NOUVEAUX PEPTIDES ACTIVATEURS DE LA SYNTHESE DES PROTEINES DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ET COMPOSITIONS COSMETIQUES

LES COMPRENANT Domaine de l'invention

La présente invention se situe dans le domaine des agents actifs cosmétiques et dermato-pharmaceutiques ainsi qu'aux compositions en comportant.

La présente invention a pour objet de fournir de nouveaux peptides activateurs de l'expression des protéines de la matrice extracellulaire.

L'invention se rapporte également à des compositions cosmétiques comprenant de tels peptides, en tant qu'agents actifs, dans un milieu physiologiquement adapté.

L'invention concerne encore l'utilisation de telles compositions pour augmenter l'expression des protéines de la matrice extracellulaire, retarder l'apparition et/ou lutter contre les signes cutanés du vieillissement, et en particulier les rides, le relâchement et la perte de volume cutané et la déshydratation de la peau et enfin, à des méthodes de soin cosmétiques destinées à retarder l'apparition et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photovieillissement.

Arrière-plan de l'invention

La peau est un organe de recouvrement composé de plusieurs couches (derme, jonction dermo-épidermique, épiderme). Le derme est le tissu de soutien de la peau et se compose d'eau, de fibres d'élastine et de fibres de collagène (70 % des fibres dermiques), enveloppées dans une matrice interstitielle de protéoglycannes. Les fibroblastes sont la principale composante cellulaire du derme et sont à l'origine de la synthèse des fibres de collagène et des fibres d'élastine.

Les glycosaminoglycanes assurent la structuration des fibrilles de collagène et d'élastine et le stockage de l'eau, grâce à leur exceptionnelle hygroscopie. L'acide hyaluronique est le glycosaminoglycane le plus abondant de la peau, et le constituant majeur du derme mais est également présent autour des kératinocytes dans Γ épiderme. Les complexes de glycosaminoglycanes et de collagène sont des acteurs majeurs de la souplesse et de la fermeté de la peau.

La peau, comme tous les autres organes, est soumise au processus physiologique complexe du vieillissement. On distingue le vieillissement intrinsèque ou chronologique et le vieillissement extrinsèque. Le vieillissement intrinsèque est la conséquence d'une sénescence génétiquement programmée et d'altérations biochimiques dues à des facteurs endogènes. Au niveau de la peau, il se caractérise par un ralentissement de la régénération des cellules et des matrices extracellulaires, aboutissant à une atrophie dermique et épidermique, une sécheresse, une réduction de l'élasticité, et l'apparition de ridules et de rides.

Le vieillissement extrinsèque, quant à lui, est dû aux agressions environnementales telles que la pollution, le soleil, les maladies, les habitudes de vie, etc. Il se superpose au vieillissement intrinsèque au niveau des zones chroniquement exposées à ces agressions; on parle alors de photovieillissement. Les principales altérations liées au photovieillissement comprennent : l'apparition de tâches pigmentaires ainsi qu'une diminution, une désorganisation des fibres de collagène provoquant l'apparition de rides.

Les recherches pour identifier des agents actifs capables de lutter contre le vieillissement cutané ont abouti à la mise sur le marché de nombreux agents actifs plus ou moins efficaces. Toutefois, il reste toujours d'actualité d'identifier de nouveaux composés capables de retarder l'apparition ou de lutter plus efficacement contre les signes du vieillissement cutané. Le problème plus particulièrement visé par l'invention est d'identifier de nouveaux agents actifs capables de lutter contre les principaux signes du vieillissement cutané siégeant au niveau de la matrice extracellulaire.

Exposé de l'invention

Les inventeurs ont mis en évidence que des peptides de formule générale (I) suivante :

Ri-(AA) _n -Xi-Pro-X ₂ -Gly-Pro-X ₃ -X ₄ -(AA) _p -R ₂

étaient de bons agents activateurs de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire. En conséquence, ces peptides sont adaptés pour lutter contre le vieillissement et le photovieillissement de la peau.

Les peptides selon l'invention se caractérisent par le fait qu'ils :

- augmentent l'expression des collagènes de type I et III

- augmentent l'expression de la fibronectine,

- augmentent l'expression de l'acide hyaluronique,

- réduisent les signes de sénescence des fibroblastes

On entend par « peptide ou agent actif activateur des protéines de la matrice extracellulaire», tout peptide de formule générale (I) capable d'augmenter la quantité de collagène, de fibronectine et d'acide hyaluronique présente dans la cellule, ou sécrétée soit en augmentant la synthèse protéique par modulation directe ou indirecte de l'expression génique, soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager.

On entend par « signes de sénescence des fibroblastes » le profil d'expression de marqueurs biochimiques associés au phénotype de sénescence cellulaire.

On entend par peau, l'ensemble des tissus de recouvrement constituant la peau, les muqueuses et les phanères, y compris les cheveux, les cils et les sourcils.

Ainsi, l'invention a pour objet premier un peptide de formule générale (I)

Ri -(AA)n-X] -Pro-X ₂ -Gly-Pro-X ₃ -X ₄ -(A A) _p -R ₂

Dans laquelle

Xi représente la glycine ou l'alanine ou la valine,

X ₂ représente la glycine ou l'alanine ou la valine,

X ₃ représente l'asparagine ou la lysine ou la glutamine ou aucun acide aminé,

4 représente la phénylalanine ou la tyrosine ou aucun acide aminé,

AA représente un acide aminé quelconque et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 2,

Rt représente la fonction aminé primaire dè l'acide aminé N-terminal, -NH2, dans laquelle un des deux atomes d'hydrogène peut être substitué soit par une chaîne alkyle de Ci à C ₃₀ saturée ou insaturée, soit par un groupement de type acyle (R-CO-) dans lequel le radical R est une chaîne alkyle de Ci à C ₃₀ saturée ou insaturée et de préférence un méthyle, soit par un groupement aromatique de type benzoyle, tosyle ou benzyloxycarbonyle,

R ₂ représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, -OH, dans lequel l'atome d'hydrogène peut être substitué par une chaîne alkyle de C _\ à C ₃₀ , ou un groupement NH ₂ , NHY ou NYY, dans lequel Y représente une chaîne alkyle de Q à C ₄ ,

ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 5 à 1 1 résidus d'acides aminés et pouvant être sous forme de sels. Selon une méthode de réalisation de l'invention tout particulièrement préférée, le peptide est de séquence :

(SEQ ID n°l) : Ala-Pro-Ala-Gly-Pro-NH ₂

(SEQ ID n°2) : Val-Pro-Ala-Gly-Pro

(SEQ ID n°3) : Val-Pro-Gly-Gly-Pro-NH ₂ - -

(SEQ ID n°4) : Gly-Pro-Ala-Gly-Pro

(SEQ ID n°5) : Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-NH ₂

(SEQ ID n°6) : Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-GLy-Pro-Asn-Tyr-NH ₂ Selon un mode de réalisation particulièrement intéressant, le peptide correspond à la séquence SEQ ID n°4.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement intéressant, le peptide correspond à la séquence SEQ ID n°5. Les acides aminés, constituant le peptide selon l'invention et désignés sous les termes

AA, peuvent être sous configuration isomérique L- et D-. De manière préférentielle, les acides aminés sont sous forme L.

Le terme « peptide » désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques.

Par « peptide », il faut également entendre le peptide naturel ou,, synthétique de l'invention tel que décrit ci-dessus, ou au moins l'un de ses fragments, qu'il soit obtenu par protéolyse ou de manière synthétique, ou encore tout peptide naturel ou synthétique dont la séquence est totalement ou partiellement constituée par la séquence du peptide précédemment décrit.

De façon à améliorer la résistance à la dégradation, il peut être nécessaire d'utiliser une forme protégée du peptide selon l'invention. Il est possible de protéger la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, soit par une substitution par un groupement R] de type acyle (R-CO-) dans lequel le radical R est une chaîne alkyle de Cj à C ₃₀ saturée ou insaturée de préférence de type méthyle, soit par une substitution par un groupement aromatique de type benzoyle, tosyle, ou benzyloxycarbonyle.

De préférence, on réalise une protection de la fonction carboxyle de l'acide aminé C- terminal, par une substitution par un groupement R ₂ de type chaîne alkyle de Q à C ₃₀ , ou un groupement NH ₂ , NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de d à C ₄ .

Le peptide selon l'invention, de séquence SEQ ID n°l à SEQ ID n°6, peut être protégé au niveau de l'extrémité N-terminale, C-terminale ou au niveau des deux extrémités.

Le peptide de formule générale (I) selon l'invention peut être obtenu soit par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide), soit par synthèse enzymatique (Kullman et al. J. Biol. Chem., 1980, vol. 225, p. 8234) à partir d'acides aminés constitutifs.

Le peptide selon l'invention peut être d'origine naturelle ou synthétique. Préférentiellement selon l'invention, le peptide est d'origine synthétique, obtenu par synthèse chimique.

Selon l'invention, l'agent actif peut être un peptide unique ou un mélange de peptides.

Le peptide selon l'invention est avantageusement solubilisé dans un ou plusieurs solvants physiologiquement adaptés, tels que l'eau, le glycérol, Péthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.

Par « physiologiquement adapté », on entend des solvants ou des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque de toxicité, d'intolérance, d'instabilité, de réponse allergique et autres effets secondaires.

Le peptide dilué est ensuite stérilisé par filtration stérile.

Après cette étape de dilution, le peptide peut être encapsulé ou inclu dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement adapté.

L'invention a pour deuxième objet une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement adapté, un peptide de formule générale (I), en tant qu'agent actif activateur de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire de la peau.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'agent actif est présent dans les compositions à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 mg/kg, et préférentiellement entre 0,01 et 5 mg/kg par rapport au poids total de la composition finale. Cette fourchette de concentrations représente la quantité nécessaire d'agent actif pour obtenir l'effet moléculaire recherché, à savoir, activer l'expression des collagènes de type I et III, de la fibronectine et de l'acide hyaluronique.

De manière préférée, la composition selon l'invention se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu physiologiquement adapté pour la peau. On entend par « application topique », le fait d'appliquer ou d'étaler l'agent actif selon l'invention, ou une composition le contenant, sur la surface de la peau.

Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydro-alcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples, de gel aqueux ou anhydre, de colloïde. Ces compositions peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'une crème, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick, ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau.

L'ensemble de ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des co-solvants (éthanol, glycérol, alcool benzylique, humectant...), des épaississants, des diluants, des émulsionnants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des huiles essentielles, des oligo-éléments, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, des filtres chimiques ou minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales etc. On peut, par exemple, citer des polymères hydrosolubles de type polymère naturel, tels que les polysaccharides, ou polypeptides, des dérivés cellulosiques de type méthylcellulose ou hydroxypropylcellulose, ou encore des polymères synthétiques, polaxamères, carbomères, siloxanes, PVA ou PVP, et notamment les polymères vendus par la société ISP.

Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, être présents à des concentrations allant de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. _

Il est bien entendu que l'agent actif selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec d'autres agents actifs.

Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent, en outre, au moins un autre agent actif destiné à renforcer l'action de l'agent actif selon l'invention, dans le domaine de la prévention et de l'amélioration des signes cutanés du vieillissement, ou encore un autre agent actif permettant d'élargir la gamme de propriétés de la composition considérée.

On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : les agents régénérants, anti-âges, antirides, apaisants, anti-radicalaires, anti-glycation, hydratants, antibactériens, antifongiques, kératolytiques, myorelaxants, desquamants, raffermissants, les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique ou la microcirculation ou la pousse des ongles ou la pousse des cheveux, les agents modulant la différenciation ou la pigmentation de l'épiderme, les agents inhibant les métallo-protéinases, ou encore les écrans ou filtres solaires.

Dans un mode plus particulier de réalisation, la composition selon l'invention comprendra, outre le peptide selon l'invention,

- au moins un composé activateur du cytochrome c et/ou,

- au moins un composé hydratant, tel qu'un composé activateur des aquaporines et/ou,

- au moins un composé activateur des sirtuines et/ou,

- au moins un composé qui augmente l'adhésion cellulaire et/ou,

- au moins un composé qui augmente la production de protéines matricielles telles que le collagène, fibronectine, laminine, glycosaminoglycanes et/ou,

- au moins un composé modulateur de l'activité du protéasome et/ou,

- au moins un composé modulateur du rythme circadien et/ou,

- au moins un composé modulateur des protéines HSP et/ou,

- au moins un composé qui augmente l'énergie cellulaire et/ou,

- au moins un composé modulant la pigmentation de la peau et/ou,

- au moins un composé activateur du coenzyme Q10 et/ou,

- au moins un composé améliorant la fonction barrière, tel qu'un composé activateur de la transglutaminase ou de la HMG-CoA réductase et/ou,

- au moins un composé protecteur de la mitochondrie.

Lesdits composés ci-dessus peuvent être d'origine naturelle, comme des hydrolysats peptidiques de plantes, ou encore d'origine synthétique, comme des peptides. Indépendamment de leurs fonctions, les autres agents actifs associés à l'agent actif selon l'invention dans la composition pourront avoir des structures chimiques très diverses. On peut citer de manière non limitative, les peptides, la vitamine C et ses dérivés, les vitamines du groupe B, la DHEA (dihydroépiandrostérone), les phytostérols, l'acide salicylique et ses dérivés, les rétinoïdes, les flavonoïdes, les aminés de sucres, les azoles, les sels métalliques, les extraits peptidiques d'origine végétale ou encore les polymères.

L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une composition cosmétique, comprenant le peptide de formule générale (I) en tant qu'agent actif, pour augmenter la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire par les cellules de la peau.

Plus particulièrement, le peptide selon l'invention est utilisé pour augmenter la synthèse des collagènes I et III et de la fibronectine par les fibroblastes de la peau humaine.

Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide de formule générale (I) est utilisé pour augmenter la densité du derme, et donc la fermeté de la peau, de retarder ou réduire le relâchement des traits du visage, la perte de volume du derme, l'amincissement de la peau, l'atonie, les ridules, les rides profondes et l'atrophie dermique.

L'invention a pour quatrième objet l'utilisation d'une composition cosmétique, comprenant le peptide de formule générale (I) en tant qu'agent actif pour augmenter l'expression de l'acide hyaluronique, à la fois par les fibroblastes et par les kératinocytes.

Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide de formule générale (I) est utilisé pour augmenter la capacité de toutes les couches de la peau à retenir l'eau et retarder ou réduire la déshydratation de la peau liée au vieillissement. L'invention a pour cinquième objet l'utilisation d'une composition cosmétique, comprenant le peptide de formule générale (I) en tant qu'agent actif pour retarder l'apparition ou diminuer la sénescence des cellules de la peau.

On entend par l'expression « retarder l'apparition ou diminuer la sénescence des cellules du derme» que, selon cet aspect avantageux de l'invention, le peptide de l'invention diminue l'expression de marqueurs de sénescence dans des fibroblastes humains dont la sénescence a été induite par extinction du gène FOX03a. L'invention a pour sixième objet une méthode de soin cosmétique destinée à retarder et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photovieillissement, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition selon l'invention.

Par manifestations cutanées du vieillissement, on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, l'amincissement de la peau, le relâchement, la perte d'hydratation et l'atonie, les rides profondes et les ridules, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique ou toute autre dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnement UV. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif.

Exemple 1 : Mise en évidence de l'effet activateur des peptides SEQ ID n°4 et n°5 sur l'expression du collagène I, du collagène III, du procollagène, de la fibronectine et de l'acide hyaluronique dans des fibroblastes humains

Le but de cette étude est de déterminer l'influence des peptides SEQ ID n°4 et n°5 et du peptide SEQ ID n°4 sur l'expression des protéines de la matrice extracellulaire suivantes : collagène I, collagène III, pro-collagène, fibronectine et acide hyaluronique dans les fibroblastes humains. Pour cela, des marquages spécifiques ont été réalisés sur des cultures de fibroblastes humains normaux issus du derme.

Protocole des marquages spécifiques : Des fibroblastes humains en culture sont traités avec le peptide SEQ ID n°5 ou le peptide SEQ ID n°4 à une concentration finale de 0,5%, 1% et/ou 3% (à partir d'une solution mère à 40 mg/kg), pendant 24, 48 et/ou 72 heures. Les cellules sont ensuite lavées, fixées au méthanol froid pendant 4 minutes à 4°C (pour les marquages collagène I, collagène III et acide hyaluronique) ou au formaldéhyde à 3.7% pendant 10 minutes à température ambiante (pour les marquages pro-collagène et fibronectine). Les cellules sont incubées en présence d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène I (Rockland, Réf : 600-401-103-0.5), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène III (Rockland, Réf : 600-401-105-0.5), d'un anticorps polyclonal de rat spécifique du pro-collagène (Millipore, Réf : MAB1912), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de la fibronectine (Sigma, Réf : F-3648), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : A21206) ou anti-rat couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Al 1006). Pour le marquage de l'acide hyaluronique, les cellules sont incubées en présence d'une protéine biotinylée spécifique (Coger, Réf : 4007631 A), puis en présence de streptavidine couplée à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : S32354). Les cellules sont alors examinées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope).

Résultats : Dans toutes les conditions testées, on observe une fluorescence plus intense dans les fibroblastes traités par le peptide SEQ ID n°5 ou le peptide SEQ ID n°4 que dans les conditions contrôle.

Conclusions : Les peptides SEQ ID n°5 et SEQ ID n°4 stimulent l'expression du collagène I, du collagène III, du pro-collagène, de la fibronectine et de l'acide hyaluronique par les fibroblastes humains dermiques.

Exemple 2 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°5 sur de l'expression du collagène I, du collagène III, du pro-collagène et de l'acide hyaluronique dans des biopsies de peau

Le but de cette étude est de déterminer l'influence du peptide SEQ ID n°5 sur l'expression des protéines de la matrice extracellulaire suivantes : collagène I, collagène III, pro-collagène, fibronectine et acide hyaluronique dans la peau humaine. Pour cela des marquages spécifiques ont été réalisés sur des échantillons de peaux humaines cultivés ex vivo.

Protocole : Des échantillons de peau humaine sont mis en culture à l'interface air/liquide. Le peptide SEQ ID n°5 est appliqué topiquement sur les échantillons à des concentrations finales de 0,5 %, 1 % ou 3 %, (à partir d'une solution mère à 40 mg/kg) puis les échantillons sont incubés durant 24, 48 et/ou 72 heures à 37°C.

Ces échantillons de peau sont ensuite fixés avec du formaldéhyde puis inclus dans de la paraffine ou fixés et inclus dans de l'OCT puis congelés à -20° C. Des coupes de 4 μιη d'épaisseur sont alors réalisées (6 μιη pour les coupes à froid).

Les marquages du collagène I et du collagène III, sur les échantillons inclus en paraffine, sont effectués après démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène I (Rockland, Ref : 600-401-103-0.5), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène III (Rockland, Ref : 600-401-105-0.5), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : A21206). Pour le marquage de l'acide hyaluronique, les cellules sont incubées en présence d'une protéine biotinylée spécifique (Coger, Réf : 4007631 A), puis en présence de streptavidine couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : S32354).

L'immunomarquage du pro-collagène, sur les échantillons inclus dans de l'OCT, est effectué après une fixation de 10 minutes à l'acétone froid. L'immunomarquage est réalisé à l'aide d'un anticorps polyclonal de rat spécifique du pro-collagène (Millipore, Réf : MAB1912) puis d'un anticorps secondaire anti-rat, couplé à un marqueur fluorescent (Invitrogen, Al 1006).

Les cellules sont alors examinées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope).

Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence plus intense au niveau du derme des échantillons de peau traités avec le peptide SEQ ID n°5. Dans le cas de l'immunomarquage de l'acide hyaluronique, on observe également une augmentation de la fluorescence au niveau de l'épidémie des échantillons de peau traités avec le peptide SEQ ID n°5.

Conclusions : Le peptide SEQ ID n°5 stimule l'expression du collagène I, du collagène III, du pro-collagène dans le derme et stimule l'expression de l'acide hyaluronique dans le derme et l'épiderme humains.

Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°5 sur l'expression des ARNs messagers du collagène I par PCR en temps réel

Le but de cette étude est de déterminer l'influence du peptide SEQ ID n°5 sur l'expression des ARNs messagers du collagène I dans les fibroblastes humains. Pour cela, l'expression du collagène I a été étudiée par PCR en temps réel.

Protocole : Des fibroblastes humains en culture sont traités avec le peptide SEQ ID n°5 à des concentrations finales de 0,5 % et 1 % (à partir d'une solution mère à 40 mg/kg) pendant 24, 48 et 72 heures. Les ARNs totaux sont extraits à l'aide d'un kit d'extraction (QIAGEN), puis reverse transcrit avec un kit spécifique contenant des inhibiteurs de RNase (Applied Biosystems). Une PCR en temps réel est réalisée dans un fhermocycleur à l'aide d'un TaqMan Gene Expression Assay spécifique du Collagène I (Applied Biosystem, Hs99999901_sl) et d'un TaqMan Gene Expression Assay spécifique du 18S utilisé comme contrôle endogène (Applied Biosystem, Hs00164004_ml). La quantification relative de l'expression des ARNs messager du Collagène I est réalisée par la méthode comparative des Ct (le Ct, threshold cycle, est l'intersection entre la courbe d'amplification et la ligne seuil).

Résultats/Conclusion : Le peptide SEQ ID n°5 stimule l'expression des ARNs messagers du Collagène I dans les fibroblastes humains.

Exemple 4 : Etude de l'expression du marqueur de sénescence P16 en présence du peptide SEQ ID n°5

Le but de cette étude est de déterminer l'influence du peptide SEQ ID n°5 sur l'expression de PI 6, une protéine dont l'expression dans la peau augmente avec l'âge. PI 6 est une protéine impliquée dans la régulation négative du cycle cellulaire, qui a été décrite comme un marqueur fiable de la sénescence celllulaire (Brookes S. et al. Expérimental Cell Research 298, 2004).

Protocole : Des fibroblastes humains en culture sont traités avec le peptide SEQ ID n°5 à des concentrations finales de 0,5 % et 1 % (à partir d'une solution mère à 40 mg/kg) pendant 48 heures. Les cellules sont préparées selon le kit Shandon Cytoblock® Cell préparation System (Thermo Scientiflc, Ref : 7401150).

Les cellules sont ensuite fixées au formaldéhyde puis incluses dans de la paraffine. Des coupes de 4 μιη sont alors réalisées. Le marquage de pl6 sur les cellules incluses en paraffine est effectué après démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps polyclonal de souris spécifique de pl6 (Santa-Cruz, Ref : sc- 81157), puis d'un anticorps secondaire anti-souris couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : A21202). Les cellules sont alors examinées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope).

Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence nucléaire moins intense dans les cellules traitées par le peptide SEQ ID n°5.

Conclusions : Le peptide SEQ ID n°5 diminue l'expression du marqueur de sénescence p!6 dans les fibroblastes humains. Exemple 5 : Mise en évidence de la réversion de la sénescence celullaire induite chez des fibroblastes, par le peptide SEQ ID n°5

Le but de cette étude est de déterminer l'influence du peptide SEQ ID n°5 sur des fibroblastes sénescents, dont la sénescence a été induite par l'extinction du gène FOX03a. Ces cellules surexpriment la bêta-galactosidase, en relation avec leur état sénescent.

FOX03a est un facteur de transcription de type Forkhead impliqué dans la longévité cellulaire. Dans la peau, la régulation négative de FOX03a accélère la sénescence des fibroblastes humains normaux (Hyun Kyoung K . et al. J. of Gerontol., 2005, vol. 60A n°l, pages 4-9). Cette propriété a été mise à profit pour induire la sénescence dans des fibroblastes humains en éteignant l'expression de FOX03a par un ARN interférant (siRNA) spécifique.

Protocole : Des fibroblastes humains en culture sont rendus sénescents par un traitement avec un siRNA spécifique de FOX03a à une concentration finale de 25 nM en utilisant la technique de transfection par la Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen, Ref : 13778- 075). Des contrôles non traités sont réalisés. Les fibroblastes sont en parallèle traités par le peptide SEQ ID n°5 à une concentration finale de 1% (à partir d'une solution mère à 40 mg/kg) pendant 48 heures.

Les cellules sont rincées et fixées dans un tampon de fixation (0,2 % glutaraldéhyde, 2 % formaldéhyde). Les cellules sont ensuite incubées à 37°C sans C02 pendant 24 heures avec une solution de X-Gal à 1 mg/mL dans 40 mM d'acide citrique/phosphate (pH 6), 5 mM K3FeCN6, 5 mM K4FeCN6, 150 mM NaCl and 2 mM MgC12. Les cellules sont alors examinées au microscope à lumière blanche (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Les cellules sénescentes ayant une activité β-galactosidase spécifique sont colorées en bleu. Les cellules traitées avec le siRNA spécifique de FOX03a montrent une augmentation de l'activité β-galactosidase liée à l'induction de la sénescence, se traduisant par une augmentation du nombre de cellules colorées en bleue. Les cellules traitées avec les siRNAs spécifiques de FOX03a et le peptide SEQ ID n°5 à 1% montrent une diminution de l'activité β-galactosidase, se traduisant par une diminution du nombre de cellules colorées en bleu.

Conclusion : Le peptide SEQ ID n°5 est capable de diminuer le phénotype de sénescence induite dans des fibroblastes humains. Exemple 6 : Préparation de compositions

1 -Crème visage anti-âge

- -

Préparer et fondre la phase A à 65-70°C. Chauffer la phase C à 65-70°C. La phase B est ajoutée à la phase A juste avant d'émulsionner A dans C. A environ 45 °C, le carbomer est neutralisé par addition de la phase D. A environ 30°C, la phase E est ensuite additionnée sous légère agitation et le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C. La phase F est alors additionnée si souhaité.