Hintergrund der Erfindung Der Begriff Fibrose bezeichnet die häufig auch als Sklerose bezeichnete krankhafte Vermehrung des Bindegewebes, die durch die Ablagerung großer Mengen extrazellulärer Matrix und bindegewebsartigem Material in Organen gekennzeichnet ist. Die Vermehrung des Bindegewebes führt zu einer beträchtlichen Schädigung der Zellen des umliegenden Gewebes.

Das umliegende Gewebe erfährt als Reaktion auf die Fibrose eine Art Vernarbungsprozess.

Je nach dem Schweregrad der Vemarbung des betroffenen Gewebes kann die Fibrose reversibel sein und sogar wieder ganz verschwinden. Häufig jedoch tendiert fibrotisches Gewebe dazu, sich zu einer noch schwerwiegenderen Läsion zu entwickeln, die zu Organversagen und sogar zum Tod des betroffenen Patienten führen kann. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn die schädigenden Umstände, welche die Fibroseentstehung begünstigen, wie z. B. Alkoholabusus, Intoxikationen, virale Infektionen (Hepatitiden), bestehen bleiben.

Die Leberzirrhose, das Endstadium vieler mit Leberfibrose assoziierten Lebererkrankungen, ist weltweit eine häufige Todesursache. In den USA stellt sie immer noch die fünfthäufigste Todesursache bei Personen unter 65 Jahren dar. Die geschätzten jährlichen medizinischen Kosten für an Zirrhose leidende Patienten betragen zwischen 6 bis 8 Billionen Dollar allein in den USA.

Viele der Faktoren, die bei der Fibroseentstehung eine Rolle spielen, sind bereits bekannt.

Trotzdem stehen bisher weder Arzneimittel noch Strategien bereit, um den Prozess der Fibrose wirksam zu verhindern oder zumindest zu verlangsamen.

Die gegenwärtige Situation ist daher wenig zufriedenstellend und wird außerdem noch durch die Tatsache verschlechtert, dass Einzelheiten über die vielschichtigen Mechanismen, die am regenerativen Prozess teilhaben, noch weniger bekannt sind.

Arzneistoffe mit Fibrose-verhindernder Wirkung stellen daher bei der Unterstützung der Organregeneration nicht per se das Mittel der Wahl dar. Da Fibrosepatienten üblicherweise erst dann einen Arzt aufsuchen, wenn die Fibrose bereits entstanden ist, sind die Heilungschancen geringer als bei anderen Krankheiten.

Gegenwärtig verwendete Tiermodelle zur Untersuchung von Leber-Fibrose und von anti- fibrogenen Stoffen umfassen durch Tetrachlorkohlenstoff induzierten Leberschaden (McLean E. K. et al., Br J Exp Pathol 1969 ; 50 : 502-506) und Ligation oder Obstruktion des Gallengangs (Gerling B. et al., J. Hepatol. 1996 ; 25 : 79-84). Im ersten Fall wird die Fibrose durch fortlaufende Zerstörung von (perizentralen) Hepatozyten ausgelöst, im zweiten Fall durch die kontinuierliche Schädigung von Hepatozyten als Folge der drastisch ansteigenden Konzentrationen der Gallensäuren.

Aufgrund des nicht vorhersehbaren Krankheitsverlaufs (hohe Frühmortalität) und den Unterschieden im Zeitverlauf und im Ausmaß der Organschädigung besitzen diese Tiermodelle jedoch sehr viele Nachteile (Gebhardt R. und Reichen J., J. Hepatology 1994, 20 : 684-691).

Weiterhin wurden transgene Tiermodelle etabliert, die sich die Eigenschaft zunutze machen, dass TGF-ß eines der wichtigsten Cytokine ist, das die Fibrogenese induziert und unterstützt.

Auch diese transgenen Modelle sind jedoch mit Nachteilen behaftet. So führt z. B. die Expression des Zytokins unter der Kontrolle des Albumin-Promotors (Sanderson N. et al., PNAS USA 1995,92 : 2572-2576) zu einer frühen und kontinuierlichen TGF-ß Produktion, welche, bedingt durch die frühe Entstehung einer fatalen Nephropathie (Bisgaard H. C. und Thorgeirsson S., Clin Lab Med 1996,16 : 325-339) nur eine kurze Lebenszeit der transgenen Tiere zur Folge hat.

Bei einem anderen transgenen Modell, welches auf dem durch Lipopolysaccharide induzierbaren CRP-Promotor beruht, blieb die Entstehung eines kontinuierlichen fibrotischen Prozesses aus, da sich bei den Tieren schnell eine Toleranz gegenüber LPS herausbildete (Kanzler S. et al., Am J Physiol 1999, 276 : 61059-61068). Ein weiterer Nachteil dieses Systems besteht außerdem darin, dass LPS selbst pathogen auf die Leber wirkt (Heller J. et al., J Hepatol 2000 ; 33 : 376-381 ; Hiraoka E. et al., Liver 1995 ; 15 : 35-38) und so auf ungünstige Weise mit dem fibrotischen Prozess interagiert.

Aufgrund der vorstehend genannten Nachteile sind die aus dem Stand der Technik bekannten transgenen und nicht-transgenen Tiermodelle nur unzureichend geeignet, die Entstehungsmechanismen der Fibrose und mögliche Therapieverfahren zu untersuchen.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem transgenen Tiermodell, welches die kontrollierte Induktion der Fibrose durch Cytokine ermöglicht, ohne jedoch auf andere schädigende Weise in den Organismus einzugreifen.

Weiterhin sollte dieses transgene Tiermodell die Möglichkeit bieten, in dem interessierenden Organ gezielt den Entstehungsmechanismus der Fibrose zu untersuchen.

Diese Probleme werden durch den Gegenstand der Ansprüche der vorliegenden Erfindung gelöst.

Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Tiermodell für Organfibrose, wobei dieses Modell ein doppelt-transgenes nicht-menschliches Tier umfasst.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein transgenes, nicht-menschliches Tier, welches stabil im Genom integriert ein erstes rekombinantes Gen enthält, welches für ein Cytokin kodiert, wobei das Cytokin konditional und organspezifisch exprimiert wird und wobei diese Expression zu Organfibrose führt.

Unter"konditional"wird die Abhängigkeit von einem Stimulus oder einem Signal verstanden. Als "konditionale Expression"ist die Expression in Abhängigkeit von einem Stimulus oder einem Signal zu verstehen. Der bevorzugte Stimulus in der vorliegenden Erfindung ist Doxycyclin.

"Organspezifische Expression"ist die Expression, die auf definierte Organe (meist nur ein Organ) beschränkt ist.

Der Begriff"organspezifischer Promotor"bezeichnet einen Promotor, der nur in definierten Organen (meist nur ein Organ) transkribiert wird und damit zur organspezifischen Expression führt.

Der Begriff"regulierbarer Promotor"bezeichnet einen Promotorbereich, der durch Transkriptionsfaktoren (Enhancer oder Silencer) reguliert wird. Eingeschränkt wird darunter verstanden, daß in Abwesenheit z. B. eines entsprechenden Enhancers keine Expression möglich ist, d. h. der Promotor also keine Basalaktivität zeigt.

Unter"partieller Expression"ist die Expressionrate eines Gens zu verstehen, die unter der Expressionsrate des Wildtyp liegt. Vorzugsweise beträgt die Expressionsrate maximal 99%, maximal 95%, maximal 75%, bevorzugt ist eine Expressionsrate von maximal 50%, weiter bevorzugt von maximal 25% der Expressionsrate des Wildtyp.

Unter"Mikroinjektion"wird die Injektion mit einer sehr feinen Kanüle in ein winziges Objekt, z. B. eine Zelle oder den Zellkern, verstanden.

Als"scheinschwanger"wird eine reproduktionsfähige weibliche Maus bezeichnet, bei der nach Geschlechtsverkehr mit einem sterilen Männchen die Schwangerschaft eingeleitet wurde. Im erfindungsgemäßen Sinn bezeichnet dies eine weibliche Maus 2,5 Tage nach dem Koitus, in deren Gebärmutter manipulierte Blastozysten eingesetzt werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Wie vorstehend ausgeführt betrifft die vorliegende Erfindung ein nicht-menschliches Tiermodell für Organfibrose, wobei dieses Modell ein doppelt-transgenes nicht-menschliches Tier umfasst.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein transgenes, nicht-menschliches Tier, welches stabil im Genom integriert ein erstes rekombinantes Gen enthält, welches für ein Cytokin kodiert, wobei das Cytokin konditional und organspezifisch exprimiert wird und wobei diese Expression zu Organfibrose führt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des ersten rekombinanten Gens durch einen ersten regulierbaren Promotor kontrolliert, wobei der erste regulierbare Promotor bevorzugt eine Tet-Operatorsequenz umfasst.

Das erste rekombinante Gen kodiert für ein Cytokin. Der Begriff Cytokin bezeichnet Botenstoffe, die die Funktionen des Immunsystems steuern und somit von großer Bedeutung für die Immunabwehr sind. Die meisten Cytokine entfalten ihre Wirkung über einen Rezeptor auf der Zelle. Eine Übersicht über Cytokine, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, findet sich in Molecular Biology and Biotechnology-A Comprehensive Desk Reference ; edited by Robert A. Meyers, VCH Publisher Inc., 1995, Seiten 200-204.

Beispiele für Cytokine sind die Interleukine, die je nach Typ des Interleukins von T-, B-Zellen und von Makrophagen sezerniert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert das erste rekombinante Gen daher für ein Cytokin, ausgewählt aus der Gruppe der proinflammatorischen Cytokine, z. B.

TGF-ß, IL-1, IL-2 und IL-13.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das nicht-menschliche transgene Tier weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es stabil im Genom integriert ein zweites rekombinantes Gen enthält, welches für ein regulierbares Transaktivatorprotein (tTA) kodiert. tTA besitzt die Fähigkeit, die Aktivität des ersten regulierbaren Promotors, und damit die Expression des Cytokins, zu kontrollieren. Der erste Promotor umfasst, wie bereits oben beschrieben, eine Tet-Operatorsequenz.

Der Begriff tTA bezeichnet das"tetracycline-dependent transactivator protein" (Triezenberg S. J. et al., Genes Dev 1988,2 (6) : 718-29 ; Gossen M. et al., Science 1995,268 (5218) : 1766-9), welches aus dem Ecoli tet Repressor besteht, der an die Transkriptions-aktivierende Domäne des Herpes Simplex Virus VP16-Proteins gebunden ist.

Wenn tTA exprimiert wird, bindet das resultierende Protein mit hoher Affinität an die Tet- Operatorsequenz, die im ersten regulierbaren Promotor enthalten ist, und stimuliert die Expression des ersten rekombinanten Gens, d. h. des Cytokins. Durch Zugabe von Tetracyclin oder Doxycyclin geht die Affinität des tTA für die Tet-Operatorsequenz verloren, tTA löst sich von der Tet-Operatorsequenz ab und die Transkription des Cytokins wird abgeschaltet.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transkription des Cytokins durch Doxycyclin (DOX) abgeschaltet.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird tTA organspezifisch exprimiert. Dies wird dadurch gewährleistet, dass tTA unter der Kontrolle eines zweiten regulierbaren, gewebespezifischen Promotors exprimiert wird.

Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn die Expression des tTA auf Hepatozyten beschränkt ist. Deshalb ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass der zweite regulierbare Promotor LAP (liver enriched activator protein) ist. Für eine leberspezifische Expression sind als zweite regulierbare Promotoren beispielsweise auch der Transthyretin-Promotor, der Insulin-like-Growth-Factor-Promotor oder die Promotoren von verschiedenen Cytochrom P450-Genen möglich.

In Abhängigkeit von der Stärke der TGF-ß Produktion kann die Organfibrose verstärkt ausgelöst werden, wenn kurze Intervalle der Ab- (4-10 Tage) und Anwesenheit (2-5 Tage) von DOX zyklisch aufeinander folgen (Intervallbehandlung). Abweichend hiervon ist es auch möglich, die Stärke der TGF-ß Produktion durch konstante Gabe von niedrigen Konzentrationen von DOX (0,2 bis 10 ug/ml) zu regulieren und so eine partielle Expression des Cytokins zu erreichen.

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des nicht- menschlichen, doppelt-transgenen Tiers. Dazu werden gemäss der vorliegenden Erfindung zunächst zwei Expressionsvektoren konstruiert. Einer der Expressionsvektoren umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Cytokin unter der Kontrolle des Tet-Operators kodiert, während der andere Vektor eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für tTA unter der Kontrolle eines organspezifischen Promotors kodiert.

Gemäß der Erfindung werden embryonale Stammzellen, vorzugsweise nicht-menschliche embryonale Stammzellen, insbesondere bevorzugt embryonale Stammzellen der Maus, getrennt mit den Vektoren transfiziert und anschließend diejenigen Stammzellen selektiert, die jeweils einen der Vektoren enthalten. Nachfolgend werden die selektierten embryonalen Stammzellen in Blastozysten mikroinjiziert und diese in ein scheinschwangeres Tier transplantiert.

Dabei werden zunächst zwei verschiedene transgene Linien etabliert : eine Linie ist transgen für das Cytokin unter der Kontrolle des Tet-Operators, die andere Linie ist transgen für den tTA unter der Kontrolle eines organspezifischen Promotors. Die Nachkommen beider Linien werden

anschließend verpaart, um doppelt-transgene Tiere mit der Fähigkeit zur konditionalen und organspezifischen Entwicklung eines Fibrose-Phänotyps zu erhalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Expression des Cytokins während der Embryonalentwicklung der transgenen Tiere durch Zugabe von Doxycyclin gehemmt.

Zur Generierung der transgenen Tiere werden bevorzugt Nager verwendet, insbesondere Mäuse und Ratten.

Anstelle des regulierbaren Transaktivatorproteins (tTA) kann auch das reverse regulierbare Transaktivatorprotein (rtTA) verwendet werden. In diesem Fall bleiben alle übrigen Konstruktionen und Schritte zur Generierung der doppelt-transgenen Mäuse dieselben, nur dass die Fibrogenese abweichend in Abwesenheit von DOX ausbleibt und durch Zugabe von DOX induziert wird (also die Auslösung in Bezug auf DOX revers ist).

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die durch das erfindungsgemäße Verfahren generierten doppelt-transgenen nicht-menschlichen Tiere ein hervorragendes Tiermodell bereitstellen, welches die kontrollierte Induktion der Fibrose durch Cytokine ermöglicht, ohne jedoch auf andere schädigende Weise in den Organismus einzugreifen. Dabei macht sich das doppelt-transgene System wie vorstehend beschrieben das tTA-System zur Kontrolle der organ-und entwicklungsspezifischen Expression von Cytokinen zu Nutze.

Ein überraschender Befund der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass in den doppelt- transgenen Tieren durch das An-und Abschalten der TGF-ß-Expression eine massive und zugleich jedoch reversible Fibrose induziert werden kann.

Das An-und Abschalten der TGF-ß-Expression wird durch die Ab-bzw. Anwesenheit von Doxycyclin gewährleistet. In Tieren, die in Anwesenheit von DOX gehalten werden, liegen keine nachweisbaren TGF-ß Konzentrationen vor. Nach DOX-Entzug setzt rasch die Fibrogenese ein, die durch eine hohe TGF-ß Produktion und einen in beträchtlichem Ausmaß erhöhten Serumspiegel dieses Cytokins gekennzeichnet ist.

Das Tiermodell der vorliegenden Erfindung bietet ausserdem die Möglichkeit, die Entstehung der Fibrose in Abhängigkeit vom betroffenen Organ und vom Alter des Tieres zu analysieren.

Die organspezifische Expression hängt von der Auswahl des zweiten, regulierbaren organspezifischen Promotors ab, der die Expression des tTA kontrolliert.

Der hier gewählte Ansatz ist auch auf die Fibrogenese anderer Organe, wie z. B. des Herzens anwendbar, wenn als zweite regulierbare Promotoren solche gewählt werden, die spezifisch in Herzmuskeizellen exprimiert werden. Analog gilt dies für die Niere und andere Organe.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den doppelt-transgenen Tieren der vorliegenden Erfindung die Fibrogenese und andere, an diesem Prozess beteiligte zelluläre Reaktionen vollständig reversibel sind. Dadurch eignet sich das vorliegende Modell nicht nur zur

Untersuchung der Entstehung der Fibrose, sondern insbesondere auch zur Untersuchung der Mechanismen, die zur Regeneration der fibrotischen Organe beitragen. Hierzu zählen beispielsweise die Apoptose von Myofibroblasten und hepatischen Sternzellen, der Abbau extrazellulärer Matrixproteine, die verstärkte Proliferation von Parenchymzellen und andere.

Damit eröffnet das Tiermodell der vorliegenden Erfindung auch die Möglichkeit eines Screening auf Arzneistoffe, die den Regenerationsprozess unterstützen und lenken.

Das Tiermodell kann ausserdem dazu verwendet werden, die Induktion der Fibrose in Abhängigkeit von unterschiedlichen Cytokinen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Pathologien und Mechanismen, die an der Fibroseentstehung beteiligt sind.

Die altersabhängige Induktion von Fibrose kann ebenfalls weitere Möglichkeiten zur Untersuchung anderer Arten von Lebererkrankungen bereitstellen.

Abbildungen Die Erfindung wird weiterhin durch die folgende Abbildung erläutert : Abbildung 1 : Crossmon-trichrome Färbung für extrazelluläre Matrix-Proteine in Leberschnitten von (A) einer doppelt-transgenen TGF-ß Maus 8 Wochen nach Beginn der Intervallbehandlung durch DOX-Entzug und (B) einer Kontrollmaus (ohne TGF-ß Expression). Die blaue Färbung zeigt die massive Ablagerung von extrazellulären Matrix-Proteinen in der initiierten Maus (A), die sich von den periportalen Arealen bis in die zentralen Areale erstreckt.

Abbildung 2 : Steady-state Spiegel der mRNA von Prokollagen I (alpha 1). Die mRNA steady- state Spiegel wurden in Kontrolltieren (T-LAP2) und doppelt-transgenen TGF-ß Mäusen nach Induktion mit 10 Intervallzyklen (on) bzw. nach weiteren 6 (off-6d) oder 21 Tagen (off-21d) mit Gabe von DOX bestimmt und sind in attog/g Gesamt-RNA angegeben. Die Werte stellen Mittelwerte + Standardabweichung von 4 Bestimmungen dar.

Beispiele Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele in nicht-beschränkender Weise veranschaulicht.

Beispiel 1 Generierung der TGF-ß1-transgenen Mäuse Die Konstruktion des TGF-ß1 Expressionsvektors erfolgte durch Kionierung einer mutierten Schweine TGF-ß1 Minimal cDNA (Brunner A. M. et al., J Biol Chem 1989,264 : 13660-13664) in die HindIIl/Eco RV Schnittstelle des TET-Klonierungsvektors pBI-5 (CVU 89934) (Baron U. et al., Nucleic Acids Res 1997,25 : 2723-2729). Prokaryotische Sequenzen wurden anschließend über Ase 1/Xmn I Doppelverdau eliminiert.

Transgene Mauslinien wurden auf übliche Weise (Standardtechniken) durch Mikroinjektion hergestellt. Für das Screening transgener Tiere wurde die DNA aus Mäuseschwänzen mit dem Dneasy-Kit (Qiagen) isoliert. PCR und Southern-Blotting erfolgte mittels TGF-ß1-und Luciferase-spezifischen Primern und entsprechenden DIG-markierten Sonden.

Als weiteres Auswahlkriterium diente die Regulierbarkeit des Transgens. Hierzu wurden primäre Ohr-Fibroblasten der transgenen Mäuse mit dem tTA Plasmid (pUHD-15.1) transfiziert und die Expression der Luciferase in Gegenwart und Abwesenheit von Doxycyclin Hydrochlorid im Kulturmedium bestimmt.

Founder-Tiere, d. h. Tiere der F1-Generation, deren Transgen gut regulierbar war, wurden mit Black-6 Mäusen (C57BL/6NCRLBR, Charles River Laboratories) verpaart, um einen stabilen und definierten genetischen Hintergrund zu erzeugen.

Beispiel 2 Generierung der doppelt-transgenen Mäuse Für die Herstellung der doppelt-transgenen Mäuse wurden die TGF-ß1-transgenen Tiere mit Vertretern der zuvor hergestellten Transaktivator-Linien TALAP1/L7 und TA'AP2/L7 (Kistner A. et al., Proc. Soc. Natal Acad. Sci, USA, 1996 ; 93 : 10933-10938) gekreuzt, die den tTA unter der Kontrolle des LAP (Liver enriched Activator Protein) exprimieren.

Um die Expression von TGF-ß1 während der Embryonalentwicklung zu hemmen, wurde dem Trinkwasser der trächtigen Weibchen Doxycyclin-Hydrochlorid (50 mg/1 in 5% Sucrosetösung) zugesetzt. Das Trinkwasser wurde alle zwei Tage gewechselt. Auch nach der Geburt wurde das Doxycyclin im Trinkwasser belassen.

Die Induktion der TGF-ß1 Expression wurde zu beliebigen Zeitpunkten durch Entfernen des Doxycyclins eingeleitet.

Beispiel 3 Analyse der TGF-ß Expression Die Serumspiegel von TGF-ß1 wurden mittels ELISA (Pharmingen) nach den Herstellerangaben bestimmt.

Vor Durchführung des ELISA wurden die Serumproben angesäuert. Die in einem Zeitintervall bis zu fünf Tagen gemessenen Serumwerte von TGF-ß bewegten sich im Bereich zwischen 250-1200 ng/ml.

Beispiel 4 Messung der Luciferase-Aktivität Die Luciferase-Aktivität wurde in Homogenaten von Leber und Niere (hergestellt mit Phosphat- Puffer, pH 7.4) in üblicher Weise gemessen (Gaunitz F. et al., Biochem Biophys Res Commun 2001,284 : 377-383).

Die Luciferase-Aktivität wurde nach den Angaben von Gaunitz und Papke, Gene transfer and <BR> <BR> Expression. In : Methods in Molecular Biology 107 (Phillips IR, Shephard EA, eds. ), pp. 361-370.

Humana Press, Totowa, NJ, 1997, gemessen. In Anwesenheit von DOX waren die Aktivitäten unter der Nachweisgrenze. In Abwesenheit von DOX wurden Luciferase-Aktivitäten bis zu 10.000 rlu/lig Protein gemessen (rlu = relative Lichteinheiten).

Beispiel 5 Induktion der Fibrose Ein typisches Induktionsschema begann 80 Tage nach der Geburt der Mäuse. DOX wurde für 5 bis maximal 10 Tage entzogen und dann wieder für 2 bis 3 Tage zugegeben. Die ersten Fibroseanzeichen zeigten sich bereits nach 2 Wochen. Innerhalb von 2 Monaten war die Fibrose bereits stark ausgebildet (Abb. 1). Wird die Intervallbehandlung fortgeführt, verstärkt sich die Fibrosierung bis hin zur Leberzirrhose.