pour les dérivés de l'oestradiol et en C . _ψ et C . , pour les dérivés des zéranol et zéaralénol. Se sont révélés particulièrement intéressants, les composés lorsque R est un radical sîlyloxy ou un radical HO(CH-) , n étant compris entre l et 7.

Dans la limite de la définition générale, il est possible d'utiliser, dans les composés selon l'invention, un composé organométallique

de métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, l'osmium, le ruthénium.

Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment CO, CS, CSe, CNR., P(R ₂ ,R,,R. ), cyclopentadiényle, R. étant notamment un radical alkyle ou -COR- et R-, R,, R. et R- étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C, à C. substitué ou non ou bien un atome d'halogène, R- pouvant être -N(CH ₂ CH ₂ C1) ₂ . Les composés métaux-carbon les peuvent comporter plusieurs métaux et jusqu'à 12 ligands.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation de complexe de bioréactifs, caractérisé en ce qu'on fait réagir le bioréactif • avec un cation alcynique complexé par un composé de métaux-σarbonyles en présence d'acide tétrafluoroborique.

De manière très intéressante, l'alkylation- complexation a lieu sélectivement en alpha d'une fonction cétone eu d'un radical hydroxy libre par rapport au noyau aromatique et de manière stéréospécifique.

Pour ce faire, on transforme la fonction cétone sous forme d'éther d'énol. Avantageusement, on fait réagir la fonction éther d'énol sur un cation alcyne-métal car¬ bonyle en présence d'hexaméthyldisilazane (HMDS) . Dans ces procédés, un solvant avantageux est le chlorure de méthylène.

D'une manière générale, pour alkyler-complexer sélectivement, sur un site ou une fonction chimique, les carbocations complexés selon l'invention, on peut com- plexer une deuxième fois temporairement avec des solvants comportant des hétéroatomes, tels que la pyridine, les sulfures, etc., le carbocation déjà complexé avec le métal-car bon le .

En particulier, il est possible d'alk ler- complexer sélectivement une fonction aminé primaire et secondaire par rapport à une fonction hydroxyle lorsque la réaction a lieu en présence de sulfures. On peut alors utiliser des solvants protiques.

De même, en conduisant la réaction- en présence de pyridine, on obtient une alkylation-complexation sélec¬ tive d'une fonction thiol (thiolate) .

Pour alkyler-complexer sélectivement un site ou une fonction chimique, il est également possible de jouer sur la nature du métal engagé dans le complexe de métal-carbon le.

Ainsi, en utilisant le cation spécifique

on peut alkyler directement les aminés sélectivement en présence de groupe OH.

Selon la présente invention, on peut procéder à une décomplexation d'un premier composé de métaux- carbonyles sur la triple liaison C-C, puis une recomplexa- tion en un deuxième complexe avec un deuxième composé de métaux-carbonyles sur la triple liaison C-C.

Pour obtenir une complexation en alpha du radical hydroxy libre, on peut procéder à une décomplexa¬ tion de la triple liaison C-C d'un premier complexe d'un composé de métaux-carbonyles en alpha d'une fonction cétone, puis une r-éduction de la fonction cétone en al¬ cool, puis une recomplexation de la triple liaison C-C en alpha du radical hydroxy libre.

La décomplexation de la triple liaison du complexe a lieu par action de sels ferriques dans l'étha- nol.

L'alkylation-complexation selon l'invention peut avoir lieu sur le carbone aliphatique même portant une fonction hydroxy ou cétone, par exemple dans le cas des dérivés zéranol et zéaralénol en position 7. Pour ce faire, on fait réagir le composé par exemple la zéralone ou zéaralénone sur un composé organo- magnésien acétylénique pour obtenir dans ce cas en posi¬ tion 7 un éthynyl zéranol ou zéaralénol, on libère les fonctions phénols, puis on complexe au niveau de la triple liaison C-C par un métal-carbonyle.

Il est possible aussi de fixer une triple liaison éloignée de plusieurs atomes de la fonction cétone par exemple dans le cas de la zéralone ou zéaralé¬ none de la position 7 en transformant la fonction cétone en oxime acide, notamment avec le bras carboxy-méthyl- oxi e (CMO) et en effectuant un couplage du type lien a ide avec l'aminé d'une amine-alcyne par exemple une amin propargyliq.ue. La complexation avec un métal- carbonyle a ensuite lieu sur la triple liaison. L'intérêt de ce bras carboxy- éthyl oxime encore appelé bras CMO, entre le composé et l'élément de mar¬ quage, (c'est-à-dire le ciuster alcyne-métal-carbonyle) et que les anticorps sont souvent préparés à partir d'i munogène dans lesquels le couplage entre le composé haptène et la protéine vectrice est réalisé à l'aide de ce bras CMO.

L'invention a également pour objet l'application des complexes obtenus pour des dosages d'antigènes et d'anticorps par IR-IA et de récepteurs biologiques par la méthode déjà décrite dans le brevet n° 82 16024.

L'invention sera -maintenant explicitée par les exemples suivants et la figure 1 qui représente le spectre IR du produit 28b de l'exemple 5 (métal = cobalt).

EXEMPLE 1

SYNTHESE SELECTIVE DE BIOREACTIFS METAUX CARBONYLES

DE L'OESTRADIOL EN POSITION 2,» A L'AIDE DE

CATIONS PROPARGYLIQUES COMPLEXES L'expérience montre qu'il est nécessaire de protéger la fonction phénol pour obtenir des produits suffisamment stables pour être utilisés dans les conditions des tests biologiques. On a choisi le groupe protecteur propanoi-1 qui conduit au dérivé :

qui a un haut pouvoir de reconnaissance vis à vis des récepteurs de l'oestradiol (RBA - 35 %).

A partir de (2) la propargylation par le cation in situ se produit en 2 et avec un bon rendement. On a utilisé les cations propargyliques dicobait hexacarbonyle. La propargylation conduit aux dérivés organo _¬ métalliques (3) et (< :

Dans un tube de Schlenck, préalablement séché et purgé par de l'argon, on introduit 1,6 cm3 du complexe éthéré de l'acide tétrafluoro- borique et 3 cm3 d'éther dialkylique (préalablement distillé sur du sodium et de la benzophenone). On ajoute alors goutte à goutte une solution de 0,22 g d'alcool propargylique dicobait hexacarbonyle dans 3 cm3 d'éther ethylique. U se forme une huile rouge insoluble. On additionne alors goutte à goutte 0,2 g (0,6.10 ^" mol.) de (2) en solution dans 5 cm3 de chlorure de méthylène (préalablement distillé sur hydrure de calcium). Après 2 à 3 heures, l'ensemble forme une solution rouge brique, indiquant que tout le cation formé a réagi. Celle-ci est lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium puis à l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium et évaporation du solvant, on obtient Q,<* g d'une huile rouge. Les produits (3) et (* ) (R = H) sont séparés par chromato- graphie sur plaque de silice (éluant CH ₂ CH ₂ /MeOH : 98/2). Les produits (3) et {>*) sont obtenus en proportions équivalentes avec un rendement global de 50 %.

IR. (3) et («0 CH ₂ C1 ₂ CO 2080, 2020, 2005, 1990 cm l

RMN CDCI ₃ (3) lH(s) 7,08 ; lH(s) 6,60 ; lH(s) 6,00 ; 2H(s) ,07 ppm (4) lH(d) 7,27 ; 7,17 ; lH(d) 6,S0 ; 6,70 ; lH(s) 6,00 -, 2H(s) 4,20 ppm

Masse sur le produit décomplexé (3) M ⁺ 368

(4) M ⁺ 368. Le Schéma réactionnel est donc le suivant :

1. HOCH _j -

3. OH en effet, BF,

Co ₂ (CO) ₆ co ₂ (co) ₆

La décomplexation de (3) et (4) par des sels ferriques en solution dans l'éthanol conduit aux produits (3') et (4') :

Ces dérivés acétyléniques permettent alors d'accéder à d'autres _t ypes de composés métaux carbonyles dérivés du molybdène Mo ₂ Cp ₂ (CO ⁾ ₆ ou de l'osmium Os- _j (CO) _{l 2} , par exemple.

/05439

1 3

EXEMPLE 2

PROPARGYLATION SELECTIVE DE LA POSITION

16 alpha' DE L'OESTRADIOL

Dans cette demande de brevet, la position alpha désigne une régiospécificité par rapport à un carbone adjacent, et alpha' ou beta' concernent des stéréospécificités différentes sur un même carbone et _d és i _<j nent des faces .

En faisant réagir en suspension dans le chlorure de mé ^t hylène le ca _t ion propargylique dicobait hexacarbonyle sur l'éther d'énol sililé d'un dérivé pro _t égé de l'oestrone ⁽ 5 ⁾ :

tant d'une propargylation comp ^β titiv e en on obtient les produits résul posi _t ion 2, 4, 16 : ⁽ 6 ^{) (} 7 ^{) (} 8 ⁾

CH^-C-ΛCH

Co ₂ (CO) ₆

Pour (5a) (5b) les produits (6), (7), (8) sont obtenus en égales proportions. Dans le cas de (5c) seul le produit (6) est formé. Or, le groupe protecteur méthylméthoxy-éther est particulièrement intéressant puisqu'il permet de retrouver facilement la fonction phénol en milieu acide sans toucher au ciuster. On a donc cherché une méthode sélective d'alkylation en 16 en présence de ce groupe protecteur du phénol de l'oestrone. Les ions carboniums (9) réagissent facilement avec les aminés primaires et secondaires, même encombrées, et sur les aminés aromatiques comme la pyridine.

(9) ( 10)

Il a donc été essayé d'utiliser le cation ( 10) comme agent de propargyla _t ion sélective des éthers d'énols. Ces expériences ont échoué pour la tertiobuty lamine, la diisopropylamine, la pyridine. Par contre, avec l'hexaméthyldisilazane (HMDS) on a pu obtenir une réaction très sélective de i'éther d'énol avec un rendement dépassant 50 % en produit isolé ( 5 ⁾ .

La réaction est régiosélective et stéréospécifique puisque l'orientation de l'attaque conduit exclusivement au produit 16 alpha'.

Propargylation en position 16 alpha' - obtention de (7) R = Cl- QCH, 0,3 g (1,65 mmol.) de Na N(SiMe,)- sont dissous dans 5 mi~de THF (préalablement distillé sur sodium, benzophenone) à température ambiante. 0,24 g (0,75 mmol.) de méthylméthoxy-éther-oestrone sont ajoutés en solution dans 3 ml de THF. Le mélange est agité 20 minutes puis 0,4 ml de chlorotrimethylsilane sont additionnés.- Après 25 minutes, le solvant est évaporé, repris par de l'étherdiéthylique et versé dans de l'eau.

La solution éthér e est lavée avec une solution saturée de NaHCO. puis à l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium, le solvant est évaporé et on obtient une huile jaune. La RMN montre que la transformation en éther d'énol est quasi quantitative et que l'huile contient deux équivalent» d'hexaméthyldisilazane. Ce matériau est donc utilisé tel quel pour la réaction de propargylation.

Le cation (9) est préparé dans l'éther à partir de 0,24 g (0,75 mmol.) d'alcool propargylique complexé et du complexe éthéré de l'acide tétrafluoroborique. (9) est abondamment lavé à l'éther puis séché sous vide et mis en suspension dans 5 ml de chlorure de méthylène. L'éther d'énol avec 2 équivalents d'HMDS est ajouté à 0 ^β C en solution dans 3 ml de chlorure de méthylène. La réaction est immédiate. Après 15 minutes, la solution rouge brique est versée dans de l'eau, lavée avec NaHCO-, puis avec de l'eau jusqu'à pH neutre, séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant est évaporé. En chromatographie de couche mince sur silice on observe une tache ^' rouge majoritaire (Rf 0,50 pour éther 1, pentane 4).

Le produit brut est adsorb sur de la silice (colonne 220 x

35 mm) et élue avec un mélange pentane-éther (5:1). Après que la première fraction colorée soit passée, on change le mélange éluant (pentane-éther 2:1) et on collecte un produit (0,38 g, 80 %) pur par chromatographie sur couche mince.

IR CH ₂ Ci ₂ CO 2090, 2050, 2020, 2000, 1760 cm ^{" 1} RMN 250 MHz CDC1 ₃ : 1H 7,21 ppm (d) ; 1H 6,81 (d,d) ; 1H 6,79 (d) ; IH 6,07 (s) ; 2H 5,07 (s) ; 3H 3,38 (s) ;_ 1H 3,31 (d,d) ; 2H 2,81 (d,d) ; IH 2,61 (d,d) ; IH 2,47 (m) ; IH 2,3 (m) ; IH 2,12 (m) ; 4H 1 ,85 (m) ; _.

5H 1,43 (m) ; 3H 0,89 (s). Masse M + NH^ 656 (produit décomplexé)

- M+ 352 M + H* 353 M + NH, 370.

EXEMPLE 3 RECOMPLEXAT10N DE (7) Le dérivé (7) est préalablement décomplexé avant que de réduire la fonction cétone en alcool (voir plus loin), le produit résultant ⁽ 1 1 ⁾

est alors réduit par NaB en milieu alcoolique, cette réaction conduit à deux produits en quantités équivalentes résultant probablement d'une attaque compétitive de l'ion hydrure sur les faces alpha' et beta'. Un seul de ces produits, le 16 of -propargyl 17 -ol (12) conserve la fonction acétylénique et peut être recompiexé par différents métaux carbonyles, par exemple Co ₂ (Cθ ,

Mo-Cp ₂ (CO) _é , Os,(CO) . ₂ , permettant d'obtenir respectivement ( 16), ( 17) et ( 18)

R =~CH ₃ (b)

Mx(CO)y =-Co ₂ (CO) ₆ (16) -CH ₂ OCH ₃ (c) -Mo ₂ Cp ₂ (CO) (17)

-Os ₃ (CO) _lQ (18)

Pour (16c), (17c) et (18c) on obtient facilement l'oestradiol substitué en 16 alpha'. Par traitement en milieu acide (HBF, éthanoi, eau), on obtient respectivement (19), (20) et (21) :

Mx(CO)y = -Co ₂ (CO) ₆ (1 )

-MO _j p^CO)^ (20) -Os ₃ (CO) _i0 (21)

1 9

DECOMPLEXATION DE (7) EN ( U) Toutes les décomplexations des dérivés alcynes-métaux- -carbonyles sont effectuées dans les mêmes conditions. On donne à titre d'exemple celle de (7) en (1 1). 0,19 g de (7) (0,30 mmol.) sont dissous dans 3 ml d'éther, on ajoute 1 mmol. de nitrate ferrique dans 10 ml d'éthanol et on laisse réagir au réfrigérateur toute une nuit. La solution est diluée avec de l'eau et extraite à l'éther, la solution éthérée est ensuite séchée, le solvant évaporé. Le produit est purifié par chromatographie sur plaque de silice (éluant éther 2, pentane 3). Le rendement est de 80 %. Masse M + H ⁺ 353 M + NH^ ⁺ 370 M ⁺ 352.

RMN 250 MHz CDCL ₃ : IH 7, 19 ppm (d) ; IH 6,82 (d,d) ; IH 6,8 (d) 2H 5,15 (d) ; 3H 3,47 (d) ; 2H 2,90 (d,d) ; IH 2,72 (m) ; IH 2,6 (m) 3H 2,2 à 2,45 (m) ; 4H 2,OO (m) ; IH 1,94 (t) ; 5H 1,52 ppm (m) IH 0,96 ppm (s).

EXEMPLE 4

OBTENTION DU 16 alpha' -PROPARGYLOICOBALT-

HEXACARBONYLOESTRADIOL ( 16) 0,08 g de ( 1 1) sont dissous dans 5 ml d'éthanol absolu et on ajoute 0,07 g de NaBH^. Le mélange est agité pendant la nuit, après _. 16 heures on ajoute de l'eau et on laisse 2 heures. Il apparaît un précipité blanc. Le tout est extrait au chlorure de méthylène, lavé avec une solution d'acide chlorhydrique puis neutralisé et séché. Le solvant est évaporé. Le produit brut est chromatographie sur des plaques de silice (éther 1, pentane 1). Deux produits sont séparés. L'un ne présente plus de proton acétylénique en RMN mais il y a des protons vinyliques dans le spectre. L'autre présente toujours un proton acétylénique, en infrarouge la bande cétone a disparu. Après 5 jours, le produit acétylénique cristallise (masse M* 35H M + H ⁺ 355, M + NH^ ⁺ 372), 0,035 g sont dissous dans 1 ml de CH-C1- et 0,045 g de cobalt octacarbonyle sont ajoutés. Après 2 heures le solvant est évaporé, le résidu est repris dans du pentane auquel on additionne quelques gouttes d'éther. La solution est filtrée sur une courte

colonne de florisil. Le solvant est évaporé et le produit chromatographie sur plaque de silice (éluant éther). La bande rouge est récupérée ⁽ 16c ⁾ . ( 16c), environ 0,07 g, est dissous dans 3 ml d'un mélange 1:1 éthanol-THF. 5 gouttes de HBF^ Et ₂ O sont ajoutées à la température ambiante, après 10 minutes un produit plus polaire rouge apparaît sur plaque de silice (éluant éther 1, pentane 1). Après 20 heures la réaction est presque complète. Le mélange est versé dans l'eau, extrait au chlorure de méthylène, après séchage on chromatographie sur plaque de silice en éluant à l'éther. La bande rouge majoritaire est récupérée, elle conduit à une huile rouge qui cristallise doucement. Le rendement est de 80 %. RMN 250 MHz (CDC1 ₃ ) : IH 7,07 (d) ; IH 6,81 (d,d) ; IH 6,54 (d) ;

IH 6,03 (t) ; IH 4,54 (s) ; IH 3,40 (d) ; IH 3,29 (d,d) ; IH 2,84 (d,d) ;

IH 2,82 (q) ; 2H 2,26 (m) ; 3H 1,93 (m) ; 7H (1 ,7 à 1,2) ; 3H 0,80 (t). Masse après décomplexation M 310.

EXEMPLE 5

SYNTHESE D'ANTIGENES ORGANOMETALLIQUE5

DANS LA SERIE DE L'alpha- ZERANOL (22), DE LA ZERALONE (23)

ET DE LA ZEARALENONE (23')

OR

A priori la complexation du noyau par un groupe cobalt tricarbonyle paraît l'approche la plus évidente. Cependant son utilisation est limitée par le fait que le produit organométallique résultant n'est pas très stable (il faut alors protéger les fonctions phénols). C'est pourquoi on a orienté le travail sur l'alkylation du noyau par des ions carbéniums organométalliques et l'al ylation sélective des positions alpha de la z _é ralone (23) et sur la complexation des éthynylzéranol alpha' et beta'.

1 ) Propargylation du noyau aromatique en 13 et 15

Comme pour l'oestradiol, il faut au préalable protéger la fonction phénol libre pour obtenir des produits stables. Le schéma réactionnel est le suivant :

C. _j iCO .

<2<

Par exemple R CΠ« _J R S CH.' (-)

R ^• - H, R- (CM ₂ ) ₃ OM (b)

Pour (22a) on obtient (24a) avec l'introduction du groupe propargylique complexé en 13. Pour (22b), la substitution électrophile aromatique se produit en position 13 et 15.

2) Propargylation des positions 6 et 8

L réaction du cation (9) sur l'éther d'énol obtenu à partir de (23), R = CH,, R' = CH ₃ , conduit dans les conditions habituelles à la substitution du noyau aromatique en position 13. Dans les mêmes conditions avec l'éther d'énol dérivé de l'oestrone, on obtient une compétition entre l'attaque sur le noyau et sur l'éther d'énol. La réaction devient régio- sélective sur l'éther d'énol en utilisant le cation (9) en présence d'hexaméthyldisilazane.

Le schéma réactionnel est le suivaçit et le mode opératoire est similaire :

(23)

OR O

R = R' - CH,

/05439

23

CH ₂ C1 ₂

3 ₎ Obtention des ethynyls zéranols al ^p ha' et béta' compl ^β vάs

A partir de (23) avec, par exemple, R = R' = t.but-diméthylsily l, il est facile d'obtenir les deux ethynyls zéranols protégés alpha' et beta' par action du magnésium acétylénique.

OR

OR

R'O

Les deux isomères alpha' et beta' sont séparés par chromato¬ graphie sur plaque de silice. Les fonctions phénols sont libérées par action du fluorure de potassium.

(26) alpha' et beta' peuvent alors être complexés par des métaux carbonyles. Co COL, Mo^o COL, Os ₃ (CO) _{[ 2} pour donner respective¬ ment (27) alpha', beta', (28) alpha', beta' et (29) alpha', beta'.

De la même manière, les composés (24) et (25), après avoir été décomplexés par action de sels ferriques dans l'ethanol, peuvent être recomplexés par des métaux carbonyles du molybdène et de l'osmium.

A partir des dérivés 26 alpha et beta complexés par MoCp2(CO). , on obtient les dérivés (27a et b) résultant de la déshydratation par catalyse acide des alcools acétyléniques complexés :

4 ⁾ Préparation des éthvnyls zéranols ( 26 ) alpha ' , beta ' 0,32 g de zéralone (23) ( 1 mmol.) en solution dans 2 ml de THF sont ajoutés à une suspension de 100 mg de NaH dans 3 ml de THF. Après une vive effervescence un précipité blanc se forme. On agite 2 heures puis on ajoute 0,6 g de tbu e- SiCl (4 mmol.) en solution dans 2 ml de THF. Il se produit une vigoureuse réaction. Le précipité se dissout et on obtient une suspension laiteuse. Après addition d'eau, le produit est extrait à l'éther, la solution est lavée, séchée et le solvant évaporé. Après plusieurs heures, le produit cristallise. On vérifie par RMN que les deux fonctions phénols sont protégées, le rendement est de 100 %.

A 1 mmol. de l'éther de la TBMS zéralone dissous dans 5 ml de THF on ajoute un excès de Grignard de l'acétylène et laisse à réagir 12 heures. Le mélange réactionnel est additionné dans une solution diluée d'acide chlorhydrique, extraite à l'éther, lavée, séchée. On obtient environ 0,7 g d'une huile jaune, présentant en RMN dans CDCU deux signaux pour un proton acétylénique à 2,4 ppm. Sur couche mince de silice (éther 1. pentane 1) on observe deux taches (Rf 0,5 et 0,6). Les deux produits sont séparés sur 6 plaques préparatives de silice (éther 1, pentane 1 ). Le rendement en produits isolés alpha' et beta' est de 66 %. Les fractions phénols sont libérées par action de Bu. NF en solution dans le THF suivie d'une hydrolyse à l'eau. Masse M* 346 M + H ⁺ 347, M + NH^ ⁺ 364.

5) Préparation d'antigfenes métallocarbonyles (28a et 28b) dérivés de la zéralone (23a) et de la zéaralénone (23b) avec le bras CMO

Les dérivés (28a et 28b) non complexés sont facilement obtenus à partir des zéralone (23a) et zéara¬ lénone (23b) par action de carboxyméthoxylamine dans la pyridine, 1*oxime acide obtenue est alors couplée à l'aminé propargylique par la méthode classique- (hydroxy succinimide et carbodiimide dans le THF suivi de l'addi¬ tion de l'aminé propargylique en présence de triéthyl- a ine). La complexation est effectuée suivant les mé¬ thodes habituelles et les produits purifiés par chroma- tographie sur colonne de silice (éluant CHgC^) sont identifiés au RMN, IH et masse.

CABBOXY-METHΥLQXIME 7' Z KALONE : 3 (Voir schéma 1 ci- après)

A une solution de 200 mg (0,62 mmole) de zéralone 2 dissous dans 20 ml de pyridine, on ajoute 400 mg (1,8 mmoles) de carbométhoxylamine. On laisse agiter 2 heures à l'obscurité. Après évaporation de la pyridine, on reprend le résidu avec de l'acétate d'é- thyle-. On rince abondamment à l'eau. La solution est ensuite séchée sur sulfate de magnésium puis évaporée. On obtient 220 mg d'un solide blanc.

On remarque en RMN l'existence des deux iso¬ mères Z et E de l'oxime. Les différents essais de sé¬ paration de ces deux isomères sur plaque de silice pré- parâtive se sont avérés infructueux (Eluants testés : éther; mélange éther-pentane avec quelque» gouttes de méthanol; chloroforme2-propanol1)

FUSION 125°C

RMN H (250 MHz, Acétone deutérée) δ en ppm :

Spectre de l'isomère majoritaire : 1,39 (3H, d, ³ J-6Hz, 19-CH ₃ )

2,32 et 3,1 OH, td, ³ J=12Hz, ² J=4,5Hz, 12-CH-H) 4,58 (2H, s, CH ₂ C00H) 5,17 (1H,m, 3- CH)

6,24 (1H,d, J=2,5Hz, 15- CH) 6,29(^H,d, ^" J=2,5Hz,13-CH) 9,14 (1H,s,14- GOH) 12,08(1H,s,16- COH)

Au spectre de l'isomère majoritaire viennent s'ajouter d'autres raies moins importantes correspon- dant à l'isomère minoritaire : 11,78 ( 6-COH); 5,35 (3-CH); 4,58(CH ₂ C00H); 1,40 (19- CH _j )

IR en cm

3337 (F et i,ι> COOH) 2964(e,v _a CH ₅ ) 945(m, J CH _≥ ) 2928 (m, v _a σH ₃ ) 2870(m,v _g CH ₂ ) 1732, 643,1628(F, CO) 1585( , C=C aromatique)

MASSE (Par désorption chimique avec comme gaz réac- tant NH Pic de masse = pic de base MH ⁺ =394; m/z=411 (M+NH^ ⁺ )

PROPARGYLAMIDE-METHYLOXIME 7 ¹ ZERALONE:4 (Voir schéma 1) 200 mg (0,5 mmole) de carboxyméthyloxime ^~ - zéralone (composé ^~ sont dissous dans 23 ml de THE et agités 1/4 d'heure à 4 ^α C. On y ajoute 67 mg (0,59 mmole) de N hydrosuccinimide ainsi qu'une solution contenant 160 mg (0,75 mmole) de NN'dicyclohexylcarbodiimide dis- sous dans 4 ce de THE. La solution est ainsi agitée 4 heures à 4°C puis 20 heures à température ambiante. Il se forme un précipité blanc.

Après filtration, la solution est remise à 4°C et on y ajoute 65 ul (1 mmole) de propargylamine et 520 ul (3,5 moles) de trié hylamine. On laisse sous agitation 4 heures à 4°C, puis 20 heures à température ambiante.

Le THE est évaporé au rotavapor et le résidu est repris avec 20 ml de dichlorométhane. La phase or¬ ganique est lavée trois fois à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium puis évaporée. On obtient 1 0 mg de solide jaunâtre (rendement 90 %).

Les produits sont purifiés sur plaque de si¬ lice préparative et les deux isomères séparés (éther comme éluant).

Rf = 0,42 et 0,49 pour les deux isomères, Rf = 0,1 pour l'oxime qui n'a pas réagie.

FUSION 160°C

RMN ~~~~—H (250 Mhz, Acétone deutérée) δ en ppm :

Pour l'isomère majoritaire :

NH-CH ₂ -CsC) 4,45 (2H,s, N0-CH ₂ -C0) 5,17(1H,m,3-CH) 6,23(1H d,^J=2,5Hz,15-CH) 6,29(1H,d, J=2,5Hz,13-CH) 7,22(1H,s large, NH) 9,15(1H,s large, 14- COH)

12,0(1H,s,16-C0H)

Pour l'isomère minoritaire

7,15(1H,s,NH) 9,14(1H,s large, 4-COH)

11,70(1H,s,16-C0H)

IR ( en cm )

3275 (F et I,^ OH associé) 2964 (e, v _fl CH^) 9^ (m,^ CH ₂ ) 2828 (m, _a CH ₂ ) 2853 (m, _s CH ₂ ) 2120 (f,o CΞC) 1697 et 1639 (F, > CO) 1580 (m, ύ C=C aromatique)

MASSE (Par désorption chimique avec comme gaz ré c- tant H- _z ) Pic de masse : MH =431 Pic de base : m/z=207 (M+NH^ ⁺ ) m/z=448 ANALYSE ELEMENTAIRE

Calculé (%) C 64,19 H 6,97 N 6,51 0 22 ,32

Trouvé (%) 64,37 7,58 6,80 20 ,75

DICOBALT HEXACARBONYL PROPARGYLAMIDE METHYXOXIMΞ 7'

ZERALONE ' î (voir εichéma 1)

Toute la manipulation se fait sous atmosphère d'argon. ^" Après avoir dissous dans 10 ml de THF 1 0 mg (0,48 mmole) de composé 4, on ajoute 170 mg de dicobalthexacarbonyl (0,5 mmole) dissous dans 3 ml de THF. On observe alors une ffervescence gazeuse et une coloration rouge apparaît. La réaction est suivie sur plaque chromato raphique silice et est complète après 1/4 d'heure.

On chromatographie alors la solution sur colonne de silice sous pression d'argon avec de l'éther comme éluant et on recueille avec un faible rendement (environ 10 %) un produit qui après évaporation est un solide rouge. Sur plaque de silice préparative (éluant : éther2-pentane1) , on peut séparer les deux isomères Z et E) (Rf = 0,2 et 0,25)

FUSION : Le produit se décompose à partir de 55°G

RMN ¹ H (250 MHz, acétone deutérée)

Pour l'isomère majoritaire : 1,35 (3H,d, ⁵ J=6Hz, 19-CH ₃ ) 3,17(1H,td, ⁵ J=l2Hz, J=4,5Hz,12-CH) 4, 47 (2H, système AB(4 raies ) ^O-CHg-CO)

12,00(1H,s,16-C0H) 4,70(2H,16 raies, système AB,^J=2,5Hz, ⁵ J=5,9Hz,

7 ,72(1H,t ,C0-NH) 9 ,14(1H,s ,14-COH)

IR. (en cm )

3238(F et 1,9 OH associé) ^" 2928 (F, v _a CH ₂ ) 2858 (m,v CH ₂ ) 2095;2052;2014 (F, ^C0 sur le métal) 1637 (F, v CO) 1585 (m, ύ C≈G aromatique)

DIMOLYBDENS DICYCIOPENTA-DIENYL TETRAGARBONYL PROPARGYLAMIDE MΞTHYLOXIME 7' ZERALONE : 6 (schéma 1)

- Synthèse de o Cp ₂ C0g à partir de Mo^p^O^,

370 mg (0,75 mmole) de Mo C ₂ C0g sont dissous dans 6 ce de diglyme sous atmosphe re d'argon. On laisse 3 heures au reflux à 160°C sous courant d'argon. Après filtration, on obtient une solution marron-rouge de o ₂ Cp ₂ C0^.

- Synthèse du composé 6_ ^60 mg (0,38 mmole) de composé 4- dissous dans 10 ml de THF sont mélangés au dimoly dènedicyclo- pentadiényltétracarbonyl o Cp ₂ CO _z , préparé précédem¬ ment (à partir de deux équivalents de Mo ₂ C ₂ C0g). On obtient très vite une solution rouge que l'on chroma- tographie sur colonne d'alumine (éther comme éluant) et sous courant d'argon. On sépare ainsi le produit synthétisé du complexe du molybdène de départ. Les

deux isomères Z et E de 1'oxime sont séparés sur plaque de silice preparative avec un mélange éluant éther 2-pentane1. (Rf=0,18 et 0,23).

FUSION : Le produit se décompose à partir de 110°C. RMN H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm :

Spectre de l'isomère majoritaire :

6,91(1H,s,NH) 9,11(1H,s,14-C0H)

12,00(1H,s,16-C0H) IR (en cm ^"1 )

3422 (F et I ,v OH associé ) 2922 (F , v _& CH ₂ )

2851 (m , v ₈ CH ₂ )

1990, 1907,183 (F, CO sur le métal) 1641 (f _fï > CO)

1583 (m, ^) C≈C aromatique) ZEARATiE ONE 7 (voir schéma 2 ci-après)

FUSION : 164°C

RMN H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm :

Tous les hydrogènes ont été attribués grâce à un .spectre de corrélation proton-proton (cosy)

2,06(5H,m,5-CH ₂ ,9-CH ₂ ,6-CH-H) 2,13(2H,m,10-CH ₂ )

2,26(1H,m,8-CH-H) 2,33(2H,m,10-CH ₂ )

2,68(1H,m,6-CH-H) 2,88( H,m,8-CH-H)

5,00(1H,m,3-CH) 5,75(1H,m,C»CH)

6 ,30 (1H,d ,^J=2 , 5Hz , 5-CH) 9 ,19(1H, s ,14-G0H)

6 ,44(1H,d , J=2 ,5Hz , 13-CH) 11 ,94(1H,s ,16-COH)

7 ,05(lH,d , ³ J=15Hz ,12-CH=G)

RMN 15G (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm : La position des C^ a été repéré par une ex¬ périence DEPT.

26(19-0) (27,28,38,40,41 ,49)≈(4-C,5-C,6-C,8-G, ,0)

10-C) 79(3-C) (108,115)=03-C,15-C) (139,1 0)≈(11-C,12-C) (150,159,16 ,178)=(14-C,16-C,17-C,18-C) (207,215)=(1-C0,7-C0)

IR_ (en cm ) 3314(F et I,* OH associé) 2976 (m, v _& CH ₃ ) 2935 (e, v _a CH ₂ ) 2868 (f, v _g CH ₂ ) 1691,1649,1618 (F,»-) CO) 1580 (m, -*) C≈C aromatique)

MASSE (Par désorption chimique avec NH ₃ comme gaz ^_ réactant) Pic de masse ≈ pic de base MH ⁺ =39 m/z=336 (M+N ⁺ ) CARBQXYMΞTHYLOXIME 7 ^f ZEARALENONE : 8 (voirschéma 2)

Nous avons utilisé le même mode opératoire que pour la synthèse du composé 3 _, . La réaction a été réalisé à partir de 400 mg (1,25 mmole) de zéaralénone 7 _, . On obtient 35 m (1,1 mmole) d'un produit visqueux (Rdt=88 %). Avec une faible concentration de produit, on peut réussir à séparer les deux isomères Z et E de l'oxime en utilisant comme mélange éluant du chloroforme2 propanoll : Rf=0,35 et 0,48

RMN 1H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm

Pour l'isomère majoritaire :

1,35(3H,d, ³ J=6Hz, 19-CH _j 2,85(2H,m,8-CH ₂ )

4,59(2H,s,N0-CH ₂ -COOH) 4,95(1H,m,3-CH) 5,7^(lH,m,11-CH=C) 6,28(1H,d, J≈2,5Hz,15-CH)

6,42(1H,d, J≈2,5Hz, 13-CH) 7,05(1H,d, ⁵ J=15Hz, 12-CH-C) 12,0 (1H,s,16-C0H)

Le produit analysé est un mélange des deux isomères Z et E de 1'oxime. Le produit minoritaire présente peu de différence spectrale avec celui de l'isomère majoritaire : 1,36 9-CH ₃ ) , 4,55 (N0-CH ₂ -C00H) , 5,13 (3-CH), 6,0 (11-CH=C) On peut ainsi estimer la proportion des deux isomères : 85 % - 15 %- IR (en cm ^"1 )

3412 (1,-ύ COOH) 2932(F, v _a CH ₂ ) 2870 (e,v _g CH ₂ ) 1717;1669 (f, •) CO) 1647;1669(F, 9 CO)

MASSE (Par désorption chimique avec H^ comme gaz réactant) Pic de masse = pic de base : MH+=<392 m/z≈392 (M+NH^ ⁺ )

PROPARGYLAMIDE METHYLOXIME 7' ZEARALENONE : 9

(voir schéma 2)

Le mode opératoire est le même que celui de la synthèse du composé 4, en utilisant 200 mg (0,5 mmole) de 8. On obtient 183 mg de solide amorphe légèrement coloré (rdt = 90 °/o). La séparation des deux isomères s'effectue sur plaque preparative de silice (avec de l'éther comme éluant) : Rf = 0,46 et 0,6.

RMN H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm

1,39 (3H,d, J=6Hz, 19-CH ₃ ) 1,38

2,67 (1H,t, J=2,5Hz, CsCH) 2,64 4,03 (2H,8raies, ³ J=2,4Hz,* ^" J=1,2Hz, NH-CH ₂ -CΞCH) 4,02

4,47 (2H,s7N0-CH ₂ -C0) 4,42

5,00 (1H,m,3-CH) 5,15

5,77 (1H,m,11-CH=C) 5,94

6,28 (1H,d, J=2,5Hz,15-CH) 6,28 6,44 (1H,d, J=2,5Hz, 13-CH) 6,46

7,08 (lH,d, J≈15Hz, 12-CH≈C) 7,10

7,21 (1H, s large, NH) 7,23

La position des hydrogènes de l'isomère majo¬ ritaire est indiquée à gauche; celle de l'isomère mino- ritaire à droite.

IR (en cm )

3288 (I , v OH assoc ié ) 2930 (f ,v _a CH ₂ ) 2853(m, ^~ τ _Q CΕ^)

2125 ( , CΞCH) 73 (f , CO) 1651 (F , CO) 1580 (m, t> C=C aromatique)

ANALYSE ELEMENTAIRE Pour C ₂₃ H ₂₈ N ₂ 0 ₆

Calculé en % C 64,48 H 6,54- N 6,5 022,43 Trouvé en % 61,57 6,95 6,09 22,26

DICOBALT HEXACARBONYL PROPARGYLAMIDE METHYLOXIMΞ 7' ZEARALENONE : 10 (voir schéma 2)

Nous avons utilisé le même mode opératoire que pour la synthèse du composé 5, le produit obtenu a une coloration rouge.

FUSION : Le produit se décompose à partir de 80°C.

439

35

HHH _E (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm

Pour l'isomère majoritaire :

1,39 (3H,d, ³ J=6Hz, 19-CH ₃ ) ,53 (2H,système AB, 4 raies, N0-CH ₂ -C0)

IR (en solution dans CHgClg) 2955 (F,v CH ) 2097 (m, » CO) 2029;2058(F, ^V CO)

DERIVES DE LA ZERALONE ⁽ Schéma 1 ⁾

DERIVES DF T.Ά ZEARALENONE (Schéma 2)

Zéaralénone

NH ₂ OCH ₂ COOH py

cobalt

EXEMPLE 6 TESTS IMMUNOLOGIQUES On a étudié le comportement des antigènes organo¬ métalliques dérivés du zéranol vis-à-vis d'anticorps du zéranol (l'immunisation ayant été réalisée à partir d'immunogène portant un bras CMO en position 7 pour le couplage à la BSA. (D. Thouvenot et R. Morfin, Applied and Environ ental Microbiology, 1983, 4^, 16-23)). Pour cela, on a effectué des courbes de compétition entre le zéranol- H et des olarités croissantes des dérivés organométalliques. Les valeurs d'affinité relative de liaison (ARL) vis-à-vis des anticorps du zéranol figurent dans le tableau ci-dessous

AFFINITE RELATIVE DE LIAISON (ARL) VIS-A-VIS DES ANTICORPS DU ZERANOL

Produit ARL

28a (Métal≈molybdène) 31 % 28a (Métal≈cobalt) 39 %

28b (Métal≈cobalt) 57 %

26 ( ,8) 5 %

27 17 %

Ces résultats montrent que tous ces complexes sont compétiteurs du zéranol- H, donc se fixent sur les anticorps. Les pourcentages élevés obtenus pour plusieurs complexes indiquent clairement la possibilité d'utiliser ces antigènes pour le dosage immunologique du zéranol. D'autre part, le spectre infra-Rouge en micropastille de KBr du complexe 28b est représenté sur lafigure 1. Les bandes caractéristiques du greffon orga¬ nométallique apparaissent à 2094, 2051 et 2024 cm ^" . Ces bandes que T'on retrouve dans tous les complexes de ce type sont nettement plus intenses que toutes les autres bandes du spectre et sont situés dans une zone où les protéines n'absorbent pas.

METHODOLOGIE DES TESTS BIOLOGIQUES EFFECTUES

ET RESULTATS

L'affinité des hormones modifiées pour le récepteur de l'oes _t radiol est déterminée par un test de compétition entre ces hormones et l'oestradiol tritié. Pour cela, des fractions de cytosol (surnageant

105 OOOXg) sont incubées en présence d'une concentration fixe d'oestradiol tritié (2.10" ) et de concentrations variables de l'hormone à tester ⁽ 9 points entre lθ ^"δ et 10 ). On détermine ainsi la valeur de RBA ("Relative

Binding Affinity") qui est le rapport X 100 de la concentration d'oestradiol non radioactif déplaçant 50 % de la liaison spécifique de l'oestradiol a son récepteur sur la molarité d'hormone modifiée déplaçant 50 % de cette liaison. Plus la valeur de RBA est élevée plus l'hormone à tester à de l'affinité pour le récepteur de l'oestradiol.

Produit . RBA 3'(acétylénique en 2) 2,5 %

•V(acétyiénique en ) 2,5 %

3 ⁽ complexé en 2) 0,001

'. (complexé en < 1,9 %

19 ⁽ acétylénique en 16) 1,2 % zéranol 32,5 %.

EXEMPLE 7

ALKYLATION-COMPLEXATION SELECTIVE DE FONCTIONS AMINES ET THIOLS

Le cation (9) réagit aussi, facilement, avec les sulfures tels que le diméthylsulfure dans le chlorure de méthylène pour conduire à un ion sulfoniu (9') qui est isolé quantitativement à partir de (9) .

O) {y)

Cet ion sulfonium est soluble et stable dans CH-C1-, l'acétone, l'acétonitrile, alors que (9) réagit sur l'acétone et l'acétonitrile. Dans ces solvants, il s'hydrolyse lentement pour donner l'alcool propargylique complexé. Dans le éthanol et l'ethanol, cet ion carbé- niu (9') modifié est soluble et donne une réaction d'alcoolyse qui requiert plus de dix minutes pour être complète tandis que (9) réagit quasi instantanément sur ces alcools, Dans ces conditions (9 ¹ ) peut être utilisé avantageusement pour des réactions de propargylation d'aminés primaires et secondaires y compris dans des milieux protiques.

Une autre méthode de propargylation des aminés consiste dans l'utilisation du cation (9 ^H ) qui implique un changement de métal.

Sa réactivité sur les aminés dans le chlorure de méthyle est immédiate, mais nous avons étendu cette réaction à d'autres milieux, acétone et acétonitrile ainsi que dans l'ethanol ou des milieux biphasiques tels que chlorure de méthylène et eau. Cette méthode est parti¬ culièrement valable pour des dérivés solubles dans l'eau et peu solubles dans les milieux organiques comme les catéchola ines.

D'autres hétéroatomes peuvent être utilisés pour complexer temporairement le cation (9) (par exemple la pyridine et ses dérivés) et moduler encore la réactivité en milieu protique avec une alkylation de thiolates dans le cas de la pyridine. A partir de (9) on possède donc une nouvelle génération d'alkylants régio et che iosélectifs de nucléophiles.

Ci-après vont être explicités les modes opé¬ ratoires pour certaines opérations intervenant dans l'al- kylation-complexation sur une aminé ou une fonction thiol.

1) H0CH ₂ C CH " ^BF 4 ^Θ > ®CH ₂ C^CH, BF® CH3 ^S CH3» Co ₂ (CO) ₅ ^C o ₂ (CO) ₅

A 0,34 g d'alcool propargylique complexé dans 5 ml d'éther, on ajoute 1 ml de HBF ₄ éther. Après formation du cation, on procède au lavage à l'éther, puis au séchage sous vide. On ajoute ensuite 10 ml de CH ₂ C1 ₂ et 0,5 ml de CH ₃ S CH ₃ (di éthyl- s lf re) . Après quelques minutes, un précipité brillant rouge se forme, on décante, on lave le précipité à l'éther. On sèche sous vide, on obtient une poudre rouge pâle (brique) légèrement brillante que l'on met au bac à froid sous argon.

2)

On ajoute 10 mg de cation dans 2 n.1 d'acétone. On laisse à O'C et on ajoute goutte à goutte en solution dans l'acétone 0,2 ml d'isopropy¬ lamine. La réaction est immédiate, il se forme un produit rouge marron. Le rendement est de l'ordre de 75 %.

La réaction peut avoir lieu dans d'autres solvants, notamment l'ethanol ou le méthanol. La réaction doit être alors portée à une température plus basse de l'ordre de -15 à -20°,- par exemple on ajoute 10 mg de cation en solution dans 1 ml d'éthanol, le tout est préparé à -15°C. Après dissolution du cation, on ajoute goutte à goutte 0,2 ml d'isopropylamine en solution dans 0,5 ml d'éthanol. La réaction est immédiate, on remonte à la température ambiante et on évapore le solvant.

3) H-CÈCCH, , B . +

T 2 4

Mθ ₂ Cp ₂ (CO) ₄

On a oute 0,16 g de cation dans 8 ml de CH-OH, on ajoute goutte à goutte 0,2 ml de diisopropyl- a ine dans 1 ml de méthanol, la _^ solution au départ orangée devient rouge. On évapore le solvant.

43

Le cation a été préparé de la manière sui- vante £ÉE§£§î _: io _de-Mo 2~ 21S214

HO-CH ₂ -C≡CH + Mθ ₂ Cp ₂ (CO) ₄ »>

On ajoute 5 g de Mo ₂ Cp ₂ (CO) dans 40 ml de dyglime traité (Na+benzophénone) au reflux sous argon pendant 3 heures. Filtration, puis évaporation du dyglime. Addition de l'alcool propargylique. 4 g d'alcool en solu¬ tion dans 50 ml d'éther sont ajoutés, puis 3 ml de.HBF ₄ aqueux dans 150 ml d'éther (goutte à goutte). Il se forme un précipité orange. Filtration, lavage, on obtient une poudre jaune.

Ce nouveau carbocation permet d'alkyler les fonctions thiol, notamment sous forme de thiolate.

Sur 0,3 g d'alcool propargylique, on obtient un cation lavé à l'éther, séché puis additionné d'un excès de pyridine d'environ 1 ml dans CH ₂ C1 ₂ , après évaporation du solvant et lavage à l'éther du résidu on obtient un résidu rose.