T í TULO

MODELO ANIMAL NO HUMANO úTIL PARA LA IDENTIFICACIóN DE COMPUESTOS FARMACéUTICOS REGULADORES DE LA VíA HEDGEHOG Y SUS APLICACIONES

SECTOR DE LA TéCNICA

Identificación de compuestos farmacéuticos mediante modelos animales no humanos, en particular en Drosophila. Sector biotecnológico y farmacéutico.

ESTADO DE LA TéCNICA

La activación de la via de señalización de la proteina Hedgehog (Hh) es clave en la inducción de patrones morfogenéticos y en los procesos de proliferación celular y modula y promueve la oncogénesis y otras enfermedades en humanos (Torroja et al., 2005, J Neurobiol, 64, 334-356). Por otro lado, la señalización o transmisión de señales mediante la proteina Hedgehog (Hh) se relaciona con los lipidos de diferentes maneras. La proteina Hh es sintetizada a partir de un precursor que sufre un proceso autoproteolitico, siendo doblemente modificada tanto por la adición de un grupo colesterol en su extremo C-terminal y por palmitoilación en su extremo N-terminal (Figura 1, ver Mann and Culi, 2005). La secreción de Hh modificada por lipidos tiene lugar por la mediación de una proteina transmembrana denominada Dispatched (Disp) (Burke et al., 1999, CeIl 99(7), 803-815). Esta proteina tiene un dominio sensible a esterol (SSD) al igual que el receptor de Hh, la proteina Patched (Ptc) , y otras proteínas involucradas en el metabolismo de los lipidos y colesterol y en el tráfico vesicular. Por otro lado, las modificaciones lipidicas de Hh son esenciales para la interacción entre Hh y los proteoglicanos hepará n sulfato (HSPGs) para controlar la

actividad de difusión y señalización de morfogenos (Callejo et al., 2006, Development 133, 471-483).

Recientemente, las partículas lipoproteicas han sido propuestas como transportadoras de ligandos modificados con lipidos desde la superficie celular, actuando de esta manera como vehículos de transporte de un amplio rango de elementos (Eaton, 2006, Curr . Opin. Genet . Dev. 16, 17-22). Desde este punto de vista los lipidos pueden ser necesarios para cargar la proteina Hh a estas partículas (Panakova et al., 2005, Nature 435, 30-33; Despande and Schell, 2005, Developmental CeIl 9, 629-638) . La proteina Hh modificada por lipidos y cargada en partículas lipoproteicas interactúa con la proteina Shifted, un nuevo componente de la matriz extracelular que colabora con HSPGs para la estabilización y difusión a través de la matriz extracelular. (Gorfinkiel et al., 200 , Developmental CeIl 8, 241-253; Glise et al., 2005, Developmental CeIl 8, 255- 266). Las modificaciones lipidicas en la proteina Hh se requieren adema s para la óptima interacción y reconocimiento de Ptc durante su recepción intracellular (Callejo et al., 2006, Development 133, 471-483). Por otro lado, se ha sugerido que el receptor LDLR pudiera estar asociado al receptor Ptc (Eaton, 2006, Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 17-22) . En ausencia del ligando Hh la proteina Ptc inhibe a la proteina Smoothened (Smo) y no hay señales de activación de esta via. La unión covalente de colesterol a Hh facilita la unión de ésta a la membrana y permite el reconocimiento a Ptc lo que permite que la proteina Smo se libere y pueda dar la señal para su activación. Recientemente, se ha observado que los esteróles podrían mediatizar la inhibición de Smo al mismo tiempo que se ha sugerido la enzimas para la biosintesis de colesterol pudieran estar implicadas en la regulación de la inhibición de Smo por Ptc

(Biljsma et al., 2006, PLOS Biology 4(8), 1397-1410). Es mas, se ha observado que dependiendo de que tipo de lipidos se trate, estos pueden actuar de agonistas o antagonista de la señalización de Hh pero su mecanismo de acción permanece sin resolver.

En este sentido, el incremento del conocimiento de la modulación de los lipidos en la interacción de la proteina Hh con sus receptores de membrana o intracelulares o con la proteina Smo permitirla avanzar en el desarrollo de herramientas útiles para el diagnóstico y tratamiento de tumores humanos, u otras patologías humanas en las que jugara un papel etiopatogénico .

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN Descripción Breve

Un objeto de la presente invención lo constituye un modelo animal no humano útil para la identificación de compuestos farmacéuticos reguladores de la via hedgehog, en adelante modelo animal de la invención, caracterizado porque permite la identificación compuestos que regulan la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención que presenta una incapacidad de sintetizar esteróles provocada por una ausencia de las enzimas implicadas, necesidad que es reemplazada de forma artificial en la dieta del animal, y en el puede determinarse la señalización de la via Hh y Smo. Esta incapacidad de sintetizar esteróles está provocada por la ausencia evolutiva de las enzimas biosinteticas de estos compuestos.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención que presenta una modificación genética en, al menos, un gen de la via de

señalización de Hedgehog que participa en la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh, perteneciente a titulo ilustrativo y sin que limite la invención, al siguiente grupo: Ptc y Smo que bloquean o estimulan la via de señalización de la proteina Hh.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso del modelo animal de la invención, en adelante uso de la invención, para la identificación de compuestos farmacéuticos reguladores de la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh.

Otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de la invención que comprende las siguientes etapas: i) adición a la dieta del animal del compuesto candidato a determinar su acción sobre la señalización de Hh, ii) una etapa, opcional, de inducción del gen de interés relacionado con la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh, cuando éste no sea constitutivo, iü) determinación de una modificación del fenotipo o parámetro biológico característico de un normal o alterado funcionamiento de las partículas lipoproteicas con Hh, inducido en ii), e iv) identificación de un compuesto regulador, ya sea inductor o bloqueante, si se produce la modificación del fenotipo en iii).

Finalmente, otro objeto de la invención lo constituye el uso de los compuestos farmacéuticos reguladores de la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades humanas, preferentemente el cáncer o cualquier otra donde estuviera implicada esta regulación .

Descripción Detallada

Asi, para demostrar la importancia de los lipidos en la señalización de la proteina Hh, se ha manipulado genéticamente la actividad de las enzimas que controlan la producción de lipidos en el disco imaginal de Drosophila. En este sentido, es conocido que SREBP (Sterol-regulatory element binding protein) es un factor de transcripción que controla múltiples genes implicados en el metabolismo lipidico, como el gen de la HMGCoA reductasa o del receptor LDL. Recientemente, se ha sugerido que la HMGCoA reductasa regula la señalización por Hh (Despande and Schell, 2005, Developmental CeIl 9, 629-638) .

La presente invención se basa en la demostración de la importancia de la adecuada interacción de la proteina Hh, con lipidos y con lipoproteinas y la consiguiente formación de partículas lipoproteicas para la correcta liberación y difusión a la matriz extracelular de Hh y su posterior internalización y/o regulación de las proteínas Ptc y Smo en las células receptoras, llevada a cabo en distintos modelos de señalamiento de Hh (ver Ejemplos). En primer lugar, se ha encontrado que la proteina Hh en el entorno extracelular se estabiliza tras la sobreproducción de lipidos mediante la sobreexpresión del factor de transcripción SREBP o de la enzima HMGCoA reductasa. En linea con lo anterior, la disminución de los niveles de los productos de estos genes rescata el fenotipo causado por el incremento de la producción de Hh (Figura 3, 4, 6 y 9, ver Ejemplo 1 ) .

Además, se ha estudiado el papel de las lipoforinas (Lp) , las lipoproteinas de Drosophila, en la señalización de Hh en el disco imaginal del ala, un tejido que no expresa Lp pero que la obtiene de la hemolinfa (Ejemplo 1.4) . La lipoforina es la principal lipoproteina transportadora de lipidos en insectos. La lipoforina

transporta en su núcleo hidrofóbico lípidos neutros como esteróles, ácidos grasos y azúcares (Arrese et al., 2001, Insect Biochemistry and Molecular Biology 31, 7-17). Para ello, se inhibió la Lp mediante RNA de interferencia, reduciendo asi el aporte de la hemolinfa; y mediante la sobreexpresión del receptor 2 de lipoforina (LpR2), el principal receptor de Lp expresado en las células del disco, con objeto de incrementar su endocitosis y reducir asi la cantidad de Lp libre en la matriz extracelular de los discos. Bajo estas condiciones la proteina Hh secretada no es estable en la matriz extracelular, sugiriendo que la proteina Hh precisa ser empaquetada con Lp, formando partículas lipoproteicas, en las células productoras para una correcta difusión y estabilización de la proteina Hh en la matriz extracelular.

Además, se ha testado la implicación de los receptores LDL (megalina) en la señalización de la proteina Hh y se ha encontrado, sorprendentemente, que la mesalina no está implicada en la señalización e internalización de la proteina Hh (Figura 5) y que ésta es capaz de internalizarse en las células sin necesidad de este receptor (Figura 8).

Por otro lado, se observó que la proteina Patched (Ptc) y la lipoproteina lipoforina son capaces de co- inmunoprecipitar, detectándose la forma de lipoforina 75 Kda (Figura 11, ver Ejemplo 3). Finalmente, y como resultado sorprendente de la presente invención se ha demostrado que el receptor de Hh, la proteina Patched (Ptc) , es un nuevo receptor de lipoproteinas, siendo capaz de internalizar activamente lipoproteinas (lipoforina en insectos) al compartimiento endocitico, que serian capaces de transportar lipidos al interior de la célula donde regularían la actividad de la proteina Smo (Figura 8 y 11), en una via independiente de Hh. Sin embargo, utilizando

distintos mutantes de Ptc se observó que la internalización de Lp no juega un papel principal en la transducción de señal de Hh aunque si parece que lo tiene en la difusión de Hh. Como conclusión, en la presente invención se propone que la proteina Ptc actúa no solo como un receptor de Hh sino además como un transportador de lipidos al interior de la célula, los cuales podrían modular la actividad de Smoothened (Smo) y convertirse asi en potenciales compuestos farmacéuticos útiles para el tratamiento de enfermedades humanas, como por el cáncer (Pasca di Magliano, M. & Hebrok, M. (2003) Nat Rev Cáncer 3, 903-11) o cualquier otra en la que se encontrara esta proteina Smo implicada . Basado en los resultados de la invención que indican que los esteróles y otros lipidos son necesarios para el correcto funcionamiento de la via de Hedgehog y de la actividad Smo y dada ciertas características de la mosca Drosophila melanogaster se puede desarrollarse un modelo animal útil no humano (mosca) para la identificación de compuestos farmacéuticos reguladores de la via Hedgehog y Smo, más concretamente, para hacer un rastreo de compuestos que participen en la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh y que pudieran modular dichas vias, por ejemplo esteróles, y ácidos grasos. Pudiéndose llevar a cabo desde varias aproximaciones en función del punto de regulación de la señalización de Hh analizado, tanto genéticamente como mediante administración de drogas o compuestos candidatos a medicamentos. Otra ventaja del presente modelo es que la via de Hedgehog es fundamental para la morfogénesis de todas las estructuras de la mosca, por lo que representa un modelo muy versátil.

En primer lugar, este modelo animal no humana se basarla en la inhibición del gen o genes implicados en la

síntesis de lípidos, por ejemplo, el gen de la proteína SREBP ó HMGCoA reductasa, entre otros. Es decir, mediante la mutación del gen que impide la expresión de las proteínas necesarias para la síntesis de lípidos en los animales mutados (Drosophila) . Además, como la mosca silvestre no es capaz de sintetizar esteróles, este tipo de compuestos los tiene que obtener de la dieta. Ya que el colesterol es clave para su supervivencia, la mosca debe tener un sistema eficiente de incorporación de compuestos lipiditos. Para este rastreo se puede proponer que los compuestos lipidíeos a ensayar (a título ilustrativo, oxysteroles, Vitamina D3, Cholesterol, Ergosterol, etc.) se disuelvan en los botes que contienen la papilla en la que normalmente se cultiva Drosophila . Los huevos de Drosophila son depositados por la madre en la papilla y una vez terminado su desarrollo embrionario, estos eclosionan del huevo y comienzan a moverse, comer y desarrollarse en este medio durante todo el periodo larvario.

Las estructuras adultas de la mosca adulta (patas, ojos alas, antenas, genitalia, etc.) se desarrollan durante el periodo larvario, dentro de la larva, a partir de los discos imagínales que son estructuras que contienen las células embrionarias precursoras de las estructuras adultas. Es, por tanto, durante el desarrollo larvario cuando se puede alterar mediante drogas el desarrollo morfogenético de la mosca adulta, las cuales se añadirían a dicha papilla. Estas manipulaciones pueden dar como resultado una alteración morfogenética que se manifiesta en la mosca adulta y que puede ser identificada fácilmente por un técnico en la materia, es decir, en biología del desarrollo .

Las construcciones genéticas y vectores necesarios para llevar a cabo el desarrollo del modelo animal de la invención pueden obtenerse por un experto medio mediante el

empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., CoId Sping Harbor Laoratory Press, N. Y., 1989 vol 1-3) . El modelo de Drosophila mutante para el gen SREBP, por ejemplo, el modelo Drosophila HLH1061ine52 descrito en la presente invención (Ejemplo 1), es incapaz de sintetizar á cidos grasos por lo que no solo el colesterol sino los á cidos grasos tienen que ser suministrados en la dieta para la supervivencia de estas moscas mutantes SREBP, pudiéndose definir la composición de distintas dietas de lipidos que analizando de forma conjunta su implicación en la actividad de la via Hh permitirla identificar qué lipido en concreto regula, inhibiendo o induciendo, dicha via, el cual se convertía en un principio activo de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades humanas, como el cáncer.

Por otro lado, como segundo modelo animal no humano de la invención útil para la identificación de compuestos reguladores de Hh, se pueden desarrollar nuevos modelos de mosca en los que la manipulación genética (por ejemplo, utilizando el sistema UAS-Gal4 de levadura, cruzando moscas con distintas mutaciones) permite obtener moscas en las que se han alterado genes de la via de Hedgehog que, como se acaba de demostrar en la invención, están regulados por compuestos en la participen en la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh, y que con promotores específicos de tejido solo se expresarían en las células precursoras de alguna estructura del cuerpo, sin afectar al resto, posibilitando su viabilidad y facilitando el uso del mismo. En los experimentos de la presente invención, por ejemplo, se ha manipulado la expresión de forma especifica en el disco del ala de la mosca, aunque para un técnico en la materia, es decir, en biología del

desarrollo y que utilice la mosca Drosophila como modelo de trabajo, desarrollar modelos en otros tejidos distintos basados en esta invención no representa una complicación.

En este sentido, como otro ejemplo, se puede obtener moscas que sobreexpresen elementos de la via de Hedgehog en otros tejidos, por ejemplo, los ojos, y como consecuencia de esta expresión anómala obtener un fenotipo en los ojos y no en otra parte del cuerpo de la mosca. Asi, sobreexpresando Patched (receptor de la via de Hedgehog) tal como se ha hecho en la presente invención (ver Ejemplo 3) con un promotor especifico de ojo se obtendrían moscas con ojos muy reducidos, ya que Patched bloquea constitutivamente la via de Hedgehog, impidiendo el desarrollo normal del ojo. Por el contrario, la sobrexpresión de Smoothened (Smo) que actúa de modulador positivo de la via de Hedgehog darla lugar a moscas con ojos aberrantemente grandes (Martin V, Carrillo G, Torroja C, Guerrero I. The sterol-sensing domain of Patched protein seems to control Smoothened activity through Patched vesicular trafficking. Curr Biol. 2001 Apr 17; 11(8) :601- 7) . En este sentido, también podrían utilizarse formas mutadas de estos genes como los utilizados en la presente invención (ver ejemplo 3, entre otros, la forma mutada PtcSSD) que constitutivamente activados pueden bloquear o inducir la via de Hedgehog. Como es durante el desarrollo larvario cuando tiene lugar la morfogénesis del ojo, seria posible encontrar un compuesto que regulará la via de Hh, positiva o negativamente, suministrándolo en el medio de cultivo. Si algún compuesto fuera capaz de modular los fenotipos causados por la sobreexpresión de los elementos de la via de Hedgehog podríamos identificarlos como posibles drogas terapéuticas.

Asi, un objeto de la presente invención lo constituye un modelo animal no humano útil para la identificación de

compuestos farmacéuticos reguladores de la vía hedgehog, en adelante modelo animal de la invención, caracterizado porque permite la identificación compuestos que regulan la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención que presenta una incapacidad de sintetizar lípidos provocada por una anulación genética de las enzimas implicadas, necesidad que es reemplazada de forma artificial en la dieta del animal, y en el puede determinarse la señalización de la vía Hh y Smo .

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención que presenta una modificación genética en, al menos, un gen de la vía de señalización de Hedgehog que participa en la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh, perteneciente a título ilustrativo y sin que limite la invención, al siguiente grupo: Ptc y Smo que bloquean o estimulan la vía de señalización de la proteina Hh.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención en el que los compuestos farmacéuticos reguladores de la vía hedgehog son útiles para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades humanas, preferentemente el cá ncer .

Una realización particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención que presenta una incapacidad de sintetizar lípidos provocada por la anulación genética, al menos, de una proteína perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: factor de transcripción SREBP y HMGCoA reductasa.

Otra realización particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención que presenta una modificación genética, en al menos un gen de la via de señalización de Hedgehog que participan en la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh, que induce la sobreexpresión de, al menos, uno de ellos, perteneciente a titulo ilustrativo y sin que limite la invención, al siguiente grupo: Ptc y Smo que bloquea o estimula la via de señalización de la proteina Hh. Otra realización particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención donde el animal pertenece al siguiente grupo: mosca Drosophila megalobaster, ratón, pollo y pez cebra.

Otra realización particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención donde la modificación genética es especifica de tejido mediante el uso de promotores de expresión específicos de tejido o célula .

Otra realización particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención donde el compuesto objeto de identificación pertenece, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: lipidos, esteróles, ácidos grasos y azúcares. Entre los esteróles podrían analizarse por ejemplo, oxysteroles, Vitamina D3, colesterol, ergosterol, etc. y derivados de los mismos

Una realización más particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención donde el modelo es Drosophila megalobaster con una modificación genética consistente en la sobreexpresión de Ptc, especifica del disco del ala u ojo del animal, y bloqueante de la señalización de la proteina Hh.

Otra realización más particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención

donde el modelo es Drosophila megalobaster con una modificación genética consistente en la sobreexpresión de Smo, especifica del disco del ala u ojo del animal, e inductora de la señalización de la proteina Hh. Otra realización más particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención donde el modelo es Drosophila megalobaster con una modificación genética consistente en la sobreexpresión de una forma mutada de Ptc, por ejemplo, PtcSSD, especifica del disco del ala u ojo del animal, e inductora de la señalización de la proteina Hh.

Otra realización más particular de la presente invención lo constituye el modelo animal de la invención donde el modelo es Drosophila megalobaster con una modificación genética consistente en la anulación o mutación genética del factor de transcripción SREBP, y irá s particularmente, el mutante de Drosophila HLH106 (HLH1061ine52) .

Otro objeto de la invención lo constituye el uso del modelo animal de la invención, en adelante uso de la invención, para la identificación de compuestos farmacéuticos reguladores de la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh.

Otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de la invención que comprende las siguientes etapas: i) adición a la dieta del animal del compuesto candidato a determinar su acción sobre la señalización de Hh, ii) una etapa, opcional, de inducción del gen de interés relacionado con la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh, cuando éste no sea constitutivo, iii) determinación de una modificación del fenotipo o parámetro biológico característico de un normal o alterado

funcionamiento de las partículas lipoproteicas con Hh, inducido en ii), e iv) identificación de un compuesto regulador, ya sea inductor o bloqueante, si se produce la modificación del fenotipo en iii) .

Otra realización particular de la invención lo constituye el uso de la invención en el que el fenotipo ó parámetro biológico determinado en iii) pertenece al siguiente grupo: determinación del desarrollo del disco imaginal del ala y tamaño del ojo de una mosca.

Finalmente, otro objeto de la invención lo constituye el uso de los compuestos farmacéuticos reguladores de la formación, difusión y recepción de partículas lipoproteicas con Hh para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades humanas, preferentemente el cáncer o cualquier otra donde estuviera implicada esta regulación .

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS Figura 1.- Esquema de producción, transporte e interacciones de la proteina Hh.

Figura 2.- Se describe un esquema de las proteínas que comparten el motivo transmembrana Sterol Sensing Domain

(SSD). Las proteínas NPCl, HMG CoA reductasa y SCAP están involucradas en el transporte de esteróles, tráfico y metabolismo, mientras que Patched, receptor de la proteina

Hh, y Dispatched, proteina que secreta a Hh, participan en la señalización de Hh.

Figura 3.- Rescate del señalamiento de Hh en moscas Drosophila mutantes para la proteina shifted (shf ^EY ) que sobreexpresan la enzima HMGCoA reductasa en el disco imaginal del ala (shf ^EY ; apGal4/UAS-hmgcr ) .

Figura 4.- Rescate del señalamiento de Hh mediante la sobreexpresión de HMGCoA reductasa (shf ² ; UAS-HMG CoA/Hh-

Gal4) en un modelo mutante shifted del ala de Drosophila en el compartimiento posterior del ala (shf ² ).

Figura 5.- El receptor de LDL, α-megalina no es un co- receptor para la proteina Hh en Drosophila. Estudio de la pérdida de la función en los clones Drosophila mutantes dor, con proteina fluorescente (FRT18dor8/FRT18armLacZ; apGal4/UAS-HhGFP) ; sin colesterol (FRT18dor8/FRT18armLacZ; apGal4/UAS-HhNGFP) y sin ácido palmitico

(FRT18dor8/FRT18armLacZ; apGal4/UAS-HhC85SGFP) . Figura 6.- Los fenotipos de ganancia de función de Hh se rescatan mediante la disminución de la síntesis de lipidos.

Hh ^Mrt ; HLH1061ine52, mosca mutante.

Figura 7.- Gradiente de glicerol (30-15%) para la detección de la proteínas α-Hh y α-lipoforina . Una vez precipitadas, las fracciones fueron testadas mediante Western blots para detectar la presencia de las proteínas α-Hh y α-Lipoforina usando anticuerpos específicos.

Figura 8.- La proteina Hh se internaliza en ausencia del receptor megalina/LPR2. 8.a) doble mutante dor-; megalina. Hh, Hh normal; HhN, Hh sin colesterol. 8.b) Esquema de la estructura proteica de los miembros de la familia de los receptores de lipoproteinas : LDLR, VLDLR, ApoER2, LRPl,

Mesalina y LRP5/6.

Figura 9.- Efecto de la disminución de la síntesis de lipidos en los niveles extracelulares de la proteina Hh.

Imágenes de disco imaginal del ala en Drosophila control

(wild-type, hhGal4; UAS-HhGFP/TM6b) ) y en Drosophila mutantes HLH106 (hhGal4; UAS-HhGFP/HLH1061ine52 ) .

Figura 10.- La proteina Patched (Ptc) es capaz de internalizar la lipoproteina lipoforina (Lp) tan eficazmente como lo lleva a cabo el receptor de lipoforina

(LpR). apGal4/UAS-PtcWt (control), apGal4/UAS-Ptcl4 (forma mutada de Ptc) y apGal4/UAS-LpR.

Figura 11.- La proteína Patched (Ptc) interacciona con la Lipoforina (Lp) e induce su internalización . A) Disco imaginal del ala de Drosophila hh-Gal4/UAS-Hh-GFP teñido por inmunofluorescencia con anticuerpos anti-Ptc (azul) y anti-ApoLI-II (rojo) que muestra la colocalización en el borde del compartimento A/P de Hh-GFP (verde), Ptc, y ApoL en estructuras punteadas apicales. B) Disco imaginal de larvas ApGal4/UAS-PtcWT-GFP; TubGalδOts (incubado durante 24 horas a temperatura restrictiva) acumula Lp (ApoLI-II) (rojo), Ptc-GFP (verde) y Hh (azul), las flecha amarillas indican la co-localización en estructuras punteadas). C) Co-localización de Ptc (verde) y Lp (ApoLI-II) (rojo) con un marcador del compartimento endocítico temprano Hrs (azul) en un disco imaginal del mismo genotipo que en B. D) Disco imaginal ApGal4/UAS-Rab7-GFP; TubGal80ts/UAS-PtcWT mostrando la co-localización de las proteínas Lp (ApoLI-II) (rojo) y Ptc (azul) usando anticuerpos específicos contra estas proteínas con Rab7-GFP (verde) (marcador de compartimento endocítico temprano, indicad por puntas de flecha en la figura) . E) Disco imaginal de genotipo ApGal4/UAS-PtcS2-GFP; TubGalδOts (después de 24 horas a temperatura restrictiva) teñido por inmunofluorescencia con anticuerpos contra Hh (azul) y contra-ApoLI-II (rojo). Observar que PtcS2-GFP (verde) también acumula Lp (ApoLI- II) y Hh, (PtcS2 tiene una mutación puntual en el SSD) . F) Disco imaginal de genotipo ApGal4/UAS-Ptcl4-GFP; TubGalδOts (24 horas a temperatura restrictiva) que sobreexpresa la proteína mutante Ptcl4-GFP, que es defectiva en internalización, se puede observar que no puede internalizar ni Lp (ApoLI-II) (rojo) ni Hh (azul). (G) Ensayos de inmunoprecipitación (IP) y Western blot. Mw: marcador de peso molecular; carril IPl: inmunoprecipitación de un extracto de proteína de larvas de genotipo UAS-PtcWT- GFP; ABlGal4 usando un anticuerpo α-GFP (ratón) y

desarrollado con un anticuerpo α-ApoLI-II (conejo) . Se observa una banda de irás de 20OkDa (punta de flecha) que se corresponde con la subunidad ApoLI de mayor peso molecular; carril input : inmunoprecipitación de una fracción del mismo lisado. Se observan dos bandas, una de 20OkDa (Apo-LI) y otra de 75kDa (Apo-LII), que se corresponden con cada uno de los dos monómeros de lipoforina; carril IP2 : inmunoprecipitación de un extracto de proteina de larvas UAS-PtcWT-GFP; ABlGal4 utilizando α-GFP (ratón) y Western Blot usando α-GFP (conejo) . Se observa una banda cercana a los 20OkDa que se coresponde con Ptc-GFP; carril IPC (control negativo) : inmunoprecipitación de un extracto de proteina Ptc salvaje de glándulas salivares utilizando un anticuerpo α-GFP de ratón y detectado con un anticuerpo α- ApoLI-II. Las bandas de aproximadamente 55kDa en los carriles IPl, IP2 y IPC se corresponden con IgG. Figura 12.- La reducción sistémica de Lp disminuye los niveles de Hh en el disco imaginal del ala. A, B) Hibridación in situ usando una sonda antisense-ApoLI-II en el disco del ala (A) y en el cuerpo gordo (B) de larvas control. C) Células del cuerpo gordo teñidas con el anticuerpo anti-ApoLI-II . Nótese la acumulación de la proteina ApoLI-II en estructuras vesiculares (inset). D-I) Expresión de Lp (D, E), Hh (F, G) y Ptc (H, I) en discos imagínales del ala de los controles (D, F y H) y de larvas HS-Gal4; UASLpRNAi después de dos golpes de calor antes de la disección (E, G y I). Nótese la disminución de los niveles de Hh y Ptc. J) representación gráfica de los niveles de Hh en los discos control y de larvas HS-Gal4; larvas UAS- LpRNAi (media de 6 discos, la barra de error representa las desviaciones estándard). K) Gráfico mostrando la intensidad de fluorescencia de Ptc a lo largo de del eje A/P de discos control (linea azul) o de larvas HS-Gal4; UAS- LpRNAi (linea rosa) .

Figura 13.- LpR2 Ectópico incrementa la internallización de Lp en los discos imagínales de las alas y reduce los niveles de Hh extracelular . A) Inmunotinción de discos de alas de apGal4; TubGal80ts/UAS-LpR2-HA (24 horas de temperatura restrictiva) mediante un anticuerpo anti-HA para mostrar la expresión ectópica de LpR2 (verde) y un anticuerpo anti-ApoLI-II en rojo y gris. La caja superior muestra la acumulación de ApoLI-II en estructuras punteadas en el compartimiento dorsal. Secciones transversales muestran la localización de ApoLI-II en regiones apicales, laterales y básales de las células y de las vesículas endociticas. B) Inmunotinción de un disco parecido con anticuerpo anti-HA (LpR2, verde) y anti-Hh (rojo y gris). Obsérvese la reducción de los niveles de Hh en el compartimiento dorsal-posterior (cabeza de flecha) . C) Tinción extracelular de un disco parecido con un anticuerpo anti-Hh mostrando un sorprendente disminución de Hh extracelular (rojo y gris) causado por LpR2 ectópico (anti- HA, verde) . Las cabezas de flecha marcan el compartimiento posterior-dorsal . D) Gráfico representativo de la intensidad de inmunofluoresecencia Hh del compartimiento ventral (control) versus el dorsal de discos de alas de moscas UAS-LpR2-HA/apGal4; TubGalδOts. E) Discos de alas de moscas TubGal80ts/hh-Gal4, con Hh-GFP (24 horas de temperatura restrictiva) inmunoteñidos con un anticuerpo anti-Ptc (rojo y gris). Obsérvese que un gradiente de Hh- GFP (verde y gris) existe en el compartimiento A (barra blanca). F) Discos de alas de moscas TubGalδOts; hh-Gal4, Hh-GFP/ UAS-LpR2-HA teñidos con un anticuerpo anti-Ptc (rojo) y anti-HA para detectar la expresión de LpR2 (azul). Nótese que los niveles de Hh en el compartimiento P, el gradiente de Hh (barra blanca) y la expresión de Ptc están reducidas en comparación con lo observado en E. G) Tinción con anticuerpo anti-Ptc (rojo) de discos de ala de moscas

TubGalδOts /UAS-HhC85S-GFP, hh-Gal4, las cuales sobreexpresan una forma de Hh (verde y gris) sin ácido palmitico. H) Tinción con un anticuerpo anti-HA (LpR2, azul) y anti-Ptc (rojo) de discos de ala de moscas TubGalδOts; UAS-HhC85S-GFP, hh-Gal4/ UAS-LpR2-HA. Obsérvese que la sobreexpresión de LpR2 no alteró los niveles de HhC85S-GFP (verde y gris) en el compartimiento no modificó su gradiente en el compartimiento A. Sin embargo, la banda de expresión de Ptc es irá s estrecha cuando UAS-LpR2 es sobreexpresado, probablemente debido a que LpR2 reduce los niveles endógenos de Hh. I) Gráfico que muestra la variación en la intensidad de fluorescencia de Ptc a lo largo de eje A/P en discos de ala de moscas TubGalδOts; hh- Gal4, Hh-GFP (una media de discos, linea azul), en discos de ala de moscas TubGalδOts; hh-Gal4, Hh-GFP/ AS-LpR2-HA (una media de 10 discos, linea rosa) y en moscas TubGalδOts; h-Gal4/ UAS-LpR2-HA (una media de 5 discos, linea amarilla) .

EJEMPLOS DE LA INVENCIóN

Ejemplo 1.- Regulación del rescate de la señalización de Hh mediante lipidos y su transporte en forma de partículas lipoproteicas . 1.1.- Rescate de la señalización de Hh en moscas Drosophila mutantes para la proteina shifted que sobreexpresan la enzima HMGCoA reductasa en el disco imaginal del ala (Figura 3 ) .

El disco imaginal del ala de Drosophila es un modelo relativamente simple y conocido para el estudio de las relaciones y actividades de la proteina Hh. Los niveles de la proteina Hh en la superficie celular se encuentran reducidos en los mutantes shifted (Gorfinkiel et al., 2006, Developmental CeIl δ, 241-253) . La sobreexpresión de HMGCoA reductasa en un modelo mutante shifted en el compartimiento

posterior del ala provoca el rescate de la señalización de Hh (Figura 4) . Los niveles de la proteina Hh en el disco imaginal del mutante que sobreexpresa la enzima HMGCoA reductasa (shf ^EY ; apGal4/UAS-hmgcr ) son similares a los observados en el grupo control (comparar tinción por inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-Hh en un disco silvestre) (Figura 3). Además, se observa que la señalización de Hh se recupera en estos discos (ver tinción por inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-Ptc) .

1.2.- Los fenotipos de ganancia de función de Hh se rescatan mediante la disminución de la síntesis de lipidos (Figura 6 ) .

En este caso se analiza el rescate de la función Hh en los mutantes de ganarla de función de Hh (Hh ^Mrt ) que muestra una expresión ectópica de Hh en la región dorsoventral del disco imaginal de ala. La reducción "one dose" de la expresión del gen SREBP (HLH1061ine52 ) en estos mutantes de Hh (Hh ^Mrt ) conlleva la obtención de un fenotipo prácticamente idéntico al que se observa en la mosca control (wild-type) . Este resultado nos indica que el contenido total de lipidos de la mosca controlados por el gen SREBP es importante para la señalización de Hh, ya que disminuyendo a la mitad la función de SREBP se rescatan los fenotipos de ganancia de función de Hh.

Por otra parte, los mutantes en SREBP (HLH1061ine52 ) son letales larvarios en homocigosis, sin embargo se pueden rescatar está letalidad administrando acido oleico en la papilla (Kunte AS, Matthews KA, Rawson RB. Fatty acid auxotrophy in Drosophila larvae lacking SREBP. CeIl Metab. 2006 Jun; 3 (6 ) : 439-48 ) . Estas moscas mutantes sobreviven sin ninguna síntesis de lipidos en su organismo pero adquiriendo de la dieta colesterol y acido oleico como única fuente lipidica. Por ello, son una herramienta

importante para controlar que lípidos suministrados en su dieta seria capaces de alterar la via de Hh una vez rescatada la letalidad con dosis bajas de colesterol y acido oleico.

1.4.- Las lipoproteinas de la mosca (lipoforinas, Lp) forman partículas lipoproteicas con la proteina Hh que permite su difusión por la matriz extracelular .

Para analizar los requerimientos de Lp para el transporte de la proteina Hh en el disco imaginal de las alas, se redujo inicialmente, el suplemento de Lp mediante la expresión de RNAi frente ApoLI and ApoLII en el cuerpo graso (que es el el hígado de la mosca) , que provocó la viabilidad de las larvas (datos no mostrados). Para resolver este problema se expresaron de forma transitoria iRNAs utilizando un promotor sensible al calor (heat- shock) . Dos pulsos de expresión de RNAi frente a Lp antes de la disección del disco provocaron una disminución de los niveles de Lp en el disco imaginal (Figura 12E) y redujo adema s los niveles de Hh en el compartimiento P del disco imaginal de las alas (Figura 12G, comparado con la Figura 12F y Figura 12J), afectando además el rango de todas las respuestas de Hh (Figura 121 comparada con Figura 12H y 12K). Estos resultados están en desacuerdo con los publicados por Panakova et al., 2005 (Panakova, D., Sprong, H., Marois, E., Thiele, C. & Eaton, S. (2005) Nature 435, 58-65) ya que este grupo no observa una disminución de los niveles de Hh al disminuir los niveles de Lp.

Para estudiar ms en detalle los requerimientos de Lp de las células del disco imaginal, se indujo la sobreexpresión ectópica del receptor Lp2 (LpR2), uno de los dos LpR en la mosca, para eliminarla del espacio extracelular. Sin embargo, esta expresión de LpR2 indujo apoptosis (datos no mostrados). Para evitar esto último se

utilizó el sistema Gal4/Gal80ts . Un pulso a temperatura restrictiva inactiva la proteina represora Gal80, permitiendo que la proteina Gal4 active UAS-LpR2. Cuando LpR2 fue transitoriamente expresada durante 24 horas en el compartimiento dorsal de los discos del ala, no se observó la expresión de Caspasa 3 activada, un marcador de apoptosis (datos no mostrados). Como era de esperar la sobreexpresión de LpR2 incrementó la endocitosis de Lp, indicado por la acumulación de vesículas intracelulares conteniendo Lp (Figura 13A) . Interesantemente, este LpR2 ectópico causó adema s una disminución de la cantidad total de Hh (Figura 13B y 13D) , como se habla observado previamente mediante RNAi (Figura 12D-K) , principalmente a nivel extracelular (Figura 13C) . Estos resultados sugieren que Lp es requerida para la estabilización de Hh en la matriz extracelular, probablemente permitiendo el empaquetamiento de Hh en las partículas de liproteinas. Además, si este fuera el caso, se podría esperar que las colas lipidicas de Hh fueran esenciales para mediar este efecto. De hecho, la expresión de LpR2 no desestabilizó la proteina Hh-GFP no modificada por lipidos cuando esta forma de Hh se co-expresó en el compartimiento P (Figura 13G y H) .

Por el contrario, una forma proteica de Hh-GFP completamente lipidica respondió a la sobreexpresión de LpR2 como la Hh endógena, mostrando niveles disminuidos en el compartimiento P (Figura 13E y 13F) y una disminución del gradiente de Hh-GFP en el compartimiento A (Figura 13E, 13F, 131). Ya que se sabe que las modificaciones lipidicas de Hh eran esenciales para que Hh interaccionara con los HSPG de la matriz extracelular (Callejo et al., 2006), estos datos sugieren que las modificaciones lipidicas de Hh son necesarias para el empaquetamiento de

Hh con Lp y su posterior interacción con los componentes de la matriz extracelular .

Para investigar si los niveles alterados de Lp podían afectar a la recepción de la señal de Hh y no sólo a su secreción, se sobreexpresó LpR2 exclusivamente en las células receptoras usando el vehiculizador ptc-Gal4. De esta forma se observó que el gradiente de Hh estaba ligeramente expandido comparando con los discos normales.

Por tanto, se puede concluir que la sobreexpresión de LpR2 en las células receptoras probablemente disminuye la endocitosis de Hh por su receptor Ptc, incrementando asi el rango del gradiente de Hh.

Ejemplo 2.- El receptor de LDL, α-megalina no es un co- receptor para la proteina Hh en Drosophila.

A continuación se procedió a analizar el papel del receptor de LDL, Megalin, como posible co-receptor de Sonic-Hh, propuesto en la literatura mediante el estudio de la pérdida de la función en los clones mutantes de Drosophila deep orange (olor) . La proteina Dor está involucrada en la maquinaria celular de degradación lisosomal. En los clones mutantes dor, la proteina Hh, y sus formas mutadas (HhN sin colesterol, y C85S sin el ácido palmitico), se acumularon en el compartimiento endocitico posterior (Figura 5). Se observa además que la proteina Megalina se incrementa en el interior de estos clones mutantes, y se colocaliza con Hh.

Se ha estudiado la internalización de la proteina Hh en los dobles clones mutantes dor y megalina (α- megalina) . Se observó la acumulación de las proteínas Hh y HhN (forma de Hh sin colesterol) dentro del clon Drosophila doble mutante, debido a la internalización de la proteina Hh y a pesar de la ausencia del receptor megalina/LPR2 (receptor de lipoforina de Drosophila) (Figura 8). Este

mismo experimento se realizo con otros miembros de la familia de receptores LDL obteniendo resultados similares a los de Megalin (datos no mostrados). Por tanto, podemos concluir que ningún miembro de la familia de Receptores LDL esta implicado directamente en la endocitosis de Hh.

Ejemplo 3.- La proteina Patched (Ptc) es capaz de internalizar la lipoproteina lipoforina (Lp) tan eficazmente como lo lleva a cabo el receptor de lipoforina (LpR) (Figura 11) .

Como Hh es transportado en partículas lipoproteicas es razonable pensar que un miembro de la familia LDLR pudiera modular la respuesta a Hh o interactuar con Ptc. El candidato para estudiar fue el receptor de lipoforina (LpR) . Ya que LDLR parece no estar involucrado en la recepción de Hh (Ejemplo 1), se analizó si la proteina Ptc por si misma era capaz de interactuar directamente con las partículas de lipoproteinas . Para investigar esta posibilidad se expresó de forma transitoria y ectópica Ptc en el compartimiento dorsal del disco imaginal del ala usando el sistema Gal80ts/Gal4. Después de 24 horas y a temperaturas restrictivas se observó que la sobreexpresión de Ptc internalizaba activamente Lp (Figura HB) . Además, se encontró un alto porcentaje de colocalización de Hh, Ptc y ApoLs en vesículas endociticas (Figura HA y B) cuando se marcaron los endosomas con anticuerpo anti-Hrs (Lloyd T. E., A. R., Wu M. N., Zhou Y., Pennetta G., Bellen H. J. (2002) CeIl 108(2), 261-9) (Figura Hc), o con el marcador Rab7- GFP (Entchev, E. V., Schwabedissen, A. & Gonzalez-Gaitan, M. (2000) CeIl 103 (6), pp . 981-991) (Figura HD), marcador ambos del compartimento endocitico) . Sin embargo, esta capacidad de Ptc para internalizar Lp es independiente de la presencia de Hh, como se ha visto por la endocitosis de Lp en células alejadas del limite del compartimiento A/P,

donde no existe Hh. Sin embargo, en discos que no sobreexpresan, se observó todavia una fuerte colocalization de ApoL, Hh y Ptc en las vesículas endociticas de las células del compartimento anterior, especialmente en el dominio más apical, donde se acumulan los endosomas tempranos (Figura HE) . Ya que Ptc internalizaba eficazmente Lp, entonces se quiso valorar si una interacción molecular era posible entre Ptc y ApoLI-II con estudios de inmunoprecipitación . Asi, se observó que la proteina ApoLI fue inmunoprecipitada por Ptc en la glándulas salivares sobreexpresando Ptc-GFP (Figura HG) , lo que confirma la interacción entre ambas proteínas.

Para comprobar que la internalización de Lp era importante para la regulación de Smo se utilizaron dos mutantes de Ptc. PtcS2 contiene una mutación en su SSD que, por analogía con otras proteínas que contienen este mismo SSD, provoca que la proteina sea insensible a la modulación por esteróles (Kuwabara & Labouesse (2002) Trends Genet . 18, 193-201) . Este mutante no puede reprimir la función de Smo pero es capaz de internalizar Hh. Después de la expresión ectópica de PtcSSD (PtcS2) se observó la internalización de Lp en un grado mayor que cuando se usó la forma salvaje PtcWT (Figura HE) . Por lo tanto, ambas formas de Ptc tanto la salvaje, que bloquea la via Hh, como la mutada PtcSSD, que activa de forma constitutiva la via Hh, internalizan Lp, indicando que esta es una propiedad de Ptc independiente de su función en la transducción de la señal Hh. El segundo mutante utilizado de Ptc fue Ptcl4, que regula Smo en respuesta a Hh pero es defectivo en la endocitosis de Hh (Torroja, C, Gorfinkiel, N. & Guerrero, I. (2004) Development 131, 2395-408). Asi, se encontró que la forma Ptcl4 no fue capaz de internalizar Lp (Figura HF), indicando que la internalización de Lp por Ptc no se requiere de forma absoluta para la regulación normal de

Smo, por lo que la internalización de Lp juega un papel menor en la transducción de señales de Hh.

MATERIAL Y MéTODOS Experimentos de sobreexpresión y generación de clones:

Se utilizó las siguientes Drosophila: UAS-LpRNAi obtenida de IMP Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC) , Fat- body-Gal4 (Gronke, S., Beller, M., Fellert, S.,

Ramakrishnan, H., Jackle, H. & R. P., K. (2003) Current Biology,13 (7), , pp . 603-606), UAS-HhGFP (Torroja, C, Gorfinkiel, N. & Guerrero, I. (2004) Development 131, 2395- 408) y UAS-HhC85S-GFP (Callejo, A., Torroja, C, Quijada, L. & Guerrero, I. (2006) Development 133, 471-83). Para desarrollar el transgén UAS-LpR2, el cDNA completo de LpR2 (EST line GH26833, obtenido de BDGP) se fusionó con el C- terminal HA tag y se clonó en el vector pUAST. Para la expresión transitoria de las construcciones UAS se usó Ap- Gal4 (o Ptc-Gal4); Tub GalδOts se obtuvieron manteniendo los cruces a 18 ⁰ C e inactivando el represor GalδOts durante 16 a 24 horas a una temperatura restrictiva (29 ⁰ C).

- Clones Mutantes: Los clones se generaron por recombinación mitótica mediada por FLP. Las larvas de cada correspondiente genotipo se incubaron a 37 ⁰ C, durante una hora, 24- 48 horas después de la deposición de huevos por las hembras (AEL) . Los genotipos utilizados fueron: FLP; FRT 42D, ptclβ /FRT 42D, arm-lacZ and FLP; FRT 82, dispS037707/ FRT 82, ubi-GFP.

- Flip-Out clones: El transgén ubx>f+>Gal4, UAS-βgal (De Celis, J. F. (1998) Int J Dev Biol 42, 335-43) fue utilizado para generar clones de expresión ectópica de las lineas UAS. Las larvas de los correspondientes genotipos se incubaron a 37 ⁰ C durante 15 minutos para inducir recombinación mediada por HSFLP.