Il a été montré récemment qu'un duplexe formé de deux courtes séquences d'oligonucléotides complémentaires (20-22 nucléotides de préférence) est capable de reconnaître spécifiquement un ARN messager ciblé et d'induire dans un contexte cellulaire la dégradation du messager. Une coupure unique de l'ARN messager empêche alors la traduction du messager en protéine (Tuschl et al., 1999 ; Zamore et al., 2000 ; Elbashir et al., 2001a ; Elbashir et al., 2001b).

Le terme d'ARN interférence a été introduit après la découverte montrant que l'injection d'ARN double brin dans le nématode C. elegans conduisait à une absence d'expression spécifique de l'ARN messager portant la séquence homologue reconnue par l'ARN double brin (Fire et al., 1998).

Les duplexes d'ARN interférents sont devenus des outils très prometteurs pour l'étude de la fonction des protéines. En effet, la suppression de l'expression d'une protéine par cette technique ne nécessite plus d'invalider le gène. Par contre, cette technique nécessite l'introduction des duplexes d'ARN interférents dans la cellule et dans les compartiments où se trouvent leur cible moléculaire, l'ARN messager, c'est-à-dire dans le cytosol. Pour cela des vecteurs de transfection sont utilisés pour introduire les ARNi dans la cellule sous forme de complexes ARN/vecteur. Les premiers travaux d'interférence de l'expression des protéines dans des cellules eucaryotes ont été réalisés en utilisant l'Oligofectamine comme vecteur de transfection (Elbashir et al., 2001b). La protéine ciblée était la lamine A/C qui s'exprime dans le noyau cellulaire (Elbashir et al., 2001b).

Les travaux des inventeurs ont montré qu'il était possible d'inhiber de manière spécifique l'expression de protéines avec seulement des concentrations en ARNi de l'ordre du nanomolaire en utilisant comme vecteur de transfection une composition à base d'une lipopolyamine, composé connu jusqu'à présent comme vecteur de transfert d'acides nucléiques.

L'invention a donc pour but l'utilisation d'une telle composition comme vecteurs de transfection d'ARN double brin à propriétés d'interférence.

Elle a également pour but de fournir de nouveaux vecteurs pour ces acides nucléiques.

L'invention vise également une méthode pour transfecter in vitro des acides nucléiques dans des cellules eucaryotes en culture.

L'utilisation selon l'invention d'un vecteur pour la transfection. d'acides nucléiques actifs pour l'ARN interférence est caractérisée en ce que ledit vecteur est une composition à base de dioctadécylamidoglycylspermine (DOGS en abrégé).

Le vecteur lipidique cationique DOGS est un vecteur de transfert d'acide nucléique (oligonucléotide, plasmide) décrit par Behr et al., 1989. La synthèse du produit et son application au domaine du transfert d'acides nucléiques (gènes et oligonucléotides) dans des cellules font l'objet des brevets EP 0394 111 B1 et US 5,476, 962.

Cette molécule est actuellement commercialisée par Promega sous la marque TransfectaSM, pour l'application transfert de gènes. De manière surprenante, les inventeurs ont constaté que cette molécule était efficace pour induire le mécanisme d'ARN interférence et vectoriser des acides nucléiques interférents dans des cellules eucaryotes.

Dans une disposition de l'invention, le vecteur est constitué par DOGS.

Dans une autre disposition, DOGS est utilisé en combinaison avec au moins un composé choisi dans le groupe comprenant : les lipides cationiques ou neutres, comme le cholestérol, participant à la complexation et à la formulation des ARN interférents, les détergents cationiques ou neutres participant à la formulation des ARN interférents et au processus de transfection, les phospholipides neutres ou chargés, comme la dioléolylphosphatidyléthanolamine (DOPE, participant à la formulation des ARN interférents et au processus de transfection, des peptides fusiogènes participant au processus de transfection, des protéines, comme les histones, participant au transport intracellulaire des complexes de transfection, des polymères hydrophiles, tels que des PEGs, participant à la formulation des ARN interférents et au processus de transfection, des polymères cationiques, tels que les polyéthylènimines et ces dérivés, participant à la complexation et à la formulation des ARN interférents et au processus de transfection, des molécules de reconnaissance de récepteurs tels que des ligands de différente nature (protéines, peptides, anticorps, métabolites, oses, vitamines).

Les acides nucléiques vectorisés sont des acides nucléiques actifs pour l'ARN interférence. Il s'agit avantageusement de duplexes d'ARNi interférents tels qu'ils sont définis dans les brevets EP 0 985 833 et WO 0 244 321.

Ces acides nucléiques peuvent être chimiquement modifiés.

De préférence, chaque brin d'ARNi comporte de 18 à 24 nucléotides.

Les brins sont plus spécialement appariés sur une région homologue d'au moins 18 nucléotides. Ils présentent avantageusement des extrémités 3'non appariées sur une longueur de 2 à 4 nucléotides.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la protéine ciblée est une protéine endogène ou une protéine hétérologue exprimée de façon stable.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la protéine ciblée est une protéine exogène. L'expression de a protéine exogène peut être obtenue de façon simultanée dans la cellule par co-transfection du gène de la protéine ciblée et des ARN interférents. En variante, l'expression protéine exogène dans la cellule peut être obtenue par transfection du gène correspondant avant ou après l'introduction des ARN interférents.

Pour la transfection de cellules in vitro, on a avantageusement recours à des vecteurs/acides nucléiques interférents contenant en outre au moins un composé du groupe défini ci-dessus et un milieu tamponné et salin pour la transfection de cellules en culture in vitro.

Pour la transfection de cellules in vivo, les formulations sont telles qu'indiquées ci-dessus mais comprennent un milieu tamponné iso-osmotique, ou faiblement salin, ou hypotonique.

Lesdites formulations sont avantageusement administrables par voie injectable ou topique, sur la peau ou les muqueuses, et contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

On notera également avec intérêt que les compositions de vecteurs/acides nucléiques interférents induisent un effet régulateur sur l'expression d'une ou de plusieurs protéines cibles responsables ou impliqués dans des maladies génétiques héréditaires, des maladies génétiques complexes, comme le cancer, ou des infections virales.

L'invention vise également une méthode de transfection d'acides nucléiques actifs par l'ARN interférence, caractérisée en ce qu'elle comprend : - l'incubation d'un complexe de transfection comprenant un vecteur, et une composition lipidique avec des cellules en culture.

Les vecteurs de transfection d'acides nucléiques actifs pour l'ARN interférence entrent également dans le champ de l'invention. Ces vecteurs sont caractérisés en ce qu'il s'agit de complexes comprenant un vecteur et une composition lipidique tels que définis ci-dessus, avec des cellules en culture.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 8, qui représentent respectivement, la figure 1, les résultats de l'analyse par cytométrie en flux de la quantité de lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées ou non par les ARNi anti-lamine A/C complexés au DOGS après marquage par immunofluorescence ; la figure 2, l'analyse des résultats obtenus par cytométrie en flux pour évaluer la quantité de lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées ou non par les ARN interférents (ARNi) anti-lamine A/C complexés au DOGS après marquage par immunofluorescence ; la figure 3, l'analyse par microscopie de fluorescence du marquage de la lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées (B, 100 nm duplexes) ou non (A, 100 % d'expression de la lamine A/C) par les ARN interférents anti- lamine A/C complexés au DOGS 72 h après la transfection ; la figure 4, l'analyse par cytométrie en flux de la quantité de lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées ou non par les ARN interférents anti-lamine A/C complexés au DOGS après marquage par immunofluorescence (48 h après la transfection) ; la figure 5, l'analyse par cytométrie en flux de la quantité de lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées ou non par les ARN interférents anti-lamine A/C complexés au DOGS après marquage par immunofluorescence (72 h après la transfection) ; la figure 6, l'analyse par cytométrie en flux de la quantité de lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées ou non par les ARN interférents anti-lamine A/C complexés au DOGS après marquage par immunofluorescence : A) effet de la concentration, B) effet du rapport N/P ; la figure 7, l'expression du gène luciférase 24 h après la cotransfection des cellules avec le plasmide pCMVLuc ou des ARN interférents anti-luciférase ou des ARN contrôles (luciférase mutés) ; et la figure 8, l'efficacité de l'extinction (en %) de la luciférase après co-transfection avec du DOGS et le mélange plasmide pCMVLuc (200 ng) et ARN interférents (10 nM, barre rouge) ou des ARN contrôles (barre bleue) dans différentes cellules.

Exemple 1 : Vectorisation d'ARN interférents par le DOGS et interférence de l'expression d'une protéine endogène la lamine A/C On rapporte ci-après les résultats obtenus avec le test d'interférence de la lamine A/C.

Deux approches sont décrites : Dans la première, on suit l'expression de la lamine A/C par un test d'immunofluorescence et on analyse le marquage obtenu par microscopie de fluorescence pour vérifier les marquages nucléaires et l'absence d'expression dans les cellules in vitro.

Dans la deuxième approche, on effectue le suivi de l'expression de la protéine par immunofluorescence couplée. à une analyse par cytométrie en flux, ce qui permet d'accéder au pourcentage de cellules affectées dans l'expression de la protéine ciblée et à l'intensité du phénomène d'interférence.

A-. Description du modèle Lamine A/C et protocoles Les lamines A/C sont des protéines de structure du noyau.

La séquence du duplexe ciblant l'ARN messager, ainsi que la partie nucléique bordante de chaque ARN interférent dans le duplexe, sont données ci-après.

Région ciblée sur l'ARN messager Lamine A/C (SEQ ID N°1) : 5'AACTGGACTTCCAGAAGAACATC Duplexe d'ARNi utilisé : Séquence sens (SEQ ID N°2) : 5'CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT Séquence antisens (SEQ ID N°3) : 5' UGUUCUUCUGGAAGUCCAGdTdT Principe du test cellulaire JO Mise en culture des cellules adhérentes J1 Préparation des complexes ARNsi/DOGS, puis transfection cellulaire J3-4 Réalisation du test d'immunofluorescence suivi d'une analyse de la fluorescence par cytométrie en flux ou microscopie de fluorescence Protocole du test 1) Test d'immunofluorescence pour l'analyse par cytométrie en flux Culture cellulaire Les cellules humaines HeLa (carcinome épithélial, ATCC CCL 2) sont mises en culture dans 2 ml de milieu MEM de Dulbeco contenant des sels de Earle, de la glutamine, des antibiotiques (pénicilline/streptomycine) et 10 % sérum de veau foetal, à raison de 80 000 cellules/puits (format plaque 12 puits).

Préparation des complexes Solution A : X nmoles de duplexe ARN interférents (solution stock 20 uM) qsp 50 pi de milieu MEM.

Solution B : Y nmoles de DOGS (solution stock à 6 mM amines dans l'éthanol) qsp 50 pi de milieu MEM. Le rapport de charges +/- (N/P= amine DOGS/phosphate ARN) est fixé à 6.

Les solutions A et B sont préparées, mélangées avec un vortex, et laissées 5 min à T° ambiante. Puis la solution B est ajoutée sur la solution A, le mélange est vortexé, puis on attend 30 min à température ambiante.

Transfection 100 pi de-complexes ARNi/DOGS sont ajoutés par puits contenant 1 ml de milieu MEM sans sérum. La plaque est alors incubée à 37°C en présence de 5 % de C02. Après 4h d'incubation, 1 ml de milieu MEM contenant 20 % de sérum est ajoutée. La plaque est incubée à 37°C.

Test d'immunofluorescence 48-72h après la transfection, le milieu de culture est éliminé. Les cellules sont détachées après une incubation à 37°C de 3 min dans 0,25 ml de solution de Trypsine 0,5 % /EDTA0, 2 %. Les cellules sont collectées dans des tubes de 5 ml et 4 ml de PBS contenant 1 % SAB (PBS tampon phosphate à 10mM pH7,4 ; SAB : sérum albumine bovine) sont ajoutés. Les cellules sont collectées par centrifugation (5 min 200 g).

Les cellules sont ensuite fixées, perméabilisées pendant 10 min à 4°C avecl ml d'une solution de méthanol préalablement refroidie à-20°C. Les cellules sont ensuite lavées avec 4 ml de PBS-SAB'1 % et collectées par centrifugation. Cette procédure de lavage est réalisée deux fois.

Les cellules sont ensuite incubées à 4°C avec 1 ml de PBS contenant 1 % de sérum de chèvre (sérum bloquant les sites non spécifiques de fixation d'anticorps sur les cellules). Les cellules sont ensuite lavées avec 4 ml de PBS-SAB 1 % et collectées par centrifugation.

Les cellules sont collectées dans 50 pi et incubées à 4°C pendant lh en présence de 50 pi d'anticorps de souris anti- Lamine A/C humaine (classe Ig G 1, Research Diagnostic Inc, Flanders, NJ). Les cellules sont ensuite lavées avec 4 ml de PBS-SAB 1 % et collectées par centrifugation. Cette procédure de lavage est réalisée deux fois.

Les cellules sont collectées dans 50 pl et incubées à 4°C pendant lh en présence de 50 pi d'anticorps de chèvre anti-Ig G de souris et conjugués à la fluorescéine (Calbiochem, La Jolla, CA). Les cellules sont ensuite lavées avec 4 ml de PBS- SAB 1 % et collectées par centrifugation. Les cellules sont finalement reprises dans 1 ml de PBS-SAB 1 % pour être analysée par cytométrie en flux.

2) Test d'immunofluorescence pour l'analyse par microscopie confocale Culture cellulaire Les cellules humaines HeLa (carcinome épithélial, ATCC CCL 2) sont mises en culture dans 1 ml de milieu MEM de Dulbeco contenant des sels de Earle, de la glutamine, des antibiotiques (pénicilline/streptomycine) et 10 % sérum de veau foetal, à raison de 50 000 cellules/puits (format plaque 4 puits, LAB-TEK, Nalge Nundc International, Naperville, IL).

Préparation des complexes (idem protocole cytométrie) Transfection 100 pi de complexes ARNi/DOGS sont ajoutés par puits contenant 0,5 ml de milieu MEM sans sérum. La plaque est alors incubée à 37°C en présence de 5 % de CO2. Après 4h d'incubation, 0,5 ml de milieu MEM contenant 20 % de sérum est ajouté. La plaque est incubée à 37°C.

Test d'immunofluorescence : 48-72h après la transfection, le milieu de culture est éliminé. Les cellules sont lavées avec 1 ml de PBS contenant 1 % SAB. Les cellules sont ensuite fixées perméabilisée pendant 10 min à 4°C avecl ml d'une solution de méthanol préalablement refroidie à-20°C. Les cellules sont ensuite lavées avec 1 ml de PBS-SAB 1 %. Cette procédure de lavage est réalisée deux fois.

Les cellules sont ensuite incubées à 4°C avec 1 ml de PBS contenant 1 % de sérum de chèvre (sérum bloquant les sites non spécifiques). Les cellules sont ensuite lavées avec 1 ml de PBS-SAB 1 %.

Les cellules sont incubées à 4°C pendant lh avec 50 ul de PBS et 50 ul d'anticorps de souris anti-Lamine A/C humaine (classe Ig G 1, Research Diagnostic Inc, Flanders, NJ). Les cellules sont ensuite lavées avec 1. ml de PBS-SAB 1 %. Cette procédure de lavage est réalisée deux fois.

Les cellules sont incubées à 4°C pendant lh en présence de50 ul de PBS et 50 ul d'anticorps de chèvre anti-Ig G de souris et conjugués à la fluorescéine (Calbiochem, La Jolla, CA). Les cellules sont ensuite lavées avec 1 ml de PBS-SAB 1 %. Les cellules sont finalement reprises dans 1 ml de PBS-SAB 1 % pour être analysées par microscopie confocale.

B-Inhibition de l'expression d'une protéine endogène après transfection de duplexes d'ARNi avec du DOGS B-1 Efficacité Les résultats de l'analyse par cytométrie en flux de la quantité de lamine A/C dans les cellules HeLa transfectées ou non par les ARNi anti-lamine A/C complexés au DOGS après marquage par immunofluorescence son t rapportés sur la figure 1 (F11 : intensité de fluorescence).

La transfection des ARN interférents anti-lamine A/C complexés avec du DOGS (N/P=6, rapport de charge amine du vecteur sur phosphate de l'ARN), selon un protocole de transfection de 4h des cellules en absence de sérum, permet d'observer une diminution de l'expression de la lamine A/C.

Une diminution de la quantité cellulaire de lamine A/C est quantifiable par immunofluorescence analysée par cytométrie en flux (voire figurel) où l'on voit apparaître une population de plus faible intensité de fluorescence par rapport aux cellules non-transfectées (100 % expression lamine A/C). La quantité de lamine A/C que l'on éteint dans la cellule est dépendante de la concentration d'ARN interférents utilisée (de 10 à 200 nM) et du temps d'observation.

L'analyse 24 h après la transfection ne montre pas de changement significatif de la quantité de lamine A/C dans les cellules, quelle que soit la concentration d'ARN interférents utilisée. 48 h après la transfection, 80 % de lamine A/C ont été supprimés mais dans seulement environ 20 % des cellules pour les conditions à 100 et 200 nM d'ARN interférents (Figure 2). Par contre, 60 % des cellules ont une diminution de leur quantité de lamine A/C de 80% pour la condition 200 nM d'ARN interférents 72 h après la transfection, ce qui est un très bon résultat. L'effet est observable déjà très nettement à partir d'une concentration de 50 nM en ARN interférents.

-La spécificité du marquage par immunofluorescence a été contrôlée et montre bien un marquage nucléaire définissant une couronne autour de la membrane nucléaire et intranucléaire avec quelques points fluorescents distribués dans le nucléoplasme (voir Figure 3 : 100 % expression lamine A/C).

Les résultats obtenus par l'analyse en cytométrie en flux ont été confirmés en observant les cellules transfectées avec les complexes ARNi/DOGS à 100 nM 72 h après la transfection (Figure 3). On voit très nettement que le marquage fluorescent révélant la lamine A/C dans le noyau a disparu dans un grand nombre de cellules. Il reste néanmoins quelques cellules positives au marquage comme l'a montré l'analyse quantitative par cytométrie.

B-2 : Effet des conditions de transfection : concentration en ARNi et rapport DOGS/ARNsi L'effet ARN interférence sur l'expression de la lamine A/C par les cellules HeLa est dépendant de la concentration en ARN interférents comme le montrent les figures 4 et 5 (analyse par cytométrie 48 et 72 h après la transfection).

Les résultats sont regroupés dans la figure 6A démontrant la reproductibilité des résultats présentés figure 1 et 2. Il est également reconfirmé que dans ce modèle d'interférence de la Lamine A/C il faut quantifier l'expression après 72 h pour observer des effets d'interférence très significatifs. La concentration la plus efficace est obtenue à partir de 100 nM en duplexe. Un effet d''interférence est également obtenu pour une concentration de 10 nM en duplexe (40 % de cellules éteintes pour la lamine A/C), ce qui souligne l'efficacité de l'approche ARN interférence. Pour obtenir une même efficacité dans la stratégie conventionnelle des oligonucléotides antisens, il faudrait utiliser environ des concentrations proche du micromolaire. La gamme de concentration donnant les meilleurs résultats d'interférence se situe de 50 à 100 nM en ARN interférents.

Pour les rapports DOGS/ARN (figure 6 B), exprimés en amine sur phosphate (N/P), une gamme optimale de 4 à 8 donne, dans les conditions d'expérience, les meilleurs résultats. Un rapport N/P de 2 montre un peu moins d'efficacité et le rapport 10, bien qu'efficace, a montré quelques signes de toxicité sur les cellules.

B-3 : Détermination de la sélectivité après transfection avec les complexes DOGS/ARNi La sélectivité du mécanisme d'ARN interférence a été étudiée en choisissant une séquence contrôle (CTRO1, séquence non spécifique de la cible mismatch', Mm) dans laquelle 3 bases de la séquence ciblée de la lamine A/C ont été changées pour abolir la reconnaissance de l'ARN messager Lamine A/C.

CTR01 : cible (SEQ ID N 4) : 5'AACAGGACUGCCAGUAGAACAU LaminA/C (SEQ ID N°5) : 5'AACUGGACUUCCAGAAGAACAU La transfection des duplexes d'ARN correspondant à la séquence control Mm montre qu'il n'y a pas d'inhibition de l'expression de la lamine A/C que l'on regarde l'expression à 48 ou 72 h après la transfection (Figure 7). Il n'y a aucun effet sur l'expression de la lamine A/C avec ce duplexe d'ARN Mm pour des concentrations d'ARN utilisée de 50 à 200 nM, alors que les ARN interférents anti-lamine A/C spécifiques ont un effet d'interférence sur l'expression.

Un autre contrôle de séquence a été réalisé en utilisant un duplexe d'ARN interférent actif sur l'ARN messager de la protéine luciférase Photinus Pyralis. Celui-ci n'a aussi montré aucun effet sur l'expression de la lamine A/C (Figure 7) 48 et 72 h après la transfection dans la même gamme de concentration d'ARN testée (50 à 200 nM).

Luc : cible ARNm (SEQ ID N° 6) : 5'AAAUGUCCGUUCGGUUGGCAG Ces résultats prouvent que le mécanisme d'interférence de l'expression de la lamine A/C en utilisant un duplexe d'ARN ciblant spécifiquement une région de l'ARN messager de la lamine A/C est efficace et sélectif.

Le vecteur DOGS est efficace pour vectoriser des ARN interférents dans des cellules vivantes et permet d'obtenir une grande efficacité d'ARN interférence sans affecter la sélectivité du mécanisme de reconnaissance ARN/cible.

Exemple 2 : Modèle de protéine exogène : la luciférase A-Modèle de co-transfection du gène cible et des ARN interférents Le modèle de la co-transfection cellulaire consiste à envoyer dans la cellule de façon simultanée un plasmide exprimant le gène exogène de la protéine étudiée et les duplexes d'ARN interférents. Cette technique présente l'avantage de permettre de mesurer rapidement l'efficacité des ARN interférents à inhiber l'expression d'une protéine étudiée. Plusieurs paramètres peuvent être obtenus comme la séquence des oligonucléotides les plus actifs (choix de la séquence reconnue sur la cible ARN messager), la concentration efficace, la durée d'inhibition de l'expression de la protéine ciblée ou le choix du type cellulaire utilisé.

La molécule DOGS a été utilisée en tant que vecteur de co-transfection ADN et d'ARN interférents (double brin) dans les essais rapportés ci-après. Le gène rapporteur de la luciférase a été utilisé comme gène exogène, car il permet de quantifier la quantité de protéine produite par une réaction de chimioluminescence.

Protocole de co-transfection plasmide et ARN double brin.

Le protocole est donné pour des transfections en plaque 24-puits, pour 200 ng de plasmide et pour 7-70 ng de duplexes d'ARN interférent (soit une étape de transfection avec 1-10 nM d'ARN interférents).

Etapel : Diluer 7-70 ng (1-10 nM) d'ARN interférents et 200 ng de plasmide pCMVLuc (gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus, CMV) dans un volume final de 50 ul de milieu de culture sans sérum. Vortexer légèrement.

Etape 2 : Diluer 0, 6-0, 8 ul de solution de DOGS (2 mM) dans 50 pi de milieu de culture sans sérum. Vortexer fortement pour former les liposomes cationiques et attendre 15 min.

Ajouter les 50 pi de la solution de DOGS sur la solution contenant les acides nucléiques. Vortexer fortement et laisser 30 minutes à température ambiante.

Pendant l'incubation nécessaire à la formation des complexes de transfection, retirer le milieu de culture des cellules pour le remplacer par 0,5 ml de milieu sans sérum.

Ajouter ensuite 100 pi par puits de complexes de transfection et remettre les cellules à 37°C pendant 4 h.

Ajouter ensuite 0,5 ml de milieu contenant 20 % de sérum (au final 10%).

Tableau 1 . Conditions de co-transfection avec 200 ng@de plasmide (recommandées pour les<BR> cellules adhérentes). Quantité Quantité de Solution stock d'ARN Dilution (ADN + Quantité Dilution du Concentration d'ADN duplexe ARN interférents* (à 1 µM) ARN) dans 50 µl de DOGS DOGS dans50 de transfection interférents milieu sans sérum µl de milieu en ARN sans sérum interférents 200 ng 7 ng 0,5 µl Etape 1 0,6 µl Etape 2 1 nM 200 ng 14 ng 1 µl Etape 1 0,65 µl Etape 2 2 nM 200 ng 35 ng 2,5 µl Etape 1 0,7 µl Etape 2 5 nM 200 ng 70 ng 5 µl Etape 1 0.,8 µl Etape 2 10 nM # d'ARN de 21 nucleotides<BR> Calcul de la quantité de DOGS ncessaire : Quantité Quantité Quantité de DOGS de plasmide d'ARN a exprimé b exprimé (a + b) x 0,003 = en ng en ng µl de DOGS

Test luciférase Préparer du tampon de lyse 1X en diluant la solution stock (5X) dans l'eau.

Enlever le milieu de culture des puits, laver avec 0, 5ml de PBS et ajouter 100zul de tampon de lyse par puits, incuber 30 minutes à température ambiante.

Récupérer les lysats dans des Eppendorf 1, 5ml et centrifuger 5 minutes à 14000rpm/min.

Ajouter 20ul de surnageant par puits d'une plaque 96 puits opaques pour luminomètre et mesurer la luminescence avec un temps d'intégration de 10 secondes (luminomètre, PhL Mediators, Vienne) après addition de 100ul'de luciférine par puits (substrat lyophilisé hydraté avec tampon et amener à température ambiante).

Dosage protéines (kit BCA-Pearce) Ajouter 1521 des surnageants dans des tubes 4ml + lml de réactif BCA (1 volume de réactif bleu pour 50 volumes de réactif blanc), vortexer (5s, 1500t/min) et incuber 30 minutes à 60°C, mesurer l'absorbance à 562 nm.

Gamme étalon de BSA : 15ul de tampon de lyse lX + pi BSA + lml BCA/tube.

Résultats de l'efficacité de la co-transfection du gène luciférase et des ARN interférents luciférase avec du DOGS.

L'efficacité du DOGS à transfecter simultanément un plasmide exprimant le gène cible de la luciférase (firefly pyralis) et les ARN interférents a été montrée sur plusieurs lignées cellulaires. Le duplexe d'ARN-luciférase spécifique choisi est celui utilisé par Elbashir et collaborateurs (Elbashir et al., 2001b) dans des cellules eucaryotes en culture et qui ont optimisé le positionnement sur la cible ARN messager luciférase. La mesure de l'efficacité est déterminée par dosage de l'activité luciférase (RLU/mg de protéine) par chimioluminescence 24 h après la co-transfection. Une inhibition de l'expression de la luciférase par les ARN

interférents la luciférase par rapport aux ARN contrôles mutés est clairement démontrée dans l'exemple détaillé de la co- transfection des cellules A549 (Fig 9). Les résultats montrent qu'une inhibition de l'expression de la protéine est supérieure à 90 % dès 10 nM d'ARN interférents, alors que la séquence d'ARN mutée est inefficace jusqu'à 100 nM. Des effets non spécifiques semblent diminuer l'efficacité générale de l'interférence quand des concentrations élevées en ARN sont utilisées, de l'ordre de 200 nM et au-dessus.

Plusieurs types cellulaires ont été co-transfectés avec le DOGS et montrent que celui-ci est efficace pour induire l'inhibition de l'expression de la luciférase. Des cellules adhérentes (HeLa, BNL Cl. 2, A 549, HEK 293, BHK, CHO) et des cellules non-adhérentes (K562, Jurkat) ont été testées et les résultats sont présentés dans la figure 10.

Références : Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J.

(1989) Efficient gene transfert into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. PNAS 86,6982- 6986.

Elbashir, SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature 411 : 494-498.

Elbashir, SM et al. (2001) RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes & Dev. 15 : 188-200.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998) Potent and spécifie genetic interfernce by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans.

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Tuschl, T. et al. (1999) Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes & Dev. 13,3191-3197.

Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P.

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