CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções; aos processos para a preparação dos referidos compostos e/ou derivados.

[0002] A presente invenção também abrange as composições farmacêuticas compreendendo os referidos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3i7-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções; medicamentos compreendendo os referidos compostos e/ou derivados, assim quanto ao uso dos compostos e/ou derivados como inibidor da enzima . fosfodiesterase, mais especificamente como inibidor da enzima fosfodiesterase de tipo 5 (PDE-5); e ao uso dos compostos e/ou derivados no tratamento de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterase, mais especificamente . inibidor da PDE-5. [0003] A presente invenção também descreve um método de tratamento de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterase, mais especificamente como inibidores da PDE-5, usando os novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3fí-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções.

[0004] Em particular, a presente invenção descreve os compostos denominados 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2- hidroxietil) -1- ( lfí-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3fí-oxazolo [3,4- a] pirazina-5 , 8-diona (BL-230) ; e 3- (benzo [d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) - 7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il) -1- (lfí-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H- oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236) .

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0005] Os compostos inibidores de fosfodiesterases são os principais agentes utilizados na clinica médica para o tratamento e/ou prevenção de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e outras doenças tratáveis com inibidores de fosfodiesterases . No caso da disfunção erétil, os inibidores de PDE-5 são os mais utilizados na clinica médica.

[0006] A disfunção erétil, mais comumente conhecida como impotência sexual é uma das doenças que mais prejudica a qualidade de vida de um homem. Durante muito tempo, a disfunção erétil assombrou os homens sem muita possibilidade de tratamento efetivo. [0007] Antes dos anos 1970, a quase totalidade dos casos de disfunção erétil era considerada como resultante de causas psicológicas, e os tratamentos consistiam na administração empírica de testosterona ou encaminhamento para um psiquiatra. O desenvolvimento de novos tratamentos, como a próteses penianas infláveis, desenvolvida em 1973 e o surgimento de injeções intracavernosas, no inicio de 1980, foram marcos importantes para a história dos tratamentos modernos de disfunção erétil. O primeiro tratamento de uso oral, à base de citrato de sildenafila (princípio ativo do medicamento Viagra ^® ) foi lançando em 1998, e foi um marco importante para o tratamento de disfunção erétil.

[0008] O tratamento oral é mais aceito pelo homem e surgiu de pesquisa clínica sobre o uso de inibidores de cGMP-PDE, mais especificamente inibidores da PDE-5. O precursor desses compostos era a 5- [2-etoxi-5- (4-metilpíperazinilsulfonil) fenil] -l-metil-3-n-propil-l, 6-dihidro-7H-pirazolo [4,3- d] pirimidina-7-ona, ou sildenafila, com propriedades vasodilatadoras e que potencializa os efeitos do óxido nítrico. A molécula de sildenafila foi originalmente descrita na patente americana US5250534.

[0009] Posteriormente, outros compostos inibidores da enzima PDE-5 foram desenvolvidos e são citados em grande número de publicações da literatura técnica, bem como em publicações de patentes. Dentre os compostos conhecidos destacamos: a molécula do vardenafila, princípio ativo do medicamento Levitra ^® , descrito originalmente na patente US3635178; a tadalafila, princípio ativo do medicamento Cialis ^® , descrito originalmente na patente americana US5859006; e o composto BL- 106, ainda não comercializado, descrito originalmente na patente americana US8338432 e desenvolvido pela mesma equipe de pesquisadores da presente invenção. [0010] Estudos disponíveis relatam que alguma forma de disfunção sexual afeta 10-52% dos homens. 0 estudo realizado por Feldman e seus colaboradores demonstraram que 52% dos homens entre as idades de 40 e 70 têm disfunção erétil de graus leve, moderada e grave. Entre as idades de 40 e 70, a prevalência de disfunção erétil leve permanece relativamente constante, porém a prevalência de disfunção erétil moderada e grave aumenta em cada década, com o total combinado de aumento evoluindo de cerca de 40% na idade de 40 anos a quase 70% aos 70 anos (Feldman HA, Goldstein I, Hatzichristou DG, et al. Impotence and its medicai and psychosocial correlates : results of the Massachusetts Male Aging Study. J Urol 1994/151 : 54-61) .

[0011] Adicionalmente, os pesquisadores verificaram que compostos relaxantes de tecido têm sido usados para promover o relaxamento de vários tecidos com o foco em tratar ou atuar como adjuvante no tratamento, procedimento ou cirurgia relacionada à litíase (Korkes, F. et al, J Bras Nefrol. (2009) 31(1): 55), aumento de próstata (por exemplo, hiperplasia prostática benigna, prostatite) (WO 9911279) e constrição uretral (Van der werf et al, BJU International (2002) 90:588). Outras desordens e/ou condições tratáveis de relaxamento de tecido são conhecidas e descritas no estado da técnica.

[0012] Inibidores de PDE-5 tem sido usados para bloquear a degradação de cGMP para prolongar os efeitos do óxido nítrico (NO) em vários tecidos, por exemplo, para manter o relaxamento induzido por NO das vias aéreas e vasos (Barnes, P. J., et al., (1995) e para manter a proteção induzida por NO de tecido (Duffin, R., et al., Br J Pharmacol. (2008) 153(4): 623). Tais ações nos tecidos mostram-se como benéficas para o tratamento de diversas desordens - que sejam desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases, principalmente da PDE-5, incluindo hipertensão pulmonar (comercialmente tratado com citrato de sildenafila) ; bronquite; asma crónica; hipertensão (EP 758653, US 7569572); doença de Raynaud (Ghofrani H.A., et al., Nat Rev Drug Discov. 2006, 5:689); início de falha cardíaca lateral direita (Ghofrani et al. (2003) AJRCCM 167(8): 1139); neurogênese e recuperação funcional pós-derrame (Zhang et al. (2002) Stroke 33: 2675-2680); relaxação arterial coronária (Halcox et al. (2002) J Am Coll Cardiol 40: 1232); desordens de excitação sexual feminina {Nehra et al. (2001) World J Urol. 19(1): 115); angina e falha cardíaca congestiva (Reffelmann et al., Circ. (2003) 108(2) :239) . Outras desordens tratáveis com inibidores da PDE-5 são conhecidas e descritas no estado da técnica.

[0013] Frente a este cenário e buscando novas alternativas de compostos inibidores de fosfodiesterases , mais especificamente como inibidores da PDE-5, para novos tratamentos da disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e outras doenças tratáveis com inibidores de fosfodiesterases , os pesquisadores da presente invenção desenvolveram novos compostos derivados de 6, 7-díhidro-3fí-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, objeto da presente invenção, os quais apresentam atividade inibidora das enzimas fosfodiesterases, incluindo a inibição da PDE-5.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A. presente invenção visa fornecer novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções. Mais especificamente os compostos denominados 3- (benzo[d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2-hidroxietil) -1- ( lH-indol-3- il) -6, 7-dihidro-3fi-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-230) ; e 3-{benzo[d] [1, 3] dioxol-5il) -7- ( <S) l-hidroxipropan-2-il) -1- (lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5 , 8- diona (BL-236) ; e/ou a mistura desses compostos (em qualquer proporção) .

[0015] Outro aspecto da presente invenção é o uso dos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, -a] pirazina- 5, 8-diona, objeto da presente invenção, para tratamento curativos e/ou profiláticos da disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases, mais especificamente com inibidores da PDE-5.

[0016] Também é o objetivo da presente invenção fornecer processos para a preparação dos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3i-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, objeto da presente invenção. Em particular, os processos para a preparação dos compostos 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2- hidroxietil) -1- ( lH-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3,4- a] pirazina-5 , 8-diona (BL-230); e 3- (benzo [d] [ 1 , 3] dioxol-5-il) - 7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il) -1- (lff-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H- oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236); e/ou as misturas desses compostos (em qualquer proporção) .

[0017] Além disso, a presente invenção também visa fornecer composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade efetiva de um dos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3Jí- oxazolo [3, -a] pirazina-5, 8-diona, ou mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; OS enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enant iomérico em quaisquer proporções. [0018] Em particular, composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um dos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, selecionados entre: 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2-hidroxietil) -1- (lff- indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona

(BL-230); e 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- { (S) 1- hidroxipropan-2-íl) -1- ( lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3#- oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona ( BL-236) ; ou mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções.

[0019] Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer um medicamento compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um dos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H- oxazolo [ 3, -a] pirazina-5 , 8-diona, a misturas desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções. Em particular, medicamentos compreendendo pelo menos um dos novos compostos derivados de

6.7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, selecionados entre: 3- {benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il} -7- (2-hidroxietil) -1- (1H- indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a]pirazina-5, 8-diona

( BL-230); e 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5il) -7- ( (S) 1-hidroxipropan- 2-il) -1- (lií-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3fí-oxazolo [3, 4-a] irazina-

5.8-diona (BL-236); e/ou a mistura desses compostos (em qualquer proporção) . BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0020] A Figura 1 mostra o espectro RMN do ¹ H para caracterização do composto obtido no exemplo 1 (BL-230) .

[0021] A Figura 2 mostra o espectro RMN do ¹³ C para caracterização do composto obtido no exemplo 1 (BL-230) .

[0022] A Figura 3 mostra o espectro EMAR para caracterização do composto obtido no exemplo 1 (BL-230) .

[0023] A Figura 4 mostra o espectro RMN do ¹ H para caracterização do composto obtido no exemplo 2 (BL-236) .

[0024] A Figura 5 mostra o espectro RMN do ¹³ C para caracterização do composto obtido no exemplo 2 (BL-236) .

[0025] A Figura 6 mostra o espectro EMAR para caracterização do composto obtido no exemplo 2 (BL-236) .

[0026] A Figura 7 mostra um gráfico da contração induzida pela fenilefrina (PE) e do efeito de DMSO (veiculo - controle negativo) em corpos cavernosos de coelho.

[0027] A Figura 8 mostra um gráfico da contração induzida pela fenilefrina (PE) e do efeito relaxante de tadalafila em corpos cavernosos de coelho.

[0028] A Figura 9 mostra um gráfico da contração induzida pela fenilefrina (PE) e do efeito relaxante do composto BL-230 em corpos cavernosos de coelho.

[0029] A Figura 10 mostra um gráfico da contração induzida pela fenilefrina (PE) e do efeito relaxante do composto BL-236 em corpos cavernosos de coelho.

[0030] A Figura 11 mostra um gráfico de curva dose-resposta, com a porcentagem de relaxamento em corpo cavernoso de coelho após administração do composto BL-230 e tadalafila.

[0031] A figura 12 mostra um gráfico de barras com a porcentagem de relaxamento do corpo cavernoso de coelho quando administrado BL-230, tadalafila e DMSO (veiculo) . [0032] A Figura 13 mostra um gráfico de barras com a porcentagem de relaxamento do corpo cavernoso de coelho quando administrado BL-236, tadalafila e DMSO (veiculo) .

[0033] A Figura 14 mostra a porcentagem de inibição das enzimas fosfodiasterases observada na presença do composto BL- 230.

[0034] A Figura 15 mostra a porcentagem de inibição das enzimas fosfodiasterases observada na presença do composto BL- 236.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0035] A presente invenção descreve novos compostos úteis para o tratamento de doenças tratáveis com inibidores de fosfodiesterase, principalmente com a inibição da PDE-5, como por exemplo, a disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e outras doenças tratáveis com inibidores de fosfodiesterases . Os compostos da presente invenção referem-se aos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3fr-oxazolo [3, 4-a] piraziná-5, 8-diona, representadas pela fórmula (I) :

onde:

- R ¹ é um grupo aromático, um grupo aromático contendo um ou mais heteroátomos, grupos fenil, fenol, 3-metoxi-4-fenol, metileno-3, -dioxifenil, 2-metoxifenil, 3-metoxifenil, 4- metoxifenil , 3, 4-dimetoxifenil, 2-halo-fenil, 3-halo-fenil , 4- halo-fenil, furil; piridínico, aromático biciclico, aromático bicíclico contendo um ou mais heteroátomos;

- R ² é arila, heteroarila, bicicloarila, CH ₂ (CH ₂ ) _n R ³ , CH ₂ (CH ₂ ) _n N ⁴ R ⁵ , CHR ⁶ CH ₂ OH, CH ₂ CH(OH)R ⁷ , CH ₂ (CH ₂ )OR ⁸ , CH ₂ (CH ₂ ) _n SR ⁹ , sais do carboxilato, sais do sulfonato ou sais quaternários de amónio;

- R ³ é OH, NH ₂ , NH ₃ ⁺ , S(0)Me, S0 ₃ H, C0 ₂ H, Cl, sais do carboxilato, sais do sulfonato ou sais quaternários de amónio;

- R ⁴ é hidrogénio, metil, etil, propil, i-propil, butil, sec- butil, terc-butil, fenil, . benzil ou sais quaternários de amónio;

- R ⁵ é hidrogénio, metil, etil, propil, i-propil, butil, sec- butil, terc-butil, fenil, benzil ou sais quaternários de amónio;

- R ⁶ é {. )-Me, (i?)-Et, (R) -i-Prop, (J¾)-i-But, (R) -fenil, (R)- CH ₂ SH, (R) -CH ₂ CH ₂ SCH ₃ , (R) -benzil, {R) -sec-But , (S)-Me, (S)-Et,

(S)-í-Prop, (S)-i-But, (S) -fenil, (S)-CH ₂ SH, ( S) -CH ₂ CH ₂ SCH ₃ ,

(S}-benzil ₇ (S) -sec-But ou CH ₂ 0H;

- R ⁷ é (2¾)-Me, (- )-Et; (i^)-Prop, (Λ) -i-Prop, {R) -fenil, {R) ^~ benzil, (S)-Me, (S)-Et; (S)-Prop, (S)-i-Prop, (S) -fenil ou (S) -benzil ;

- R ⁸ é Ci-6 alquil, C ₂ - ₆ alquenil, C ₂ -e alquinil, fenil ou benzil;

- R ⁹ é Ci-6 alquil, C ₂ -e alquenil, C ₂ -s alquinil, fenil ou benzil;

- n é um número compreendido entre 0 e 4;

a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis.

[0036] Os compostos de fórmula (I) podem conter um ou mais centros quirais, podem assim existir enantiômeros e/ou diastereoisomeros. Em particular, um centro quiral é evidenciado com um asterisco {*) na descrição da fórmula (I) . Portanto, a presente invenção também abrange os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos de fórmula (I) nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções.

[0037] Os compostos de fórmula (I) podem existir sob duas formas tautoméricas, e a invenção inclui uma ou mais formas tautoméricas e misturas dessas formas (em qualquer proporção) .

[0038] Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula (I) são formados pela adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos de sais incluem, porém, não estão limitados aos sais de: nitrato, cloridrato, bromoidrato, sulfato ou bissulfato, fosfato, hidrogeno- fosfato, acetato, benzoato, succinato, fumarato, maleato, lactato, citrato, tartarato, gluconato, metassulfonato, benzenossulfonato e p-toluenossulfonato . Os compostos da fórmula (I) podem ser usados em sais de metais farmaceuticamente aceitáveis, em particular, sais de metais alcalinos com bases, como por exemplo, os sais de sódio e potássio .

[0039] Em uma concretização especifica, a presente invenção descreve os novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3fí- oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona, representados pela fórmula (D :

- R ¹ é metileno-3-4-dioxifenil ; - R ² é CH ₂ (CH ₂ ) _n R ³ ou CHR ⁶ CH ₂ OH;

- R ³ é OH;

- R ⁶ é (S) -Me;

- n é igual a 1;

a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções .

[0040] Em uma concretização mais especifica, os novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H-oxazolo [ 3 , 4-a] pirazina- 5,8-diona, estão representados pelas seguintes fórmulas:

- Fórmula (II) :

denominado 3-{benzo[d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2-hidroxietil ) -1- (lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8- diona (BL-230) ; e

- Fórmula (III) :

denominado 3- (benzo [d] [ 1 , 3] dioxol-5-il } -7- ( ( S ) 1-hidroxipropan- 2-il) -1- ( lff-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3i?-oxazolo [3, 4-a] pirazina- 5,8-diona (BL-236) ;

ou a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas, e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enant iômeros e/ou d astereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções .

[0041] Em outra concretização da presente invenção, refere- se ao PROCESSO DE SÍNTESE do composto de fórmula (II), denominado 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( 2-hidroxietil ) -1- (lfí-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8- diona (BL-230) , o qual pode ser obtido utilizando os compostos (E) -metil 2- ( (benzo [d] [1,3] dioxol-5-ilmetileno) amino) -3- (1H- indol-3-il) -3-oxopropanoato, descrito pela estrutura química (a); metil 2- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -3- (2-cloroacetil) -5- (lH-indol-3-il) -2, 3-dihidrooxazolo- -carboxilato descrito pela estrutura química (b) e a amina 2-aminoetanol descrita pela estrutura química (c) .

[0042] Para a síntese do composto de fórmula (II) , o composto (b) é preparado através da reação do composto (a) na presença de uma solução de piridina seca (Py) em tetrahidrofurano (THF) e solução de cloreto de cloroacetila . Depois de finalizada a reação para formação do intermediário

(b) , este é adicionado ao meio com álcool etílico e 2- aminoetanol (c) , no final da reação é adicionado etanol e água, resultando na obtenção do composto de Fórmula (II), como ilustrado no Esquema [1]:

[0043] Já o composto de fórmula (III) , denominado 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il ) -1- (1H- indol-3-il) -6, 7-dihidro-3íf-oxazolo [3, 4-a] irazina-5 , 8-diona

(BL-236) , de acordo com a presente invenção, pode ser obtido utilizando os compostos (E)-metil 2- ( (benzo [d] [1, 3] dioxol-5- ilmetileno)amino) -3- (lH-indol-3-il) -3-oxopropanoato, descrito pela estrutura química (a) ; metil 2- (benzo [d] [1, 3] díoxol-5- il) -3- (2-cloroacetil ) -5- ( lJJ-indol-3-il) -2, 3-dihidrooxazolo-4- carboxilato descrito pela estrutura química (b) e a amina (S)~ 2-aminopropan-l-ol descrita pela estrutura química (d) .

[0044] Para a síntese do composto de fórmula (III), o composto (b) é preparado através da reação do composto (a) na presença de uma solução de piridina seca (Py) em tetrahidrofurano (THF) e solução de cloreto de cloroacetila . Depois de finalizada a reação para formação do intermediário (b) , este é adicionado ao meio álcool etílico ,e { S) -2- aminopropan-l-ol (d) , no final da reação é adicionado etanol e água, resultando na obtenção do composto de Fórmula (III), como ilustrado no Esquema [2] :

[0045] A presente invenção também contempla composições farmacêuticas, ou seja, uma forma apropriada de dosagem, onde a composição citada compreende como ingrediente ativo uma quantidade efetiva de um ou mais compostos da fórmula (I), incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções .

[0046] Preferencialmente, as composições da presente invenção compreendem como ingrediente ativo os novos compostos, que estão representados pelas seguintes fórmulas: - Fórmula ( II) :

denominado 3-(benzo[d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2-hidroxietíl) -1- (lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8- diona (BL-230) ; e

- Fórmula (III) :

denominado 3- {benzo [d] [1,3] dioxol-5-il) -7- ( (S) 1-hidroxipropan- 2-il) -1- (ltf-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3fí ^" -oxazolo [3, 4-a] pirazina- 5, 8-diona (BL-236) ;

ou a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enant iômeros e/ou diastereoisõmeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enant iomérico em quaisquer proporções .

[0047] As COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS podem ser preparadas por métodos bem conhecidos pelo estado da técnica. Apropriadamente, Remington' s Pharmaceutical Sciences ou fontes similares de informação podem ser usadas para preparar uma formulação farmacêutica adequada para veicular o composto da invenção .

[0048] As COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS da presente invenção podem ser administradas por via oral, tópica, injetável, nasal e retal. O modo particular selecionado dependerá dos compostos presentes na composição.

[0049] As COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS para administração oral podem ser apresentadas, mas não limitadas, à: pós, grânulos, cápsulas, comprimidos, comprimidos efervescentes, comprimidos mastigáveis, comprimidos revestidos, pílulas, géis, gomas mastigáveis, filmes, soluções, xaropes, elixires, suspensões, emulsões, e outros.

[0050] A presente invenção também contempla COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS compreendendo uma quantidade terapeut icamente efetiva de um ou mais compostos da fórmula (I), e/ou de seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas, e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções; e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0051] Em particular, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS compreendendo como principio ativo pelo menos um dos seguintes compostos selecionados do grupo constituxdo por:

(a) 3- (benzo [d] [ 1, 3 ] dioxol-5-il ) -7- (2-hidroxietil) -1- ( 1H- indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, -a] pirazina-5, 8-diona

(BL-230), descrito na fórmula (II),

(b) 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2- il) -1- ( lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3Jí-oxazolo [3, 4-a] pirazina-

5, 8-diona (BL-236) descrito na fórmula (III);

a mistura desses compostos em qualquer proporção, incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas, e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções; e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis .

[0052] Os COMPOSTOS descritos na presente invenção, incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas, e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções; são empregados para o tratamento e/ou profilaxia de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases , como por exemplo, da PDE-5. As desordens tratáveis com inibidores de PDE podem ser litiase, hiperplasia prostática, hipertensão pulmonar, constrição ureteral, disfunção sexual feminina e/ou disfunção sexual masculina, mas não limitada à somente esses exemplos.

[0053] Adicionalmente, a presente invenção contempla COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS compreendendo os compostos descritos na presente invenção, incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas, e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções; são empregados para o tratamento e/ou profilaxia de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases, como por exemplo, da PDE-5. As desordens tratáveis com inibidores de PDE podem ser litiase, hiperplasia prostática, hipertensão pulmonar, constrição ureteral, disfunção sexual feminina e/ou disfunção sexual masculina, mas não limitada à somente esses exemplos.

[0054] Em particular, os compostos 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5- il) -7- (2-hidroxietil) -1- (lff-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H- oxazolo [3 , 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-230) descrito na fórmula (II), e 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2- il) -1- ( lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3íf-oxazolo [3, 4-a] pirazina- 5, 8-diona (BL-236) descrito na fórmula (III); ou a mistura desses derivados (em qualquer proporção), incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas, e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas nâo-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções.

[0055] Adicionalmente, a presente invenção descreve um METÓDO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO de disfunções associadas à atividade das fosfodiesterases, administrando dose efetiva de pelo menos um dos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H- oxazolo [ 3 , 4-a] pirazina-5 , 8-diona, a mistura desses derivados {em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções. As desordens tratáveis com inibidores de PDE podem ser disfunção erétil, litiase, hiperplasia prostática, hipertensão pulmonar, constrição ureteral, disfunção sexual feminina e/ou disfunção sexual masculina, mas não limitada à somente esses exemplos.

[0056] A presente invenção também descreve um MÉTODO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases, como por exemplo, da PDE-5, administrando dose efetiva de pelo menos um dos novos compostos derivados de 6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4- a] pirazina-5, 8-diona, a mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró- drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções . [0057] Em particular, os compostos 3- (benzo [d] [ 1 , 3] dioxol-5- il) -7- (2-hidroxietil) -1- (lH-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H- oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-230 - fórmula II); e 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il) -1- (lff- indol-3-il) -6, 7-dihidro-3fí-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236 - fórmula III}; ou mistura desses derivados (em qualquer proporção) , incluindo seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; os enantiômeros e/ou diastereoisômeros dos compostos nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso enantiomérico em quaisquer proporções.

EXEMPLOS :

[0058] Os exemplos a seguir, descritos detalhadamente, ilustram a presente invenção sem, todavia, limitar seu escopo de proteção, e que várias modificações, à luz das mesmas, serão sugestivas aos especialistas na técnica. Tais realizações equivalentes devem estar incluídas dentro do escopo e alcance das reivindicações que acompanham.

EXEMPLO 1 : Preparação do composto de fórmula II denominado 3- <benzo[d] [1 , 3] dioxol-5-il) -7- (2-hidroxietil) -1- (lH-indol-3- il) -6, 7-dihidro-3íT-oxazolo [3, 4-a] irazina-5, 8-diona (BL-230) .

[0059] Em um balão de 500 mL munido de agitação mecânica, funil de adição e tubo secante contendo CaCl ₂ foram adicionados o composto (a) (10,20 g, 28,0 mmol) e uma solução de piridina seca (11,3 mL} em 102 mL de tetrahidrofurano (THF) seco, a qual foi agitada por 30 minutos. A esta suspensão foi adicionado lentamente, aproximadamente por 2 horas, uma solução de cloreto de cloroacetila {2,9 mL, 36,4 mmol)

(reagente 2) em 30 mL de THF seco. Após a adição, a mistura reacional foi reagida por um período de 4 horas à temperatura ambiente, resultando na formação do intermediário (b) . Ao término deste período, o álcool etílico (42 mL) e o composto (c) denominado 2-aminoetanol (39,3 g, 644,0 mmol) foram adicionados ao meio e a mistura agitada por um período de 16 h. Ao final deste tempo foram adicionados ao meio 250 mL de etanol e 100 mL de água. O sistema foi submetido à destilação a vácuo e o excesso de solvente removido até a precipitação do produto. O balão foi resfriado à temperatura ambiente, e em seguida, resfriado a temperatura entre 0 e 5°C. O sistema resfriado foi mantido sob agitação por 2 horas à temperatura entre 0 e 5°C. A suspensão resultante foi filtrada a vácuo e o precipitado lavado com 100 mL de etanol. O sólido foi colocado em um balão de 250 mL e adicionou-se 60 mL de etanol e a mistura foi agitada por um período de 30 minutos. Terminado esse período o sólido foi filtrado e seco a vácuo resultando na formação do produto de fórmula (II), conforme o esquema [1] abaixo .

[0060] Esquema [1] : Síntese do composto 3-

(benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- (2-hidroxietil) -1- { ltf-indol-3- il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [ 3, 4-a] pírazina-5 , 8-diona (BL-230) .

[0061] 0 composto obtido por esse processo apresenta nome IUPAC 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-íl) -7- (2-hidroxietil} -1- (1H- indol-3-il) -6, 7-dihidro-3tf-òxazolo [ 3 , 4-a] pírazina-5 , 8-diona, (BL-230), estrutura química descrita pela fórmula (II): e apresenta as seguintes características: fórmula molecular: C23Hi _{9 3} 0 ₆ ; sólido amarelo; Ponto de fusão 254-258 ^° C, RMN ¹ H (500 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO): δ 11.87 (ls, IH) , 8.96 {ls, IH), 7.85 (d, J = 10.0 Hz, IH), 7.47 (d, J = 10.0 Hz, IH), 7.18-7.05 (m, 5H) , 6.98 (d, J = 10.0 Hz, IH), 6.05 (s, 2H) , 4.84-4.32 (m, IH), 4.28 (dd, J = 30.0 Hz, J = 15.0 Hz, 2H) , 3.65-3.61 (m, 2H) , 3.50-3.45 (m, 2H) (Figura 1); RMN ¹³ C (125 MHz, (CD ₃ ) ₂ SO): 5159.1, 157.2, 148.8, 148.1, 148.0, 136.3, 131.5, 131.3,

125.7, 122.7, 121.8, 121.1, 120.9, 112.7, 108.8, 107.0, 105.4,

102.8, 101.9, 90.8, 58.9, 52.9, 48.2 (Figura 2}; EMAR (El) m/z calculado para C ₂₃ H19N ₃ O ₆ : [433.1274] ⁺ encontrado: 434.1336 [M+H] ⁺ (Figura 3) .

EXEMPLO 2 : Preparação do composto de fórmula (III) denominado 3- (benzo [d] [1 , 3] dioxol-5il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il) -1- (1H- indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3 , 4-a]pirazina-5 , 8-diona (BL-236) .

[0062] Em um balão de 500 mL munido de agitação mecânica, funil de adição e tubo secante contendo CaCl ₂ foram adicionados o composto (a) (10,20 g, 28,0 mmol) e uma solução de piridina seca (11,3 mL) em 102 mL de tetrahidrofurano (THF) seco, a qual foi agitada por 30 minutos. A esta suspensão foi adicionado lentamente, aproximadamente por 2 horas, uma solução de cloreto de cloroacetila (2,9 mL, 36,4 mmol) (reagente 2) em 30 mL de THF seco. Após a adição, a mistura reacional foi reagida por um período de 4 horas à temperatura ambiente, resultando na formação do intermediário (b) . Ao término deste período, o álcool etílico (42 mL) e o composto (d) denominado ( S) -2-aminopropan-l-ol (48,4 g, 644,0 mmol) foram adicionados ao meio e a mistura agitada por um período de 16 h. Ao final deste tempo foram adicionados ao meio 250 mL de etanol e 100 mL de água. O sistema foi submetido à destilação a vácuo e o excesso de solvente removido até a precipitação do produto. O balão foi resfriado à temperatura ambiente, e em seguida, resfriado a temperatura entre 0 e 5°C. 0 sistema resfriado foi mantido sob agitação por 2 horas a temperatura entre 0 e 5°C. A suspensão resultante foi filtrada a vácuo e o precipitado lavado com 100 mL de etanol. O sólido foi colocado em um balão de 250 mL e adicionou-se 60 mL de etanol e a mistura foi agitada por um período de 30 minutos. Terminado esse período o sólido foi filtrado e seco a vácuo resultando na formação do produto de fórmula (III), conforme o esquema [2] abaixo.

[0063] Esquema [2] : Síntese do composto 3-

(benzo[d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona

(BL-236) .

[0064] O composto obtido por esse processo apresenta nome IUPAC 3- (benzo[d] [ 1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) l-hidroxipropan-2-il) - 1- ( lH-indol-3-il) -6, 7 -dihidro-3H-oxazolo [3, 4-a] pirazina-5 , 8- diona, (BL-236) , estrutura química descrita pela fórmula (III) :

e apresenta as seguintes características: fórmula molecular: C24H21 3O6; sólido amarelo; Ponto de Fusão 235-239 °C, RMN ^X H (300 MHz , (CD ₃ ) ₂ SO): δ 11.87 (d, J = 3.0 Hz, 1Ή) , 8.98 (d, J = 3.0 Hz, IH), 7.87 (d, J = 9.0 Hz, IH), 7.47 (d, J = 9.0 Hz, IH), 7.14-7.06 (m, 5H) , 6.98 (d, J = 9.0 Hz, IH), 6.04 (s, 2H) , 4.85 (t, J = 6.0 Hz, IH), 4.67-4.60 (m, IH) , 4.07 (dd, J = 21.0 Hz, J = 18.0 Hz, 2H) , 3.59-3.52 (m, IH), 3.51-3,40 (m, IH), 1.07 (d, J = 6.0 Hz, 3H) (Figura 4); RMN ¹³ C, 75 MHz , (CD ₃ ) ₂ SO, δ 159.5, 157.5, 148.8, 148.1, 148.0, 136,3, 131.6, 131,3, 125.7, 122.6, 121.8, 121,0, 120.9, 112.8, 108.8, 107.0, 105.7, 102.8, 101.9, 90.7, 61.9, 49.9, 46.5, 13.7 (Figura 5) ; EMAR (El) m/z calculado para [C24H21 3O6] ⁺ : 447.1430, encontrado: 470.1325 [M+Na] ⁺ (Figura 6).

EXEMPLO 3 : Avaliação do efeito relaxante dos compostos BL-230 e BL-236 em corpo cavernoso isolado de coelhos

Tecido

[0065] Para esse estudo, coelhos New Zealand White (2 - 3,5 kg) foram utilizados para obtenção de tecido peniano, que foi extirpado e transferido para uma solução de Krebs gelada. Para o estudo foram utilizados 4 tiras do corpo cavernoso (CC) do tecido peniano de coelhos New Zealand White.

Registro da tensão Isométrica .

[0066] As tiras foram montadas em câmaras de incubação de tecido de 10 ml contendo solução Krebs a 37 °C, pH entre 7,3 a 7,5; continuamente borbulhada com uma mistura de 95% de oxigénio (0 ₂ ) e 5% de gás carbónico (C0 ₂ } . Aos tecidos foram aplicados uma tensão inicial de 10 mN, seguido de um período de estabilização de 60 minutos. As mudanças de tensão (força isométrica) foram obtidas utilizando transdutores isométricos (ADInstruments, Austrália) e registradas em um sistema de aquisição de dados PowerLab 4/30 (Chart software, version 7.3.7, ADInstruments, MA, USA para o BL-230, e version 7,0 ADInstruments, MA para o BL-236) .

[0067] Analisando os dados obtidos, é possível observar que: (a) 1 μΜ de fenilefrina ( PE ) foi capaz de induzir contração sustentada em tecido do corpo cavernoso de coelhos, conforme pode ser observados nas Figuras 7 a 10; (b) a administração de dimetilsulfóxido (DMSO) , veículo utilizado para solubilizar os compostos, não induziu relaxamento do tecido (Figura 7); (c) a administração 1 μΜ de tadalafila resultou em relaxamento do tecido (Figura 8); (d) os compostos BL-230 e BL-236, na concentração de 1 μΜ, produziram relaxamento do tecido de forma semelhante ao de tadalafila na mesma concentração (Figuras 9 e 10, respectivamente) .

[0068] Curvas cumulativas de resposta à concentração dos compostos BL-230 e tadalafila (0,001 - 10 μΜ) foram obtidas em tiras de corpo cavernoso de coelho pré-contraídos com 1 μΜ PE. Como pode ser observado na Figura 11, o composto BL-230 produziu relaxamento dose dependente semelhante ao observado para a tadalafila (0,001 - 10 μΜ) na contração causada pela fenilefrina. Adicionalmente, as Figuras 12 e 13 também ilustram o relaxamento observado com os compostos BL-230, BL- 236 e a tadalafila, onde é possível observar (Figura 12 e 13) , que o BL-230 foi capaz de induzir 78,47% de relaxamento do corpo cavernoso de coelho, o BL-236 induziu 93,05%, enquanto a tadalafila induziu relaxamento no corpo cavernoso em torno de 100%. Por outro lado, o DMSO apresentou relaxamento não significativo, em torno de 20.

[0069] Os resultados obtidos demonstram que os compostos BL- 230 e BL236 produzem relaxamento em tecidos de corpos cavernosos de coelhos.

EXEMPLO 4 : Estudo pré-clinico xn vitro para avaliar o perfil de inibição de fosfodiesterases (PDE) pelos compostos BL-230 de fórmula (II) e BL-236 de fórmula (III) .

[0070] Estes estudos foram realizados para avaliar o perfil de inibição de 13 tipos de fosfodiesterases (PDE) humanas, pelos compostos BL-230 e BL-236. Mais especificamente o perfil de inibição da PDE1B, PDE2Ai, PDE3A, PDE3B, PDE4Ai _A , PDE4Bi, PDE4D ₂ , PDE5, PDE6, PDE7A, PDE8A ₁ , PDE10A ₂ e PDE11A ₄ . Para estes estudos foram realizados ensaios enzimáticos já conhecidos e padronizados pelo estado da técnica.

4.1: Atividade dos efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE1B.

[0071] Os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade das enzimas PDE1B humana foram quantificados através da medição da produção de guanosina 5' -monofosfato (5'GMP) a partir de monofosfato cíclico de guanosina (cGMP) , utilizando enzima recombinante humano expressa em células Sf9 e o método de detecção foi utilizando HTRF ^® {Homogeneous Time Resolved Fluorescence Technology) .

[0072] 0 composto teste, o composto referência ou a água (controle) foram misturados com 0.07U da enzima PDE1B em um tampão contendo 44,4 mM de cloridrato de Tris-hidroximetil aminometano (Tris-HCl) , 5,28 mM de Cloreto de magnésio (MgCl ₂ ) , 0,88 mM de cloreto de cálcio (CaCl ₂ ) , 2,64 mM de ditiotreitol (DTT) e 0,198 U de calmodulin e 0, 044% de polissorbato 20 (Tween ^® 20) (pH 7,8). Em seguida, a reação foi iniciada pela adição de 240 nM do substrato cGMP e a mistura foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para medições do controle basal, a enzima foi omitida da mistura da reação. O aceptor de fluorescência (Dye2 cGMP marcado) e o doador de fluorescência (anticorpo anti-cGMP marcado com criptato de európio) foram adicionados, na presença de 1 mM de 3-isobutil- 1-metilxantina (IBMX) . Após 60 minutos, a transferência de fluorescência correspondente ao montante de cGMP residual foi medido a Aex=337 nm, Aem=620 nm e Xem=665 nm, utilizando um leitor de microplacas (RubyStar, BMG) . A atividade da enzima foi determinada pela divisão do sinal medido a 665 nm, pelo sinal medido a 620 nm (razão) . Os resultados foram expressos como uma porcentagem de inibição da atividade da enzima controle. 0 composto inibidor padrão de referência utilizado foi o calmidazolium, o qual foi testado em cada ensaio a várias concentrações para obter uma curva de inibição a partir do qual o seu valor de IC50 foi calculado.

[0073] Para este ensaio os pesquisadores utilizaram como base os ensinamentos descritos por Bender (BENDER, A.T. and BEAVO, J.A. (2006) , Cyclic nucleotide phosphodiesterases : Molecular regulation to clinicai use, Pharmacol. Rev. , 58: 488).

[0074] De. acordo com os resultados obtidos, foi possível verificar (Figuras 14 e 15) que os compostos BL-230 e BL-236, respectivamente, não inibiram a atividade das enzimas PDE1B . 4.2: Atividade dos efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade das enzimas PDE2Ai, PDE3A, PDE4Ai _¾ , PDE4Bi, PDE7A, PDE8A ₁ , PDEIOA ₂ e PDEIIA ₄ .

[0075] Os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade das enzimas PDE2Ai, PDE3A, PDE4Ai _A , PDE4Bi, PDE7A, PDE8A ₁ , PDEIOA ₂ e PDEIIA ₄ humana foram quantificados através da medição da produção de adenosina 5' -monofosfato (5'AMP) a partir de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) , utilizando enzima recombinante humano expressa em células Sf9 e o método de detecção foi utilizando HTRF ^® .

[0076] O composto teste, o composto referência ou a água (controle) foram misturados com a enzima (as enzimas e suas quantidade utilizadas estão descritas na Tabela 1) em um tampão contendo 44,4 mM de Tris-HCl, 5,28 mM de MgCl ₂ , 2,64 mM de DTT e 0,044% de Tween ^® 20 (pH 7,8) . Em seguida, a reação foi iniciada pela adição de 40 nM do substrato cA P e a mistura foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para medições de controle basal, a enzima foi omitida da mistura de reação. O aceptor de fluorescência (Dye2 cAMP marcado) e doador de fluorescência (anticorpo anti-cAMP marcado com criptato de európio) foram adicionados, na presença de 1 mM de IBMX. Após 60 minutos, a transferência de fluorescência correspondente ao montante de cAMP residual foi medido a Àex=337 nm, Aem=620 nm e Àem=665 nm, utilizando um leitor de microplacas (RubyStar, BMG) . A atividade da enzima foi determinada pela divisão do sinal medido a 665 nm, pelo sinal medido a 620 nm (razão) . Os resultados foram expressos como uma porcentagem de inibição da atividade da enzima controle. Os compostos inibidores padrões de referência utilizados para cada uma das enzimas utilizadas estão descritos na tabela 1, os quais foram testados em cada ensaio a várias- concentrações para obter uma curva de inibição a partir do qual o seu valor de IC ₅₀ foi calculado.

[0077] Para este ensaio os pesquisadores utilizaram como base os ensinamentos descritos por: Bender (BENDER, A.T. and BEAVO, J.A. (2006) , Cyclic nucleotide phosphodíesterases : Molecular regulation to clinicai use, Pharmacol. Rev., 58: 488 [PDE2Aie PDE3A] ) ; Saldou (SALDOU, N . , et al. (1998), Comparison of recombinant human PDE4 isoforms : interaction with substrate and inhibitors, Celi Signal., 10: 427.[PDE4A _iA e PDE4Bi] ; Smith (SMITH, S.J., el al. (2004), Discovery of BRL 50481 [N,N- dimethylsulfonamido)~4-methyl-nitrobenzene], a selective inhibitor of phosphodiesterase 7: In vitro studies in human monocytes, lung macrophages, and CD8+ T-lymphocytes, Mol. Pharm., 66: 1679. [PDE7A] ) ; Fisher (FISHER, D. A. , et al. (1998), Isolation and characterizatíon of PDE8A, a novel human cAMP-specific phosphodiesterase, Biochem. , 246: 570. [PDE8A ₁ ] ) ; Soderling. (SODERLING, S.H., et al. (1999), Isolation and characterizatíon of a dual-substrate phosphodiesterase gene family: PDE10A, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96:7071 [PDE10A ₂ ] ) ; e Fa cett (FAWCETT, L., et al. (2000), Molecular cloning and characterizatíon of a distinct human phosphodiesterase gene family: PDEllA, Proc. Natl. Acad. Sei., 97: 3702. [PDE11A ₄ ].

Tabela 1 : Lista de Enzimas e seus respectivos compostos referência de inibidor padrão das PDE' s .

PDE10A2 0,25U de PDEIOA2 Papaverina

PDEHA4 1U de PDEIIA ₄ Papaverina

[0078] De acordo com os resultados obtidos, foi possível verificar (Figuras 14 e 15) que os compostos BL230 e BL-236, respectivamente, não inibiram a atividade das enzimas PDE2A _X , PDE3A, PDE4A _IA , PDE4Bi, PDE7A e PDE8A ₁ . Enquanto que os compostos BL230 e BL-236 inibiram em 75% e 80%, respectivamente, a atividade da enzima PDEIIA ₄ . E adicionalmente, é possível observar que o composto BL-230 foi capaz de inibir em 35% a atividade da enzima PDE10A ₂ .

4.3: Atividade dos efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE3B.

[0079] Os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE3B humana foi quantificada através da medição da produção de 5'A P a partir de cAMP, utilizando enzima recombinante humano expressa em células Sf9 e o método de detecção foi utilizando HTRF ^® .

[0080] O composto teste, o composto referência ou a água (controle) foram misturados com 0,7U da enzima PDE3B em um tampão contendo 50 mM de Tris-HCl, 6 mM de MgCl ₂ , 3 mM de DTT e 0,05% de Tween ^® 20 (pH 7,8). Em seguida, a reação foi iniciada pela adição de 40 nM do substrato cAMP e a mistura foi incubada durante 30 minutos à 22 °C. Para medições de controle basal, a enzima foi omitida da mistura de reação. O aceptor de fluorescência (Dye2 cAMP marcado) e o doador de fluorescência (anticorpo anti-cAMP marcado com criptato de európio) foram adicionados, na presença de 1 mM de IBMX. Após 60 minutos, a transferência de fluorescência correspondente ao montante de cAMP residual foi medido a Àex=337 nm, Xem=620 nm e em=665 nm, utilizando um leitor de microplacas (RubyStar, BMG) . A atividade da enzima foi determinada pela divisão do sinal medido a 665 nm, pelo sinal medido a 620 nm (razão) . Os resultados foram expressos como uma porcentagem de inibição da atividade da enzima controle. 0 composto inibidor padrão de referência utilizado foi a milrinona, o qual foi testado em cada ensaio a várias concentrações para obter uma curva de inibição a partir do qual o seu valor de IC50 foi calculado.

[0081] Para este ensaio os pesquisadores utilizaram como base os ensinamentos descritos por Bender {BENDER, A.T. and BEAVO, J.A. (2006) , Cyclic nucleotíde phosphodiesterases : Molecular regulation to clinicai use, Pharmacol. Rev., 58: 488)

[0082] De acordo com os resultados obtidos, foi possível verificar (Figuras 14 e 15) que os compostos BL230 e BL-236, respectivamente, não inibiram a atividade das enzimas PDE3B.

4.4: Atividade dos efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE4D ₂ .

[0083] Os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE4D ₂ humana foram quantificados através da medição da produção de 5 ΆΜΡ a partir de cAMP utilizando uma enzima recombinante humano expressa em células Sf9 e o método de detecção utilizando foi o HTRF ^® .

[0084] O composto teste, o composto de referência ou água (controle) foram misturados com 0.75CJ de PDE4D ₂ em tampão de Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) (Invitrogen) complementado, e l,5mM de MgCl ₂ , 0,1% de albumina do soro bovino (BSA) . Em seguida, a reação foi iniciada pela adição de 40 nM do substrato cAMP e a mistura é incubada durante 15 minutos à 37 °C. Para medições de controle basal, a enzima foi omitida da mistura de reação. O aceptor de fluorescência (Dye2 cAMP marcado) e o doador de fluorescência (anticorpo anti-cA P marcado com críptato de európio) foram adicionados, na presença de 1 mM de IBMX.. Após 60 minutos a temperatura ambiente, a transferência de fluorescência correspondente ao montante de cAMP .residual foi medido a Aex=337 nm, Aem=620 nm e Aem=665 nm, utilizando um leitor de microplacas (Envision, Perkin Élmer) . A atividade da enzima foi determinada pela divisão do sinal medido a 665 nm, pelo sinal medido a 620 nm (razão) . Os resultados foram expressos como uma porcentagem de inibição da atividade da enzima controle. O composto inibidor padrão de referência utilizado foi o rolipram, o qual foi testado em cada ensaio a várias concentrações para obter uma curva de inibição a partir do qual o seu valor de IC ₅ o foi calculado.

[0085] Para este ensaio os pesquisadores utilizaram como base os ensinamentos descritos por Saldou, (SALDOU, N., et al. (1998), Comparison of recombinant human PDE4 ísoforms: interaction with substrate and inhibitors, Celi Signal., 10: 427).

[0086] De acordo com os resultados obtidos, foi possível verificar (Figuras 14 e 15) que o composto BL-230 inibiu 55% a atividade da enzima PDE4D ₂ , enquanto que o composto BL-236 não apresentou efeito inibitório para esta enzima.

4.5: Atividade dos efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade das enzimas PDE5.

[0087] Os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE5 humana foram quantificados através da medição da produção de 5 ' GMP a partir de cGMP utilizando uma enzima isolada a partir de plaquetas humanas de Cerep e o método de detecção utilizado foi o ensaio de proximidade de cintilação (SPA) .

[0088] O composto teste, o composto referência ou a água (controle) foram adicionados a um tampão contendo 40 m Tris- HC1 (pH 7,8), 3 mM de MgCl ₂ , 1,4 mM de DTT, 0,21% de BSA, 200 mM. de cloreto de amónio (NH ₄ C1) , 1 μΜ de cGMP e- 0,1 pCi de [ ³ H}cGMP. Em seguida, a reação foi iniciada pela adição da enzima (valor final, dependendo da eficiência do isolamento) e a mistura foi incubada por 60 minutos a 2.2 °C. Para medições de controle basal, a enzima foi omitida da mistura de reação. Em sequencia foram adicionadas as esferas SPA de incubação. Após 20 min a 22 °C, sob agitação, a quantidade de [ ³ H]5'GMP foi quantificada com um contador de cintilações (Topcount, Packard) . Os resultados foram expressos como uma porcentagem de inibição da atividade da enzima controle. 0 composto inibidor padrão de referência utilizado foi o dipiridamol, o qual foi testado em cada ensaio a várias concentrações para obter uma curva de inibição a partir do qual o seu valor de IC ₅ o foi calculado.

[0089] Para este ensaio os pesquisadores utilizaram como base os ensinamentos descritos por eishaar, (WEISHAAR, R.E., et al. (1986), Multiple molecular forms of cyclic nucleotide phosphodiesterase in cardiac and smooth muscle and in platelets, Biochem. Pharmacol., 35:787).

[0090] De acordo com os resultados obtidos os pesquisadores verificaram que os compostos BL-230 e BL-236 são fortes inibidores da PDE5, sendo que o BL-230 apresentou 90% de inibição e o BL-236 apresentou 86% de inibição (Figuras 14 e 15 respectivamente) .

4.6: Atividade dos efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE6.

[0091] Os efeitos dos compostos BL-230 e BL-236 sobre a atividade da enzima PDE6 humana foram quantificados através da medição da produção de 5'GMP a partir de cGMP, utilizando uma enzima isolada a partir de retina bovina da Cerep e o método de detecção utilizado foi o ensaio de proximidade de cintilação

(SPA) .

[0092] O composto teste, . o composto referência ou a água (controle) foram adicionados a um tampão contendo 40 mM Tris- HC1 (pH 7,8), 3 mM de MgCl _2/ 1,4 mM de DTT, 0,21% de BSA, 200 mM de NH ₄ C1, 2 uM de cGMP e 0,05 μθί de [ ³ H]cG P. Em seguida, a reação foi iniciada pela adição da enzima (valor final, dependendo da eficiência do isolamento) e a mistura foi incubada por 60 minutos a 22 °C. Para medições de controle basal, a enzima foi omitida da mistura de reação. Em sequencia foram adicionadas as esferas SPA de incubação. Após 20 minutos a 22 °C, sob agitação, a quantidade de [ ³ H]5'GMP foi quantificada com um contador de cintilações (Topcount, Packard) . Os resultados foram expressos como uma porcentagem de inibição da atividade da enzima controle. O composto inibidor padrão de referência utilizado foi o zaprinaste, o qual foi testado em cada ensaio a várias concentrações para obter uma curva de inibição a partir do qual o seu valor de IC ₅₀ foi calculado.

[0093] Para este ensaio os pesquisadores utilizaram como base os ensinamentos descritos por Ballard, (BALLARD, A. S., et al. (1998), Effects of Sildenafil on the relaxation of human corpus cavernosum tissue in vitro and on the activities of cyclic nucleotide phosphodiesterase isozymes, J. Urol., 159: 2164) .

[0094] De acordo com os resultados obtidos os pesquisadores verificaram que os compostos BL-230 e BL-236 são fortes inibidores da PDE6, sendo que o BL-230 apresentou 85% de inibição e o BL-236 apresentou 90% de inibição (Figuras 14 e 15 respectivamente) .

[0095] Independente dos testes utilizados, os resultados obtidos que mostram uma inibição (ou estimulação) superior a 50% são indicativos de efeito forte. Os resultados que mostram uma inibição (ou estimulação) entre 25 % e 50% são indicativos de efeito fraco ou moderado. Os resultados com inibição (ou estimulação) inferiores a 25% .não ..são considerados significativos, e principalmente, são atribuídos à variabilidade do sinal em torno do controle.