NOUVEAUX AGENTS TENSIOACTIFS BIODÉGRADABLES DE TYPE COPOLYMÈRES AMPHIPHILES CONSTITUÉS DE SEGMENTS HYDROPHOBES ET D'OLIGO ET/OU POLYSACCHARIDES L'invention a pour objet l'utilisation à titre d'agents tensioactifs d'une famille de copolymères bioérodables amphiphiles constitués de segments hydrophobes et d'oligo-et/ou polysaccharides. Ils sont particulièrement utiles dans des secteurs comme celui des détergents et des traitements de surface et de façon plus générale dans les domaines de la détergence, la pharmacie, les cosmétiques, l'écologie, l'agroalimentaire...

Les agents tensioactifs ou surfactifs sont généralement des molécules et/ou macromolécules chargées ou non chargées à caractère amphiphile, c'est-à-dire possédant d'une part une région hydrophile et d'autre part une région hydrophobe. Cette structure particulière induit une orientation de ces molécules lorsqu'elles sont présentes à des interfaces de type liquide/liquide, liquide/gaz ou liquide/solide.

Typiquement, un agent tensioactif est une molécule constituée d'un ou plusieurs groupement (s) hydrophile (s) ionique (s) ou non et une ou plusieurs chaîne (s) hydrophobe (s), le plus souvent hydrocarbonée (s) insoluble (s) dans l'eau. Les propriétés tensioactives découlent de l'antagonisme entre ces deux parties.

On distingue généralement 4 types de tensioactifs : Les tensioactifs anioniques comprenant des groupements hydrophiles chargés négativement tels que des fonctions carboxylates, sulfates ou sulfonates, -les tensioactifs cationiques comprenant des groupements chargés positivement tels qu'une fonction ammonium quaternaire, -les tensioactifs amphotères comprenant des groupements chargés positivement et négativement et qui, selon le pH,

se comportent en surfactifs anioniques ou cationiques comme par exemple les bétaïnes, -les tensioactifs non ioniques, les plus employés, dont le caractère de solubilité dans l'eau résulte de l'accumulation dans la molécule de fonctions alcools ou de fonctions éthers.

Parmi les familles de tensioactifs les plus connues, on peut citer notamment d'une part, à titre d'agent ionique, les sels d'acide gras, les sulfates d'alkyle, les sels d'ammonium quaternaires, et d'autre part, les alkylphénols éthoxylés (APE), les poly (glucosides d'alkyle) (PGA), les alcools éthoxylés (AE), les composés comportant des séquences poly (éthylèneglycols) (PEG) ou poly (oxyéthylènes) (POE), à titre d'agent non ionique.

La présente invention est basée sur la découverte de nouveaux agents tensioactifs dont la structure polymère dérive de l'association de segments hydrophiles de nature oligo-et/ou polysaccharides naturels ou modifiés et de segments hydrophobes.

On entend par « oligosaccharide », dans le présent exposé, tout sucre composé d'au moins 5 unités saccharidiques, au plus 50 unités saccharidiques.

On entend par « polysaccharide », dans le présent exposé, tout sucre composé de plus de 50 unités saccharidiques.

Plus précisément, la présente invention a pour objet l'utilisation à titre d'agent tensioactif d'au moins un copolymère amphiphile bloc séquencé linéaire et/ou branché comportant au moins une séquence oligo-eau polysaccharidique naturelle ou modifiée et au moins une séquence hydrophobe constituée de polymères bioérodables de formule générale (1) :

dans laquelle : - X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR'ou CONHR", avec R, R'et R"représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en Ci à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en Ci à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono-ou polyhydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à Cis.

On entend par « polymère bioérodable », dans le présent exposé, tout polymère pouvant tre dégradé par des organismes vivants, le plus souvent par les enzymes de ces organismes.

Avantageusement, la nouvelle famille d'agent tensioactif revendiquée est bioérodable, de part la présence de liaisons hydrolysables dans sa structure.

Un autre aspect avantageux de ces tensioactifs est leur caractère biocompatible.

D'autre part, les propriétés tensioactives des copolymères selon l'invention sont modulables. Ainsi, à concentration de monomère constante, leur solubilité peut tre ajustée en jouant sur la proportion, la longueur et la nature des segments de nature saccharidique incorporés dans la structure polymère. De mme, à concentration de chaînes saccharidiques constante, leur solubilité est directement liée à la proportion, à la nature, et à la longueur des segments hydrophobes.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les copolymères possèdent des propriétés tensioactives telles qu'ils sont ni

solubles dans l'eau, ni dans un solvant organique, se plaçant donc nécessairement à l'interface des deux phases en présence.

Dans le segment de formule générale (1), X représente de préférence un radical CN. Plus préférentiellement, Y représente un radical COOR'avec R'tel que défini précédemment. De façon plus préférée, R' est choisi parmi les groupements méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, n- butyle, sec-butyle, isobutyle, isohexyle, octyle, 2-méthoxyéthyle.

L'unité répétitive du cyanoacrylate d'isobutyle peut tre plus particulièrement citée à titre d'illustration d'une unité susceptible de composer un segment de formule générale (1).

Par structure séquencée, on entend désigner une structure qui dérive de l'établissement d'une liaison covalente entre au moins l'une des extrémités du segment de nature saccharidique et l'une des extrémités de la chaîne polymère de formule générale (1). Sont utiles à titre de tensioactifs : des structures copolymères linéaires comprenant soit un unique segment de formule générale (I) lié à une extrémité du segment de nature saccharidique, soit deux segments de formule générale (1), identiques ou différents, liés respectivement de part et d'autre du segment de nature saccharidique ; des structures copolymères greffées possédant une ou des ramification (s) latérale (s) de nature hydrophobe sur le segment de nature saccharidique.

La liaison covalente, établie entre les deux types de segment, est généralement de nature C-C ou C-O-C.

La liaison covalente peut dériver de la polymérisation radicalaire ou anionique d'au moins une molécule d'un composé de formule (II).

dans laquelle X et Y sont tels que définis précédemment, en présence d'un oligo-et/ou polysaccharide.

Le segment de nature saccharidique dérive d'un oligo-ou polysaccharide d'origine naturelle ou synthétique, modifié ou non.

On entend par « oligo-ou polysaccharide modifié », tout oligo-ou polysaccharide ayant subi un changement sur son squelette, comme par exemple l'introduction de fonctions réactives ; le greffage d'entités chimiques (molécules, chaînons aliphatiques, chaînes de PEG, etc...) ; fonctionnalisation de l'une des fonctions de l'oligo-ou polysaccharide, telle que la substitution d'une ou plusieurs fonctions hydroxyles par des fonctions telles que les fonctions amines, amides, acylamines, par estérification ou éthérification d'une ou plusieurs fonctions hydroxyles, par amidification d'une ou plusieurs fonctions amines ; l'élimination d'une ou plusieurs fonctions, par exemple des fonctions hydroxyles de l'oligo-ou polysaccharide ; la salification d'une ou plusieurs fonctions de l'oligo-ou polysaccharide telles que les fonctions hydroxyles, amines, sulfoniques, carboxyliques. Il existe dans le commerce des polysaccharides modifiés par greffage de la biotine, de composés fluorescents, etc... D'autres polysaccharides greffés avec des chaînes hydrophiles (ex. PEG) ont été décrits dans la littérature. On peut également envisager d'utiliser dans le cadre de la présente invention des polysaccharides modifiés à l'image de ceux décrits dans la référence Jozefowicz and Jozefonvicz, Biomaterials, 18,1633-1644 (1997), ou des polysaccharides modifiés par greffage d'un ligand qui peut tre un principe actif, une entité de reconnaissance spécifique d'un récepteur ou d'un antigène cellulaire, un antigène, une entité chimique chargée positivement ou négativement. Bien sûr, cette modification ne doit pas affecter la polymérisation du monomère de formule générale (II) en présence de l'oligo-ou polysaccharide modifié.

Tout oligo-ou polysaccharide « modifié » peut tre également désigné par le terme « dérivé » de l'oligo-ou polysaccharide.

Dans le présent exposé, on entend par « oligo-ou polysaccharide d'origine naturelle », tout oligo-ou polysaccharide extrait d'organismes vivants tels que les algues, les végétaux, les animaux, les microorganismes.

Dans le présent exposé, on entend par « oligo-ou polysaccharide d'origine synthétique », tout oligo-ou polysaccharide produit par synthèse chimique ou par un procédé biotechnologique.

En l'occurrence, il s'avère possible, à travers le choix d'un oligo-ou polysaccharide d'origine naturelle ou synthétique, d'ajuster la charge ionique d'un copolymère correspondant et donc de préparer des tensioactifs à ionicité spécifique.

Par exemple, pour un tensioactif anionique, on privilégie le choix d'un oligo-et/ou polysaccharide anionique comme les glycosaminoglycanes, tels que l'héparine, les acides polysialiques, les parties glucidiques des glycoprotéines, les oligo-et/ou polysaccharides neutres substitués par des groupes carboxyliques, sulfates ou sulfonates tels que le sulfate de dextrane, le sulfate de dermatane, le sulfate de pentosane et les gommes naturelles anioniques.

De la mme manière, les tensioactifs cationiques ou neutres sont préparés en privilégiant le choix, respectivement, d'un oligo-et/ou polysaccharide cationique comprenant par exemple des séquences glucosamines telles que la chitine et ses dérivés ou d'un oligo-eau polysaccharide neutre comme l'amidon, le glycogène, les dextrines, la cellulose, le dextrane et les gommes naturelles neutres.

A titre illustratif des oligo-ou polysaccharides pouvant tre mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, on peut plus particulièrement citer les oligo-ou polysaccharides comprenant les motifs D-glucose tels que la cellulose, l'amidon, le dextrane, le glycogène, les cyclodextrines, les motifs D-galactose, D-mannose, D-fructose tels que l'inuline, le galactosane, le manane, le fructosane, le motif fucose tel que le fucane et leurs dérivés pour les polysaccharides neutres. On peut

également utiliser des polysaccharides anioniques tels que les parties glucidiques des glycoprotéines ou des glycolipides et leurs dérivés comme le poly (acide sialique), encore dénommé acide colominique ou poly (acide N-acétylneuraminique), l'acide neuraminique, les parties glucidiques de l'orosomucoïde, les glycosaminoglycanes comme l'acide hyaluronique, l'héparine, le sulfate de chondroïtine, ou encore les extraits d'algues tels que les algues marines comme la carragheenane, ou l'alginate. Sont également avantageux, les polysaccharides cationiques, par exemple les polymères de glucosamines ou leurs dérivés. Le chitosane en est un exemple préféré.

Sont plus particulièrement préférés selon l'invention, les oligo-et polysaccharides suivants : le dextrane, l'amidon, l'amylose, le glycogène, la cellulose, l'inuline, la chitine, les cyclodextrines, le xylane, la xanthane, l'arabinane, le fucane, le curdlan, le pullulane, le chitosane, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine, l'héparine, le poly (acide N- acétyineuraminique), l'acide neuraminique, les parties glucidiques de l'orosomucoïde, la pectine, l'alginate, la gélose, la carragheenane, l'amylopectine, le succinoglycane, l'acide poly (glucuronique), l'acide poly (mannuronique), et leurs dérivés comme par exemple le sulfate de dextrane, les héparanes sulfates, les esters d'amylose, l'acétate de cellulose, le sulfate de pentosane.

Par « dérivé » d'un oligo-et/ou polysaccharide, on entend tout oligo-et/ou polysaccharide « modifié » tel que défini précédemment.

Selon une variante de l'invention, la séquence polysaccharidique est préférée.

L'oligo-et/ou polysaccharide possède préférentiellement une masse molaire supérieure ou égale à 6000 g/mol.

Avantageusement, les copolymères possèdent une teneur en oligo-ou polysaccharide contrôlée.

Les tensioactifs préférés selon l'invention sont les copolymères constitués d'héparine ou de dextrane à titre de segment de nature saccharidique et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à titre de segment hydrophobe, résultant d'une polymérisation anionique et/ou radicalaire.

Le copolymère revendiqué peut se présenter sous une forme pulvérulente. II peut tre directement introduit dans le milieu à l'état de poudre et se solubiliser sous agitation à des interfaces de type liquide.

L'agent tensioactif peut tre utilisé notamment pour préparer des émulsions. II est alors généralement utilisé à raison de 0.1 à 10 % du poids total de l'émulsion, de préférence de 0.2% à 5%.

Les copolymères selon l'invention qui se présentent sous une forme linéaire peuvent tre obtenus selon le procédé décrit dans la demande PCT/FR01/03619.

Plus précisément, ce procédé consiste en une polymérisation par voie radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule générale (11) : <BR> <BR> x<BR> CH2==C. OIX<BR> y dans laquelle : - X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR'ou CONHR" avec R, R'et R"représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en Ci à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en Ci à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono-ou polyhydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, avec ledit segment oligo-et/ou polysaccharidique étant lié soit par l'une de ces extrémités à un unique segment de formule générale (I), soit par chacune de ses deux extrémités, à un segment de formule générale (1), les deux segments hydrophobes étant identiques ou différents,

ladite polymérisation radicalaire étant réalisée en présence d'au moins une molécule d'un oligo-et/ou polysaccharide, dans des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou à la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur Redox radicalaire convenable.

Comme énoncé précédemment, il s'avère possible de privilégier la polymérisation radicalaire, au détriment de la polymérisation anionique naturellement prépondérante, en réalisant notamment la réaction de polymérisation dans des conditions de pH défavorables à la génération d'anions libres, comme par exemple les ions OH-.

Pour ce faire, le pH du milieu réactionnel est de préférence ajusté à une valeur inférieure à 2 et plus préférentiellement inférieure à 1,5.

Cette réaction est également réalisée dans des conditions d'atmosphère inerte.

Le solvant est avantageusement choisi de façon à ce que, tout en maintenant des conditions favorables à la polymérisation radicalaire et plus particulièrement à la formation du segment hydrophobe de formule (I), la solubilité de l'oligo-et/ou polysaccharide soit complète dans le milieu défini par ce solvant.

Dans la mesure où l'on souhaite privilégier la formation du copolymère directement sous la forme, de particules ou de micelles, le solvant est également choisi pour tre faiblement ou non solubilisant vis- à-vis du copolymère.

Avantageusement, il est choisi de préférence parmi les solvants aqueux, hydroalcooliques ou hydroacétoniques.

Le solvant choisi est acidifié avec un acide organique ou minéral et de préférence un acide nitrique pour obtenir un pH adéquat au déroulement de la polymérisation radicalaire.

En ce qui concerne les quantités respectives en oligo-et/ou polysaccharide et monomère de formule générale (II), elles peuvent varier largement, en fonction des propriétés tensioactives désirées. Le procédé

décrit dans la demande PCT/FR01/03619 a précisément pour avantage de permettre un contrôle de la structure du copolymère que l'on souhaite préparer. Les quantités en réactifs introduits sont également fonction de leurs masses molaires respectives et de leurs degrés de solubilité dans le milieu réactionnel.

En ce qui concerne l'amorceur Redox, il s'agit généralement de mélanges d'agents oxydants et réducteurs, organiques ou inorganiques, générant des radicaux durant l'étape de transfert électronique. Cette génération de radicaux a pour avantage de nécessiter une énergie d'activation faible contrairement aux amorceurs radicalaires classiques, ce qui permet d'amorcer des polymérisations radicalaires à des températures relativement basses (0-50°C).

L'amorceur Redox utilisé comprend de préférence au moins un sel métallique choisi parmi les sels de Ce4+, V5+, Cr6+, Mn3+. Selon une variante préférée de l'invention, il s'agit de Ce. II est généralement introduit sous la forme de nitrate de cérium et d'ammonium.

La concentration en initiateur radicalaire est susceptible d'influencer le déroulement de la polymérisation radicalaire. C'est ainsi que la composition du copolymère et la longueur des séquences respectives de l'oligo-et/ou du polysaccharide et du polymère de formule générale (I) sont modulables en fonction de la concentration en amorceur. Son ajustement relève des compétences de l'homme de l'art.

En ce qui concerne la température réactionnelle, elle est ajustée à une valeur compatible avec l'amorçage de la polymérisation.

Généralement, cette température est comprise entre 0 et 50°C.

En ce qui concerne l'ordre d'introduction des différents réactifs, on procède de préférence à une solubilisation de l'oligo-et/ou polysaccharide au sein du solvant choisi, puis à l'ajout de l'amorceur radicalaire Redox.

Le monomère de formule (II) est ensuite introduit dans le mélange.

A l'issue de la réaction, le copolymère peut tre obtenu sous une forme soluble ou sous la forme de micelles, d'agrégats ou particules.

A la fin de la polymérisation, on peut procéder si nécessaire à une neutralisation du pH du milieu réactionnel. De préférence, celui-ci est ajusté à une valeur demeurant inférieure ou égale à 7,5. Le copolymère est récupéré par des techniques conventionnelles.

Selon une variante préférée du procédé décrit, on procède préalablement à l'isolement du copolymère, à une complexation du sel métallique résultant de la réaction de l'amorceur radicalaire. Cette complexation qui relève des compétences de l'homme de l'art, permet d'éliminer ces sels métalliques.

En ce qui concerne les copolymères selon l'invention se présentant sous une forme ramifiée, ils sont accessibles par un procédé distinct qui implique une polymérisation anionique. Ce type de procédé est notamment décrit dans le brevet EP0007895 (Couvreur et al., 1979) et dans la publication de S. J. Douglas, L. Illum, S. S. Davis, Journal of colloid and interface science, 103,154 (1985).

Généralement les polymérisations anioniques sont réalisées en présence d'un acide fort à un pH inférieur à 3 et préférentiellement voisin de 2,5.

Les agents tensioactifs selon l'invention peuvent tre utilisés notamment pour stabiliser des émulsions cosmétiques, comme par exemple des produits de maquillage comprenant des pigments organiques et inorganiques présents en phase aqueuse et/ou huileuse.

Les agents tensioactifs selon l'invention peuvent tre également utilisés pour la dispersion de particules solides finement divisées de nature variée dans des fluides, en particulier dans un milieu aqueux liquide, notamment les colloïdes. Ces particules solides dispersées peuvent tre des pigments pour les peintures ou les encres, des oxydes métalliques magnétiques, des agents de brillance optique ou des produits agrochimiques (fongicides).

De façon générale, les agents tensioactifs selon l'invention peuvent tre employés notamment comme émulsionnants (ou émulsifiants),

agents de suspension, solubilisants, agents mouillants, moussants ou détergents. Ils peuvent entrer dans la composition de produits nettoyants (lessives, détergents) et tre employés dans des domaines très variés tels que l'industrie du papier, du cuir et du textile (ex. les adoucisseurs de tissus), la fabrication d'extincteurs, de produits cosmétiques et pharmaceutiques, l'extraction des minerais, la catalyse organique...

Les exemples et figures figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.

FIGURES Figure 1 : Profils de turbidité obtenus par mesure de la transmission d'un rayon lumineux en fonction de la hauteur d'un tube contenant les émulsions de l'exemple 5 : émulsion de référence, émulsion préparée avec le copolymère dextrane-PIBCA (A), émulsion préparée avec le copolymère héparine-PIBCA (B).

Figure 2 : Micrographies des émulsions de l'exemple 5, obtenues par microscopie optique : émulsion préparée avec le copolymère dextrane-PIBCA (A), émulsion préparée avec le copolymère héparine- PIBCA (B).

Figure 3 : Profils de turbidité présentés par les émulsions de l'exemple 6, l'émulsion de référence, l'émulsion préparée avec le copolymère dextrane-PIBCA (A'), et l'émulsion préparée avec le copolymère héparine-PIBCA (B').

Figure 4 : Stabilité de latex constitués de copolymères de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) et de dextrane (colonnes blanches) et constitués de copolymères de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) et

d'héparine (colonnes noires) évaluée par la mesure du diamètre hydrodynamique après préparation (temps 0) et conservation en dispersion aqueuse à +4°C pendant plusieurs mois. Les barres d'erreurs représentent la distribution de la dispersion en taille. ND : non déterminé Les diamètres hydrodynamique et les distributions en taille des latex sont inchangés pendant la période de conservation considérée.

EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'un copolymère constitué de dextrane et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) (PIBCA) à structure linéaire.

Dans un tube en verre de 2 cm de diamètre, 0,1375 g de dextrane sont dissous dans 8 ml HN03 (0,2 mot/1), sous agitation magnétique à 40°C et avec un léger bullage à l'argon. Après 10 minutes, 2 ml de solution acide d'ions cérium (8. 10-2 M de cérium IV ammonium nitrate dans HN03 à 0,2 mol/1) puis 0,5 ml de cyanoacrylate d'isobutyle sont ajoutés. Après 10 minutes, le bullage à l'argon est arrté et le tube en verre est bouché. Après au moins 40 min, l'agitation est arrtée et le tube en verre refroidi sous l'eau du robinet. Le pH est ajusté avec NaOH (1 N) pour qu'après l'ajout de 1,25 ml de tri sodium citrate dihydrate (1,02 M) il arrive directement à une valeur de 7 0,5. Enfin, la suspension est stockée au réfrigérateur.

A ce stade, une suspension de particules polymères colloïdales stables est obtenue.

Les copolymères constituant les particules sont purifiés comme suit :

Des boudins à dialyse (Spectra/Por CE MWCO : 100000) sont régénérés 30 minutes avec de l'eau osmosée, et les suspensions colloïdales passées au vortex puis introduites dans les boudins.

On réalise deux dialyses successives de 1 H30 contre 5 litres d'eau osmosée qui sont suivies d'une autre dialyse d'une nuit contre 5 litres d'eau osmosée.

Les copolymères ainsi purifiés et contenus dans les boudins à dialyse sont récupérés puis sont séchés par lyophilisation sans addition de cryoprotecteur.

Pour ce faire les copolymères sont aliquotés dans des piluliers puis congelés (-18°C). La lyophilisation est réalisée avec un appareil Bioblock Scientific Christ alpha 1-4 pendant 48 heures. Les lyophilisats sous forme de poudres blanches sont conservés au réfrigérateur jusqu'à usage.

Exemple 2 : Préparation d'un copolymère constitué d'héparine et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure linéaire.

Le mme protocole que celui décrit en exemple 1 est reproduit en utilisant 0,1375 g d'héparine à la place du dextrane.

Exemple 3 : Préparation d'un copolymère constitué de dextrane et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure ramifiée.

Le mme protocole que celui décrit en exemple 1 est reproduit en utilisant 2 ml d'acide nitrique 0,2 moi/1 à la place des 2 ml de solution acide d'ions cérium.

Exemple 4 : Préparation d'un copolymère constitué d'héparine et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure ramifiée.

Le mme protocole que celui décrit en exemple 3 est reproduit en utilisant 0,1375 g d'héparine à la place du dextrane.

Exemple 5 : Propriétés tensioactives des copolymères à structure linéaire.

Pour contrôler les propriétés tensioactives des copolymères, des émulsions modèles volontairement instables ont été préparées. Leur instabilité a été évaluée à l'aide d'un Turbiscano qui permet de suivre l'évolution du profil de turbidité exprimé en transmission sur la hauteur des tubes dans le temps.

Une émulsion de référence est préparée à partir de : - 3 ml d'eau - 3 ml d'acétate d'éthyle Une émulsion contenant le copolymère dextrane-PIBCA préparé selon l'exemple 1 est composée de : - 12 mg de copolymère de dextrane-PIBCA purifié et lyophilisé.

- 3 ml d'eau - 3 mi d'acétate d'éthyle Une émulsion contenant le copolymère héparine-PIBCA préparé selon l'exemple 2 est composée de : - 12 mg de copolymère d'héparine-PIBCA purifié et lyophilisé.

- 3 ml d'eau - 3 ml d'acétate d'éthyle Les émulsions sont préparées dans un tube en verre à fond rond et à bouchon à vis de 12 ml à 28°C selon la séquence d'agitation suivante réalisée en continu : Vortex, vitesse maximale : 15 secondes.

Retournements du tube : 2.

Vortex, vitesse maximale : 15 secondes.

Retournements du tube : 20.

Vortex, vitesse maximale : 30 secondes.

Retournements du tube : 2.

Vortex, vitesse maximale : 30 secondes.

A la fin de la séquence d'agitation, 5 ml de l'émulsion sont immédiatement transférés à l'aide d'une pipette en verre graduée dans la cellule de mesure d'un Turbiscane MA2000. La cellule est placée dans l'appareil afin d'enregistrer le profil de transmission sur la hauteur du tube.

Des enregistrements sont effectués toutes les minutes pendant 30 min.

A titre d'exemple, la figure 1 montre les profils de turbidité exprimés en transmission sur la hauteur du tube. Ils ont été enregistrés lors du suivi de l'évolution des trois émulsions aux temps 0,2, 10 et 30 minutes. Une augmentation de la transmission en bas du tube indique une séparation de phase de l'émulsion par expulsion de l'eau. Une augmentation de la transmission en haut du tube indique une séparation de phase de l'émulsion par expulsion de l'acétate d'éthyle. Une transmission nulle signifie que le milieu est turbide (trouble) dû à la présence d'une émulsion.

Le tableau 1 donne les vitesses de migration des phases des différentes émulsions obtenues lors du déphasage de l'émulsion initiale, mesurées à une hauteur de 30 % des pics de transmission. Vitesses de migration des phases (mm/minß Emulsions Phase inférieure : Phase supérieure : acétate eau d'éthyle Référence > 18, 8 > 18, 3 Dextrane-PIBCA 0, 0 2, 5 Héparine-PIBCA 0, 4 0, 0 Tableau 1 La vitesse de migration des phases est d'autant plus grande que l'émulsion est instable. Les émulsions préparées avec le copolymère de

dextrane-PIBCA et d'héparine-PIBCA sont beaucoup plus stables que l'émulsion de référence ce qui indique que les copolymères possèdent des propriétés tensioactives.

La figure 2 montre les globules des émulsions par observation au microscope optique après formation de l'émulsion. Les globules obtenus sont de taille plus importante pour l'émulsion préparée avec le copolymère héparine-PIBCA que ceux de l'émulsion préparée avec le copolymère dextrane-PI BCA.

Exemple 6 : Propriétés tensioactives des copolymères à structure ramifiée.

Le protocole d'étude des propriétés tensioactives des copolymères obtenus par polymérisation anionique selon les exemples 3 et 4 est identique à celui donné dans l'exemple 5.

Une émulsion de référence est préparée à partir de : - 3 ml d'eau - 3 ml d'acétate d'éthyle Une émulsion contenant le copolymère de dextrane-PIBCA préparé selon l'exemple 3 est composée de : - 12 mg de copolymère de dextrane-PIBCA purifié et lyophilisé.

- 3 ml d'eau - 3 ml d'acétate d'éthyle Une émulsion contenant le copolymère d'héparine-PIBCA préparé selon l'exemple 4 est composée de : - 12 mg de copolymère d'héparine-PIBCA purifié et lyophilisé.

- 3 ml d'eau - 3 ml d'acétate d'éthyle.

Le tableau 2 donne les vitesses de migration des phases des différentes émulsions obtenues lors du déphasage de l'émulsion initiale, mesurées à une hauteur de 30 % des pics de transmission.

Vitesses de migration des phases l _ (mm/min) Emulsions Phase inférieure : Phase supérieure : acétate eau d'éthyle Référence > 18,8 > 18,3 Dextrane-PIBCA 12, 0 8, 0 Héparine-PIBCA 1, 4 0, 0 Tableau 2 Les mmes phénomènes de vitesse de migration des phases sont observés avec ces émulsions, indiquant que les copolymères possèdent des propriétés tensioactives.

La figure 3 montre les profils de turbidité exprimés en transmission sur la hauteur du tube. Ils ont été enregistrés lors du suivi de l'évolution des trois émulsions aux temps 0,2, 10 et 30 minutes. Une augmentation de la transmission en bas du tube indique une séparation de phase de l'émulsion par expulsion de l'eau. Une augmentation de la transmission en haut du tube indique une séparation de phase de l'émulsion par expulsion de l'acétate d'éthyle. Une transmission nulle signifie que le milieu est turbide (trouble) dû à la présence d'une émulsion.

Exemple 7 : Préparation d'un copolymère constitué de gamma-cyclodextrines et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure linéaire.

Le mme protocole que celui décrit en exemple 1 est reproduit en utilisant 0,1375 g de gamma-cyclodextrines à la place du dextrane.

Le copolymère obtenu est soluble dans l'acétone.

Exemple 8 : Préparation d'un copolymère constitué de sulfate de dextrane et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure linéaire.

Le mme protocole que celui décrit en exemple 1 est reproduit jusqu'après l'étape de dialyse en utilisant 0.1375 g de sulfate de dextrane à la place du dextrane. La méthode est appliquée en utilisant des sulfates de dextrane de différentes masses molaires.

Les copolymères obtenus s'auto-organisent en particules colloïdales en dispersion dans l'eau. Le diamètre hydrodynamique de ces particules varie selon la masse molaire du sulfate de dextrane utilisé lors de la synthèse (voir tableau 3).

Le tableau 3 donne le diamètre hydrodynamique des particules colloidales formées par auto-organisation de copolymères constitués de sulfate de dextrane et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure linéaire préparés à partir de sulfate de dextrane de masses molaires différentes. Masses molaires du Diamètre Sulfate de dextrane (Da) hydrodynamique (nm) 10 000 192 40 000 274 50 000 333 500 000 408 Tableau 3 Exemple 9 : Stabilité d'un latex constitué de copolymères de dextrane et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure linéaire.

Le latex est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 1 jusqu'à l'étape de dialyse incluse. II est conservé dans un flacon bouché à

+4°C sous la forme d'une dispersion aqueuse tel qu'il a été préparé. Le diamètre hydrodynamique des particules est évalué à différent temps de conservation par diffusion quasi-élastique de la lumière à 90° à l'aide d'un nanosizer de type COULTER N4PIus après dilution dans l'eau. Le diamètre hydrodynamique des particules de latex proche de 300 nm reste inchangé durant une période de conservation en dispersion de 36 mois.

(voir Figure 1).

Exemple 10 : Stabilité d'un latex constitué de copolymères d'héparine et de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) à structure linéaire.

Le latex est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 jusqu'à l'étape de dialyse incluse. Il est conservé dans un flacon bouché à +4°C sous la forme d'une dispersion aqueuse tel qu'il a été préparé. Le diamètre hydrodynamique des particules est évalué à différent temps de conservation par diffusion quasi-élastique de la lumière à 90° à l'aide d'un nanosizer de type COULTER N4PIus après dilution dans l'eau. Le diamètre hydrodynamique des particules de latex proche de 95 nm reste inchangé durant une période de conservation en dispersion de 30 mois.

(voir Figure 4).

La figure 4 montre la stabilité de latex constitués de copolymères de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) et de dextrane (colonnes blanches) et constitués de copolymères de poly (cyanoacrylate d'isobutyle) et d'héparine (colonnes noires) évaluée par la mesure du diamètre hydrodynamique après préparation (temps 0) et conservation en dispersion aqueuse à +4°C pendant plusieurs mois. Les barres d'erreurs représentent la distribution de la dispersion en taille. ND : non déterminé Les diamètres hydrodynamique et les distributions en taille des latex sont inchangés pendant la période de conservation considérée.