Neue 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate und deren Verwendung in diagnostischen und analytischen Nachweisverfahren

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2,4- Dichlorphenoxyessigsäurederivate zur Kopplung an Trägermoleküle und Festphasen. Die Verbindungen lassen sich unter anderem zur Markierung von Biomolekülen in bioanalytischen Anwendungen verwenden. Ein Teil der hier beschriebenen Verbindungen ermöglicht Markierungen ohne in situ Aktivierung und unter physiologischen Bedingungen. Außerdem erleichtert das Vorhandensein von Abstandhaltern innerhalb der 2,4- Dichlorphenoxyessigsäurederivate die Bindung durch Antikörper.

Die Derivate können löslichkeitsvermittelnde Gruppen enthalten.

Hintergrund der Erfindung:

Im Rahmen moderner analytischer und diagnostischer Verfahren hat die Markierung von Trägermolekülen eine zentrale Bedeutung. Markierungen können z.B. dazu dienen, Trägermoleküle im Verlauf analytischer Verfahren mit Hilfe spezifischer Liganden abzutrennen, nachzuweisen oder zu quantifizieren. Es existieren verschiedene Verfahren, um derartige Markierungen durchzuführen, z.B. mittels Biotin oder mit Hilfe des sogenannten Strep-Tags (Skerra A, Schmidt TG (1999) . Applications of a peptide ligand for streptavidin: the Strep-tag. Biomol Eng. 16:79-86) oder auch mittels Digoxigenin. Wegen der großen praktischen Bedeutung der Markierung von Trägermolekülen und des Bedarfs für den Einsatz mehrerer verschiedener Markierungen im Verlauf analytischer Verfahren ist es notwendig, weitere zur Markierung geeignete Moleküle zu entwickeln.

Gegenüber dem _. Stand der Technik stellt sich daher die Aufgabe neue Verbindungen zur Markierung von Träger- bzw. Substratmolekülen, wie z.B. Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nukleotiden, Nukleinsäuren, Lipiden oder Sacchariden, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel (I)

die in Wasser stabil und löslich sind, wobei der Spacer 1 bis 25 gleiche oder verschiedene geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Saccharide, Polyole oder aus der folgenden Gruppe ausgewählte Reste umfasst:

wobei X und Y unabhängig voneinander -O- oder -S- sind und n eine ganze Zahl im Bereich zwischen 1 und 15 ist, wobei die markierungsvermittelnde Gruppe (MVG) aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

wobei R jeweils gleiche oder verschiedene Reste aus der folgenden Gruppe sind:

Wasserstoff, linearer, verzweigter oder cyclischer Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, linearer oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, geschütztes oder ungeschütztes Amin,

ausgenommen die folgenden Verbindungen (n = 1, 2, 3, ..., 13) :

In den oben und im folgenden gezeigten Strukturformeln sollen die verwendeten Schlangenlinien verdeutlichen, dass es sich bei den markierten Bindungen tatsächlich um Bindungen handelt und nicht um Alkylreste (wie z.B. Methyl oder Methylen), die in der Fachwelt oft genauso dargestellt werden, ohne dass die jeweils beteiligten C-Atome angegeben sind.

Als Aminosäuren kommen alle natürlichen Aminosäuren in Frage, vorzugsweise Alanin, beta-Alanin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin, Citrullin, Cystein, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Homoserin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Sarcosin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, und Valin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D-Konfigurationen, sowie auch nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, wie z.B. 2-Aminoethylglycin, Phenylglycin, Penizillamin, Norvalin, Norleucin, Alpha- Aminobuttersäure, Diaminopropionsäure, Cyclohexylalanin, Bu- tylglycin, Aminoisobuttersäure, Thienylalanin, Statin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D-Konfigurationen, sowie Amino- Oligoethylenglycol-Carbonsäuren oder Amino-

Oligopropylenglycol-Carbonsäuren.

Unter geschützten Aminosäuren werden Aminosäuren verstanden, die eine Schutzgruppe tragen, wie z.B. S-Acetamidomethyl-

(Acm) , t-Butyloxycarbonyl- (Boc) , t-Butyl- (tBu) , Trityl-

(Trt ) , 2,2,4,6, 7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl-

(Pbf) , Tosyl- (Ts), Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc) , (1,1,- dioxobenzo [b] thiophene-2-yl-methyl) oxycarbonyl- (Bsmoc) , Ben- zyloxycarbonyl- (CBz) , Benzhydryloxycarbonyl- (Bhoc) oder be- ta-2-Adamantyl- (Ada) . Ungeschützte Aminosäuren sind demnach

Aminosäuren, die eine solche Schutzgruppe nicht tragen.

Bei den Nukleosiden kann es sich um Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in syn- oder anti-Konfiguration, sowie um ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (Nukleotide) oder Derivate davon handeln, wie z.B. zyklische Formen, wie 3' -5'- zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP) , oder ihre Desoxy- o- der Didesoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie Xanthosin, Hypoxanthosin, 6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5- Iod-2' -desoxyuridin, 6-Thioguanin, Azothymidin oder Didesoxyi- nosin und ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (synthetische Nukleotid-Analoga) .

Gemäß einer besonderen Ausführungsform können somit anstelle der in Formel (I) angegebenen Nukleotid-triphosphat-, Desoxy- nukleotid-triphosphat- oder Didesoxynukleotid-triphosphat- Reste auch die entsprechenden, in der allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 genannten Nukleotidreste verwendet werden, sowie die sich aus Figur 8 (A) , (B) und (C) durch die jeweils möglichen Substituentenkombinationen ergebenden Nukleotidderivate, die hiermit ausdrücklich eingeschlossen sind.

Saccharide innerhalb des Spacers können erfindungsgemäß aus einer linearen oder verzweigten Kette aus 1 bis 10 gleichen oder verschiedenen Monosacchariden bestehen, z.B. aus Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Arabinose, N-Acetylglucosamin oder Fructose, oder aus 1 bis 5 gleichen oder verschiedenen Disac- charidbausteinen wie Cellobiose, Lactose, Chitobiose, Lactosa- min aufgebaut sein, die vorzugsweise, aber nicht zwangsläufig, ^" beta-1, 4-glycosidisch verknüpft sind oder aus Kombinationen oder Derivaten der genannten Strukturen bestehen. Außerdem kann der Spacer aus O-glycosylierten Serin, Threonin oder N-

glycosylierten Asparagin- und/oder Glutaminsäure Untereinheiten aufgebaut sein oder diese enthalten. Der Spacer kann darüber hinaus aus linearen oder verzweigten Polyolen mit 3 bis 15 Hydroxylgruppen aufgebaut sein, die ganz oder teilweise mit den oben genannten Spacer-Komponenten, wie z.B. Saccharid- o- der Polyolstrukturen, verknüpft sein können. Gemäß einer Ausführungsform können die Polyole auch als solches als Spacer verwendet werden, d.h. ohne zusätzliche Spacer-Komponenten. Alditole wie zum Beispiel Glucitol, Mannitol, Allitol oder Ga- lactitol aber auch Cyclitolderivate wie zum Beispiel Abkömmlinge des Inositols zählen zu erfindungsgemäß bevorzugten Polyolen.

Unter „markierungsvermittelnden Gruppen" (MVG) werden funktionelle Einheiten verstanden, die eine Markierung von Substratmolekülen mit 2, 4-Dichlorphenoxyacetylresten (2,4-D) oder 2,4- D-Derivaten, die mit Abstandshaltern (Spacern) versehen sind, vermitteln. Die Vermittlung der 2, 4-D-Markierung kann dabei entweder direkt durch chemische Reaktion der markierungsvermittelnden Gruppe mit einem Substratmolekül erfolgen, wobei 2,4-D oder ein 2, 4-D-Derivat mit Abstandshaltern auf das Substratmolekül übertragen wird, oder indirekt durch Einbau/Inkorporation der markierungsvermittelnden Gruppe, die in diesem Fall kovalent mit der 2, 4-D-Markierungseinheit verknüpft bleibt, in ein entsprechendes Substratmolekül. Soweit die markierungsvermittelnde Gruppe ersterem Anspruch genügt, wird sie im Folgenden auch als reaktive Gruppe (RG) bezeichnet. Markierungsvermittelnde Gruppen, die eine direkte übertragung der 2, 4-D-Markierung ermöglichen, sind z.B. amin-, thiol-, aldehyd-reaktive Gruppen oder Gruppen mit gemischter Reaktivität. Markierungsvermittelnde Gruppen, die einen indi-

rekten Einbau der 2, 4-D-Markierung ermöglichen, sind z.B. geschützte oder ungeschützte Aminosäuren, Nukleotide, Sacchari- de, oder Lipide.

Unter 'linearer oder verzweigter Alkylrest ¹ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel C _n H _2n+ ] _. ' bzw. C _n H _2n verstanden. Es handelt sich insbesondere um Reste mit 1, 2, 3, 4, 5, ... 14 oder 15 Kohlenstoffatomen. Explizit eingeschlossen sind die Reste Methyl (-en), Ethyl(-en), Propyl(-en), Isopropyl (-en) , Butyl(-en), Isobu- tyl(-en), sek. Butyl(-en), tert. Butyl (-en) , Pentyl(-en), Iso- pentyl(-en), Neopentyl (-en) , Hexyl(-en), Heptyl(-en), Octyl(- en) , Nonyl(-en), Decyl(-en), und mit Methyl-, Ethyl- oder Pro- pylgruppen substituierte Heptyl(-en), Octyl(-en), Nonyl(-en)- oder Decyl (-en) -Reste, wie z.B. 6, 7, 8, 9, 10-Pentamethyldecyl (- en) oder 8-Methyl-9, 10-diethyldecyl (-en) .

Nicht einschränkende Beispiele für einen linearen oder verzweigten Alkenyl-Rest sind Kohlenwasserstoffreste mit 2, 3, 4, 5, ..., 14 oder 15 Kohlenstoffatomen sowie einer oder ggf. mehreren eis oder trans konfigurierten C-C-Doppelbindungen. Explizit eingeschlossen sind Propenyl (-en) , 2-Butenyl (-en) , 3- Butenyl (-en) , 2-Pentenyl (-en) , 3-Pentenyl (-en) , 1,3- Hexadienyl (-en) , 1, 5-hexadienyl (-en) , Alkenylreste mit konjugierten C-C-Doppelbindungen, wie z.B. 1, 3, 5, 7 , 9-Decapentenyl (- en) .

Bei den oben genannten Alkoxyresten handelt es sich um lineare oder verzweigte Alkylreste der obigen Definition, die über ein Sauerstoffatom an die in den obigen Formeln gezeigten C- oder N-Atome gebunden sind.

Das oben genannte Amin kann eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe sein, also -NH ₂ , NHR' oder NR' ₂ , wobei R' ein Alkylrest nach der obigen Definition sein kann.

Bevorzugte Verbindungen haben die Formel (II)

bei der Zl ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten:

mit nl = 1 - 15,

wobei Z2 ausgewählt ist aus den folgenden Substituenten:

mit n2 = 1 - 15,

wobei M ⁺ ein einwertiges, anorganisches oder organisches Kation ist,

wobei PG eine Amino-Schutzgruppe ist.

Gemäß der vorstehenden Definition können nl und n2 jeweils ganze Zahlen im Bereich von 1 bis 15 sein, also 1, 2, 3, 4, ...

14 oder 15. Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit nl = 5 oder nl = 10 und/oder n2 = 4 oder n2 = 11,

Bei dem Kation handelt es sich insbesondere um Lithium, Kalium, Ammonium, Rubidium, Cäsium, vorzugsweise Natrium oder Tetraalkylammonium (insbesondere Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Tetrapropylammonium, Tetrabutylammonium, Tetrapentylammonium oder Tetrahexylammonium) .

Die Amino-Schutzgruppe ist beispielsweise eine der oben genannten Schutzgruppen und vorzugsweise (1,1- Dioxobenzo [b] thiophen-2-yl-methyl) oxycarbonyl- (Bsmoc) , t- Butyloxycarbonyl- (Boc) oder Benzyloxycarbonyl- (CBz) und insbesondere Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc).

Anstelle des angegebenen Desoxyuridin-5' -triphosphat-Rests können auch die entsprechenden, in der allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 genannten Nukleotidreste verwendet werden, sowie die sich aus Figur 8 (A) , (B) und (C) durch die jeweils möglichen Substituentenkombinationen ergebenden Nukleotidderivate, die hiermit ausdrücklich eingeschlossen sind.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden Verbindungen der Formeln (III) und (IV) bereitgestellt:

mit n = 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 und mit m = l _f 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.

Der Rest W ist vorzugsweise -O- oder -NH-, und der Rest R ist vorzugsweise Wasserstoff (-H) , Succinimidyl, Sulfo- succinimidyl, Amino (-NH ₂ ), 5- (allyl) -2' -desoxyuridin-5' - triphosphatidyl oder Fmoc-Lysinyl . Anstelle der 5- (3- Amidoallyl) -2' -desoxyuridin-5' -triphosphatidyl-Verbindung kommen vor allem auch die in der allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 genannten modifizierten Nukleotidderivate ebenso in Betracht wie die sich aus Figur 8 (A), (B) und (C) durch die jeweils möglichen Substituentenkombinationen ergebenden Nukleotidderivate, die hiermit ausdrücklich eingeschlossen sind. Ebenso ausdrücklich eingeschlossen sind die in der Allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 und der Allgemeinen Arbeitsvorschrift 6 genannten Aminosäurederivate. Anstelle der Derivate der allgemeinen Formel (IV) - und im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausdrücklich eingeschlossen - kommen vor allem auch Derivate in Betracht, die sich aus den in Figur 9 dargestellten PoIy- ethylenglykol-Derivaten ableiten.

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Derivate der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), die hierin auch als „2, 4-D-Derivate" bezeichnet werden. Die Substanz 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure sowie Ester- oder Amid- oder andere Derivate und Salze davon wurden ursprünglich als Herbizide entwickelt und genutzt. Konjugate, bei denen die 2,4-

Dichlorphenoxyessigsäure kovalent an nieder- oder hochmolekulare Träger gebunden vorliegt, werden für eine Vielzahl von bioanalytischen Zwecken verwendet. Hauptsächlich werden derartige Derivate in kompetitiven Immunoassays eingesetzt, die der toxikologischen Analytik des Herbizides im Trinkwasser, in Nahrungsmitteln oder in Körperflüssigkeiten dienen sollen (vgl. z.B.: Kroger S, Setford SJ, Turner AP (1998). Immunosensor for 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid in aqueous/organic solvent soil extracts. Anal Chem. 70:5047-5053; Bier FF, Kleinjung F, Ehrentreich-Forster E, Scheller FW (1999) . Changing functionality of surfaces by directed self-assembly using oli- gonucleotides-the Oligo-Tag. Biotechniques . 27:752-756; Ha- lamek J, Hepel M, Skladal P (2001) . Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4- dichlorophenoxyacetic acid. Biosens Bioelectron. 16:253-260). In den beschriebenen Tests wird 2,4-D nach gängigen Methoden direkt in situ über die Carboxylfunktion kovalent an Trägermoleküle gebunden und in Kompetition mit freier 2,4-D durch spezifische Antikörper (vgl. Franek M, Kolar V, Granatova M, Ne- vorankova Z (1994). Monoclonal ELISA for 2,4- Dichlorophenoxyacetic Acid: Characterization of antibodies and assay optimization. J Agric Food Chem. 42:1369-1374; Franek M, Brichta J (2003). Identification of Monoclonal Antibodies against 2,4-D Herbicide by ELISA and DNA Sequencing. J Agric Food Chem. 51:6091-6097.) nachgewiesen. Die dazu erforderlichen Antikörper wurden durch Immunisierung von Versuchstieren mit 2, 4-D-Protein- oder 2, 4-D-Poly-L-Lysinkonjugaten gewonnen (vgl. z.B. Franek M (1989) . CS8707109A1, Immunogenes for pro- duction of antibodies against polychlorinated biphenyls and method of their preparation; Schecklies E (1995).

DE19529250C1, Preparation of hapten-carrier conjugates con- taining polyaminoacids as carriers.).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich sehr gut an Trägermoleküle, Festphasen und Substratmoleküle binden, die nachfolgend auch einfach als „Träger" oder „Substrate" bezeichnet werden. Dabei sind Träger (moleküle) und Substrate lösliche und Festphasen unlösliche Stoffe, an die die 2,4- Dichlorphenoxyessigsäurederivate über die Einheit „MVG" gekoppelt werden können. Substratmoleküle sind z.B. Makromoleküle (makromolekulare Substratmoleküle) , wie biogene Makromoleküle, wobei Makromoleküle chemische Verbindungen mit einer molekularen Masse von mindestens 500 g/mol sind. Biogene Makromoleküle sind chemische Verbindungen, deren Strukturen Verbindungen entsprechen, die aus metabolischen Prozessen resultieren oder daran beteiligt sind. Biogene Makromoleküle, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert sind, müssen jedoch nicht zwangsläufig das Ergebnis metabolischer Vorgänge sein, sondern können anderen Quellen entstammen.

Die Begriffe "löslich" und "unlöslich" beziehen sich auf wäss- rige und/oder organische Flüssigkeiten. Vorzugsweise ist die Verbindung zwischen den Substraten und den Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine kovalente Bindung, jedoch können andere Verknüpfungen ebenso geeignet sein und sind somit ausdrücklich eingeschlossen.

Im Sinne der Erfindung bedeutet "in Wasser stabil", dass die entsprechende Verbindung in flüssigen Medien, die einen Wasseranteil von mindestens 80% besitzen, bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 9 und einer Temperatur von 0 ⁰ C innerhalb von

wenigen Minuten, vorzugsweise innerhalb von 5 Minuten, zu weniger als 50 % zerfällt, bzw. dass die entsprechende Verbindung in flüssigen Medien, die einen Wasseranteil von mindestens 80% besitzen, bei einem pH-Wert von 7 und bei 4 ⁰ C innerhalb von 20 Minuten, vorzugsweise innerhalb von 1 Stunde, zu weniger als 50 % zerfällt.

„In Wasser löslich" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass 100 μMol der erfindungsgemäßen 2, 4-Dichlorphenoxyacetatderivate in 1 1 eines flüssigen Mediums mit einem Wasseranteil von mindestens 80 % bei 25°C aufgelöst werden können.

Die 2, 4-Dichlorphenoxyacetyl-Gruppe stellt ein Hapten dar. Dabei bezeichnet der Begriff Hapten ein kleines organisches Molekül, das einen spezifischen Bindungspartner für einen gegen dieses Hapten gerichteten Antikörper darstellt. Hierbei besteht die Möglichkeit, dass bei der Bindung eines Antikörpers an die an ein Trägermolekül gebundene 2, 4-Dichlorphenoxy- essigsäure angrenzende Regionen des Trägermoleküls die Bindung stören können. Andererseits könnte der Antikörper aber auch Strukturelemente des bei seiner Entwicklung verwendeten Hap- ten-Trägerproteinkonjugates, insbesondere die Struktur der Verknüpfung zwischen Hapten und Trägermolekül, zusammen mit dem Hapten erkennen und daher ein solches Trägermolekül für eine hochaffine Bindung benötigen. Die hier beanspruchten Verbindungen enthalten Spacer, um störende Effekte zu verringern und/oder um Strukturelemente der Hapten- Trägerproteinverknüpfung zu imitieren. In den erfindungsgemäßen Verbindungen liegen die Spacer in Form aliphatischer Kohlenstoffketten vor, so dass eine Steigerung der Affinität der Bindung zwischen Antikörper und Hapten erreicht werden kann.

Die Affinität der Bindung zwischen 2, 4-Dichlorphenoxyacetyl- Gruppe und Antikörper wird insbesondere durch einen direkt an die Carboxylatfunktion der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure gebundenen, unverzweigten aliphatischen Spacer um ein Mehrfaches erhöht. Die erfindungsgemäßen 2, 4-Dichlorphenoxyacetatderivate schließen vorzugsweise lineare Alkyl-Spacer ohne oder in Kombination mit Oligoethylenglycoleinheiten entsprechend den Formeln III und IV ein, bei denen n eine ganze Zahl im Bereich von 1-15 ist. Der Vorteil von Aminohexansäure (n=5) oder 11- Aminoundecansäure (n=10) umfassenden Spacern in einem ELISA ist beispielhaft in Figur 3 gezeigt. In den erfindungsgemäßen Verbindungen können löslichkeitsvermittelnde Gruppen im Spacer oder der Gruppe (MVG) aus Formel (I) enthalten sein. Diese Gruppen können aus Ladungsträgern oder Oligoethylenglycol- Substrukturen bestehen. Löslichkeitsvermittelnde Saccharid- Substrukturen innerhalb des Spacers können erfindungsgemäß aus einer linearen oder verzweigten Kette aus 1 bis 10 gleichen oder verschiedenen Monosacchariden bestehen, z.B. aus Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Arabinose, N-Acetylglucosamin oder Fructose, oder aus 1 bis 5 gleichen oder verschiedenen Disac- charidbausteinen wie Cellobiose, Lactose, Chitobiose, Lactosa- min aufgebaut sein, die vorzugsweise aber nicht zwangsläufig beta-1, 4-glycosidisch verknüpft sind oder aus Kombinationen oder Derivaten der genannten Strukturen bestehen. Außerdem kann der Spacer aus O-glycosylierten Serin, Threonin oder N- glycosylierten Asparagin- und/oder Glutaminsäure Untereinheiten aufgebaut sein oder diese enthalten. Der Spacer kann darüber hinaus aus linearen oder verzweigten Polyolen mit 3 bis 15 Hydroxylgruppen aufgebaut sein, die ganz oder teilweise mit den oben genannten Spacer-Komponenten, wie z.B. Saccharid- o- der Polyolstrukturen, verknüpft sein können. Die im Spacer

enthaltenen Saccharid-Substrukturen können einerseits mit 2,4- Dichlorophenoxyessigsäure oder einer Alkylspacer enthaltenden Variante der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure, andererseits mit den für Struktur (I) definierten markierungsvermittelnden Gruppen (MVG) substituiert sein. „Löslichkeitsvermittelnd" im Sinne der Erfindung bedeutet eine Steigerung der Löslichkeit der beanspruchten Verbindungen in flüssigen Medien mit einem Wasseranteil von mindestens 80%.

Ladungsträger können beispielsweise die folgenden Elemente und chemischen Strukturen sein: Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Phosphatgruppen als negative Ladungsträger sowie Ammonium- o- der Guanidylgruppen als positive Ladungsträger die sich als Substituenten am Spacer oder der Gruppe (MVG) der generischen Formel (I) befinden.

Unter Oligoethylenglycol-Substrukturen werden erfindungsgemäß folgende Strukturen verstanden: verzweigte oder unverzweigte, an einem oder mehreren Enden substituierte Ethylenglycol- Homopolymere oder Propylenglycol-Homopolymere, sowie gemischte Ethylenglycol-/Propylenglycol-Copolymere mit durchschnittlichen Molekulargewichten zwischen 100 und 5000 g/mol . Explizit eingeschlossen sind die Strukturelemente l-Ethoxy-2-ethoxy- ethyl, l-Ethoxy-2- (2-ethoxyethoxy) ethyl, l-ethoxy-2- [2- (2- ethoxyethoxy) ethoxy] ethyl und deren höhere Homologe, die einerseits mit 2, 4-Dichlorophenoxyessigsäure oder einer Al- kylspacer-enthaltenden Variante der 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure, andererseits mit den für Struktur (I) definierten markierungsvermittelnden Gruppen (MVG) substituiert sind.

Die Kopplung der hier beanspruchten Verbindungen an Träger ermöglicht ihre Verwendung als Markierung. Die Verknüpfung zwischen Träger und 2, 4-Dichlorphenoxyacetyl-Derivat wird erfindungsgemäß durch die Gruppe MVG vermittelt. Einige Gruppen J_RG_)_ können ohne weitere Aktivierung an Träger gekoppelt werden, bei anderen ist eine Aktivierung in situ notwendig. Car- boxylate müssen in wässrigen Lösungen beispielsweise durch die Zugabe von Aktivierungsreagenzien wie N- (3- Dimethylaminopropyl) -N ¹ -ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDAC) aktiviert werden, um für eine Kopplung an Träger zur Verfügung zu stehen. Aminreaktive Aktivester wie Succinimidyl- oder SuI- fosuccinimidylester reagieren direkt mit aminofunktionalisier- ten Trägern. ähnliches gilt für Pentafluorphenylester sowie für Aldehyde, Aziridine und Epoxide. Aldehydreaktive Reagenzien wie Hydrazide werden nicht in situ aktiviert, ebenso bedürfen Sulfhydryl-reaktive Reagenzien wie Maleinimide, Vinyl- sulfone oder Pyridyldithiole in der Regel keiner in situ Aktivierung.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Kopplung an Trägermoleküle oder Festphasen. Erfindungsgemäß eingeschlossen ist auch die Verwendung der folgenden Verbindungen 6- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) hexansäure und 11- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) undecansäure

zur Kopplung an Trägermoleküle oder Festphasen.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie von 6- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) hexansäure und 11- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) undecansäure und analoger Substanzen mit zusätzlich enthaltenen Oligoethylenglycol- Substrukturen, wie z.B. die in Figur 9 genannten Ethylengly- colderivate, zur Kopplung an Substratmoleküle, insbesondere an Aminosäure (n) , verzweigte oder unverzweigte Oligopeptide, Polypeptide, Proteine, Nukleinbasen, Nukleoside, Nukleotide, O- ligonukleotide, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Glykoproteine oder Lipide. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Aminosäuren, Polypeptide mit 2 bis 50 Aminosäuren, Proteine mit einer Molmasse von mehr als 5 kDa, Nukleinbasen, Nukleotide oder Nukleoside, sowie Derivate davon, wie z.B. ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate oder zyklische Formen, Polynukleotide mit 2-100 Nukleotiden, Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-5000 Nukleotiden, Sacchari- de, Oligosaccharide aus 2-30 Monosacchariden oder Polysaccharide mit einer Molmasse von mehr als 5 kDa.

Die Erfindung betrifft in analoger Weise ferner die Verwendung der folgenden Verbindungen (n = 1, 2, 3,.., 13):

zur Kopplung an Substratmoleküle zum Nachweis dieser Substratmoleküle .

Saccharide mit 1 bis 30 Monosaccharideinheiten können aus folgenden Aldosen und Ketosen aufgebaut sein: D-Erythrose, D- Threose, D-Ribose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Lyxose, D-Allose, D-Altrose, D-Glucose, D-Mannose, D-Gulose, D-Idose, D- Galactose, D-Talose und D-Tetrulose, D-Ribulose, D-Xylulose, D-Psicose, D-Fructose, D-Sorbose, D-Tagatose sowie außerdem aus D-Glucosamin , N-Acetyl-D-Glucosamin (GIcNAc) , D- Galactosamin, N-Acetyl-D-Galactosamin (GaINAc) , D-Mannosamin, N-Acetyl-D-Mannosamin (ManNAc) , L-Daunosamin, N-Acetyl- Daunosamin, L-Fucose, L-Rhamnose, D-Quinovose, D-Olivose, D- Digitoxose, D-Cymarose, D-Glucuronsäure, D-Mannuronsäure, D- Galacturonsäure, L-Iduronsäure, 2-Desoxy-D-Ribose, N-Acetyl- Muraminsäure (MurAc) , 5-N-Acetyl-Neuraminsäure (Neu5Ac) und 3- Desoxy-D-manno-oct-2-ulopyranosonsäure (Kdo) .

Nukleinbasen können Purin- oder Pyrimidinbasen, wie z.B. Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Uracil, Hypoxanthin oder Xanthin und Derivate davon sein.

Bei den Nukleosiden kann es sich um Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in syn- oder anti-Konfiguration, sowie um ihre Mono-, Di-, oder Triphosphate (Nukleotide) oder Derivate davon handeln, wie z.B. zyklische Formen, wie 3' -5'- zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP) , oder ihre Desoxy- o- der Didesoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie Xanthosin, Hypoxanthosin, 6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5- Iod-2' -desoxyuridin, 6-Thioguanin, Azothymidin oder Didesoxyi-

nosin oder ihre Mono-, Di- oder Triphosphate (synthetische Nukleotid-Analoga) .

Bei Lipiden kann es sich um entweder zyklische, azyklische o- der polyzyklische Verbindungen bestehend aus gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren (z.B. Buttersäure, Dodecansäure, oder Alpha-Linolensäure) handeln, oder um Triglyzeride, Wachse, o- der membranbildende Lipide, wie z.B. Phospholipide, Glyce- rophospholipide, Glycolipide oder Sphingolipide (z.B. Phospha- tidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Diphosphatidylglycerol, Dioleoylphospha- tidylethanolamin, Sphingomyelin, Cerebroside, Ganglioside, Ce- ramide oder Sulfatide), oder um Terpenoide, wie z.B. Steroide, Retinoide oder Carotinoide (z.B. Cholesterol, Phytosterol, Er- gosterol, Vitamin D, Digitalis, Strophantin, Testosteron oder Progesteron) .

Erfindungsgemäß bevorzugte Festphasen sind beispielsweise funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen- oder Glasoberflächen, bevorzugterweise Amino-, Thiol-, Aldehyd- oder Epoxyd- funktionalisierte Polystyrol-, Polypropylen oder Glasoberflächen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich außerdem auf Trägermoleküle und/oder Festphasen, an die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt sind bzw. auf die erfindungsgemäßen Verbindungen, an die die genannten Trägermoleküle und/oder Festphasen gekoppelt sind. Bei der Kopplung handelt es sich vorzugsweise um eine chemische Bindung, wobei eine physikalische Bindung jedoch nicht ausgeschlossen ist.

Erfindungsgemäß werden diese Trägermoleküle, an die die erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt sind, für diagnostische oder analytische Assays verwendet. Erfindungsgemäß werden die Festphasen, an die die erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt sind, in analytischen Assays zum Nachweis und in präpara- tiven Ansätzen zur Reinigung von anti-2,4- Dichlorphenoxyacetyl-Antikörpern oder -Antikörperfragmenten verwendet .

Dabei bezeichnet der Begriff „Assay" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein qualitatives oder quantitatives Nachweis-, Mess- oder Untersuchungsverfahren zum Nachweis oder zur Messung von Molekülen (Analyten) . Insbesondere werden hierunter immunologische Assays, festphasengestützte diagnostische Anwendungen, enzymgekoppelte Immunosorbent Assays, Hybridisierungsassays, Polymerasekettenreaktionen und biologische Markierungs- und Aufnahmeexperimente verstanden.

Dabei bezeichnet der Begriff „immunologischer Assay" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung einen Assay, bei dem Antikörper als Liganden zur Bindung oder zum Nachweis eines Analyten eingesetzt werden. Diese immunologischen Assays schließen insbesondere enzymgekoppelte Immunosorbent Assays und Hybridisierungsassays ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Der Begriff „Hybridisierungsassay" schließt Assays ein, bei denen mit erfindungsgemäßen 2, 4-D-Derivaten markierte Sonden in biologischen Standard-Assays verwendet werden, wie z.B. Polymerasekettenreaktionen, Genexpressionsanalysen und Blot- Analysen.

Dabei bezeichnet der Begriff „festphasengestützte diagnostische Anwendung" ein diagnostisches Verfahren, das sich einer festen Phase bedient, auf der für einen Analyten spezifische Fängermoleküle immobilisiert sind. Der Analyt wird selektiv aus der Probensubstanz auf der festen Phase zurückgehalten, ungebundene Komponenten werden durch Waschen der Festphase entfernt, und der Analyt wird anschließend mit markierten Sonden nachgewiesen.

Analyte sind dabei die bei der Analyse zu bestimmenden Komponenten. Analyte können dabei Moleküle sein, wie z.B. in dieser Erfindung definierte Substrat- oder Trägermoleküle, aber auch Aminosäuren, lineare oder verzweigte Oligopeptide, Polypeptide, Proteine, Nukleinbasen, Nukleoside, Nukleotide, Oligo- nukleotide, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Monosaccharide, O- ligosaccharide, Polysaccharide, Glycoproteine oder Lipide. Vorzugsweise umfassen die Oligo- und Polypeptide 2 bis 50 Aminosäuren, die Polynukleotide 2 bis 100 Nukleotide und die Oligosaccharide 2 bis 30 Monosaccharide. Polysaccharide und Proteine haben vorzugsweise eine Molmasse von mehr als 5 kDa . Nukleinsäuren umfassen vorzugsweise 100 bis 5000 Nukleotide. Die Analyten können dabei optional mit zusätzlichen Markermolekülen, wie z.B. Biotin, Enzymen oder chromogenen Substanzen bzw. Farbstoffen ausgestattet sein, die den Nachweis des Analyten über dem Fachmann bekannte Nachweisreaktionen ermöglichen.

Dabei bezeichnet der Begriff „biologisches Markierungsexperiment" ein Experiment, bei dem ein Trägermolekül, an welches eine der erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt ist, zur Markierung von biologischen Proben verwendet wird. Solche bio-

logische Proben können beispielsweise Mikroorganismen, Gewebe, Körperflüssigkeiten, lebende Zellen, Plasmamembranen und intrazelluläre Membranen, künstliche Membranen und Liposomen, Zellkerne, Organellen und subzelluläre Strukturen, Rezeptoren und extrazelluläre Matrix-Komponenten einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein.

Dabei bezeichnet der Begriff „biologisches Aufnahmeexperiment'" ein Experiment, bei dem einem Versuchstier in vivo ein Trägermolekül, an welches eine der erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt ist, beispielsweise durch Verfüttern oder durch Injektion verabreicht wird, wobei der Verbleib des Trägermoleküls in unterschiedlichen Zell- und/oder Gewebetypen nach Tötung des Tieres mit Hilfe des Nachweises der Dichlorphenoxyes- sigsäuremarkierung untersucht wird. Alternativ zu einem in vivo Experiment kann ein entsprechendes markiertes Trägermolekül auf ein Gewebeexplantat oder auf kultivierte Zellen aufgebracht und nach entsprechender Inkubation der Verbleib des Trägermoleküls in unterschiedlichen Zelltypen oder subzellulären Kompartimenten analysiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung sowie zur Identifizierung und Charakterisierung von Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten gegen 2, 4-Dichlorphenoxyacetyl-Verbindungen. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Zwecke der Gewinnung polyklonaler oder monokonaler Antikörper sowie zur Herstellung von "single chain" variablen Antikörperfragmenten (scFv) und Antigen-bindenden Antikörperfragmenten (Fab) eingesetzt. Monoklonale Antikörper werden dabei bevorzugt von Hybridomen produziert, die nach der Methode von Franek et al.

(Franek M, Kolar V, Granatova M, Nevorankova Z (1994) . Monoclonal ELISA for 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid: Characteriza- tion of Antibodies and Assay Optimization. J Agric Food Chem. 42:1369-1374.) erhältlich sind. Antigen-bindende Antikörper- Fragmente, wie monovalentes Fab und divalentes (Fab) ₂ sind von diesen monoklonalen anti-2, 4-D-Antikörpern durch dem Fachmann bekannte Methoden ableitbar.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und Figuren beschrieben, wobei es sich um bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren handelt, die die Erfindung jedoch nicht einschränken.

Beschreibung der Figuren:

Figur 1 : ReaktionsSchema I .

überblick über die in den Beispielen beschriebene Synthese einiger erfindungsgemäßer . 2,4- Dichlorphenoxyessigsäurederivate .

Figur 2 : ReaktionsSchema II .

überblick über die in den Beispielen beschriebene Synthese einiger erfindungsgemäßer 2,4- Dichlorphenoxyessigsäurederivate mit Oligoethylengly- col-Substrukturanteilen.

Figur 3: 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäurederivate in der Peptid- synthese und ihr Nachweis im Immunoverfahren (ELISA) .

Ein 15mer Peptid aus Ovalbumin (NH ₂ - (I) - GSIGAASMEFCFDCFCOOH, oder NH ₂ -GSIGAAS-(II)-MEFCFDCF- COOH, oder NH ₂ -GSIGAASMEFCFDCF-(III)-COOH) wurde im SPOT-Maßstab auf einer Zellulosemembran synthetisiert. Epsilon-amino 2,4- DichlorphenoxyessigSäurederivat-markierte Lysine (Verbindungen (2c), (4b), (4d)) mit unterschiedlichen Abstandhaltern (-, C6 und CIl) wurden amino- (I) oder carboxyterminal (III) aufgebracht oder innerhalb der 15mer Sequenz (II) eingefügt. Zum Nachweis im Immunoverfahren wurden terminal markierte Peptide am jeweils gegenüber liegenden Ende und in der Sequenz markierte Peptide carboxyterminal mit Biotin versehen. Nach Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen wurden die Peptide von der Zellulosemembran abgelöst, gefriergetrocknet und in physiologischer Salzlösung aufgenommen. Seriell verdünnte markierte Peptide wurden auf mit monoklonalem anti-2, 4-D-Antikörper (Klon E2/G2) beschichteten und mit Casein abgesättigten

Mikrotitrationsplatten gebunden. Der Nachweis der gebundenen Peptide erfolgte mit Meerrettichperoxidase gekoppeltem Streptavidin gefolgt von 3, 3', 5,5'- Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxid. Nach Anpassung einer 4-Parameterkurve an die Messwerte als Maß für das Bindungsverhalten der jeweiligen Peptide wurde die maximale optische Dichte (OD) bei 450 nm und der EC ₅₀ -Wert der Verdünnungsreihe bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. * = signifikant höhere OD als nach Markierung an Position I, II, III- oder IIIC6 (P<0,05; One-way ANOVA, Bon- ferroni Post hoc test) .

Figur 4: Reversible Markierung von Peptiden mit 2- (2- (2,4- dichlorophenoxy) -1-hydroxyethyliden) -5,5- dimethylcyclohexan-l,3-dion (2 , 4-D-Dimedon) . Ein

15mer Peptid aus Ovalbumin (NH ₂ -GSIGAASMEFCFDCF-COOH) wurde im SPOT-Maßstab auf einer Zellulosemembran synthetisiert und nachfolgend aminoterminal mit 2,4-D- Dimedon derivatisiert . Nach Abspaltung der Seitenket- tenschutzgruppen wurde die Membran mit 1 % (w/v) Ca- sein in Phosphatpuffer (D-PBS) geblockt. Der Nachweis der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäurederivat-Markierung erfolgte mit biotinyliertem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2) und AlexaFluor680 markiertem Streptavidin. Die Fluoreszenzsignale wurden wie beschrieben quantifiziert. Anschließend wurde das 2, 4-D-Dimedon durch Einwirken von 5 % (v/v) Hydrazinhydrat in D-PBS abgespalten und die Fluoreszenzsignale nach 5, 20, 60 und 100 min Hydrazinexposition erneut bestimmt.

Figur 5: Immunhistologische Verwendung eines mit 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) markierten Substratmoleküls .

A, B: Fixierte und permeabilisierte humane Dickdarmkarzinom (Caco-2) -Zellen wurden mit 10 % (v/v) foeta- lem Rinderserum (FBS) in D-PBS abgesättigt und anschließend mit 15 μM Weizenkeimagglutinin, welches zuvor mit Verbindung (3b) markiert worden war (2,4-D- WGA), in 5 % (v/v) FBS in D-PBS inkubiert. Gebundenes 2,4-D-WGA wurde mit 2,4-D spezifischem monoklonalem Antikörper (Klon E2/G2) und einem Ziege anti-Maus IgG AlexaFluor546-markiertem Zweitantikörper nachgewiesen. Die Bindung von 2,4-D-WGA erfolgte vornehmlich an der Golgimembran (A). Zellkerne wurden mit 4 ',6- Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid (DAPI) gegengefärbt (B) . C, D: Caco-2 Zellen wurden gemäß dem o- ben genannten Protokoll behandelt, allerdings ohne den anti-2,4-D Antikörper einzusetzen Der AlexaFlu- or546-markierte Zweitantikörper erzeugte ein vernachlässigbares Hintergrundsignal (C) , die Zellkerne hingegen konnten erneut mit DAPI visualisiert werden (D). Der Balken repräsentiert 10 μm.

Figur 6: Markierung von DNA-Fragmenten mit 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure-desoxyuridin-triphosphat Derivaten (2 , 4-D-dUTP-Derivaten) durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) .

Eine DNA-Probe, ein Fragment (ca. 630 bp) des murinen Prionprotein-Gens, wurde wie beschrieben durch PCR in Ab- oder Anwesenheit von unterschiedlichen Mengen an 2, 4-D-dUTP-Derivaten amplifiziert . Die Derivate trugen entweder keinen Abstandhalter (2,4-D-dUTP, (5a)), einen aliphatischen C6-Abstandhalter (2, 4-D-Ahx-düTP, (5b) ) , oder einen aliphatischen Cll-Abstandhalter (2, 4-D-Aun-dUTP, (5c) ) zwischen der 2,4-D und dem De-

soxyuridin-triphosphat (dUTP)-Rest. A: 35 ng der gereinigten PCR Produkte wurden auf einem 1 %-igen Aga- rosegel separiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. B: Die separierten DNA-Proben wurden auf eine Nylonmembran transferiert, dort immobilisiert und nach Absät- tigung der Membran mit Hilfe von anti-2,4-D Erstantikörper (Klon E4/C2) und AlexaFluorβθO-markiertem Zweitantikörper wie beschrieben detektiert. Spur 1: Kontroll DNA-Probe, die in Gegenwart von 0,4 nMol unmarkiertem dUTP amplifiziert wurde; Spuren 2-4: DNA- Proben, die in Gegenwart von steigenden Mengen (1, 5, oder 10 μl) der Verbindung (5a) amplifiziert wurden; Spuren 5-6: DNA-Proben, die in Gegenwart von steigenden Mengen (1 oder 5 μl) der Verbindung (5b) amplifiziert wurden; Spur 7: DNA-Probe die in Gegenwart von 1 μl der Verbindung (5c) amplifiziert wurde; bp: Basenpaare; kbp: Kilobasenpaare.

Figur 7: 2 , 4-D-Derivatisierungsgrad von Proteinen nach Markierung mit Verbindung (3b) .

Die Substratmoleküle Insulin (A; 3 primäre Aminofunk- tionen pro Molekül, entspricht 3 reaktiven Positionen) , Ubiquitin (■; 8 reaktive Positionen) oder re- kombinantes PhI p 2-His6 (•; 8 reaktive Positionen) wurden mit ansteigenden molaren überschüssen an Verbindung (3b) derivatisiert . Der mittlere 2,4-D- Derivatisierungsgrad wurde durch MALDI-TOF-MS Analysen bestimmt und in Prozent Derivatisierung der reaktiven Positionen ausgedrückt.

Figur 8: 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure- (2 ,4-D) -markierte Nukle- otidderivate .

überblick über mögliche erfindungsgemäße 2,4-D- markierte Nukleotidderivate, die nach Allgemeiner Arbeitsvorschrift 5 synthetisiert werden können. (A)

Mögliche 2, 4-D-Nukleotidderivate, die über eine endständige Phosphatgruppe mit 2, 4-D-Derivaten markiert sind. (B) Mögliche 2, 4-D-Nukleotidderivate, die über die Kohlenhydrateinheit mit 2, 4-D-Derivaten markiert sind. (C) Mögliche 2, 4-D-Nukleotidderivate, die über die Purin- oder Pyrimidinbasen-Einheit mit 2, 4-D- Derivaten markiert sind.

Figur 9: 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure- (2 , 4-D) -Derivate mit O- ligoethylenglycol-Substrukturanteilen.

überblick über mögliche erfindungsgemäße 2,4-D-

Derivate mit Oligoethylenglycol-Substrukturanteilen, die nach Allgemeiner Arbeitsvorschrift 6 synthetisiert werden können.

Beispiele

Die Beispiele 1 bis 11 erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Beispiele 12 bis 20 ihre Anwendung als Markierungsreagenzien. Die in den Figuren 1 und 2 gezeigten Reaktionsschemata geben einen überblick über die in den Beispielen beschriebene Synthese der 2,4- Dichlorphenoxyessigsäurederivate .

Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 zur Synthese von Alkylaminosäu- rederivaten von 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure

Die entsprechende Alkylaminosäure wurde bei 37 °C in einer ä- quimolaren Menge Tetrabutylammoniumhydroxidlösung (25 % (w/v) in Wasser) gelöst. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der ölige Rückstand über Phosphorpentoxid (P ₂ O ₅ ) getrocknet. 0,05 Mol der erhaltenen Alkylaminosäuresalze wurden mit 0,05 Mol der Verbindung (Ib) in 200 ml absolutem Dioxan gelöst, 0,07 Mol Triethylamin wurden zugesetzt und der Ansatz anschließend über Nacht bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und der Rückstand in 40 ml ammoniakali- schem Wasser gelöst (resultierender pH: 10). Die Emulsion wurde zu 250 ml 10 % (w/v) Zitronensäure in Wasser gegeben (resultierender pH: 5). Es bildete sich ein weißer Niederschlag. Dieser wurde abfiltriert und mit 50 ml 10 % (w/v) Zitronensäure und 40 ml Wasser gewaschen. Die Rohausbeute wurde bestimmt und das Produkt in Dioxan gelöst. Mit einem überschuss an Kationenaustauscherharz (Amberlite IR-120) wurde unter vorsichtigem Schwenken 30 Minuten bei RT entsalzt. Der überstand wurde abgenommen und das Lösemittel eingeengt. Der Rückstand wurde am ölpumpenvakuum getrocknet.

Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 zur Synthese von Succinimidy- lestern von 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) oder 2,4-D- Alkylaminosäure Derivaten

1 mMol der 2,4-D oder des entsprechenden Alkylaminosäurederi- vates der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure wurde in 20 ml absolutem Dioxan gelöst. 1,1 mMol Pyridin wurden zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Zusatz eines zweifachen überschusses an Di- (N-succinimidyl) -carbonat (DSC) initiiert und der Ansatz anschließend 48 Stunden bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml eiskaltem Wasser suspendiert und nachfolgend 60 Minuten bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde isoliert, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen, am ölpumpenvakuum getrocknet und trocken gelagert.

Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 zur Synthese von Sulfo- succinimidyIestern von 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) oder 2 , 4-D-Alkylaminosäure-Derivaten

1 mMol der 2,4-D oder des entsprechenden Alkylaminosäurederi- vates der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure wurde in 3 ml absolutem N, N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Eine äquimolare Menge N- Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz und 1,15 mMol N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Kieselgel 60; Laufmittel Essigsäureethylester >95 %). Nachdem 30 Minuten auf Eis weitergerührt wurde, wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde in vacuo eingeengt und der Rückstand in 25 ml eiskaltem Ethanol suspendiert. Es wurde 40 Minuten bei RT gerührt, das Produkt abfiltriert und mit wenig

Ethanol gewaschen. Das Produkt wurde am ölpumpenvakuum getrocknet und trocken gelagert.

Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 zur Synthese von N-alpha-(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl) - geschützten Aminosäurederivaten, die an den Seitenketten mit 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4- D) oder 2 , 4-D-Derivaten markiert sind

0,3 mMol des entsprechenden aktivierten Carbonsäurederivates der 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure, (Ib), (3a) oder (3c), wurden äquimolar mit N-alpha- ( 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -L-lysin in 6 ml absolutem N, N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. 0,36 mMol Triethylamin wurden hinzugefügt und der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschicht- chromatographisch überprüft (Laufmittel: Cyclohexan: Aceton (1:1), 1 % (v/v) Trifluoressigsäure) . Die Rohprodukte wurden isoliert und anschließend säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Laufmittel: Cyclohexan: Aceton (1:1), 1 % (v/v) Trifluores- sigsäure) gereinigt. Produktfraktionen wurden isoliert, das Lösungsmittel entfernt und die gereinigten Produkte trocken gelagert.

In vergleichbarer Weise können nach entsprechender Modifikation von Allgemeiner Arbeitsvorschrift 4 mit geeigneten Schutzgruppen versehene Aminosäurederivate von Asparaginsäure oder Glutaminsäure, z.B. N-alpha-Fmoc-Asparaginsäure-alpha-t- Butylester oder N-alpha-Fmoc-Glutaminsäure-alpha-t-Butylester, unter Einsatz von (Id) mit 2, 4-D markiert werden. Voraussetzung für die analoge Umsetzung von mit geeigneten Schutzgruppen versehenen Tyrosin-, Serin- oder Threoninderivaten nach einer modifizierten Allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 ist der Einsatz eines alkoholreaktiven Derivates von 2, 4-D nach Formel

- ag -

ii), wie zum Beispiel eines Halogenalkans, das unter basischen Bedingungen unter Verwendung eines inerten Lösungsmittels, wie zum Beispiel Tetrahydrofuran, zur Reaktion gebracht wird. Ein mit geeigneten Schutzgruppen versehenes Cystein-Derivat kann in Analogie zur Allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 mit z.B. Ma- leimid- oder Halogenalkan-funktionalisierten 2,4-D- Markierungsreagenzien ungesetzt werden. Eine Reinigung ist nachfolgend mit chromatographischen Verfahren möglich.

Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 zur Synthese von 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) markierten Nukleotidderivaten

18 μMol der jeweiligen aktivierten Carbonsäurederivate von 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure (Ib, 3b oder 3d) wurden in 360 μl wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. 8,5 μMol 5- (3- Aminoallyl) -2' -desoxyuridin-5' -triphosphat (AA-dUTP) Natriumsalz wurden in 4,25 ml 100 mM Natriumtetraboratpuffer (pH 8,0) gelöst. 750 μl dieser Lösung wurden zu 120 μl der frisch bereiteten Aktivesterlösung der Verbindungen (Ib), (3b) oder (3d) in DMSO gegeben. Die Mischungen wurden in einem überkopfSchüttler für 4,5 Stunden bei RT inkubiert. Die Rohprodukte wurden in Teilmengen per Anionenaustauschchromatographie (MiniQ column, GE Healthcare, Uppsala, SWE) gereinigt und mit einem linearen Gradienten (20 mM - 1 M NH ₄ HCO ₃ -Puffer (pH 7,9)) eluiert (äKTApurifier 10 HPLC; GE Healthcare) . Fraktionen, die das jeweilige Produkt enthielten, wurden isoliert und die Lösungsmittel in vacuo entfernt. Die Produkte wurden trocken bei -20 ⁰ C gelagert.

In vergleichbarer Weise können nach Arbeitsvorschrift 5 Nukleotide, wie Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin oder Guanosin in syn- oder anti-Konfiguration jeweils als Mono-, Di-, oder Triphosphatverbindung oder Derivate davon, wie z.B. zyklische Formen, wie 3' -5' -zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP) , o-

der ihre Desoxy- oder Didesoxy-Formen, oder synthetische Nukleosid-Analoga, wie Xanthosin, Hypoxanthosin, 6- Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, 5-Iod-2' -desoxyuridin, 6- Thioguanin, Azothymidin oder Didesoxyinosin jeweils als Mono-, Di-, oder Triphosphatverbindung (synthetische Nukleotid- Analoga) , mit 2,4-D markiert werden. Voraussetzung für die a- naloge Umsetzung nach Arbeitsvorschrift 5 ist das Vorhandensein von mindestens einer Phosphatgruppe und einer freien reaktiven Gruppe, wie z.B. einer primären Aminfunktion, eines Aldehydes oder eines Thiols. Diese können durch Modifikation der Purin- oder Pyrimidinbase, oder des Kohlenhydrat- oder eines Phosphatrestes bereitgestellt werden. Beispiele für derartige modifizierte Nukleotidderivate, die einen besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellen, sind N6-(4- Amino) butyl-adenosin-5' -triphosphat , N6- ( 6-Amino) hexyl- adenosin-5' -triphosphat, 8- [ (4-Amino) butyl] -amino-adenosin-5' - triphosphat, 8- [ (6-Amino) hexyl] -amino-adenosin-5' -triphosphat, 2' /3' -O- (2-Aminoethyl-carbamoyl) -adenosin als 5'-di- oder triphosphat, Adenosin-5' -[- (4-aminophenyl) ] triphosphat, gamma- [ 6-Aminohexyl] -adenosin-5' -triphosphat, gamma- [ (6-Aminohexyl) - imido] -adenosin-5' -triphosphat, gamma- [ (8-Aminooctyl) -imido] - adenosin-5' -triphosphat, gamma- [6-Aminohexyl] -guanosin-5' - triphosphat, gamma- [ ( 6-Aminohexyl) -imido] -guanosin-5' - triphosphat, gamma- [ (8-Aminooctyl) -imido] -guanosin-5' - triphosphat, 2' /3' -O- (2-Aminoethyl-carbamoyl) -guanosin-5' - triphosphat, 8- [ (6-Amino) hexyl] -amino-guanosin-5' - monophosphat , 8- [ ( 6-Amino) hexyl] -amino-guanosin-5' - triphosphat, gamma- [ ( 6-Aminohexyl) -imido] -7-methyl-guanosin- 5' -triphosphat, 2' /3' -O- (2-Aminoethyl-carbamoyl) -7-methyl- guanosin-5' -di- oder triphosphat, 5- (3-Aminoallyl) -2' -desoxy- uridin-5' -triphosphat, gamma- [ (6-Aminohexyl) -imido] -2' -desoxy- uridin-5' -triphosphat, gamma- [ (8-Aminooctyl) -imido] -2' -desoxy- uridin-5' -triphosphat, 5- (3-Aminoallyl) -uridin-5' -triphosphat, 5- (3-Aminoallyl) -2' -desoxy-uridin-5' - [ (alpha, beta) - methyleno] diphosphat, 5- (3-Aminoallyl) -2' -desoxy-uridin-5' -

[ (alpha, beta) -methyleno] triphosphat, 5-Propargylamino-2' - desoxy-cytidin-5' -triphosphat , oder 5-Propargylamino-cytidin- 5' -triphosphat .

In Analogie zu Arbeitsvorschrift 5 kann das derartig ausgestattete Nukleotidderivat mit einem überschuss an reaktiver 2, 4-D-Markierungssubstanz zur Reaktion gebracht werden. Dazu wird beispielsweise ein mit einer primären Aminofunktion ausgestattetes Nukleotidderivat mit Verbindung (Ib), (3b) oder

(3d) umgesetzt, ein mit einer Aldehydfunktion ausgestattetes Nukleotidderivat mit Verbindung (Id) und ein mit einer Thiol- funktion ausgestattetes Nukleotidderivat mit z.B. Maleimid- oder Halogenalkan-funktionalisierten 2,4-D-

Markierungsreagenzien. Eine Reinigung ist nachfolgend mit ani- onenaustauschchromatographischen Verfahren möglich. Abhängig von ihrer Nettoladung eluieren die Produkte bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen an Puffer, wie dem oben genannten NH ₄ HCO ₃ -PUffer. Figur 8 gibt einen überblick über weitere 2,4-D markierte Nukleotidderivate .

Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 zur Synthese von 2 , 4-

Dichloxphenoxyessigsäure-Derivaten mit Oligoethylenglycol-

Substrukturanteilen oder Aminosäureanteilen.

10 ml einer Lösung aus 1,01 mMol (850 mg) Fmoc-NH-PEGn-COOH in wasserfreiem Dichlormethan (DCM) wurden mit 3,80 mMol (650 μl) Diisopropylethylamin (DIPEA) gemischt, für 15 min über Molekularsieb (3 ä) getrocknet und anschließend zu 1 g 2- Chlortritylchlorid-Harz (Beladungsdichte: 1,1 mMol/g) gegeben. Nach 120 min unter Schutzgasatmosphäre (N ₂ ) wurde das Harz jeweils 3x mit 15 ml DCM/Methanol/DIPEA (17:2:1) und 3x mit 15 ml DCM gewaschen und anschließend über Nacht über Natriumhydroxid getrocknet. Das Harz wurde in drei Teile ä 500 mg geteilt und je ein Teil wurde für die Synthese der Verbindungen (6a), (6b) und (6c) verwendet.

Zur Synthese der Verbindungen (6b) und (6c) wurde jeweils eine der Harz-Teilmengen für 30 min in je 10 ml DCM gequollen, danach 2x für 10 min mit 10 ml 20 % (v/v) Piperidin/N, N- Dimethylformamid (DMF) inkubiert und anschließend jeweils 5x mit 10 ml DMF gewaschen. 3,0 mMol der jeweiligen Fmoc- Aminoalkansäure und 3,0 mMol (1,241 g) an O-(lH-6- Chlorbenzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-Tetramethyluronium-hexafIu- orphosphat (HCTU) wurden in 5 ml DMF gelöst, 5,85 mMol (1 ml) DIPEA wurden hinzugefügt und die Lösung zu den jeweiligen Harz-Teilmengen gegeben. Nach 120 min unter Schutzgasatmosphäre (N ₂ ) wurden die Harz-Teilmengen 3x mit jeweils 10 ml DMF gewaschen, anschließend 2x für 10 min mit 10 ml 20 % Piperi- din/DMF behandelt und jeweils 5x mit je 10 ml DMF gewaschen. Die Aminoalkansäure derivatisierten Harzteilmengen wurden in einem zweiten Syntheseschritt zu den Verbindungen (6b) bzw. (6c) umgesetzt. Zur Synthese der Verbindung (6a) wurde in diesem Syntheseschritt direkt die nicht Aminoalkansäure- derivatisierte Harz-Teilmenge eingesetzt. 3,0 mMol (663 mg) 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure und 3,0 mMol (1,241 g) HCTU wurden in 5 ml DMF gelöst, 5,85 mMol (1 ml) DIPEA wurden hinzugefügt und die resultierenden Lösungen wurden zu den Harz- Teilmengen gegeben. Nach 120 min unter Schutzgasatmosphäre (N ₂ ) wurden die Harz-Teilmengen 3x mit jeweils 10 ml DMF und 3x mit jeweils 10 ml DCM gewaschen. Die Produkte wurden durch 2malige Behandlung der Harz-Teilmengen mit 15 ml einer 10%-igen Trifluoressigsäurelösung (TFA) in DCM abgespalten. Die Harz- Teilmengen wurden abschließend 3x mit je 10 ml DCM gewaschen. Abspalt- und Waschlösungen wurden vereinigt und die Lösemittel in vacuo entfernt. Die Rückstände wurden in je 2 ml Wasser aufgenommen und für 5 min bei 16000 g zentrifugiert . Die überstände wurden isoliert und gefriergetrocknet. Die öligen Rückstände wurden ohne weitere Reinigung für die Synthese der Suc- cinimidyl-Ester (7a), (7b) und (7c) verwendet.

In vergleichbarer Weise können nach Allgemeiner Arbeitsvorschrift 6 andere Oligoethylenglycol-Substrukturen enthaltende 2, 4-D-Derivate synthetisiert werden. Derartige Oligoethy- lenglycol-Substrukturen können erfindungsgemäß verzweigte oder unverzweigte, an einem oder mehreren Enden substituierte Ethy- lenglycol-Homopolymere oder Propylenglycol-Homopolymere, sowie gemischte Ethylenglycol-/Propylenglycol-Copolymere mit durchschnittlichen Molekulargewichten zwischen 100 und 5000 g/mol sein. Explizit eingeschlossen sind die Strukturelemente 1- Ethoxy-2-ethoxy-ethyl, l-Ethoxy-2- (2-ethoxyethoxy) ethyl, 1- ethoxy-2- [2- (2-ethoxyethoxy) ethoxy] ethyl und deren höhere Homologe. Voraussetzung für die analoge Umsetzung nach Arbeitsvorschrift 6 ist das Vorhandensein einer Fluorenylmethoxycar- bonyl- (Fmoc) oder ( 1, 1, -dioxobenzo [b] thiophen-2-yl- methyl) oxycarbonyl- (Bsmoc) -geschützten Aminofunktion, sowie das einer freien Säure-, Hydroxy-, Amin-, Imidazol-, Phenol-, oder Thiolfunktion. Beispiele für derartige Oligoethylengly- col-Substruktur enthaltende Verbindungen sind Fmoc-NH-PEG ₂ -COOH (MW 559), Fmoc-NH-PEGii-propionsäure (MW 840), oder Fmoc-NH- PEG ₂₇ -propionsäure (MW 1545) .

In Analogie zu Allgemeiner Arbeitsvorschrift 6 kann eine derartig ausgestattete, Oligoethylenglycol-Substrukturen enthaltende Verbindung im ersten Syntheseschritt mit 2- Chlorotritylchlorid-Harz umgesetzt werden. Nach terminaler Entschützung kann das so modifizierte Harz entweder direkt mit freier 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure, oder zunächst mit einer Fmoc- oder Bsmoc-geschützten Aminoalkansäure und in einem weiteren Syntheseschritt mit 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure wie beschrieben umgesetzt und das Produkt anschließend vom Harz abgespalten werden. Figur 9 zeigt weitere 2,4-D Derivate, die Oligoethylenglycol-Substrukturen enthalten.

In vergleichbarer Weise können analog zu Allgemeiner Arbeitsvorschrift 6 auch Aminosäuren enthaltende 2, 4-D-Derivate synthetisiert werden. Voraussetzung ist dabei, dass die Aminosäu-

ren N-terminal Fmoc- oder Bsmoc-geschützt vorliegen und gegebenenfalls die Seitenketten orthogonale Schutzgruppen tragen. Als orthogonale Schutzgruppen kommen z.B. S-Acetamidomethyl- (Acm) , t-Butyloxycarbonyl- (Boc) , t-Butyl- (tBu) , Trityl- (Trt) , 2,2,4,6, 7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl- (Pbf), Tosyl- (Ts), Benzyloxycarbonyl- (CBz) oder beta-2- Adamantyl- (Ada) in Frage. Als Aminosäuren kommen alle natürlichen Aminosäuren in Frage, vorzugsweise Alanin, beta-Alanin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin, Citrullin, Cystein, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Homoserin, Hydroxypro- lin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Sarcosin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, und Valin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D- Konfigurationen, sowie auch nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, wie z.B. 2-Aminoethylglycin, Phenylglycin, Penizilla- min, Norvalin, Norleucin, Alpha-Aminobuttersäure, Diaminopro- pionsäure, Cyclohexylalanin, Butylglycin, Aminoisobuttersäure, Thienylalanin, Statin, sowohl in ihren L- als auch in ihren D- Konfigurationen, sowie Amino-Oligoethylenglycol-Carbonsäuren oder Amino-Oligopropylenglycol-Carbonsäuren. Beispiele für derartige Aminosäurederivate sind Fmoc-Alanin-OH, Fmoc- Arginin (Pbf) -OH, Fmoc-Asparagin (Trt) -OH, Fmoc- Asparaginsäure (tBu) -OH, Fmoc-Cystein (Trt ) -OH, Fmoc- Glutamin(Trt) -OH, Fmoc-Glutaminsäure (tBu) -OH, Fmoc-Glycin-OH, Fmoc-Histidin (Trt) -OH, Fmoc-Isoleucin-OH, Fmoc-Leucin-OH, Fmoc-Lysin (Boc) -OH, Fmoc-Methionin-OH, Fmoc-Phenylalanin-OH, Fmoc-Prolin-OH, Fmoc-Serin (tBu) -OH, Fmoc-Threonin (tBu) -OH, Fmoc-Tryptophan (Boc) -OH, Fmoc-Tyrosin (tBu) -OH, oder Fmoc- Valin-0H.

In Analogie zu Allgemeiner Arbeitsvorschrift 6 kann das derartig ausgestattete Aminosäurederivat im ersten Syntheseschritt

mit 2-Chlorotritylchlorid-Harz umgesetzt werden. Nach terminaler Entschützung kann das so modifizierte Harz entweder direkt mit freier 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure, oder zunächst mit einer Fmoc- oder Bsmoc-geschützten Aminoalkansäure und in einem weiteren Syntheseschritt mit 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure wie beschrieben umgesetzt und das Produkt anschließend vom Harz abgespalten werden. Dabei darf der Volumenanteil an TFA maximal 10 % betragen.

Beispiel 1

Herstellung von 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure-N- Hydroxysuccinimidyl-Ester (Ib)

0,08 Mol 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure (17,6 g) und 0,08 Mol N- Hydroxysuccinimid (9,2 g) gelöst in 180 ml absolutem Dioxan wurden durch Zusatz einer äquimolaren Menge an N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,08 Mol; 16,5 g) zur Reaktion gebracht. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und nach Waschen mit wenig absolutem Dioxan verworfen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und eingeengt. Der Rückstand wurde mit 60 ml Methanol : Ethanol (1:1) und anschließend mit Diethylether gewaschen, abfiltriert und am ölpumpenvakuum getrocknet. Das Produkt wurde trocken gelagert. Die Ausbeute betrug 73 % (R _f (Kieselgel/Ethylacetat ) = 0,86) .

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 2.86 (s, 4H), 5.02 (s, 2H), 6.91 (d, IH), 7.22 (dd, IH), 7.40 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 25.6, 64.5, 115.5, 124.6, 127.8, 128.1, 130.5, 151.8, 164.0, 168.5

Beispiel 2

Herstellung von 6- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) acetylamido) -hexyl amin (Id)

1 mMol der Verbindung (Ib) (301 mg) wurde über Nacht bei RT mit 1 mMol (253 mg) N-Boc-1, 6-Diaminohexanhydrochlorid und 1,2 mMol (206 μl) Diisopropylethylamin (DIPEA) in 15 ml wasser-

freiem Dioxan/N,N-Dimethylformamid (DMF) (1:2) inkubiert. Der Reaktionsumsatz wurde dünnschichtchromatographisch kontrolliert (Toluol: Aceton (2:1), R _f = 0,44). Nach 22 h wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Das Rohprodukt wurde für 30 min bei RT mit 30 ml eiskaltem Wasser gerührt und anschließend durch Filtration isoliert. Das Zwischenprodukt wurde am ölpum- penvakuum getrocknet und trocken bei RT gelagert (Ausbeute 78 %). Zur Entschützung wurde das N-Boc-geschützte Zwischenprodukt in 7 ml Dioxan/Trifluoressigsäure (TFA) (1:1) aufgenommen und für 180 min bei RT inkubiert. Der Fortschritt der Entschützung wurde dünnschichtchromatographisch kontrolliert. Nach 180 min wurden weitere 3,5 ml TFA hinzugefügt und die Lösung für weitere 210 min bei RT gerührt. Nach vollständiger Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde mit Dioxan und eiskaltem Toluol gewaschen und durch Filtration isoliert. Verbleibendes Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und die Verbindung (Id) wurde trocken bei 4 ⁰ C gelagert. Ausbeute (über 2 Schritte) 59 %.

¹ H-NMR (360 MHz, DMSO) δ 1.27 (m, 4H), 1.42 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 3.12 (q, 2H), 4.60 (s, 2H), 7.04 (d, IH), 7.36 (dd, IH), 7.59 (d, IH).

¹³ C-NMR (90,6 MHz, DMSO) δ 25.3, 25.7, 26.7, 26.8, 28.9, 38.0, 38.1, 67.9, 115.3, 122.4, 125.0, 127.9, 129.3, 152.4, 166.6.

MS-ESI (m/z): 318,091 [M] (berechnet für Ci ₄ Cl ₂ H ₂₀ N ₂ O ₂ : 318,091).

Beispiel 3

Herstellung von 6- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) hexansäure (2a)

0,05 Mol (18,67 g) 6-Aminohexansäure-tetrabutylammoniumsalz wurden mit 0,05 Mol (15,05 g) (Ib) in 200 ml absolutem Dioxan und 0,07 Mol (10 ml) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt. Die Rohausbeute wurde bestimmt (90 %) und die Verbindung aus Toluol rekristallisiert (Reinheit (RP-HPLC, Jupiter C18) >98 %) .

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.41 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 2.36 (t, 2H), 3.38 (q, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.84 (d, IH), 7.23 (dd, IH), 7.41 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 24.2, 26.2, 29.1, 33.7, 38.9, 68.3, 114.7, 123.7, 127.5, 128.1, 130.2, 151.6, 167.3, 178.4

MS-ESI m/z: 333,053 [M] (berechnet für Ci ₄ Cl ₂ H ₁₇ NO ₄ : 333,053)

Herstellung von 11- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) undecansäure (2b)

0,05 Mol (22,17 g) 11-Aminoundecansäure-tetrabutylammoniumsalz wurden mit 0,05 Mol der Verbindung (Ib) (6,34 g) in 200 ml absolutem Dioxan und 0,07 Mol (10 ml) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 1 umgesetzt. Die Rohausbeute wurde bestimmt (81 %) und die Verbindung mit Toluol : Aceton (1:1) als Laufmittel säulenchromatographisch (Kieselgel 60) gereinigt (Reinheit (RP-HPLC, Jupiter C18) >98 %).

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.31 (m, 12H) , 1.56 (m, 2H) , 1.63 (m, 2H) , 2.34 (t, 2H) , 3.36 (q, 2H) , 4.52 (s, 2H) , 6.84 (d, IH) , 7.22 (dd, IH) , 7.41 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 24.7, 26.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 33.9, 39.1, 68.3, 114.7, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 167.2, 178.8

MS-ESI m/z: 403,130 [M] (berechnet für Ci ₉ Cl ₂ H ₂₇ NO ₄ : 403,132)

Beispiel 4

Herstellung von 6- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) hexansäure-N-hydroxysuccinimid (3a)

1 mMol (0,33 g) 6- (2- (2, 4-Dichlorphenoxy) acetylamino) hexansäure wurde mit 2 mMol Di- (N-succinimidyl) -carbonat (DSC) (0,51 g) in 20 ml absolutem Dioxan und 1,1 mMol (82 μl) Pyri- din nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 2 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 90%.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.48 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 2.62 (t, 2H), 2.81 (s, 4H), 3.39 (q, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.85 (d, IH), 7.24 (dd, IH), 7.41 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 24.2, 25.6, 25.9, 28.9, 30.8, 38.8, 68.3, 114.7, 123.8, 127.4, 128.0, 130.2, 151.7, 167.1, 168.4, 169.1

MS-ESI m/z: 430,070 [M] (berechnet für Ci ₈ Cl ₂ H ₂₀ N ₂ O ₆ : 430,070)

Herstellung von 11- (2- (2,4-

Dichlorphenoxy) acetylamino) undecansäure-N-hydroxysuccinimid

(3c)

1 mMol (0,40 g) 11- (2- (2, 4-Dichlorphenoxy) acetylamino) - undecansäure wurde mit 2 mMol Di- (N-succinimidyl) -carbonat (DSC) (0,51 g) in 20 ml absolutem Dioxan und 1,1 mMol (82 μl) Pyridin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 2 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 90%.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.29 (m, 10H), 1.40 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 2.60 (t, 2H), 2.83 (s, 4H), 3.36 (q, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.84 (d, IH), 7.22 (dd, IH), 7.41 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 24.5, 25.6, 26.8, 28.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 30.9, 39.1, 68.3, 114.6, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 167.0, 168.6, 169.1

MS-ESI m/z: 500,147 [M] (berechnet für C ₂₃ Cl ₂ H ₃₀ N ₂ O ₆ : 500,148)

Beispiel 5

Herstellung von 2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) essigsäure-hydrazid (Ia)

50 mMol (11 g) 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden in 25fachem molarem überschuss an Thionylchlorid (90 ml) unter zweistündigem Refluxieren zum Säurechlorid umgesetzt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde abdestilliert. Das 2, 4-Dichlorphenoxy- acetylchlorid wurde in 50 ml absolutem Dioxan aufgenommen und

äquimolar mit Hydrazin-Monohydrat über Nacht bei RT umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde eingeengt. Die Ausbeute betrug >90 %.

¹ H-NMR (360 MHz, DMSO/CDC1 ₃ (1:1)) δ 4.60 (d, 2H), 7.01 (d, IH), 7.23 (dd, IH), 7.39 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, DMSO/CDCI ₃ (1:1)) δ 66.2, 113.8, 121.9, 124.7, 126.3, 128.1, 151.0, 165.0

MS-ESI m/z: 233,996 [M] (berechnet für C ₈ Cl ₂ H ₈ N ₂ O ₂ : 233,996)

Herstellung von 6- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) - acetylamino) hexansäure-hydrazid (4a)

0,5 mMol (215 mg) der Verbindung (3a) wurden in 10 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren zu einer Hydrazin-Monohydratlösung (5 mMol in 60 ml Dioxan) getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT weiter gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wurde 10 Minuten in 30 ml kaltem Wasser gerührt, der sich bildende Niederschlag wurde abfiltriert und am ölpumpenvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 66 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.36 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 2.24, 2.55 (t, 2H), 3.35 (m, 2H), 4.51 (d, 2H), 6.86 (m, IH), 7.21 (m, IH), 7.38, 7.41 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 24.7, 24.9, 26.0, 26.2, 29.0, 29.1, 33.9, 38.8, 67.1, 68.3, 114.7, 114.9, 123.7, 127.4, 128.1, 130.1, 130.2, 151.6, 167.5, 173.3

MS-ESI m/z: 347,079 [M] (berechnet für Ci ₄ Cl ₂ Hi ₉ N ₃ O ₃ : 347,080)

Herstellung von 11- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamino) undecansäure-hydrazid (4c)

0,5 mMol (250 mg) der Verbindung (3c) wurden in 10 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren zu einer Hydrazin-Monohydratlösung (5 mMol in 60 ml Dioxan) getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, der Niederschlag mit eiskaltem Wasser gewaschen und am ölpumpenvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 90 %.

¹ H-NMR (360 MHz, DMSO) δ 1.24 (m, 12H), 1.43 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 2.01, 2,20 (t, 2H), 3.13 (q, 2H), 4.61 (s, 2H), 7.06 (d, IH), 7.37 (dd, IH), 7.60 (d, IH).

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 24.4, 25.1, 26.2, 28.4, 28.5, 28.6, 28.7, 28.8, 28.9, 33.3, 33.6, 38.1, 38.2, 66.2, 67.9, 115.3, 122.4, 125.0, 127.9, 129.2, 152.4, 166.4, 166.5, 171.5

MS-ESI m/z: 417,157 [M] (berechnet für Ci ₉ Cl ₂ H ₂₉ N ₃ O ₃ : 417,159)

Beispiel 6

Herstellung von 6- (2- (2,4-

Dichlorphenoxy) acetylamino) hexansäure-N- hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (3b)

1 mMol (333 mg) der Verbindung (2a) wurde mit 1 mMol (218 mg) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz in 3 ml absolutem N, N- Dimethylformamid (DMF) durch Zusatz von 1,15 mMol (237 mg) N, N ' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 53 %.

¹ H-NMR (360 MHz, DMSO) δ 1.34 (m, 2H), 1.46 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 2.64 (t, 2H), 2,86 (dd, IH), 3.12 (q, 2H), 3.16 (m, IH), 3.94 (m, IH), 4.60 (s, 2H), 7.04 (d, IH), 7.36 (dd, IH), 7.58 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, DMSO) δ 23.8, 25.2, 28.3, 30.0, 30.8, 37.8, 38.0, 56.2, 67.8, 115.3, 122.5, 124.9, 127.9, 129.2, 152.5, 165.3, 166.5, 166.6, 168.7

MS-ESI m/z: 510,026 [M] (berechnet für Ci ₈ Cl ₂ H ₂₀ N ₂ O ₉ S: 510,027)

Herstellung von 11- (2- (2,4-

Dichlorphenoxy) acetylamino) undecansäure-N- hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (3d)

1 mMol (404 mg) der Verbindung (2b) wurde mit 1 mMol (218 mg) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz in 3 ml absolutem N, N- Dimethylformamid (DMF) durch Zusatz von 1,15 mMol (237 mg)

N, N ' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 3 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 76 %.

¹ H-NMR (360 MHz, DMSO) δ 1.24 (m, 10H) , 1.34 (m, 2H) , 1.41 (m,

2H) , 1.61 (m, 2H) , 2.63 (t, 2H) , 2.85 (dd, IH) , 3.11 (q, 2H) ,

3.15 (m, IH) , 3.93 (m, IH) , 4.60 (s, 2H) , 7.04 (d, IH) , 7.35 (dd, IH) , 7.58 (d, IH)

¹³ C-NMR (90, 6 MHz, DMSO) δ 24.2, 26.2, 27.9, 28.4, 28.6, 28.7, 28.8, 30.1, 30.8, 38.1, 56.2, 67.8, 115.3, 122.4, 124.9, 127.9, 129.2, 152.4, 165.2, 166.4, 166.5, 168.7

MS-ESI m/z: 580,103 [M] (berechnet für C ₂₃ Cl ₂ H ₃₀ N ₂ O ₉ S: 580,105)

Beispiel 7

Herstellung von 6- (2- (2 ,4-Dichlorphenoxy) acetylamino) -2- (9H- fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino) hexansäυre (2c)

0,3 mMol (100 mg) der Verbindung (Ib) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha- ( 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -L-lysin in 6 ml absolutem N, N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 76 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.35 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.57 (m,

2H), 3.12 (q, 2H), 3.91 (m, IH), 4.25 (m, 3H), 4.58 (m, 2H),

7.05 (m, IH), 7.36 (m, 4H), 7.66 (m, 2H), 7.88 (m, 5H), 7.95 (m, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 22.9, 28.4, 30.3, 38.1, 46.6, 53.6, 65.5, 67.8, 115.3, 120.0, 122.5, 125.0, 125.1, 125.2, 126.9, 127.5, 127.9, 128.5, 129.2, 131.4, 140.6, 143.7, 152.4, 156.1, 166.5, 166.8, 172.6, 173.8

MS-ESI m/z: 570,131 [M] (berechnet für C ₂₉ Cl ₂ H ₂₈ N ₂ O ₆ : 570,132)

Herstellung von 6- (6- (2- (2 ,4-

Dichlorphenoxy) acetylamino)hexanoylam±no) -2- (9H-fluoren-9-yl- methoxycarbonylamino) hexansäure (4b)

0,3 mMol (130 mg) der Verbindung (3a) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha- ( 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -L-lysin in 6 ml absolutem N, N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 72 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.40 (m, 8H), 1.65 (m, 2H), 2.03 (m,

4H), 3.11 (m, 4H), 3.89 (m, IH), 4.23 (m, 3H), 4.59 (s, 2H),

7.05 (d, IH), 7.32 (m, 3H), 7.41 (t, 2H), 7.53 (d, IH), 7.75 (d, 2H), 7.85 (d, 2H)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 23.1, 25.0, 26.0, 28.7, 28.8, 29.5, 30.5, 35.3, 35.7, 38.2, 38.3, 46.7, 53.8, 65.6, 67.9, 113.0, 115.4, 120.0, 122.6, 125.1, 125.2, 125.3, 127.0, 127.6, 128.0, 129.3, 140.7, 143.8, 152.5, 156.2, 162.3, 166.6, 171.9, 173.9

MS-ESI m/z: 683,202 [M] (berechnet für C ₃₅ Cl ₂ H ₃₉ N ₃ O ₇ : 683,217)

Herstellung von 6- (11- (2- (2 ,4-

Dichlorphenoxy) acetylamino) undecanoylamino) -2- (9H-fluoren-9- yl-methoxycarbonylamino) hexansäure (4d)

0,3 mMol (150 mg) der Verbindung (3c) wurden zusammen mit 0,3 mMol (110 mg) N-alpha- ( 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -L-lysin in 6 ml absolutem N, N-Dimethylformamid (DMF) und 0,36 mMol (50 μl) Triethylamin nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 4 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 61 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.18 (m, 12H), 1.41 (m, 8H), 1.62 (m, 2H), 2.02 (t, 2H), 3.02 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.87 (m, IH), 4.26 (m, 3H), 4.58 (s, 2H), 7.05 (d, IH), 7.32 (m, 3H), 7.41 (t, 2H), 7.58 (d, IH), 7.71 (d, 2H), 7.87 (d, 2H)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 23.1, 25.2, 25.3, 26.3, 28.7, 28.8, 28.9, 29.0, 30.4, 30.7, 35.4, 35.5, 38.0, 38.1, 38.3, 46.7, 53.8, 65.6, 68.0, 115.4, 120.1, 122.6, 125.1, 125.3, 125.3,

127.1, 127.6, 128.0, 140.7, 143.8, 143.9, 152.5, 156.2, 157.9,

158.2, 166.5, 166.6, 171.9, 172.0, 172.7, 173.9

MS-ESI m/z: 753,301 [M] (berechnet für C ₄₀ Cl ₂ H ₄₉ N ₃ O ₇ : 753,295)

Beispiel 8

Herstellung von 2- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) -1-hydroxyethyliden) - 5 , 5-dimethylcyclohexan-l , 3-dion (Ic)

15 mMol (3,3 g) 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure wurden in 150 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. 16,5 mMol (2,3 g) 5,5-

Dimethyl-1, 3-cyclohexandion (Dimedon) , 15 mMol (3,1 g) N, N'- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 15 mMol (1,8 g) 4- Dimethylaminopyridin wurden hinzugefügt. Der Ansatz wurde 48 Stunden bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Der Syntheserückstand wurde mit 50 ml Essigsäureethylester extrahiert und filtriert. Das Filtrat wurde mit 1 M Kaliumhydrogensulfat- und anschließend mit 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand mit Di- ethylether gewaschen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und am ölpumpenvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 19 % (Smp. 170-175 ⁰ C, R _f (Kieselgel, Essigsäureethylester) = 0,8). Erneutes Extrahieren des Syntheserückstandes mit Essigsäureethylester erhöhte die Ausbeute um 5-10 %.

¹ H-NMR (360 MHz, DMSO) δ 0.95 (s, 6H), 2.11 (s, 4H), 5.06 (s, 2H), 6.69 (d, IH), 7.24 (d, IH), 7.47 (d, IH)

¹³ C-NMR (90,6 MHz, DMSO) δ 28.2, 29.8, 52.7, 74.2, 112.4, 114.9, 121.6, 123.2, 127.6, 128.7, 153.6, 189.3, 194.2

MS-ESI m/z: 342,042 [M] (berechnet für Ci ₆ Cl ₂ Hi ₆ O ₄ : 342,043)

Beispiel 9

Herstellung von 2 , 4-Dichlorphenoxyacetyl- [5- (3-amidoallyl) -2 ' - desoxyuridin-5' -triphosphat] (5a).

6 μMol (1,8 mg) der Verbindung (Ib) wurden mit 1,5 μMol (0,9 mg) 5- (3-Aminoallyl) -2' -desoxyuridin-5' -triphosphat Natriumsalz in 870 μl 100 mM Natriumtetraboratpuffer (pH 8,0) in Gegenwart von 14 % (v/v) wasserfreiem Dimethylsulfoxid nach der

allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 umgesetzt. Das Produkt (5a) eluierte unter den Versuchsbedingungen von der Anione- naustauschchromatographie-Säule zwischen 54,5 ± 2,9 % und 71,8 ± 2,6 % in 1 M NH ₄ HCO ₃ Puffer (pH 7,9).

¹ H-NMR (360 MHz, D ₂ O) δ 2.35 (m, 2H), 3.93 (m, 2H), 4.17 (m, 3H), 4.61 (m, 2H), 6.18 (m, IH), 6.25 (m, IH), 6.33 (m, IH), 6.95 (m, IH), 7.23 (m, IH), 7.46 (m, IH), 7.81 (s, IH).

MS-ESI m/ z : 724 , 970 [M] (berechnet für C ₂₀ Cl ₂ H ₂₄ N ₃ Oi ₆ P ₃ : 724 , 975 ) .

Herstellung von 6- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) acetylamido) - hexanoyl- [5- (3-amidoallyl) -2 ' -desoxvuridin-5' -triphosphat]

(5b) .

6 μMol (3,2 mg) der Verbindung (3b) wurden mit 1,5 μMol (0,9 mg) 5- (3-Aminoallyl) -2' -desoxyuridin-5' -triphosphat Natriumsalz in 870 μl 100 mM Natriumtetraboratpuffer (pH 8,0) in Gegenwart von 14 % (v/v) wasserfreiem Dimethylsulfoxid nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 umgesetzt. Das Produkt (5b) eluierte unter den Versuchsbedingungen von der Anione- naustauschchromatographie-Säule zwischen 46,0 ± 2,5 % und 65,5 ± 3,0 % in 1 M NH ₄ HCO ₃ Puffer (pH 7,9).

¹ H-NMR (360 MHz, D ₂ O) δ 1.26 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 2.25 (m, 4H), 3.27 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 4.13 (m, 3H), 4.55 (m, 2H), 6.08 (m, 2H), 6.21 (m, IH), 6.79 (m, IH), 7.18 (m, IH), 7.85 (m, IH), 7.68 (s, IH).

MS-ESI m/z : 837 , 050 [M] (berechnet für C ₂₆ Cl ₂ H ₃₄ N ₄ Oi ₇ P ₃ : 837 , 050 ) .

Herstellung von 11- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) acetylamido) - undecanoyl- [5- (3-amidoallyl) -2' -desoxyuridin-5' -triphosphat]

(5c) .

3 μMol (1,8 mg) der Verbindung (3d) wurden mit 0,75 μMol (0,45 mg) 5- (3-Aminoallyl) -2' -desoxyuridin-5' -triphosphat Natriumsalz (AA-dUTP) nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 umgesetzt. In Abweichung zur allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 wurden 3 μMol der Verbindung (3d) in 60 μl wasserfreiem Dimethyl- sulfoxid (DMSO) gelöst und zu einer Lösung aus 0,75 μMol AA- dUTP in 375 μl 100 inM Natriumtetraboratpuffer (pH 8,0), 2,24 ml Wasser und 367 μl wasserfreiem DMSO gegeben. Nach 4,5- stündiger Inkubation bei RT wurden ca. 95% des Lösungsmittels in vacuo entfernt und der Rückstand in 300 μl Wasser zur weiteren Reinigung per Anionenaustauschchromatographie gelöst. Die Verbindung (5c) eluierte unter den Versuchsbedingungen von der Anionenaustauschchromatographie-Säule zwischen 71,0 ± 2,6 % und 97,9 ± 2,8 % in 1 M NH ₄ HCO ₃ Puffer (pH 7,9).

MS-ESI m/z: 908,134 [M] (berechnet für C _3I Cl ₂ H ₄₅ N ₄ Oi ₇ P ₃ : 908,137) .

Beispiel 10

Herstellung von 6- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) acetylamido) -PEGn-

Carbonsäure (6a)

500 mg 2-Chlortrityl- (Fmoc-NH-PEGu) Harz wurden mit 3,0 mMol (663 mg) 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 6 umgesetzt. Ein gelbes öliges Produkt wurde isoliert. Ausbeute 58 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 2.61 (t, 2H), 3.57 (t, 2H), 3.64 (m, 46H), 3.78 (t, 2H), 4.55 (s, 2H), 6.86 (d, IH), 7.22 (dd, IH), 7.41 (d, IH).

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 34.9, 38.9, 66.6, 68.3, 69.5, 70.2, 70.4, 70.5, 70.6, 70.7, 77.2, 114.8, 123.8, 127.4, 128.0, 130.2, 151.7, 167.5, 173.4.

MS-ESI m/z: 933,305 [M+TFA] (berechnet für C ₃₇ Cl ₂ H ₆₀ F ₃ NO ₁₈ : 933,314) .

Herstellung von (6- (2- (2,4- Dichlorphenoxy) acetylamido) hexylamido) -PEGn-Carbonsäure (6b)

500 mg 2-Chlortrityl- (Fmoc-NH-PEGn) Harz wurden mit 3,0 mMol (1,06 g) Fmoc-Aminohexansäure im ersten Syntheseschritt und 3,0 mMol (663 mg) 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure im zweiten Syntheseschritt nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 6 umgesetzt. Ein gelbes öliges Produkt wurde isoliert. Ausbeute 58

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.39 (m, 2H), 1.60 (quin, 2H), 1.69 (quin, 2H), 2.29 (t, 2H), 2.61 (t, 2H), 3.37 (q, 2H), 3.46 (m, 2H), 3.58 (t, 2H), 3.65 (m, 44H), 3.78 (t, 2H), 4.54 (s, 2H), 6.86 (d, IH), 7.23 (dd, IH), 7.41 (d, IH).

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 25.3, 26.3, 29.0, 34.9, 35.8, 39.0, 39.7, 66.6, 68.2, 69.5, 70.2, 70.3, 70.4, 70.5, 70.6, 77.0, 114.9, 123.8, 127.5, 128.1, 130.2, 151.6, 167.7, 173.4, 174.4.

MS-ESI m/z: 932,404 [M] (berechnet für C _4I Cl ₂ H ₇₀ N ₂ Oi ₇ : 932,405) .

Herstellung von (6- (2- (2,4-

Dichlorphenoxy) acetylamido) undecanoylamido) -PEGn-Carbonsäure

(6c)

500 mg an 2-Chlortrityl- (Fmoc-NH-PEGn) Harz wurden mit 3,0 mMol (1,27 g) Fmoc-Aminoundecansäure im ersten Syntheseschritt und 3,0 mMol (663 mg) 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure im zweiten Syntheseschritt nach der allgemeinen Arbeitsvorschrift 6 umgesetzt. Ein gelbes öliges Produkt wurde isoliert. Ausbeute 58

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.29 (m, 12H), 1.59 (m, 4H), 2.24 (t, 2H), 2.61 (t, 2H), 3.36 (q, 2H), 3.47 (m, 2H), 3.57 (t, 2H), 3.65 (m, 44H), 3.77 (t, 2H), 4.54 (s, 2H), 6.85 (d, IH), 7.23 (dd, IH) , 7.42 (d, IH) .

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 25.4, 26.4, 28.7, 28.8, 28.9, 29.0, 34.5, 35.9, 38.9, 39.2, 66.2, 67.8, 69.3, 69.8, 69.9, 70.0, 70.2, 76.9, 114.4, 123.4, 127.1, 127.7, 129.8, 151.2, 167.2, 173.2, 174.6.

MS-ESI m/z: 1002,487 [M] (berechnet für C ₄₆ Cl ₂ H ₈₀ N ₂ Oi ₇ : 1002,483) .

Beispiel 11

Herstellung von 6- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) acetylamido) -PEGn-

Succinimidylester (7a)

61 μMol (50 mg) der Verbindung (6a) wurden zu einer Lösung aus 100 μMol (11 mg) N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 100 μMol (21 mg) N, N' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 500 μl wasserfreiem Dioxan gegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt, 500 μl Diethylether wurden hinzugefügt, die Mischung

wurde auf 0°C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde isoliert und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Ausbeute 82 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 2.83 (s, 4H), 2.90 (t, 2H), 3.57 (t, 2H), 3.64 (m, 46H), 3.85 (t, 2H), 4.53 (s, 2H), 6.85 (d, IH), 7.22 (dd, IH), 7.41 (d, IH).

¹³ C-NMR (90.6 MHz, CDCl ₃ ) δ 25.5, 32.1, 38.9, 65.7, 68.3, 69.5, 70.4, 70.5, 70.6, 70.7, 77.2, 114.7, 123.8, 127.3, 128.0, 130.2, 151.7, 166.7, 167.2, 168.9.

MS-ESI m/z: 976,361 [M+AcOH] (berechnet für C _4I Cl ₂ H ₆₆ N ₂ O ₂₀ : 976,359) .

Herstellung von (6- (2- (2,4-

Dichlorphenoxy) acetylamido) hexylamido) -PEGn-Succinimidylester

(7b)

53 μMol (50 mg) der Verbindung (6b) wurden zu einer Lösung aus 100 μMol (11 mg) N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 100 μMol (21 mg) N, N' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 500 μl wasserfreiem Dioxan gegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt, 500 μl Diethylether wurden hinzugefügt, die Mischung wurde auf 0°C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde isoliert und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Ausbeute 91 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.38 (m, 2H), 1.59 (quin, 2H), 1.69 (quin, 2H), 2.26 (t, 2H), 2.84 (m, 4H), 2.91 (t, 2H), 3.36 (q, 2H), 3.45 (m, 2H), 3.57 (t, 2H), 3.65 (m, 44H), 3.85 (t, 2H), 4.52 (s, 2H), 6.85 (d, IH), 7.23 (dd, IH), 7.41 (d, IH).

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 25.4, 25.6, 26.2, 29.0, 32.1, 32.4, 38.8, 40.0, 65.7, 68.3, 69.3, 70.1, 70.4, 70.5, 70.6, 70.7, 77.2, 114.8, 123.8, 127.4, 128.0, 130.2, 151.7 166.7, 167.4, 168.9, 171.4.

MS-ESI m/z: 1089,452 [M+AcOH] (berechnet für C ₄₇ Cl ₂ H ₇₇ N ₃ O _2I : 1089,443) .

Herstellung von (6- (2- (2,4-

Dichlorphenoxy) acetylamido) undecanoylamido) -PEGn- Succinimidy- lester (7c)

50 μMol (50 mg) der Verbindung (6c) wurden zu einer Lösung aus 100 μMol (11 mg) N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 100 μMol (21 mg) N, N' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 500 μl wasserfreiem Dioxan gegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt, 500 μl Diethylether wurden hinzugefügt, die Mischung wurde auf 0 ⁰ C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde isoliert und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Ausbeute 86 %.

¹ H-NMR (360 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.28 (m, 12H), 1.59 (m, 4H), 2.18 (t, 2H), 2.87 (m, 4H), 2.91 (t, 2H), 3.35 (q, 2H), 3.45 (m, 2H), 3.56 (t, 2H), 3.64 (m, 44H), 3.85 (t, 2H), 4.51 (s, 2H), 6.85 (d, IH), 7.23 (dd, IH), 7.42 (d, IH).

¹³ C-NMR (90,6 MHz, CDCl ₃ ) δ 25.4, 25.6, 25.9, 26.8, 29.1, 29.2, 29.3, 29.4, 32.2, 37.5, 39.1, 39.7, 65.7, 68.3, 70.2, 70.5, 70.6, 70.7, 77.2, 114.7, 123.7, 127.4, 128.0, 130.2, 151.6, 166.7, 167.0, 168.9, 169.4.

MS-ESI m/z: 1159,536 [M+AcOH] (berechnet für C ₅₂ Cl ₂ H ₈₇ N ₃ O _2I : 1159,521) .

Beispiel 12

Bestimmung der Hydrolyse Halbwertszeiten von Aktivesterderivaten

Die Hydrolyse Halbwertszeiten von Aktivesterderivaten in physiologischem Puffer wurden per ¹ H-NMR Spektroskopie ermittelt. Dazu wurde ein 50 mM Phosphatpuffer in Deuteriumoxid (D ₂ O, 99,98 %) (deutero, Kastellaun, DE), pD 7,2, angesetzt. Die Phosphatsalze wurden 3x aus frischem Deuteriumoxid gefriergetrocknet. Abschließend wurde das Ausgangsvolumen an frischem D ₂ O hinzugefügt und der pD-Wert überprüft. Stammlösungen von Aktivesterderivaten von 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D)

(Ib, 3b, oder 3d) , von Digoxigenin (Digoxigenin-3-0- methylcarbonyl-ε-aminocaproyl-N-hydroxysuccinimid (DIG-C6-NHS)

(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, DE) ) oder von Biotin (sulfo- succinimidyl-biotin oder sulfo-LC-biotin (KMF Laborchemie, Lohmar, DE) ) (jeweils 15-30 mg/ml, 50 mM) wurden für jedes Experiment frisch in wasserfreiem D _ß -Dimethylsulfoxid (D _ö -DMSO, H ₂ O<0,01 %; Euriso-Top, Saarbrücken, DE) angesetzt. Um die Hydrolysereaktion zu initiieren, wurden jeweils 10 μl dieser Lösungen zu 490 μl des deuterierten 50 mM Phosphatpuffers (pD 7,2) welcher mit 3- (Trimethylsilyl) -l-propansulfonsäure-Dβ Natriumsalz (TMSPS) (Merck, Darmstadt, DE) (0,1 mg/ml) als internen Standard versetzt war, gegeben. Die Konzentration der Aktivester in dieser Lösung betrug 1 mM. Die Hydrolyse der Aktivesterderivate wurde bei RT per ¹ H-NMR Spektroskopie (600 MHz) überwacht (Avance DRX-600 System; Bruker BioSpin, Rheins- tetten, DE) . Das erste ¹ H-Spektrum wurde 6-12 min nach Zugabe des Phosphatpuffers aufgenommen, weitere Spektren wurden nach ungefähr 20, 40, 60, 120, 240, 360 und 1000-1600 min (über

Nacht) aufgenommen. Nach der letzten Messung (über Nacht) wurde erneut der pD-Wert der Lösung überprüft. Die Hydrolyse jedes Aktivesterderivates wurde in 2-3 unabhängigen Experimenten gemessen.

Die Bruker Software X-WIN-NMR (V 2,5) wurde genutzt, um die zu verschiedenen Messzeitpunkten aufgenommenen Spektren zu prozessieren und auszuwerten (Bruker BioSpin, Rheinstetten, DE) . Dazu wurden Signale, deren Intensität oder chemische Verschiebung durch die Deuterolyse verändert wurde und die nicht durch Signale anderer Kerne überlagert waren, integriert und in Relation zum internen Standard TMSPS gesetzt. Aus der Veränderung der Peakintegrale wurde die Konzentration des nicht hydrolysierten Aktivesterderivates berechnet und diese gegen die Zeit aufgetragen. Die Hydrolyse Halbwertszeit, bei der 50 % der jeweiligen Aktivesterderivate hydrolysiert vorlagen, wurde durch nicht-lineare Regression ermittelt (GraphPad Prism Suite (v.4.0.0); GraphPad Software, San Diego, CA, USA) (Tabelle 1) .

Beispiel 13

Markierung von Substratmolekülen (>20000 Da) mit 2,4- Dichlorphenoxy-Aktivesterderivaten und ihr Nachweis

Ovalbumin (Merck Biosciences, Bad Soden, DE) , wurde in einer Konzentration von 135 mg/ml (3 mM) in 100 mM Natriumtetraboratpuffer pH 8,2 gelöst, portioniert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ⁰ C gelagert. Zur Markierungsreaktion wurden 100 nMol Ovalbumin aus der Stammlösung vorgelegt und soviel Natriumtetraboratpuffer zugesetzt, dass sich nach Zugabe der Aktivesterlösung ein Endvolumen von 300 μl ergab. Schließlich wurde die Markierungsreaktion durch Zugabe von 1,5

μMol einer frisch bereiteten Lösung (65-100 mg/ml; 120-330 mM) des jeweiligen Aktivesters (s. Tabelle 2) in Dimethylsulfoxid (DMSO) gestartet. Der Volumenanteil an Dimethylsulfoxid (DMSO) im Reaktionsansatz war dabei <5 % (v/v) .

Der Reaktionsansatz wurde bei RT durch Invertieren gemischt, bevor nach einer Reaktionszeit von 180 min die Umsetzung durch Zugabe von 200 μl (1,5 mMol) Glycin in Natriumtetraboratpuffer gestoppt wurde. Der Reaktionsansatz wurde in dieser Form über Nacht bei 4 ⁰ C weiter über Kopf geschwenkt und anschließend gegen Natriumtetraboratpuffer dialysiert. Die Konzentration des dialysierten, markierten Proteins wurde nach Standardverfahren bestimmt. Das markierte Protein wurde seriell in Natriumtetraboratpuffer verdünnt, und in geometrisch absteigender Menge auf Nitrocellulose (4,8 x 3 cm, 0,2 μm Porengröße, Whatman bzw. Schleicher & Schuell, Dassel, DE) immobilisiert (16000- 3,12 pg/Dot bzw. 16000-3,12 ng/Dot). Die Membran wurde luftgetrocknet und trocken bei -2O ⁰ C gelagert.

Vor Gebrauch wurde die eingelagerte Membran aufgetaut, dreimal mit D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ ) gewaschen und für 30 min bei RT mit 1 % (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS (Blocking-Lösung) abgesättigt. Die derart geblockte Membran wurde unter Schwenken für 90 min bei RT mit 4 ml (0,28 ml/cm ² Membran) einer Erstantikörperlösung aus monoklonalem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2; 1 μg/ml) in Blocking-Lösung inkubiert. Erneut wurde dreimal mit D-PBS gewaschen und die Membran wurde 90 min bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm ² Membran) Zweitantikörperlösung (Ziege anti-Maus AlexaFluor680 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ; 2 μg/ml in Blocking-Lösung) inkubiert. Nach weiterem ausgiebigem Waschen der Membran in D-PBS wurden die Nachweisgrenzen für die Markierung

mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) und eines entsprechenden Bildauswerteprogramins (Odyssey-Software Vl.2, LI- COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) bestimmt. Die Rohdaten wurden mit Hilfe eines Statistikprogramms (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ausgewertet. Eine übersicht der Nachweisgrenzen ist in Tabelle 4 gezeigt.

Beispiel 14

Markierung mit 2 , 4-Dichlorphenoxy-Hydrazidderivaten und ihr

Nachweis

Das Glykoprotein Mucin aus Schweinemagen (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, DE), wurde in D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 mM NaCl, 8,1 inM Na ₂ HPO ₄ ) gelöst, seriell in D-PBS verdünnt, und in geometrisch absteigender Menge auf Nitrocellulose (4,8 x 3 cm, 0,2 μm Porengröße, Whatman bzw. Schleicher & Schuell, Dassel, DE) immobilisiert (2000-1 pg/Dot) . Die Membran wurde luftgetrocknet und trocken bei -20 ⁰ C gelagert.

Vor Gebrauch wurde die eingelagerte Membran dreimal mit D-PBS gewaschen. Anschließend wurden die vicinalen Diole in den Zuckerresten des Mucins mit Periodat oxidiert. Dazu wurde die Membran 20 min bei RT mit 10 mM Natrium-m-Periodat (Sigma- Aldrich, Taufkirchen, DE) in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) behandelt. Anschließend wurde dreimal mit D-PBS gewaschen, bevor die Membran mit 2,5 nMol/ml Markierungs-Hydrazid (2,4- Dichlorphenoxyessigsäure- (2, 4-D) -derivate (s. Tabelle 3)) in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) für 60 min bei RT inkubiert wurde. Erneut wurde dreimal mit D-PBS gewaschen und die Membran für 30 min bei RT mit 1 % (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS abgesättigt.

Die derart geblockte Membran wurde unter Schwenken für 90 min bei RT mit 4 ml (0,28 ml/cm ² Membran) einer Erstantikörperlösung aus monoklonalem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2; 1 μg/ml) in Blocking-Lösung inkubiert. Erneut wurde dreimal mit D-PBS gewaschen und die Membran wurde 90 min bei RT mit 3 ml (0,21 ml/cm ² Membran) Zweitantikörperlösung (Ziege anti-Maus AlexaFluor680 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ; 2 μg/ml in Blocking-Lösung) inkubiert. Nach weiterem ausgiebigem Waschen der Membran in D-PBS wurden die Nachweisgrenzen für die Markierung mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) und eines entsprechenden Bildauswerteprogramms (Odyssey-Software Vl.2, LI- COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) bestimmt. Die Rohdaten wurden mit Hilfe eines Statistikprogramms (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ausgewertet. Eine übersicht der Nachweisgrenzen ist in Tabelle 4 gezeigt.

Beispiel 15

Markierung von Substratmolekülen (<20000 Da) mit 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure Derivaten .

Stammlösungen der Aktivesterderivate (Ib), (3b), (3d), (4,2- 9,2 mg/ml, 14 mM) sowie der Aktivesterderivate (7a), (7b), (7c) (ca. 15 mM) wurden für jede Markierungsreaktion frisch in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) angesetzt, ebenso wie eine Insulinlösung (200 μg/ml, 35 μM; Rinderinsulin, MW 5733,49; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 0,02 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (PBS/EDTA). Zur Markierung wurde Insulin (35 nMol, entsprechend 105 nMol Ami- nofunktionen (2 NH ₂ -Termini (Untereinheit A und B) , 1 Lysin Seitenkette) ) , mit den entsprechenden Aktivesterderivaten (350 nMol) in einem Volumen von 1,25 ml PBS/EDTA in Gegenwart von maximal 2 % (v/v) DMSO umgesetzt. Die Lösungen wurden mit einem überkopfSchüttler für 90 min bei RT inkubiert und die Markierungsreaktionen anschließend durch Zugabe von Glycin (1 mMol) in PBS/EDTA terminiert. Die Inkubation wurde für 60 min bei RT fortgesetzt. Anschließend wurden die Lösungen gegen PBS/EDTA dialysiert (MWCO 2000) . Nach erneuter Dialyse einer Teilmenge gegen Wasser wurden die jeweiligen Zusammensetzungen der Proben und die Molekülmassen der Produkte per MALDI-TOF-MS bestimmt (Bruker-Reflex II; Bruker-Daltonik, Bremen, DE). Der mittlere Derivatisierungsgrad wurde bestimmt wie unter Olivier et al beschrieben (Olivier V, Meisen I, Meckelein B, Hirst TR, Peter-Katalinic J, Schmidt MA, Frey A (2003) . Influence of targeting ligand flexibility on receptor binding of particu- late drug delivery Systems. Bioconjug Chem. 14:1203-8.) (Tabelle 5) .

Die Konzentrationen der markierten Insulinkonjugate wurden mit Hilfe von Standardverfahren bestimmt und serielle Verdünnungen der markierten Konjugate in PBS/EDTA wurden angefertigt. Gleiche Mengen der Insulinkonjugate (1000-0,12 ng Konju- gat/Kavität in je 50 μl) wurden auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Kavitäten) und einem PVDF-Membranboden immobilisiert (Corning, Corning, NY, USA) . Die Platten wurden zuvor mit 70 % (v/v) Ethanol aktiviert und mit PBS/EDTA gewaschen. Nach 30-minütiger Inkubation bei RT mit den Insulinkonjugaten wurden die Lösungen mit Hilfe einer Vakuumvorrichtung entfernt (MultiScreen Vakuum Vorrichtung; Millipore, Schwalbach, DE) . Die Mikrotiterplatten wurden anschließend einem Waschzyklus unterzogen, bei dem sie 3x mit 200 μl/Kavität Dulbecco' s Phos- phat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ ), die 0,1 % (v/v) Tween20 enthielt (PBST), mit Hilfe der Vakuumvorrichtung und anschließend 3x mit 300 μl/Kavität D-PBS mit einem automatischen Plat- tenwascher gewaschen wurden. Die Mikrotiterplatten wurden mit 200 μl/Kavität 2 %-igem (w/v) Kaseinat in D-PBS (Kaseinat-PBS) für 30 min bei RT abgesättigt und die Lösungen wurden anschließend mit Hilfe der Vakuumvorrichtung abgezogen. Die abgesättigten Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen und anschließend für 30 min bei RT mit 50 μl/Kavität einer Lösung aus verdünntem monoklonalem Erstantikörper gegen 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure (1 μg/ml) in Kaseinat-PBS inkubiert. Nach einem weiteren Waschzyklus (je 4x) wurden die Platten für 30 min bei RT mit 50 μl/Kavität einer Lösung aus Meerrettich- peroxidase markiertem Ziege anti-Maus IgG Antikörper (2 μg/ml; Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) in Kaseinat-PBS inkubiert. Nachdem die Platten einem weiteren Waschzyklus unterzogen wurden (je 6x) wurde das Farbsignal für 30 min bei RT

im Dunkeln durch Zugabe von 75 μl/Kavität eines auf Tetra- methylbenzidin-basierenden Reagenzes entwickelt (1 mM 3,3' ,5, 5'-Tetramethylbenzidin, 3 mM H ₂ O ₂ in 200 mM Kaliumzit- rat, pH 4,0; (Frey A, Meckelein B, Externest D, Schmidt MA (2000). A stable and highly sensitive 3,3', 5, 5'- tetramethylbenzidine-based Substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods. 233:47-56.))- Die Reaktion wurde nach 30 min bei RT durch Zugabe von 125 μl/Kavität 1 M Schwefelsäure terminiert. Die überstände (175 μl/Kavität) wurden auf eine nichtbindende Miktrotitrati- onsplatte aus Polystyrol transferiert (Corning) und die Absorption wurde mit einem Mikrotitrationsplattenlesegerät (Ver- samax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt. Die Rohdaten wurden mit Hilfe eines Statistikprogramms (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ausgewertet. Eine übersicht der Nachweisgrenzen ist in Tabellen 6 und 7 gezeigt.

markiertem Zweitantikörper erbracht. Das Detektionslimit (DL) (Mittelwert ± Standardfehler) über dem Schwellenwert ist in pg Protein angegeben und in Femtomol Markierung umgerechnet: fMol Markierung = [DL (pg protein) / 5,73 pg/fmol (MW _insulin ) ] * Derivatisierungsgrad (Tabelle 5)]. Der Schwellenwert wurde nach der Methode von Frey et al. bestimmt (Frey A, Di Canzio J, Zura- kowski D (1998). A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays . J Immunol Methods. 221:35-41.). (c) Signifikant geringere Nachweisgrenze als nach Markierung mit 2,4-D, welches keinen Abstandhalter trägt (P<0,001; One-way ANOVA, Bonferroni Post hoc test).

Beispiel 16

Markierung mit 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure-markierten N- alpha- (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -L-lysin-Derivaten und ihr

Nachweis

18mer Oligopeptide wurden nach dem SPOT-Syntheseverfahren für Zellulosefilter-immobilisierte Peptidbibliotheken (Frank R

(1992). Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane sup- port. Tetrahedron 48: 9217-9232) hergestellt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei RT. Zellulosefilter wurden mit 0,02 ml/cm ² Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) -geschützter Aminosäure Prolin (0,2 M Fmoc-Prolin, 0,46 M 1-Methylimidazol und 0,26 M Diisopropylcarbodiimid (DICD) in DMF) behandelt. Nach der Veresterung wurden die nicht reagierten Hydroxylgruppen der Zellulose für 24 h mit 15 ml (0,13 ml/cm ² ) 2 % (v/v) Essigsäureanhydrid in N, N-Dimethylformamid (DMF) abgesättigt und die Membran dreimal mit DMF gewaschen. Die Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppen erfolgte für 5 min durch 10 ml (0,09 ml/cm ² ) 20 %

(v/v) Piperidin in DMF. Danach wurde fünfmal mit DMF gewaschen. Als Nachweis für die gekuppelte Aminosäure wurden die freien Aminogruppen auf dem Zellulosefilter für 10 min mit 15 ml (0,13 ml/cm ² ) einer Bromphenolblaulösung (0,01 % (w/v) in DMF) angefärbt. Anschließend wurde dreimal mit 100 % Ethanol gewaschen und die Membran im Kaltluftstrom getrocknet. Dieser Inkubations-Zyklus, bestehend aus Ix Essigsäureanhydrid, 3x DMF, Ix Piperidin, 5x DMF, Ix Bromphenolblau und 3x Ethanol, wurde auch zwischen den einzelnen Syntheseschritten durchgeführt. Ab dem dritten Syntheseschritt wurde die Inkubationszeit mit der Essigsäureanhydridlösung, die dann nur noch zum

Absättigen der nicht reagierten Aminofunktionen dient, auf 20 min verkürzt.

Die Synthese erfolgte mit einer automatischen Pipettier- maschine (ASP 222, Intavis Bioanalytical Instruments AG, Köln, DE). Zunächst wurde eine Lösung aus 0,2 M tert- Butyloxycarbonyl- (Boc) -lysin- (Fmoc) -OH und 0,35 M 1-Hydroxy- benzotriazol (HoBt) sowie 0,25 M Diisopropylcarbodiimid (DICD) in l-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) 30 min vor ihrem Einsatz hergestellt und bei RT inkubiert. Nach 30 min Reaktionszeit wurde die Lösung zentrifugiert , um aufgetretene Präzipitate zu entfernen, und jeweils 0,1 μl der Kupplungslösung wurden mit Hilfe der automatischen Pipettiermaschine auf definierte Areale der Zellulosemembran pipettiert. Diese Areale werden als SPOTs bezeichnet und stellen die Syntheseorte für die einzelnen Peptide dar. In allen nachfolgenden Syntheseschritten wurden zur Verlängerung der Peptidkette für jedes Peptid jeweils 0,2 μl einer 0,2 M Aminosäureaktivesterlösung appliziert, die täglich frisch zubereitet wurde. Zur Herstellung der Aminosäureaktivesterlösung wurde eine Lösung von 0,2 M Fmoc-geschützter Aminosäure, deren Seitenkette, falls erforderlich, orthogonal geschützt war (tert.-Butyl (tBu) für Serin, Threonin, Tyrosin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; Trityl für Asparagin, Glutamin, Histidin; t-Butyloxycarbonyl (Boc) für Lysin und Tryptophan; 2,2,4,6, 7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) für Arginin und Acetamidomethyl (Acm) für Cystein) und 0,35 M 1-Hydroxy-benzotriazol (HoBt) in trockenem, entsalztem N-Methylpyrrolidon mit 1,25 Mol DICD pro Mol Aminosäure versetzt und 30 min bei RT reagieren gelassen. Anschließend wurden entstandene Präzipitate durch Zentrifugation entfernt. Für jeden Syntheseschritt wurde die Aminosäureaktivesterlösung dreimal aufgebracht und jeweils mindestens 40 min bei RT rea-

gieren gelassen. Auf diese Weise wurden 18mer Peptide synthetisiert, die amino- oder carboxyterminal oder innerhalb einer lβmer Sequenz (abgeleitet aus dem Protein Ovalbumin) mit 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure-markierten N-alpha- (9-

Fluorenylmethyloxycarbonyl) -L-lysin-Derivaten (Verbindungen 2c, 4b und 4d) markiert wurden.

Die Seitenkettenschutzgruppen (außer Acm) wurden durch zwei einstündige Inkubationen mit 10 ml (0,09 ml/cm ² ) einer Lösung aus 50 % (v/v) Trifluoressigsäure, 2 % (v/v) destilliertem Wasser und 3 % (v/v) Triisobutylsilan in Dichlormethan abgespalten. Anschließend wurden die zellulosegebundenen Peptide zunächst viermal mit Dichlormethan, dann viermal mit 0,1 %

(v/v) HCl, 50 % (v/v) Methanol in zweifach destilliertem Wasser und schließlich viermal in 1 M Essigsäure, pH 1,9 gewaschen. Die Membran wurde über Nacht im Vakuum getrocknet. Die SPOTs wurden ausgestanzt und in 2 ml-Mikroreaktionsgefäße transferiert. Um die Peptide von den Membranschnipseln abzuspalten, wurden 500 μl einer Lösung aus 0,1 M Triethylammoniu- macetat (TEAA), 20 % (v/v) Ethanol, pH 7,5 in zweifach destilliertem Wasser zu jedem Membranschnipsel gegeben. In dieser Form wurde über Nacht inkubiert, die überstände wurden anschließend in ein frisches 2 ml-Mikroreaktionsgefäß gegeben und die Abspaltungsreaktion wurde für 2 h wiederholt. Beide Peptidlösungen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die so getrockneten Peptide wurden in 1,5 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM NaCl (L-PBS) x 0,005 %

(w/v) Tween 20 gelöst, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80° C gelagert. Schema a-c gibt eine übersicht über die synthetisierten Peptide:

a) NH ₂ -Terminus: Ac-x-GSIGAASMEFCFDVFK-y-z rCarboxy-Terminus b) NH ₂ -Terminus: Ac-y-GSIGAASMEFCFDVFK-x-z rCarboxy-Terminus c) NH ₂ -Terminus: Ac-GSIGAAS-y-MEFCFDVFK-x-z : Carboxy-Terminus (Ac = Acetyl, x = Lysin- (Biotin) , y = Verbindungen 2c, 4b oder 4d, z = Diketopiperazinrest, Aminosäuren sind im Ein- Buchstabencode angegeben)

Zum Nachweis der markierten Peptide in einem Immunoverfahren wurden hochbindende Mikrotitrationsplatten mit 96 Vertiefungen

(Corning, Corning, NY, USA) mit einem Volumen von 75 μl/Vertiefung einer Erstantikörperlösung (anti-2,4-D, Klon E2/G2, 50 ng/ml in L-PBS) beladen und so über Nacht bei 4 ⁰ C mit Antikörper beschichtet. Die Vertiefungen der Mikrotitrati- onsplatte wurden mit einer Waschlösung (D-PBS) dreimal gewaschen und anschließend für 3-4 h bei RT mit einer Absätti- gungslösung (1 % (w/v) Casein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ ) (BIo- cking-Lösung) gefüllt. Es wurde viermal mit D-PBS gewaschen, und 75 μl einer Lösung aus seriell in D-PBS verdünnten markierten Peptiden (1:750-1:1536000) wurden in jede Kavität gegeben. In dieser Form wurde die Mikrotitrationsplatte 2,5 Stunden bei RT inkubiert und danach nicht gebundene Peptide durch viermaliges Waschen mit D-PBS entfernt. Zum Nachweis der über die 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure-Derivat-Markierung gebundenen, biotinylierten Peptide wurde mit 75 μl/Vertiefung einer 1 μg/ml Lösung aus peroxidase-markiertem Streptavidin

(SA-HRP, 1 μg/ml in Casein/PBS, 60 min RT) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) in Blocking-Lösung für 60 min bei RT inkubiert. Die Mikrotitrationsplatte wurde sechsmal mit D- PBS gewaschen und das Entwickeln des Farbsignals erfolgte

durch Zugabe von 75 μl/Vertiefung eines 3, 3', 5,5'- Tetramethylbenzidin-Wasserstoffperoxid Substrats und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln (Frey A, Meckelein B, Exter- nest D, Schmidt MA (2000) . A stable and highly sensitive 3, 3 ' , 5, 5 ' -tetramethylbenzidine-based Substrate reagent for en- zyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods . 233:47- 56). 125 μl 1 M Schwefelsäure wurden in jede Vertiefung gegeben und die Absorption wurde mit einem Mikrotitrationsplatten- lesegerät (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt. Die Bindungs- bzw. Titrationskurven wurden an eine A- Parameterlogistikfunktion angepasst (SoftMax Pro VA. I ₁ Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) und die daraus gewonnenen Werte zur maximalen Signalhöhe und zum Titrationswendepunkt statistisch ausgewertet (GraphPad Prism Suite V4.00, GraphPad Software, San Diego, CA, USA) . Eine übersicht der Resultate ist in Figur 3 gezeigt.

Beispiel 17

Markierung mit und Nachweis von 2- (2- (2 , 4-Dichlorphenoxy) -1- hydroxyethyliden) -5 , 5-dimethylcyclohexan-l , 3-dion (2 , 4-D Dime- don)

Ein 15mer Fragment aus Ovalbumin (NH ₂ -GSIGAASMEFCFDCF-COOH) , wurde wie in Beispiel 10 beschrieben im SPOT-Maßstab auf Zellulosemembran synthetisiert. Im Unterschied zu Beispiel 10 wurde das Peptid aber über den nicht abspaltbaren Anker, beta- Alanylalanin (beta-A) an der Membran verankert (NH ₂ -Peptid- CONH-beta-A-Membran) . Nach der Fmoc-Entschützung des N- Terminus des Peptides wurde das Peptid mit 0,2 μl einer Lösung

aus 0,2 M 2, 4-D-Dimedon (Ic) in l-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) derivatisiert . Die Seitenkettenschutzgruppen wurden wie beschrieben entfernt, die Membran dreimal 10 Minuten in D-PBS

(Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7,4; 2,7 rriM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 inM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ ) gewaschen und nachfolgend 5 Stunden in Blocking-Lösung (1 % (w/v) Casein Hammarsten grade, BDH, Poole, UK in D-PBS) abgesättigt. Um die Markierung nachzuweisen, wurde die derart geblockte Membran über Nacht bei 4 ⁰ C mit 4 ml (2 ml/cm ² Membran) einer Lösung aus biotiny- liertem anti-2,4-D Antikörper (Klon E4/C2; 1 μg/ml; biotiny- liert nach Herstellerangaben mit 15- ( [biotinoyl] amino) - 4,7,10, 13-tetraoxapentadecansäure-N-hydroxysuccinimidylester

(NHS-PE04-Biotin) (Uptima über KMF Laborchemie, Lohmar, DE) in Blocking-Lösung inkubiert und anschließend sechsmal für 10 min mit D-PBS gewaschen. Es folgte eine Inkubation mit 3 ml (1,5 ml/cm ² Membran) einer Lösung aus 250 ng/ml AlexaFluor680 markiertem Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in Blocking-Lösung für 90 min bei RT. Die Membran wurde abschließend dreimal für 10 min bei RT mit D-PBS gewaschen und die Fluoreszenzsignale wurden quantifiziert (Odyssey Infrared Imager und Odyssey Software Vl.2, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA). Anschließend wurde die Markierung durch Einwirken von 4 ml (2 ml/cm ² Membran) 5 % (v/v) Hydrazin-Monohydrat in D-PBS für 5, 20, 60 oder 100 min bei RT entfernt, die Membran dreimal mit D-PBS gewaschen und die Fluoreszenzsignale erneut quantifiziert. Figur 4 stellt die Reversibilität der Markierung mit 2, 4-D-Dimedon dar.

Beispiel 18

Immunhistochemischer Nachweis eines mit: 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) markierten Substratmoleküls

Weizenkeimagglutinin (WGA) , ein Lektin welches N- Acetylglucosamin als Rezeptorkohlenhydrat bindet, wurde mit der Verbindung (3b) markiert. Dazu wurde eine Stammlösung von WGA (10 mg/ml, 0,3 mM) in 100 mM Natriumtetraboratpuffer (pH 8,2) hergestellt, diese portioniert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ⁰ C gelagert. Eine Stammlösung der Verbindung (3b) (26,5 mg/ml, 50 mM) in wasserfreiem Dimethyl- sulfoxid (DMSO) wurde frisch zur Markierung angesetzt. Zur Markierung wurde WGA (100 nMol, entsprechend ungefähr 1,5 μMol Aminofunktionen) mit Verbindung (3b) (500 nMol) in einem Volumen von 400 μl 100 mM Natriumtetraboratpuffer (pH 8,2) in Gegenwart von 2,5 % (v/v) DMSO umgesetzt. Die Lösung wurde auf einem überkopfSchüttler für 90 min bei RT inkubiert und die Markierungsreaktion durch Zugabe von 600 μl Glycin (2,5 μMol) in Natriumtetraboratpuffer (pH 8,2) terminiert. Es wurde über Nacht bei 4°C weiter inkubiert und die Lösung anschließend gegen Natriumtetraboratpuffer dialysiert (MWCO 3500) . Die Konzentration des markierten WGA (2,4-D-WGA) wurde in Standardverfahren bestimmt, das 2,4-D-WGA wurde portioniert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ⁰ C gelagert. Das 2,4- D-WGA wurde in einem histologischen Experiment zur Markierung von Golgimembranen eingesetzt. Dazu wurden humane Dickdarmkarzinomzellen (Zelllinie Caco-2, Klon C2BBel; ATCC, Manassas, VA, USA) ) für 48 oder 72 h auf sterilen Deckgläschen (Bellco Biotechnology, Vineland, NJ, USA) kultiviert und wie folgt bei RT behandelt. Die Zellen wurden 3x mit Dulbecco' s Phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ ) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen für 10 min mit 4 % (w/v) Paraformaldehyd in D-PBS fixiert, und danach für 5 min in 4 % Paraformaldehyd in D-PBS in

Gegenwart von 0,1 % (v/v) Triton X-100 permeabilisiert . Die Zellen wurden mit D-PBS gewaschen, für 10 min mit 50 mM Glycin in D-PBS inkubiert und erneut mit D-PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 10 % (v/v) foetalem Rinderserum (FBS) in D-PBS jeweils für 30 min abgesättigt, bevor sie für 1 h mit 15 μM (0,5 mg/ml) 2,4-D-WGA in 5 % (v/v) FBS in D- PBS (FBS/PBS) in einer befeuchteten Kammer inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen 3x für 15 min mit D-PBS unter vorsichtigem Schütteln gewaschen. Um die 2, 4-D-Markierung nachzuweisen, wurden die Zellen 1 h mit 2, 4-D-spezifischem monoklonalem Antikörper (Klon E2/G2; 3,4 mg/ml in FBS/PBS) in der befeuchteten Kammer inkubiert. Wiederum wurden die Zellen 3x für 15 min mit D-PBS unter leichtem Schütteln gewaschen, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation mit AlexaFluor546- markiertem Ziege anti-Maus Antikörper (0,4 mg/ml in FCS/PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in der Feuchtekammer. Nach einem weiteren Waschzyklus wurden die Zellkerne durch 5 minütige Inkubation mit 4' , 6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochloridlö- sung (DAPI) (300 nM in D-PBS) gefärbt. Abschließend wurden die Deckgläschen 2x mit D-PBS und 2x mit Wasser vorsichtig gespült. Die derart gewaschenen Deckgläschen wurden mit Mowiol, welches 2,5 % (w/v) 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) enthielt, auf Glasobjektträgern montiert. Die Zellen wurden mit einem Nikon Diaphot300 Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Düsseldorf, DE) , welches mit einer Polaroid DMC2 Kamera (Polaroid, Dreieich-Sprendlingen, DE) ausgerüstet war, untersucht (Figur 5) .

Beispiel 19

Markierung von DNA mit 2 , 4-Dichlorphenoxyessigsäure- (2 , 4-D) - desoxyuridintriphosphat- (dUTP) Derivaten (5a, 5b oder 5c).

Um eine DNA-Probe zu markieren wurde ein murines Prionprotein- Gen-Fragment durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ampli-

fiziert. Als Templat-DNA wurde der Vektor pET15b (Merck Bios- ciences, Nottingham, UK) verwendet, der die für die Aminosäuren 90-231 des Prionproteins kodierende cDNA enthielt (siehe: Schwarz A, Kratke O, Burwinkel M, Riemer C, Schultz J, Henklein P, Bamme T, Baier M (2003). Immunisation with a syn- thetic prion protein-derived peptide prolongs survival times of mice orally exposed to the scrapie agent. Neurosci Lett . 350:187-9.)). Die verwendeten Oligonukleotide (Primer) waren spezifisch für die T7-promotor- und die T7-terminator-Sequenz (Vorwärtsprimer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-S'; Reversprimer : 5'- TGGCAGCAGCCAACTCAGC-3' ; IBA, Göttingen, DE) . 1 μl Templat-DNA Lösung (20 ng DNA) wurde zu einer PCR Mischung gegeben, die 25 pMol von jedem Primer, Ix Taq DNA Polymerase Puffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 3,5 U Taq DNA Polymerase (New England Biolabs), und einen Desoxynukleotid Mix aus dATP, dGTP und dCTP (je 10 nMol) sowie dTTP (6, 8 oder 9,6 nMol) (Sigma- Aldrich, Taufkirchen, DE) enthielt. 2, 4-D-markierte dUTP- Derivate (5a, 5b oder 5c) wurden zur Markierung des PCR- Produktes eingesetzt. Dazu wurden 10, 5 oder 1 μl der Produktfraktionen (ungefähr je 4, 2 oder 0,4 nMol), welche von der Anionenaustauschersäule bei ungefähr 57 % (5a), 48 % (5b) oder 85 % (5c) 1 M NH ₄ HCO ₃ Puffer eluiert hatten (siehe allgemeine Arbeitsvorschrift 5) und nach ihrer Elution gefriergetrocknet und anschließend in 1 ml Wasser aufgenommen worden waren, der PCR-Mischung hinzugefügt. Jeder Ansatz wurde mit deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 μl gebracht. Als Positivkontrolle wurden analoge Mischungen mit unterschiedlichen dTTP:dUTP Verhältnissen (6:4, 8:2, 9,6:0,4, oder 10:0 nMol) angesetzt, allerdings wurde dazu nicht—2, 4-D-markiertes dUTP verwendet (Sigma-Aldrich) . Die PCR-Reaktionen wurden in einem Primus 25 Cycler (Peqlab Biotechnologie, Erlangen, DE) mit dem folgenden Programm durchgeführt: initiales Erwärmen auf 95°C für 2 min, gefolgt von 35 Zyklen an Denaturierung (95°C für 1 min), Primer Anbindung (51,5°C für 1 min), und Primer Verlängerung (75°C für 1 min) . Nach dem letzten Zyklus wurde zusätz-

lieh für 5 min auf 75°C erwärmt. Die Größe des Amplicons von ungefähr 630 Basenpaaren wurde mit Hilfe eines 1,5 %-igen

(w/v) Agarosegels und Ethidiumbromidfärbung verifiziert (Mar- ker: 2-log DNA Leiter (New England Biolabs) ) .

Der Einbau von 2, 4-D-markierten dUTP-Derivaten (5a, 5b oder 5c) wurde nach einem Southern Blot der DNA-Fragmente durch 2, 4-D-spezifische Antikörper überprüft. Dazu wurden die PCR Produkte mit Hilfe eines kommerziellen PCR-Reinigungskits entsprechend der Herstellerangaben gereinigt (Qiagen, Hilden, DE) . Jeweils 35 ng der gereinigten PCR Produkte, die entweder nicht markiert oder mit den Verbindungen (5a), (5b) oder (5c) markiert worden waren, wurden auf einem 1,5 %-igen (w/v) Aga- rosegel separiert und durch Ethidiumbromidfärbung in einem UV- Transilluminator visualisiert . Die PCR Produkte wurden auf Nytran SuPerCharge Nylonmembranen mit Hilfe eines Turboblotter Systems nach Herstellerangaben transferiert und immobilisiert

(Whatman bzw. Schleicher & Schuell, Dassel, DE) . Die Membranen wurden in passgenauen Wannen für 2 h bei RT in 1 % (w/v) Ca- sein (Hammarsten grade, BDH, Poole, UK) in Dulbecco' s Phospat- gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (D-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO ₄ , 136 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ ) (Casein/PBS) abgesättigt und anschließend für 1 h bei RT mit einer Lösung aus anti-2,4- D Antikörper (2 μg/ml; Klon E4/C2) in Casein/PBS inkubiert. Die Membranen wurden 5x für 5 min mit D-PBS, welches 0,05 % Tween 20 enthielt (PBST), gewaschen und danach für 45 min bei RT mit einer Lösung aus AlexaFluor680-markiertem Ziege antiMaus IgG Antikörper (0,2 μg/ml; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inkubiert. Danach wurde erneut mit D-PBS gewaschen (5x 5 min) und die Fluoreszenzsignale wurden mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes ausgelesen (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Bios- ciences, Lincoln, NE, USA) und mit einer geeigneten Bildauswertesoftware quantifiziert (Odyssey Software v.1.2) (Figur 6) .

Das Detektionslimit für die 2, 4-D-markierten DNA-Fragmente wurde im Dot Blot ermittelt. Die DNA-Fragmente, die in Gegenwart von 10 μl (5a) oder 5 μl (5b) amplifiziert worden waren, wurden wie beschrieben gereinigt und ihre Konzentration in Standardverfahren bestimmt. Die DNA-Fragmente wurden seriell verdünnt und in geometrisch absteigender Menge auf Nytran Su- PerCharge Nylonmembranen (Whatman bzw. Schleicher & Schuell) immobilisiert (10000-0,61 pg DNA/Dot) . Die Membranen wurden in passgenauen Wannen für 2 h bei RT in Casein/PBS abgesättigt und anschließend für 1 h bei RT mit einer Lösung aus anti-2,4- D Antikörper (2 μg/ml; Klon E4/C2) in Casein/PBS inkubiert. Die Membranen wurden 6x für 10 min mit D-PBS, welches 0,05 % Tween 20 enthielt, gewaschen und danach für 60 min bei RT mit einer Lösung aus AlexaFluor680-markiertem Ziege anti-Maus IgG Antikörper (0,2 μg/ml; Invitrogen) in Casein/PBS inkubiert. Danach wurde erneut mit D-PBS gewaschen ( 6x 10 min) und die Fluoreszenzsignale wurden mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegerätes ausgelesen (Odyssey Infrared Imager, LI-COR Biosciences) und mit einer geeigneten Bildauswertesoftware quantifiziert (Odyssey Software v.l.2) (Tabelle 8).

Beispiel 20

Effizienz der Markierung unterschiedlicher Substratmoleküle mit Verbindung (3b) .

Eine Stammlösung der Verbindung (3b) (20-50 mM) wurde für jedes Markierungsexperiment frisch in wasserfreiem Dimethylsul- foxid (DMSO) vorbereitet. Verschiedene Proteinose Substratmoleküle (Rinderinsulin 200 μg/ml, 35 μM, MW 5733,49 (Sigma- Aldrich, Taufkirchen, DE) ; Rinderubiquitin 1 mg/ml, 120 μM, MW 8565 (Sigma-Aldrich) ; rekombinantes Hisβ-markiertes Gräserpol-

lenallergen 2 aus Phleum pratense (PhI p 2), 1,3 mg/ml, 110 μM, MW 12214,45 (siehe Suck R, Petersen A, Weber B, Becker WM, Fiebig H, Cromwell O (2004). Analytical and preparative native Polyacrylamide gel electrophoresis : Investigation of the recombinant and natural major grass pollen allergen PhI p 2. E- lectrophoresis 25:14-9)) wurden in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst. Zur Markierung wurden Insulin (5 nMol, entsprechend 15 nMol Aminofunktionen) , Ubiquitin (5 nMol, entsprechend 40 nMol Aminofunktionen), oder PhI p 2 (5 nMol, entsprechend 45 nMol Aminofunktionen) mit unterschiedlichen molaren überschüssen an Verbindung (3b) in einem Gesamtvolumen von 50- 200 μl an 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2) umgesetzt. In keinem Experiment waren mehr als 2 % (v/v) DMSO zugegen. Bei allen Insulin enthaltenden Markierungsreaktionsansätzen wurden den verwendeten Puffern 0,02 mM Ethylendiamintetraessigsäure (ED- TA) zugesetzt. Die Lösungen wurden mit einem überkopfSchüttler für 90 min bei RT inkubiert und die Markierungsreaktionen durch Zugaben von Glycin (1 mMol) in Phosphatpuffer (pH 7,2) terminiert. Die Reaktionsansätze wurden weitere 60 min bei RT inkubiert, bevor die Lösungen gegen Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert wurden (MWCO 2000-3500) . Die Masse und Zusammensetzungen der Konjugate wurde nach einer weiteren Dialyse gegen Wasser per MALDI-TOF-MS Analysen bestimmt (Bruker-Reflex II in- strument; Bruker-Daltonik, Bremen, DE) . Der mittlere Derivati- sierungsgrad der jeweiligen Probe wurde nach Olivier et al bestimmt (Olivier V, Meisen I, Meckelein B, Hirst TR, Peter- Katalinic J, Schmidt MA, Frey A (2003) . Influence of targeting ligand flexibility on receptor binding of particulate drug de- livery Systems. Bioconjug Chem. 14:1203-8) (Figur 7).