PRODUCIDOS IN VITRO.

Sector técnico

La presente invención puede ser utilizada en el área de reproducción animal, más específicamente corresponde a un diagnostico pre implantatorio para embriones obtenidos con tecnologías de reproducción asistida. Esta tecnología es de especial interés en la industria ganadera y salud, debido a que es válida para embriones de mamíferos no humanos y humanos.

Técnica Anterior

Las tecnologías de reproducción asistida (ARTs) se han desarrollado durante los últimos años, sustentadas por sus aplicaciones e impacto tanto en los tratamientos de infertilidad humada como para el incremento del valor genético de los rebaños de importancia económica. Por definición, la reproducción asistida se refiere al uso de conocimientos y tecnologías que permiten reemplazar o facilitar los procesos naturales que ocurren durante la reproducción en humanos y animales. Las ARTs se pueden agrupar en aquellas de menor complejidad las cuales incluyen manipulación del ciclo reproductivo de la hembra, superovulación, inseminación artificial, conservación de gametos y embriones, y la transferencia de embriones (producidos in vivó), mientras que las de mayor complejidad se refieren a las que involucran la producción de embriones in vitro (IVP). En humanos, las técnicas de mayor complejidad incluyen la fecundación in vitro (FIV) e inyección espermática intracitoplasmática (ICSI), mientras que en animales también se considera la transferencia nuclear somática (TNS) como tecnología con aplicaciones reproductivas que permite la creación de un nuevo individuo.

El auge del uso de las tecnologías reproductivas estuvo marcada por el nacimiento del primer bebé a partir de la transferencia de embriones producidos in vitro (1978) y más tarde (1981) por el nacimiento del primer ternero de fecundación in vitro. Humanos y bovinos han sido las dos especies de mayor impacto en el desarrollo y perfeccionamiento de las tecnologías reproductivas de alta complejidad. En el 2015, la Sociedad Internacional de Tecnologías de Embriones (IETS) reportó la transferencia de más de un millón de embriones bovinos, de los cuales aproximadamente la mitad fueron producidos in vitro, demostrando la importancia de esta tecnología en la industria bovina (Thibier M., Thai J Vet Med. 2016). La producción de embriones in vitro contribuye al mejoramiento genético del rebaño valorando el potencial de ambos parentales y reduciendo significativamente el tiempo generacional (Kasinathan et al., 2015).

En humanos, las tecnologías reproductivas se utilizan para el tratamiento de infertilidad en la pareja, donde un tercio de los casos se debe a problemas femeninos, un tercio a problemas masculinos y el último tercio, a infertilidad de ambos parentales o problemas desconocidos (American Society for Reproductive Medicine (ASRM)). Durante los últimos años, las tasas de fertilidad (en humanos) se han incrementado en la mayoría de los países del mundo, incluso en los países desarrollados. El nuevo rol social de la mujer ha provocado un desplazamiento de la edad reproductiva hasta un punto donde se presentan los mayores problemas de fertilidad. A partir de los 35 años, se produce un deterioro paulatino de la fertilidad en la mujer; a los 40 años, la posibilidad de gestación es menor del 40%, lo cual ha contribuido al incremento de los tratamientos de reproducción asistida de alta complejidad (Geraedts et al., 2009; Zegers-Hochschild et al., 2014). Durante los años 2008, 2009 y 2010 se reportaron más de 4.461.309 ciclos de IVP a partir de los cuales se estima que hayan nacido 1.144.858 niños (Dyer et al., 2016).

Debido al impacto económico y social de las tecnologías de producción in vitro de embriones, durante los últimos años se han perfeccionado los protocolos asociados, optimizando las metodologías, los medios de cultivo y las condiciones generales de producción así como profundizado en los conocimientos biológicos para garantizar un mayor éxito del proceso. Independientemente de la especie, el éxito de las tecnologías in vitro depende en gran medida del dominio de los aspectos biológicos relacionados con el programa de desarrollo embrionario. En general, los embriones de mamíferos pueden desarrollarse fuera del ambiente materno durante el periodo previo a la implantación (etapa pre-implantatoria). Los sistemas in vitro actuales permiten el desarrollo hasta el punto donde el embrión debe ser transferido al ambiente materno para que se produzca la interacción física y molecular que garantizan la implantación y por tanto el desarrollo a término del nuevo individuo. Durante este periodo pre- implantatorio el embrión sufre cambios morfológicos, celulares y moleculares trascendentales que definirán su calidad y competencia para continuar el desarrollo normal a término.

La etapa de desarrollo pre-implantatorio se caracteriza por puntos críticos que deben ser sobrepasados para lograr el éxito del desarrollo: 1) Formación del cigoto (formación de pronúcleos de ambos parentales), 2) Primera división celular, 3) activación del genoma embrionario, 4) compactación y 5) primera diferenciación celular y formación del blastocisto. Estos cambios están acompañados por cambios epigenéticos y de expresión génica que explican el desarrollo a partir de una estructura con células homogéneas (células embrionarias o blastómeras con igual expresión génica) que se convierte paulatinamente en un individuo con tipos celulares con funciones diferentes.

Los embriones de mamíferos han demostrado una gran plasticidad para adaptarse a los cambios ambientales y alcanzar con éxito el desarrollo a término. Sin embargo, las condiciones in vitro como medios de cultivo, condiciones atmosféricas (C02 y 02), temperatura y la manipulación extensiva pueden afectar significativamente el desarrollo provocando cambios epigenéticos drásticos, induciéndose la detención del desarrollo en alguno de los puntos críticos mencionados anteriormente. Sin embargo, independientemente de la técnica utilizada y de la especie, las tasas de desarrollo embrionario hasta blastocisto son altas. En humanos se estima una tasa de desarrollo hasta blastocisto entre 30 y 40 % dependiendo de diferentes factores, considerando fundamentalmente la calidad de los gametos (Sepúlveda et al., 2011). En animales, los resultados son similares o ligeramente superiores (Bavister, 1995; Abe et al., 1999; Ferguson y Léese 1999; Crosier et al., 2000; McEvoy et al., 2001). Alcanzar el estado de blastocisto es un gran desafío para el embrión, no solo sobrepasó los eventos críticos de la etapa pre-implantatoria sino que es un embrión listo para comunicarse con el ambiente materno. Sin embargo, independientemente de contar con embriones que han superado esta etapa crítica, el éxito del desarrollo a término y la posibilidad de generar un individuo saludable es baja tanto en humanos como en animales.

En Chile, siete centros de reproducción asistida reportaron en el 2011 un total de 1.918 ciclos de IVP. La eficacia de los tratamientos se midió en tasa de embarazo clínico o tasa de parto dependiendo del tratamiento: 1: tasa de embarazo clínico por aspiración: ICSI: 32,5%; FIV: 29,2% y 2: tasa de parto por aspiración: ICSI: 21,5%; FIV: 18,6%. Estos resultados fueron obtenidos utilizando ovocitos de la paciente; la tasa de parto incrementó hasta 41,9% utilizando ovocitos de donantes (mujeres edad reproductiva y fertilidad adecuada) (Schwarze et al., 2014). En general, se estima que en mujeres entre 35-39 años el éxito del tratamiento es cerca del 30% sin embargo en mujeres mayores de 40 años solo se logra un 15% de desarrollo a término (U.S. Centers for Disease Control's SARI, report 2014).

El éxito de la implantación, desarrollo embrionario y fetal depende en gran medida de la competencia embrionaria pero también del ambiente previo (materno) y de la "comunicación" que se establece entre ambos (Stroband y van der Lende, 1990). El ambiente materno es más factible de controlar; en humanos mediante seguimiento y/o tratamiento que garantice la receptividad endometrial y en animales a través de la selección de hembras receptoras con óptimas condiciones nutricionales y reproductivas. El incremento del éxito la tecnología, referido al incremento del nacimiento de individuos saludables, dependerá directamente del aumento significativo en la generación de embriones de calidad que permita una mayor tasa de implantación y desarrollo a término.

La calidad embrionaria define la competencia y capacidad de desarrollo de un embrión, para dar lugar a nuevo individuo saludable. En embriones producidos in vitro, la competencia depende de los componentes biológicos y técnicos involucrados, refiriéndose al origen de los gametos (ovocitos y espermatozioides), protocolos de superovulación, técnica de maduración y fecundación, cultivo embrionario, manipulación embrionaria y ausencia de señales materno-embrionarias durante el periodo in vitro.

Durante el desarrollo in vivo (natural), el periodo pre-implantatorio ocurre a lo largo del oviducto materno, donde el embrión dispone de todos los nutrientes, señales paracrinas, tensión de oxigeno etc., necesarios para garantizar su desarrollo. In vitro, se mimetizan estas condiciones pero están muy lejos de alcanzar los "estándares" maternos. Las leyes de la genética explican cómo se transmiten los caracteres desde los parentales hasta la descendencia, sin embargo, la expresión de los caracteres genéticos durante el desarrollo está determinado en mayor medida por los mecanismos epigenéticos que controlan la expresión génica sin cambios en la secuencia de ADN heredada (Waddington, 1939; Wu and Morris, 2001). Los cambios ambientales producen cambios epigenéticos para modular la expresión génica para enfrentar dichos cambios. En este sentido y debido a la extensa manipulación, los embriones producidos in vitro tendrán diferente "comportamiento" comparados con aquellos producidos in vivo.

Los cambios epigenéticos y de los patrones de expresión génica provocados por las condiciones in vitro ocurren al azar y en diferente grado en cada embrión (individual) por tanto, un alto porcentaje de embriones no podrá continuar su programa de desarrollo normal (Garcia-Rosello et al., 2009; Giritharan et al., 2010; Mahalingaiah et al., 2012; Manikkam et al., 2013; Ventura Junca et al., 2015). Muchas modificaciones de expresión génica como consecuencia de modificaciones epigenéticas, no se hacen evidentes durante la etapa in vitro pero sí durante la etapa implantatoria, durante la gestación e incluso durante la vida adulta del nuevo individuo. El éxito del desarrollo de los embriones producidos in vitro dependerá de la magnitud de los cambios epigenéticos que se produzca durante el periodo in vitro (Ventura Juncá et al., 2015; Rodriguez-Alvarez et al., 2010; Velásquez et al., 2016; 2017). Durante las últimas décadas se ha dedicado un gran esfuerzo para optimizar tanto los componentes biológicos como técnicos que ¡mpactan en la calidad embrionaria. Sin embargo, se ha alcanzado un umbral a partir del cual no se ha observado un impacto significativo en el éxito final de las tecnologías reproductivas. De hecho, tanto en humanos como en especies de granja, las tasas de nacimiento se han mantenido constantes durante los últimos años (Kushnir et al., 2017). Actualmente, el éxito de las tecnologías reproductivas de alta complejidad depende en la capacidad de seleccionar para la transferencia, los embriones más competentes, con mayor probabilidad de desarrollo a término.

Las técnicas actuales de clasificación y selección embrionaria se definen como invasivas o no invasivas dependiendo del grado de manipulación embrionaria que requieren. Las técnicas no invasivas son las más utilizadas y el "Gold Standard" en todas las especies. Estas técnicas se basan en la observación y clasificación morfológica o morfo-cinética de acuerdo al desarrollo embrionario, propio de la especie. En especies donde la transferencia se realiza en etapas tempranas (antes del blastocisto), la selección se basa principalmente en parámetros como la posición del segundo cuerpo polar, la formación de ambos pronúcleos (en cigoto), número y tamaño de blastomeras y porcentaje de fragmentación (en estadios de 2-8 células) (Fenwick et al., 2002; Zollner et al., 2002; Nagy et al., 2003; Gianaroli et al. 2003). La observación de la formación de ambos pronúcleos indica que ocurrió la fecundación y que este embrión tiene la dotación cromosómica procedente de ambos parentales; sin lugar a duda este embrión tiene probabilidades de desarrollo a término (Balaban et al., 2004). Sin embargo, este evento es el primer punto crítico del desarrollo y no garantiza que el embrión supere las próximas etapas (Aydin et al., 2011). Adicionalmente, existen especies en las que debido a las características del citoplasma ovocitario (alta acumulación de lípido) no es posible la observación pronuclear por lo que se considera que ocurrió fecundación si el embrión logra experimentar al menos, la primera división celular.

Cuando los embriones son transferidos en estadio de blastocisto se utiliza para su clasificación morfológica el grado de expansión y formación de ICM y TB para definir el estadio de desarrollo (blastocisto temprano o blastocisto expandido). Esto es importante considerando que a partir del blastocisto, el trofoblasto secretará las señales embrionarias necesarias para garantizar la comunicación embrio-materna que garantizarán el éxito de la implantación. Una desincronización entre el estado de desarrollo y el ambiente materno al cual se transfiere el embrión, conlleva al fallo de esta comunicación. La calidad del blastocisto se puede definir morfológicamente mediante las características del ICM y TB (Gardner y Schoolcraft, 1999; Richter et al., 2001). Sin embargo, la clasificación morfológica es un criterio subjetivo influenciado por la experiencia del embriólogo (observador) y la ausencia de estándares universales de clasificación. Adicionalmente, los criterios morfológicos que definen un blastocisto competente no reflejan las características moleculares (epigenéticas, ploidía y expresión génica) de este embrión y por tanto, no garantizan una gestación exitosa (Rodríguez et al., 2008; 2010; 2013; Velásquez et al., 2016).

La morfo-cinética o monitoreo del tiempo y calidad de las divisiones embrionarias y el momento de alcanzar los puntos críticos durante el periodo pre- implantatorio, incrementa la probabilidad de seleccionar embriones con mayor competencia (Lequarre et al., 2003; Isom et al., 2012; Kaith et al., 2015). Se ha propuesto que los embriones que más temprano experimentan la primera división celular (antes de las 24 horas en humanos y bovinos), tienen mayor probabilidad de alcanzar el estado de blastocisto (Kaith et al., 2015). En bovinos, los embriones que alcanzan el estado de blastocisto al D 6,5 post fecundación tienen mayor probabilidad de continuar su desarrollo durante el periodo peri-implantatorio (Mellisho et al., 2016, 2017). Sin embargo, los sistemas de monitoreo en tiempo real sin perturbar el cultivo embrionario (Time Lapse System; observación mediante microscopio en incubadora), están estandarizados para embriones humanos y existen muy pocas referencias de su impacto en la selección de embriones de otras especies (Kovacs, 2014). Adicionalmente, los datos sobre la validez de este sistema son contradictorios y existe muy poca evidencia que muestran los efectos positivos del uso del monitoreo en tiempo real sobre la predicción de la implantación y la continuidad de la gestación (Meseguer et al., 2011; Kovacs, 2014).

Hoy en día es aceptado el hecho que la morfología o morfo-cinética no son métodos suficientes para predecir el desarrollo embrionario una vez transferido a la madre receptora. Un embrión puede alcanzar el estado de blastocisto con un patrón de expresión génica que no se corresponda con la función de los tipos celulares presentes (ICM y TB). Se ha demostrado que blastocistos murinos y bovinos con una morfología adecuada carecen de expresión de factores de pluripotencia (OCT4) que garantizarían el estado indiferenciado del ICM; estos embriones no son capaces de continuar su desarrollo (Nichols et al., 1998; Niwa et al., 2000; Rodriguez-Alvarez et al., 2010; Velásquez et al., 2016). Un embrión de calidad requiere expresar las señales de reconocimiento en el momento e intensidad adecuados para lograr el reconocimiento de la gestación una vez en el ambiente materno. Esto significa que un blastocisto con un TB incapaz de emitir estas señales no logrará implantarse y producir una gestación saludable. En humanos, un blastocitos de excelente calidad morfológica puede mostrar un patrón caótico de anomalías cromosómicas cuando es analizado mediante hibridación genómica comparativa mediante microarreglo (aCGH) (Harvey J. Stern, 2014).

Considerando la información planteada, un método interesante para la determinación de la calidad y competencia embrionaria es el estudio de los patrones de expresión génica que se correlacionan con el desarrollo normal. La clave para este método es la clave la identificación de marcadores genéticos y sus rutas de señalización, útiles para la selección embrionaria (Khan y Dubé, 2012; Rodriguez- Alvarez et al., 2010; 2013). El desarrollo de la bioinformática y con la alta sensibilidad de las técnicas moleculares actuales, permite realizar detallados análisis de expresión génica a partir de pequeñas biopsias de un embrión (Picard y King, 1985; Cenariu et al., 2012). En humanos, los embriones producidos in vitro presentan altas tasas de aberraciones cromosómicas que en un alto porcentaje de los casos se debe a la utilización de ovocitos de mujeres mayores de 35 años (como se mencionó anteriormente). El diagnóstico genético pre-implantatorio (PGD) permite la identificación de estas alteraciones genéticas, evitando la trasferencia de embriones portadores de enfermedades hereditarias o anomalías que pueden provocar cambios en el patrón de desarrollo normal. El PGD se recomienda también en pacientes con enfermedades genéticas graves, cuando no hay implantación o existen pérdidas recurrentes de la gestación después de varios tratamientos de IVF o cuando se detectan alteraciones meióticas en los espermatozoides (Geraedts et al., 2010). Traeger-Synodinos y colaboradores reportaron en 2010, 51589 ciclos en los que se realizó PGD (Traeger-Synodinos et al. 2013) el diagnóstico de desórdenes asociados a un solo gen, aneuploidias, anomalías genéticas heredadas, enfermedades ligadas al cromosoma X e incluso diagnóstico de sexo sin fines médicos (social) (Traeger- Synodinos et al. 2013).

La mayoría de las clínicas de fertilidad que realizan más de 500 ciclos al año ofrecen PGD para alguno o todos de los casos mencionados anteriormente (Traeger- Synodinos et al. 2013). Sin embargo, La Sociedad Europea de Reproducción y Embriología Humana (ESHRE) ha presentado los siguientes problemas asociados al PGD: 1) Poco eficaz; los datos de éxito son bajos y el embrión seleccionado sufre otros defectos por la manipulación y 2) Se generan errores de diagnóstico que han sido adjudicados a errores humanos debido al análisis de una sola célula. Independientemente de la ventaja que representa el PGD para incrementar las tasas de implantación (Traeger-Synodinos et al. 2013), este método es extremadamente invasivo ya que requiere mayor manipulación para la toma de una biopsia de un embrión cuya calidad ya está comprometida debido al sistema in vitro. Los resultados de desarrollo a término se calculan en base al número de embriones transferidos pero en ninguna publicación se menciona el número de embriones que detienen su desarrollo por esta manipulación y que por tanto nunca son transferidos. En bovinos por ejemplo, cerca del 20% de los embriones de excelente calidad, biopsiados en estado de blastocisto mueren (degeneran) pocas horas después del procedimiento (Veláquez et al., 2016; 2017).

Considerando la baja predictibilidad de la selección morfológica y el carácter invasivo del PGD, hoy en día la mayoría de los grupos de investigación están enfocados en el desarrollo de métodos no invasivos que brinden similares resultados que el PGD. En humanos, el análisis trascriptómico de las células del cúmulo de los ovocitos colectados muestra resultados útiles para predecir la competencia de los embriones producidos con esos ovocitos (Assou et al., 2008). Sin embargo, los resultados aún no son suficientes para validar este método con respecto al incremento del desarrollo embrionario a término. Adicionalmente, técnicamente este método puede ser utilizado en humanos donde por lo general se trabaja con un número reducido de ovocitos pero en animales de granja la mayoría de los ciclos se realizan con cientos de ovocitos por lo que se hace inviable su aplicación práctica.

Una característica de los embriones pre-implantatorios es su comunicación constante con el medio que lo rodea, consumo de nutrientes, de oxígeno, síntesis de moléculas de señalización etc. Todo esto se manifiesta en el medio de cultivo ya sea a través del metabolismo de sustratos o incremento de estas moléculas (proteínas) de señalización. Ante esto surgió una hipótesis interesante que plantea que los cambios en los medios de cultivo reflejan la actividad del embrión y por tanto su competencia si logramos discriminar entre embriones de buena y mala calidad. Esta hipótesis a un nuevo método de diagnóstico embrionario no invasivo ya que el medio de cultivo se descarta y no se necesita mayor manipulación del embrión. El estudio de las señales embrionarias combinado con su morfología no solo no induciría mayores daños en el embrión, sino que tendría un mayor valor predictivo que los anteriores. Basado en esto se han realizado múltiples trabajos retrospectivos con el objetivo de ubicar a los embriones y sus respectivos medios de cultivo en una de esas categorías.

Existe un gran número de reportes de estudios metabolómicos a partir de medio de cultivo de embriones humanos y animales que muestran un incremento significativo en las tasas de implantación (Gardner and Léese, 1987; Gardner and Wale, 2013). Esta ¡dea no es nueva, de hecho, en 1987, Gardner y Léese reportaron el aumento del metabolismo de la glucosa durante el cultivo in vitro, está relacionado con una mayor tasa de implantación de embriones murinos. En 2013, Gardner y Wale mostraron resultados similares en embriones humanos. Sin embargo, existen resultados contradictorios debido a diferencias en la composición de los medios de cultivo (fuentes energéticas principalmente) entre los diferentes laboratorios y la complejidad y sensibilidad de las técnicas analíticas (Devreker et al., 2000; Botros et al., 2008; Gardner and Wale, 2013). El análisis secretómico basado en el medio de cultivo ha mostrado también resultados interesantes con alto valor predictivo. Las proteínas secretadas por el embrión podrían reflejar sus características epigenéticas y de control de expresión génica siendo la proteína el resultado final de este proceso; de hecho, el análisis transcriptómico no necesariamente predice los cambios fenotípicos (procesos biológicos y funciones celulares). Los cambios fenotípicos que se producen como consecuencia de los sistemas in vitro, son el resultado de cambios en numerosas proteínas con diferentes funciones: factores de transcripción, proteínas estructurales, proteínas secretables, muchas de las cuales, median la comunicación con el ambiente materno. La secreción de proteínas como APOA1, Leptina e INFtau, al medio de cultivo tiene una alta correlación con la competencia in vivo de embriones humanos y animales (Stojkovic et al., 1999; Mains et al., 2011).

Desde muy temprano el embrión y la madre se comunican a través de señales moleculares que garantizan ese dialogo para que se produzca la implantación y el desarrollo final. El criterio general es que las condiciones endometriales para la receptividad embrionaria son mantenidas por la secreción de progesterona por el cuerpo lúteo y que la necesidad de la presencia del embrión se produce en determinado punto (dependiendo de la especie) que coincide con el aumento de la señal de reconocimiento. Esta señal se refiere a la secreción de moléculas específicas por embrión como es INFtau en rumiantes o hCG en humanos. Estas moléculas modulan rutas de señalización que reprimen la lisis del cuerpo lúteo y por tanto se mantienen las condiciones favorables en el endometrio materno para que se produzca la implantación. Sin embargo, los estudios más recientes, demuestran que esta comunicación embrio-materna es mucho más temprana y más amplia, o sea, no se limita a una señal por parte del embrión.

El embrión temprano secreta señales paracrinas que tienen un efecto sobre la respuesta materna a nivel de oviducto, de hecho, en bovinos, el oviducto puede distinguir entre un ovocito no fecundado y un cigoto; las características del cumulus pueden afectar la migración embrionaria y el momento en que el embrión alcanza el útero (Ortiz et al., 1989; Kolle et al., 2009; Maíllo et al., 2015). La expresión génica de las células oviductales y endometriales, puede cambiar dependiendo de la presencia de un embrión e incluso dependiendo del origen del dicho embrión (si es producido in vivo, por IVF o clonación) (Georgiou et al., 2005; Mansouri-Attia et al., 2009; Forde et al., 2011; Maíllo et al., 2015). La pregunta a raíz de esta información es qué moléculas o mecanismos median esta comunicación temprana, antes de la expresión significativa de las moléculas clásicas de reconocimiento (INFtau y hCG por ejemplo).

Recientemente se ha determinado que los embriones pre-implantatorios en estadio de mórula y blastocisto, secretan moléculas como microRNAs que pueden modular la expresión génicas de las células vecinas (mecanismo paracrino de señalización) (Kropp et al., 2014). Los microRNAs son pequeños RNA (~22 nucleotidos), miembros de la familia de los RNA no codificantes. Participan en la regulación de la expresión génica a nivel post-trascripcional, reduciendo la abundancia del RNAm diana o inhibiendo la síntesis proteica (Lau et al., 2001; Lim et al., 2003). Debido a su función celular, los microRNA están relacionadas con el estado epigenético de una célula. El patrón de expresión de estos microRNAs, secretados al medio de cultivo durante el desarrollo embrionario in vitro, se ha relacionado con la calidad embrionaria (Machtinger et al., 2017). Sin embargo, el patrón de expresión de microRNAs secretados individualmente es difícil de evaluar así como validar la hipótesis de función como mecanismo de señalización celular.

Recientemente se ha identificado que las células secretan vesículas extracelulares (EVs: microvesículas y Exosomas) como mecanismo de señalización que pueden modificar el fenotipo de otra célula cercana e incluso que se encuentre distante en el organismo. Las EVs, en particular los exosomas (Exo), son nanopartículas de < 100 nm de diámetro, secretadas por la célula mediante exocitosis al espacio intercelular, la sangre y diversos fluidos corporales. Se ha identificado la secreción de EVs a partir de diferentes células tumorales, endometriales, células madre, adultas y embrionarias y embriones pre-implantatorios (Saadeldin et al., 2014; Zhang y Wrana, 2014; Mellisho et al., 2017). Los Exo, llevan consigo proteínas, ácidos nucleicos (DNA, RNAm y microRNAs) y lípidos que regulan la expresión génica de las células receptoras mediante variados mecanismos, aún en estudio (Hergenreider et al., 2012). Tanto las células madre embrionarias (ESCs) como los embriones (de cerdo) producen Exo que contienen RNAm que codifican para factores de pluripotencia (OCT4, SOX2) (Ratajczak et al., 2006) y podrían modular (mantener) las características pluripotentes de las células de la vecindad, lo cual es uno de los mayores retos biológicos del desarrollo embrionario. La reciente identificación y caracterización molecular de EVs secretadas tanto por el oviducto como por el endometrio, indican su posible rol en la mediación de la comunicación entre el embrión y el ambiente materno (Ng et al., 2013).

La función de los Exo depende de las células donde se originan, pudiendo variar incluso dentro de las mismas células, dependiendo de su estado de diferenciación o diferentes características funcionales de la célula secretora. Basado en su contenido y en su capacidad de mediar la comunicación celular, las EVs se han utilizado tanto para el diagnóstico de diferentes patologías así como para el transporte de moléculas para uso terapéutico. El hecho que estas vesículas se secreten a los fluidos corporales o medios de cultivo (para sistemas in vitrd), facilita su recuperación con mínima invasión del sistema biológico. Además, el desarrollo de técnicas moleculares altamente sensibles permite el análisis detallado del contenido de las EVs, así como la interpretación de estos datos y posible vinculación con el estado epigenético o funcional de la célula secretora.

A pesar de todos estos avances en materia de fertilización in vitro y del conocimiento de la comunicación materno fetal, aún existe la necesidad de implementar sistemas de diagnóstico pre-implantatorio de embriones producidos in vitro mediante el estudio de variables no invasivas, incluyendo el uso de EVs.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1: Gráfico de crecimiento embrionario, considerando el diámetro al D7, D9 y Dll de desarrollo in vitro.

Figura 2: Fotografía de microscopía electrónica mostrando una representación de vesículas extracelulares secretadas por embriones partenogenéticos (A) y de IVF (B).

Figura 3: Fotografía de microscopía electrónica mostrando la presencia de cuerpos multivesiculares (MVB) en células embrionarias como indicación de la biogénesis de exosomas en estas células.

Figura 4: Distribución de las vesículas extracelulares secretadas al medio de cultivo in vitro, por embriones bovinos pre-implantatorios partenogenéticos y de IVF, de acuerdo a su competencia. Eje Y: Concentración (10 ⁸ /ml); Eje X: tamaño (nm). Figura 5: Diámetro embrionario al día 7,5 de desarrollo in vitro. Los embriones fueron clasificados retrospectivamente según su capacidad de desarrollo hasta el día 11 en cultivo in vitro extendido. Letras diferentes indican diferencias estadísticas con p<0,05.

Figura 6: Distribución de las vesículas extracelulares secretadas al medio de cultivo in vitro, por embriones bovinos pre-implantatorios de acuerdo a su competencia. Eje Y: Concentración (10 ⁸ /ml); Eje X: tamaño (nm).

Figura 7: Media del tamaño de las EVs aisladas del medio de cultivo de embriones durante el periodo pre-implantatorio (hasta blastocisto: día 7,5). Los medios de cultivo y sus respectivas EVs fueron clasificados en grupos de acuerdo al embrión original que a su vez fueron clasificados retrospectivamente según su capacidad de desarrollo hasta el día 11 en cultivo in vitro extendido. Letras diferentes indican diferencias estadísticas con p<0,05.

Figura 8: Concentración (xl0 ⁸ /ml) de EVs aisladas del medio de cultivo de embriones durante el periodo pre-implantatorio (hasta blastocisto: día 7,5). Los medios de cultivo y sus respectivas EVs fueron clasificados en grupos de acuerdo al embrión original que a su vez fueron clasificados retrospectivamente según su capacidad de desarrollo hasta el día 11 en cultivo in vitro extendido. Letras diferentes indican diferencias estadísticas con p<0,05.

Divulgación de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo método no invasivo de diagnóstico pre-implantatorio de embriones producidos in vitro mediante el estudio de variables no invasivas que incluyen morfo-cinética y características poblacionales de vesículas extracelulares (EVs), tamaño y concentración secretadas al medio de cultivo. Adicionalmente se plantea el uso de las EVs secretadas por embriones pre- implantatorios para determinar las características genéticas del embrión en función del contenido de ADN genómico. La metodología descrita se refiere a embriones de mamíferos humanos y no humanos.

Existe una diferencia entre el uso del término competencia y viabilidad embrionaria, un embrión competente es aquel que tiene la capacidad de generar una gestación y mantener un desarrollo normal a término generando un individuo saludable. En este documento el término competencia embrionaria se refiere a la capacidad de desarrollo hasta un punto definido mientras que el término viabilidad se refiere a si el embrión está vivo y funcional al momento de la evaluación.

El método de diagnóstico pre-implantatorio comprende las siguientes etapas:

a) Aislamiento de las EV;

b) Tipificación de poblaciones de EVs;

c) Análisis de marcadores de superficie de EVs mediante citometría de flujo;

d) Aislamiento de ADN contenido en EVs secretadas al medio de cultivo por embriones producidos in vitro,

e) Determinación de variables morfo-cinéticas relacionadas con la competencia embrionaria; y

f) Evaluación en un modelo predictivo basado en el análisis la secreción de vesículas y características morfo-cinéticas del embrión. El método de diagnóstico comienza con el uso de medios definidos para el cultivo embrionario, los cuales son depletados de EVs aportadas por las fuentes proteicas (suero fetal o alúmina). Los embriones son cultivados en este medio durante el periodo in vitro, el medio se colecta para su análisis al momento que los embriones son retirados para su evaluación morfológica y su posterior procesamiento (criopreservación o transferencia a madre receptora). El medio de cultivo colectado se conservará en tubos de 1,5 mi estériles, de forma individual, identificados con el embrión del cual proviene y se mantendrá en refrigeración (4-8°C) o congelado (- 80°C) dependiendo del tiempo requerido para su procesamiento.

A partir de cada medio de cultivo se aislarán las EVs mediante centrifugación diferencial: paso 1, centrifugación a 200-700xg/10-20 min, para eliminar detritos y células; paso 2, 1500-3500xg/ 10-20 min; paso 3, 10000-12000xg/ 30 min, en los cuales el sobrenadante se usa para el siguiente paso; y finalmente paso 4, 100000- 120000xg/120 min; en este paso final se elimina el sobrenadante, y el pellet que contiene las EVs se reconstituye en 100 μΙ de PBS. Las poblaciones de EVs se caracterizan mediante Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) para determinar la concentración y tamaño de las EVs presentes en el medio aislado. El análisis de realiza con el equipo NanoSight NS300 (NanoSight Ltd, Malvern, UK) de acuerdo al protocolo del fabricante y recomendaciones de Winck et al. (2015). Las muestras diluidas se cargan a la cámara automáticamente, a 25 °C, con velocidad de flujo constante utilizando la bomba para jeringa, incluida con el fin de reducir errores del operador. El software NTA 2.3 es utilizado para la captura de datos y análisis de tamaño y concentración de nanopartículas basadas en el movimiento Browniano y midiendo la dispersión de luz. Cada análisis será replicado 5 veces por muestra. El reporte NTA provee información global y por muestra, lo que incluye tamaño medio de partículas, (esto define a su vez la cantidad y propiedades de microvesículas y exosomas por separado) desviación estándar del tamaño de partículas, concentración de partículas (cantidad por ml_) y gráfica de distribución del tamaño de las partículas de la muestra.

Análisis de marcadores de superficie de EVs mediante citometría de flujo.

Se confirma la presencia de EVs mediante la determinación de marcadores canónicos de superficie (CD9 y CD81). La tercera parte de las EVs analizadas por NTA se someterán a esta evaluación. Dada el pequeño tamaño (nm) de las EVs, que impide la detección por citometría de flujo, se conjugan con perlas de látex marcadas con fluoróforos. Brevemente, se mezclarán 0,125 μΙ_ de 4 μιη de perlas de látex aldehído/sulfatos con 4xl0 ⁸ partículas de MVs/Exo en un volumen final de 100 μΙ_ de PBS y se incuban a 4°C, toda la noche. Posteriormente se añade glicina al PBS (concentración final 100 mM) para bloquear las perlas no unidas a EVs, se lavan, centrifugan y conjugan con anticuerpos específicos comerciales contra marcadores de superficie canónicos de MVs/Exo, conjugados con distintos fluoróforos (CD9-PE ficoeritina y CD81-Texas Red) de modo que se puedan leer los 3 a la vez en un citómetro de flujo. Se determina la proporción de positividad a cada uno. No se incluirá la detección del tercer marcador clásico (CD63) ya que ha sido demostrado previamente en nuestro laboratorio la baja presencia de este marcador en vesículas secretadas por embriones (bovinos), cuyo tamaño se encuentra en el rango de los exosomas (30-120 nm).

Aislamiento de ADN contenido en EVs secretadas al medio de cultivo por embriones producidos in vitro.

El resto de EVs aisladas y analizadas por NTA a partir del medio de cultivo se utilizan para el aislamiento de ADN total contenido, utilizando kits comerciales acorde a las instrucciones de los fabricantes. El ADN se cuantifica y es congelado a -80°C. El ADN es sometido a análisis genético mediante aCGH. Brevemente, el ADN extraído se cuantifica, marca y co-hibrida con ADN de referencia de humanos sanos. El mareaje de ambas muestras se lleva a cabo por random priming con Cy-5 y Cy-3 respectivamente. El ADN se híbrida con el arreglo (CytoChip-180K, BlueGnome Ltd., UK) en el SureScan de Agilent. Las imágenes se cuantifican con el Agilent feature extraction software V9.5.3.1 y se analizan con el paquete de softwares de Agilent. Este arreglo permite detectar cambios en el número de copias de >50 kb en 138 regiones target (microdeleciones-duplicaciones de loci) y >150 kb en el resto del genoma.

Con esta evaluación se determina la presencia de aberraciones cromosómicas sin necesidad de toma de biopsia embrionaria y utilizando las tecnologías moleculares existentes.

Determinación de variables morfo-cinéticas relacionadas con la competencia embrionaria

Mediante procedimientos de observación directa se determina el momento de blastulación como variable de gran valor predictivo de la competencia embrionaria según los datos de nuestro laboratorio. Para ello se usará el tiempo de blastulación de acuerdo al programa de desarrollo de la especie; se define como referencia el día de la blastulación con respecto al día de la fecundación, según las referencias de la literatura; Ejemplo: Bovinos Día 7, Humanos Día 5. Se definirá como bastulación temprana (BTE) aquellos embriones que comiencen el proceso de cavitación -0,5 días con respecto al día de blastulación y +0,5 días bastulación tardía (BTA).

Ejemplo Bovinos: BTE= 6,5 días; BTA= 7,5 días.

Modelo predictivo basado en el análisis la secreción de vesículas v características morfo-cinéticas del embrión.

Se emplean estadígrafos que permiten evaluar el modelo de predicción de competencia embrionaria que incluye variables no invasivas, morfo-cinética y características de vesículas extracelulares.

La variable dicotómica competencia embrionaria que se refiere a desarrollo o no, hasta un punto crítico del desarrollo, (competente - no competente) se analiza mediante una regresión logística binaria utilizando el software SPSS. Esto para determinar la probabilidad de ocurrencia de embriones viables. En el modelo, se incluyen las siguientes variables como predictoras de la respuesta: blastulación (temprana - tardía) como variable categórica, diámetro promedio (mm) de EVs al día en que los blastocistos son seleccionados para transferencia (o criopreservación), la concentración de partículas (xlO ⁸ ) y la moda del tamaño de las EVs (nm), como covariables cuantitativas. Este modelo proporciona un método no invasivo para predecir el éxito del desarrollo embrionario, de esta forma se garantizan mayores tasas de implantación tanto en animales como en humanos. Incluye variables no invasivas y fáciles de medir, en un tiempo breve (5 horas después de la colecta de la muestra) y predice la competencia embrionaria en un 75%. Este diagnóstico combina criterios cualitativos y cuantitativos lo cual incrementa el éxito de la predicción de la calidad embrionaria. El uso del medio de cultivo para el aislamiento de EVs, proporciona un método de determinación de criterios genéticos de calidad embrionaria, sin necesidad de manipulaciones invasivas para la toma de biopsias, que pueden causar mayor daño embrionario. En animales, el fallo de la implantación tiene consecuencias negativas para la producción ya que se incrementan los gastos asociados al mantenimiento de hembras receptoras vacías (que no generan crías en periodo determinado). En humanos, la transferencia de embriones con baja probabilidad de implantación incrementa el número de intentos para la generación de una gestación saludable lo cual tiene un costo económico elevado así como consecuencias para la salud tanto física como mental de la paciente. En humanos, no existen métodos cuantitativos y confiables para predecir la calidad de los embriones pre-implantatorios, por lo que se opta por la transferencia de 2-3 embriones por ciclo, lo que provoca gestaciones múltiples con consecuencias negativas para la salud de la madre y fetos. Estos casos requieren mayor atención médica, desgaste emocional y económico para la pareja.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Identificación y caracterización de vesículas secretadas por embriones bovinos producidos in vitro mediante partenogénesis y

fecundación in vitro.

Este experimento fue concebido para determinar la presencia de EVs en el medio de cultivo de embriones bovinos producidos in vitro utilizando dos tecnologías que producen embriones con diferente competencia: 1) partenogénicos (PA), menos competentes y 2) fecundación in vitro (IVF), más competentes. Los embriones partenogenéticos fueron producidos por la activación artificial del ovocito maduro por lo que no tienen contribución genética paterna y por tanto no son capaces de implantarse y desarrollarse a término. En este estudio, los embriones fueron cultivados en medio depletado de EVs y clasificados al día 7 de desarrollo embrionario. Los embriones que alcanzaron el estado de blastocisto y con excelente calidad morfológica fueron seleccionados y su medio de cultivo fue colectado para evaluar la presencia de EVs y sus características: 1) identificación morfológica de las EVs mediante microscopía electrónica, 2) presencia de marcadores de superficie (CD9 y CD63) mediante citometría de flujo, y 3) concentración y tamaño de partículas (nm) mediante NTA.

Los blastocistos fueron transferidos a cultivo nuevamente para evaluar su capacidad de continuar su desarrollo hasta el día 11 de cultivo in vitro a través de un sistema de cultivo extendido desarrollado en nuestro laboratorio. Se evaluó el estado de desarrollo de cada embrión y se determinó el diámetro cada día, durante todo el cultivo extendido (D7-D11). En la figura 1 se obtiene que al día 11, los blastocistos día 7 fueron clasificados retrospectivamente como competentes (CB) y no-competentes (NCB); CB: blastocistos que llegaron al día con crecimiento lineal y NCB: aquellos que cuyo diámetro no aumentaba o disminuyera (colapsara) a partir del D9 de desarrollo. Los embriones con incremento sostenido de su tamaño fueron considerados competentes.

En la figura 2 se observa la presencia de vesículas con características de bicapa lipídica (característico de microvesículas y exosomas) en el medio de cultivo de embriones bovinos producidos tanto por PA (2A) como por IVF (2B). En la figura 3 se identificó la presencia de cuerpos multivesiculares (MVB) en células trofoblasticas de los embriones lo que la activación del mecanismo de biogénesis de exosomas en estas células. Se demostró la presencia de marcadores de superficie CD63 y CD81 en las EVs aisladas del medio de cultivo. Finalmente se determinó la concentración y la distribución de tamaño de la población de vesículas aisladas. El mayor número de EVs estuvo en el rango de tamaño característico de los exosomas (30-120 nm) (Figura 4). No se observaron diferencias significativas en la media o la moda del tamaño de las EVs entre los grupos analizados (IVF-CB, IVF-NCB, PA-CB y PA-NCB) pero sí se determinó que la concentración de EVs fue significativamente mayor (p<0,05) en los embriones IVF-NCB.

Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para determinar posibles agrupaciones de las variables concentración y tamaño de EVs en función de la competencia embrionaria: 1: PA-CB; 2: PA-NCB; 3: IVF-CB; 4: IVF-NCB. Se demostró que la concentración de EVs es diferente dependiendo del tipo de embrión, mostrando una mayor variabilidad en los embriones producidos por IVF, especialmente los NCB. Este resultado indican que los embriones producidos por IVF tienen mayor variabilidad en la secreción de estas partículas, probablemente debido a diferencias en su estado epigenético como consecuencia del origen del genoma (combinación materna y paterna) y su capacidad individual de responder a las condiciones ambientales in vitro. Esto es el primer indicio que el mecanismo de producción de exosomas depende de las características de cada embrión (su origen) y probablemente esté significativamente relacionado con su competencia.

Ejemplo 2: Validación estadística de la capacidad de competencia embrionaria considerando variables no invasivas como morfo-cinética y características de poblaciones de vesículas extracelulares (concentración y tamaño de EVs).

Para probar que la velocidad de blastulación, el tamaño de los blastocistos y la concentración y tamaño de las EVs secretadas al medio de cultivo, son variables con alto valor predictivo de competencia embrionaria, se realizó un diseño experimental tomando como modelo embriones bovinos producidos por FIV.

Los embriones fueron cultivados individualmente hasta estadio de blastocisto en medio de cultivo (SOFaa) depletado previamente de EVs (Figura 4: SOF dep - control negativo). Los embriones se clasificaron al D5 post FIV para determinar el desarrollo hasta mórula; los embriones que no alcanzaron este estadio ese día fueron descartados del estudio. Todas las mórulas (D5) se mantuvieron en cultivo individual y se evaluó nuevamente al día 6,5 para determinar los embriones con blastulación temprana (BTE) y posteriormente al día 7,5 para determinar los embriones con blastulación tardía (BTA). Los embriones sin presencia de blastocel al día 7,5 fueron descartados del estudio, así como los embriones de BTE que mostraron signos de degeneración al día 7,5. Todos los blastocistos que permanecieron en el estudio fueron medidos (diámetro μιη) al día 7,5. Al día 7,5 se colectó el medio de cultivo, los cuales se conservaron individualmente e identificado con el respectivo embrión. Los blastocistos se mantuvieron en cultivo extendido hasta el día 11 de desarrollo para determinar su competencia. De esta forma los blastocistos se clasificaron primero por el momento de blastulación y retrospectivamente según su competencia, organizándose 4 grupos: BTE-C, BTE-NC, BTA-C, BTA-NC. Las EVs se aislaron a partir del medio de cultivo de cada embrión y fueron analizadas por NTA (individualmente): posteriormente, se colectó la totalidad de EVs analizadas y se utilizaron para evaluar su contenido de moléculas señalizadoras (microRNAS) como indicador del estado epigenético embrionario para "la comunicación" con el ambiente (sistema in vitró). En total se evaluaron 268 embriones de los cuales, 83 embriones correspondieron a BTE-C, 68 embriones de BTE-NC, 62 embriones de BTA-C y 55 embriones de BTA-NC. Se determinó que los embriones clasificados como BTE-C presentaron un mayor diámetro (p<0,05) con respecto a los demás grupos (figura 5), observándose también una correlación positiva entre el diámetro al D7,5 de desarrollo y la viabilidad embrionaria (r=0,31; p<0,001) y su diámetro al dll (r=0,48; p<0,001).

Se analizaron estadísticamente las variables obtenidas a partir del análisis de NTA (media del tamaño de EVs (nm) y la concentración) (Figura 6). Se observó que las EVs secretadas por los embriones del grupo BTE-C secretan EVs significativamente más grandes que el resto de los grupos y que además, los embriones del grupo BTE-NC secretan vesículas significativamente más pequeñas (Figura 7). Con respecto a la concentración de EVs, no se observaron diferencias significativas entre los grupos: BTE-C, BTA-C, BTA-NC. Sin embargo, el grupo BTE-NC secreta una cantidad de vesículas significativamente mayor que el resto de los grupos (Figura 8). Estos resultados, confirman que las características de las poblaciones de EVs secretadas por embriones bovinos pre-implantatorios a medio de cultivo durante el desarrollo in vitro, están relacionadas con la competencia embrionaria. Para confirmar esta hipótesis se realizó la secuenciación del contenido de microRNA presente en las poblaciones de EVs secretadas por cada embrión de cada grupo (según la clasificación anterior). Este análisis indicó, primero que el contenido global de microRNA presente en EVs secretadas por embriones pre-implantatorios bovinos (de 120 células aproximadamente) puede ser analizados mediante RNAseq (Norgen Biotek Corp, Toronto, Canadá). Se detectaron 13 microRNA derregulados entre los grupos extremos (BTE-C vs BTA-NC) (p<0,05; FDR<0,05). En general se detectaron 3 microRNAs que mantuvieron el mismo patrón de regulación comparando embriones más y menos competentes (según nuestro sistema de clasificación); Por ejemplo: bta-m¡R-26 siempre se encontró sobre-expresado en embriones más competentes con FC (Fold change)=2,9 comparando BTE-C vs BTE-NC; FC=4,2 para BTE-C vs BTA-NC, FC=2,8 comparando BTA-C vs BTA-NC. En este caso es interesante el hecho que el FC entre los grupos más y menos competentes, independientemente del momento de blastulación sea similar. Otro ejemplo es el bta-m¡R-34 el cual incrementa su expresión a medida que disminuye la calidad embrionaria.

Ejemplo 3: Modelo estadístico para determinar la calidad embrionaria basado en las variables propuestas.

Con los datos anteriores se evaluó la capacidad predictiva de las variables propuestas. Para ello la variable dicotómica competencia (competente - no competente) fue analizada mediante una regresión logística binaria utilizando el software SPSS. En este estudio, como se mencionó anteriormente, la competencia embrionaria se definió por la capacidad de cada embrión de mantener un crecimiento lineal hasta el día 11 de desarrollo in vitro.

Este análisis se realizó para determinar la probabilidad de ocurrencia de embriones competentes. En el modelo, se incluyeron las siguientes variables como predictoras de la respuesta: blastulación (temprana - tardía; asignándose los valores 1 y 0 respectivamente) como variable categórica, diámetro promedio (mm) de blastocistos al día 7,5 de desarrollo, la concentración de partículas (xl0 ⁸ /ml) y el tamaño de las EVs (nm), como covariables cuantitativas. El valor de r2 de Cox y Snell en este modelo fue 0,36, el r2 de Nagelkerke fue 0,48, el valor -2log de verosimilitud igual a 259,771 y la sensibilidad de 84%.

Tabla 1: Parámetros y estadígrafos de la regresión logística.

a. Variable(s) ¡ntroducida(s) en el paso 1 : Momento Blastulación, Tamaño EVs, Concentración EVs,

Diámetro Embrión D7.5. Ecuación del modelo:

Log predictor= -9,737+(-0,68*Momento Blastulación)+(0,045*Tamaño EVs)+(- 0,197*Concentración EVS)+(0,043*Diámetro Embrión D7.5)

Probabilidad de Competencia Embrionaria= e (Log predictor)/(l+( e (Log predictor))

Tabla 2. Ejemplo usando valores reales experimentales.

^probabilidad calculada por el modelo, mayor que 0,5 indica competencia embrionaria y menor que 0,5 indica embrión no competente ** la competencia experimental se refiere a la determinación en base a la observación del desarrollo embrionario hasta el día 11 de desarrollo in vitro según diseño experimental utilizado.

El modelo propuesto permite calcular la probabilidad que cada embrión sea competente o no competente, basado en las variables mencionadas. En la tabla 2, a modo de ejemplo, se incluyen los valores experimentales de las variables incluidas en el modelo, se calcula la probabilidad, se predice la competencia embrionaria y se compara con la competencia experimental. Se comprobó la eficacia del modelo mediante una prueba lógica para determinar si se cumple o no la condición de competencia. La tabla 3 muestra los porcentajes de clasificación correcta del modelo para los resultados competentes y no competentes, que da un porcentaje global de 75%. Lo cual significa que el modelo clasifica correctamente el 75% de los casos (porcentaje de pronóstico o predicción correcta según el modelo). Tabla 3: Clasificación de valores observados y predichos (valor de corte= 0,5)

Los resultados anteriores demuestran que este modelo que incluye variables no invasivas y fáciles de medir, en un tiempo corto (5 horas después de la colecta de la muestra) predice la competencia embrionaria en un 75 %.