La présente invention a pour objet de nouveaux colorants du groupe des anthocyanes, les compositions les contenants ainsi que leurs procédés de préparation.

De très nombreuses molécules naturelles présentent des propriétés colorantes. Parmi celles-ci, les anthocyanes sont des composés très répandus dans la nature qui sont responsables des colorations orangées, rouges ou bleues de nombreux végétaux et en particulier de la plupart des fruits. Les anthocyanes présentent une parfaite innocuité et pourraient même posséder des propriétés nutritionnelles intéressantes (8) . Les anthocyanes constituent donc de bons candidats pour 1 'élaboration de colorants dans les domaines de l'alimentation et de la cosmétologie.

En effet, la méfiance grandissante des consommateurs vis-à-vis des additifs alimentaires artificiels, jugés inutiles parfois mêmes toxiques, conduit certains à souhaiter la suppression des colorants. Cependant la couleur reflète souvent la qualité des produits alimentaires et conditionne leur acceptabilité par les consommateurs. Ainsi, les colorants naturels tendent à remplacer les colorants synthétiques (5, 9) ; mais les colorants naturels des aliments, principalement des fruits et légumes, sont très souvents dégradés lors des opérations de transformation (action d'enzymes lors de broyages ou de pressurages, dégradation thermique, oxydation) ce qui limite leur utilisation sauf à les associer avec des stabilisateurs. La demande du consommateur pour des produits attractifs colorés mais non toxiques nécessite donc de disposer de colorants naturels comme les anthocyanes. De très nombreuses sources d'anthocyanes ont été proposées tels que le marc de raisin, le chou rouge, le sureau, le cassis, etc.. et sont utilisées industriellement

pour la préparation de colorants; mais il s'agit généralement d'extraits relativement bruts contenant outre les anthocyanes libres, sous forme glycosylée, d'autres molécules susceptibles de les stabiliser et/ou d'en modifier la couleur, soit par des phénomènes de copigmentation, il s'agit alors d'associations non covalentes entre une molécule anthocyanique et un copigment, comme un acide phénol, un flavonoïde ou des ions métalliques, soit par des phénomènes de complexation et il s'agit alors de liaisons covalentes; de tels complexes formés par réaction covalente entre anthocyanes et tanins seraient notamment à 1 'origine de la couleur des vins vieux.

En solution aqueuse les molécules anthocyaniques existent sous quatre formes en équilibre (4) . La forme rouge, correspondant au cation flavylium, prédominante en milieu acide et beaucoup plus stable que les autres formes, devient minoritaire, voire absente, lorsque le pH augmente. Outre ce comportement vis-à-vis du pH qui interdit l'usage des colorants anthocyaniques connus à ce jour dans les produits laitiers et carnés de pH supérieur à 4, les préparations proposées à partir de ces molécules se révèlent généralement très instables au cours du stockage.

Ces molécules anthocyaniques naturelles, dont le noyau flavylium est représenté ci-dessous, présentent une très grande variété de structures.

Elles comprennent une vingtaine d'aglycones diversement hydroxylés ou méthoxylés et des formes glycosylées qui peuvent être acylées . Ces diverses substitutions leur confèrent des propriétés colorantes et des stabilités différentes. De plus, les phénomènes de

copigmentation et la formation de liaisons covalentes, en particulier avec les tanins ou 1 'éthanal, influent également sur ces caractéristiques. Toute une gamme de couleurs allant de l'orange au rouge peut ainsi être obtenue. Cependant, de nombreux facteurs, incluant notamment le pH, la température, la présence d'oxygène mais aussi celle d'agents de blanchiment ou d'antioxidants conmme les sulfites et l'acide ascorbique, concourrent dans certaines conditions à dégrader ces molécules, modifiant ainsi leurs propriétés colorantes. II a donc été proposé dans l'Art antérieur d'associer aux colorants anthocyaniques des agents photoprotecteurs permettant de stabiliser les couleurs.

Les anthocyanes monoglucosides sont nettement plus stables vis-à-vis de la décoloration que les aglycones correspondants (7) . De même, les diglucosides, présentant une substitution supplémentaire en 5, sont beaucoup plus stables que les 3-monoglucosides correspondants. Cependant, ils sont plus sensibles au brunissement, probablement à cause du sucre en position 5 qui participe à des réactions de type Maillard (Francis, 1989) . Les substitutions en position 4, par exemple par un groupement méthyle ou phényle, confèrent également une stabilité accrue au chromophore, notamment vis-à-vis de la décoloration par un additif couramment utilisé dans l'industrie alimentaire, le sulfite (Timberlake et Bridle, 1967) .

Le but de la présente invention est de proposer de nouveaux colorants rouges d'origine naturelle, présentant en solution une stabilité supérieure à celle des anthocyanes, notamment dans une gamme de pH plus étendue, permettant d'élargir leur domaine d'application traditionnellement limité à l'industrie des boissons. En outre, la relative lipophilie / hydrophobicité de certains de ces pigments autorise leur utilisation dans des milieux lipidiques ou de type émulsion qui constituent de nouveaux marchés potentiels (produits laitiers, sauces dérivées de mayonnaises, cosmétiques, ... ) .

Ces nouveaux pigments, de couleur rouge à orangée, ont été obtenus dans un premier temps à partir du vin, sous forme d'espèces chimiques pures parfaitement définies, puis ils ont été analysés, caractérisés et synthétisés au laboratoire par les Inventeurs, selon des procédés faisant également l'objet de la présente Invention.

Cette série de nouveaux dérivés anthocyaniques présentent les caractéristiques structurales propices à la stabilisation de la couleur (substitution à la fois en position 5, par un groupement non osidique, et en position 4, dans le noyau flavylium) . De plus, ils répondent aux objectifs souhaités pour des applications dans le domaine alimentaire ou de la cosmétologie, en particulier une meilleure résistance au chauffage, une stabilité accrue dans une gamme plus large de pH et une conservation de la couleur en présence de sulfite.

Les colorants anthocyaniques selon 1 ' invention répondent plus particulièrement à la formule générale (I) :

(I) dans laquelle :

- les radicaux RI, R2, R3 , R4 et R5 sont choisis parmi les groupements habituellement rencontrés sur le noyau flavylium des anthocyanes ou des groupements équivalents dont certains sont précisés dans la description qui suit;

les radicaux R et R' , identiques ou différents, peuvent avoir une grande diversité de structures. Parmi lesquelles, on peut citer : un atome d'hydrogène, des groupements fonctionnels acide carboxylique, aldéhyde, alcool, aminé, amide, thiol, etc..., les groupes alkyles à un ou plusieurs atomes de carbone, linéaires, ramifiés ou cycliques, saturés ou non, les groupements aromatiques ou heterocycliques, lesdits groupes alkyles et groupements aromatiques ou heterocycliques pouvant être éventuellement substitués par des groupements fonctionnels comme les fonctions alcool, acide carboxylique, aminé, amide, aldéhyde ou cétone, ou encore les radicaux R et R' forment avec les atomes de carbones auxquels il sont attachés une structure cyclique à plusieurs liaisons saturée ou non, éventuellement substituée et pouvant inclure un hétéroatome.

Les composés de formule (I) résultent d'une réaction de cycloaddition de type [4+2] impliquant :

- d'une part l'hydroxyle en position 5 et le carbone en position 4 dans le cation flavylium de formule (II) ci-dessous :

OH (II) dans laquelle Ri , R2 , R3 , R4 et R5 ont les mêmes significations que dans la formule (I) , et

- d ' autre part , un composé possédant une double liaison polarisée et/ou polarisable du fait des groupement R et R ' qu ' il porte, R et R ' étant définis comme dans la formule (I) .

Parmi les composés possédant une double liaison polarisée et/ou polarisable du fait des groupement R et R ' , on peut distinguer les composés de formules ( III ) et ( IV) ci-dessous :

R CH = CH R '

( III) dans laquelle , le radical R représente un groupement essentiellement carboné donneur d ' électrons avantageusement aliphatique , alicyclique , aromatique ou hétérocyclique saturé ou non, éventuellement substitué , et le radical R ' représente un groupement essentiellement carboné attracteur d ' électrons avantageusement choisi parmi , un atome d ' hydrogène , un groupe -OH, un groupe -COOH, un groupe -COH, un groupe -CH2OH un groupe -COOR" où R" représente un groupe alkyle ramif ié ou non de 2 à 5 carbones éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OH, -COOH, -COH.

O OH

R C 11 CH _? R ' ^ _^ Z_^I R C 1 = CH R '

^Z (IV) dans laquelle, R et R' identiques ou différents, peuvent avoir la même diversité de structures que dans la formule (I) , dès lors qu'ils permettent

1 'énolisation.

Parmi les colorants anthocyaniques de formule (I) susceptibles d'être issus de réactions des composés de formule (II) avec les composés de formule (III), l'Invention envisage plus particulièrement ceux où le radical R est choisi parmi, un radical phényle substitué par un ou plusieurs groupes -OH, -OCH3, alkyles ou hétéroalkyles, -SH, -NO, -SO3H, -NH2 , -OR" ' où R" ' représente un ose éventuellement mono ou pluri-acylé dont le groupement acylant est lui-même éventuellement substitué par un ose; parmi ceux- ci, on préfère les colorants de formule (I) où le radical R

est un groupe mono, di ou triphenol éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OCH3.

Parmi les colorants anthocyaniques de formule (I) susceptibles d'être issus de réactions des composés de formule (II) avec les composés de formule (IV) , l'Invention envisage plus particulièrement ceux où les radicaux R et R' sont choisis parmi, un atome d'hydrogène, un groupe -COOH, un groupe alkyle portant éventuellement une fonction alcool ou acide carboxylique.

En ce qui concerne les radicaux Ri, R2 3» R4 et R5, l'Invention concerne plus particulièrement ceux choisis parmi, un atome d'hydrogène, un groupe -OH, un groupe -OCH3 , un groupe -OR" ' où R" ' représente un ose éventuellement mono ou pluri-acylé dont le groupement acylant est lui-même éventuellement substitué.

On préfère les colorants anthocyaniques de formule (I) dans laquelle : - les radicaux Ri et R3 sont choisis parmi, un atome d'hydrogène, un groupe -OH, un groupe -OCH3 , un groupe -OR" ' où R" ' représente un ose éventuellement mono ou pluri-acylé dont le groupement acylant est lui-même éventuellement substitué par un ose, - le radical R2 représente un groupe -OH,

- les radicaux R4 et R5 _SO nt ^c hoisis parmi, un groupe -OH, un groupe -OCH3 , un groupe -OR"' où R" ' représente un ose éventuellement mono ou pluri-acylé dont le groupement acylant est lui-même éventuellement substitué. Parmi les groupes -OR" ' , on peut citer par exemple ceux dans lesquels R" ' est un ose choisi parmi, le glucose, le galactose, l'arabinose, le rutinose, le xylose, éventuellement acylé par les acides acétique, p-coumarique, caféique, malique, préférentiellement en position 6.

A titre d'exemples non limitatifs de colorants anthocyaniques, l'Invention envisage les composés de formule (I) dans laquelle :

Le radical R représente un atome d'hydrogène, un groupe -COOH, un groupe CH3, un groupe CHOH- CH3 _e t le radical R' représente un atome d'hydrogène, un groupe -CH2-COOH. Parmi ceux-ci, on peut ceux dans lesquels R représente un groupe -COOH et R' un atome d'hydrogène, R et R' représentent un atome d'hydrogène, R représente un groupe CH3 et R' un atome d'hydrogène, R représente un groupe -COOH et R' représente un groupe -CH2-COOH, R représente un groupe CHOH-CH3 et R' représentent un atome d'hydrogène, ou encore

- Le radical R représente un groupement aliphatique, alicyclique, aromatique ou hétérocyclique saturé ou non, éventuellement substitué, et le radical R' représente un atome d'hydrogène, un groupe -OH, un groupe -COOH, un groupe -COH, un groupe -CH2OH un groupe -COOR" où R" représente un groupe alkyle ramifié ou non de 2 à 5 carbones éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OH, -COOH, -COH. Parmi ceux-ci, on peut citer ceux dans lesquels le radical R représente un radical phényle substitué par un ou plusieurs groupe -OH, -OCH3 , alkyles ou hétéroalkyles, -SH, -NO, -SO3H, -NH2 , -OR"' où R" ' représente un ose éventuellement mono ou pluri-acylé dont le groupement acylant est lui-même éventuellement substitué par un ose. On préfère plus particulièrement ceux dans lesquels le radical R est un groupe mono, di ou triphenol éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OCH3.

Des colorants anthocyaniques intéressants selon l'invention sont des monoglucosides, et notamment ceux répondant à la formule (V) suivante :

dans laquelle les radicaux Ri, R3, R6 et R7, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe -OH ou un groupe -OCH3.

Plusieurs colorants de l'Invention répondant à la formule (I) ont été mis en évidence pour la première fois par les Inventeurs par analyse CLHP d'un vin ou d'un extrait de marc de raisin. L'étude complémentaire de leur processus de formation a permis de montrer que certains d'entre-eux résultent de la réaction des anthocyanes avec des produits du métabolisme des levures utilisées pour réaliser la fermentation alcoolique en vinification. Afin de confirmer ce processus réactionnel, des colorants ont été synthétisés au laboratoire en faisant réagir des anthocyanes avec les composés de formules (IV) adéquats. Ainsi les composés de formules (IV) suivants ont été utilisés pour préparer les colorants de formule (I) correspondants : - l'acide pyruvique, où R représente un groupe -COOH et R' représente un atome d'hydrogène,

- l'éthanal, où R et R' représentent un atome d'hydrogène,

- l'acétone, où R représente un groupe -CH3 , et R' représente un atome d'hydrogène, l'acide alpha-cétoglutarique, où R représente un groupe -COOH et R' représente un groupe -CH2- COOH,

- l'acétoïne, où R représente un groupe -CHOH-CH3 et R' représente un atome d'hydrogène.

Par ailleurs, deux des colorants de l'Invention répondant à la formule (V) et susceptibles d'être préparés au laboratoire à partir de composés de formule (III) ont été mis en évidence par les Inventeur pour la première fois au cours de l'analyse par chromatographie liquide (CLHP) d'un vin. La singularité de leur spectre d'absorption UV- visible, obtenu avec un détecteur à barette de diodes, a incité à aller plus loin dans la caractérisation d'un de ces produits. Après son isolement et sa purification par CLHP, le composé a été analysé par spectroscopie RMN et spectrometrie de masse. Les résultats de ces analyses nous ont permis d'établir une structure qui dérive du 3- (6-p-coumaroyl) - glucoside de malvidol, pigment que l'on trouve dans le raisin et le vin. L'hydrolyse alcaline du composé caractérisé a produit le deuxième pigment initialement détecté et de l'acide coumarique, suggérant qu'il s'agit probablement du même dérivé, formé cette fois à partir du 3-glucoside de malvidol, anthocyane majeure du raisin et du vin; Le mécanisme que les Inventeurs ont envisagé pour expliquer la formation des deux composés suppose une cyclisation (à 6 centres) entre le 4-vinylphénol et 1 ' anthocyane. Le vinylphénol, dans le vin, peut être issu de la décarboxylation de l'acide p-coumarique par des levures.

Pour confirmer ce processus réactionnel, les Inventeurs ont réalisé la synthèse du dérivé vinylphénol du 3-glucoside de malvidol. L'anthocyane (7,9 mg) , isolée à partir des pellicules de baies de raisin et purifiée par

CLHP; a été solubilisée dans 2 ml d'une solution d'acide chlorhydrique (10 exp.-3 M). A cette solution (7,5 mM) , a été ajouté 0,05 ml d'une solution de vinylphénol (à 10% dans le propyleneglycol) , ce qui correspond à un rapport molaire de 2,9 moles de vinylphénol pour 1 mole d'anthocyane. Le mélange réactionnel a été placé dans un bain thermostaté à 30°C et maintenu sous agitation pendant la durée de la réaction. L'évolution du milieu a été suivie par CLHP. Après 4 heures de réaction, 1 'anthocyane a été convertie quantitativement en son dérivé vinylphénol. Son temps de rétention et son spectre d'absorption UV-visible enregistré en barette de diodes sont identiques à ceux du produit détecté dans le vin. Le produit synthétisé a donc été purifié par CLHP et analysé par spectroscopie RMN et spectrometrie de masse. Les résultats confirment la première structure, à savoir qu'il s'agit du produit formé par cyclisation entre la double liaison vinylique du phénol, l'hydroxyle en position 5 et le carbocation en position 4 de 1 'anthocyane dont la masse moléculaire est de 609.

L ' invent i on c onc erne donc tout particulièrement le colorant anthocyanique dérivé du 3 - glucoside de malvidol répondant à la formule (VI) suivante :

La figure 1 représente les spectres UV- visibles du 3-glucoside de malvidol en (A) et de son adduit vinylphénol en (B) . On observe que en comparaison avec le spectre du 3-glucoside du malvidol, le rapport des maxima d'absorbance entre le visible et l'UV a sensiblement augmenté pour le dérivé vinylphénol.

Ce résultat peut être expliqué par l'augmentation de la taille du chromophore de ce nouveau colorant anthocyanique. En outre, il est intéressant de noter, comme montré à la figure 2, qu'une de ses formes de résonance est une autre anthocyane de type pelargonidol . Cette forme semble d'ailleurs la plus stable, si l'on se réfère au maximum d'absorbance de la bande visible, pour lequel on observe un glissement vers les plus courtes longueurs d'onde (λ=504 nm, caractéristique du pelargonidol au lieu de λ=531 nm pour le malvidol) .

Ceci explique la coloration plus orangée du dérivé vinylphénol de formule (V) . Compte-tenu de ces résultats, il s'avère possible, par le jeu des substituants tant au niveau du pigment que du vinylphénol, d'obtenir toute une gamme de couleurs allant de 1 'orange au rouge.

Par ailleurs, en bloquant simultanément les positions 4 et 5 de 1 'anthocyane, la cyclisation confère une plus grande stabilité au nouveau composé.

Ces résultats ouvrent donc la voie d'obtention de la série de nouveaux colorants anthocyanique de formule (I) à partir des composés de formule (III) définis précédemment.

L'Invention concerne aussi, les mélanges et composition comprenant plusieurs des colorants anthocyaniques précédents.

L'invention concerne aussi la préparation des colorants anthocyaniques précédents.

Un procédé préféré de préparation d'un colorant anthocyanique ou d'un mélange de colorants anthocyaniques, selon l'invention, consiste à réaliser une réaction de cycloaddition de type [4+2] impliquant :

- d'une part l'hydroxyle en position 5 et le carbone en position 4 dans le cation flavylium de formule II ci-dessous :

OH

(II) dans laquelle RI, R2, R3 , R4 et R5 ont les mêmes significations que dans la formule (I) , et

- d'autre part, un composé possédant une double liaison polarisée et/ou polarisable du fait des

groupement R et R' qu'il porte, R et R' étant définis comme dans la formule (I) .

Une première forme de réalisation de la réaction de cycloaddition de type [4+2] définie ci-dessus est caractérisée en ce que le composé possédant une double liaison polarisée et/ou polarisable mis en oeuvre répond à la formule suivante :

R— CH=CH—R* (III) dans laquelle, le radical R représente un groupement essentiellement carboné donneur d'électrons avantageusement aliphatique, alicyclique, aromatique ou hétérocyclique saturé ou non, éventuellement substitué, et le radical R' représente un groupement essentiellement carboné attracteur d'électrons avantageusement choisi parmi, un atome d'hydrogène, un groupe -OH, un groupe -COOH, un groupe -COH, un groupe -CH2OH un groupe -CO0R" où R" représente un groupe alkyle ramifié ou non de 2 à 5 carbones éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OH, -COOH, -COH.

Avantageusement, ce procédé consiste à faire réagir en milieu acide une ou plusieurs molécules d' anthocyane ou un extrait global de diverses anthocyanes contenues dans un ou plusieurs végétaux ou dans un ou plusieurs sous-produits de transformation desdits végétaux, avec un excès d'un ou plusieurs composés répondant à la formule (III) , puis l'on recueille du milieu de réaction et éventuellement purifie le dit colorant anthocyanique par tout moyen approprié. Dans cette première forme de réalisation, on préfère les composés de formule (III) dans laquelle :

- le radical R représente un groupe mono, di ou triphenol éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OCH3. - le radical R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe -COOH.

Un composé de formule (III) préféré est un acide hydroxycinnamique tel que l'acide para-coumarique ou le vinylphénol, ou un dérivé de ceux-ci portant au moins un substituant sur le groupe phénol. Une variante à cette première forme de préparation des colorants de l'invention consiste : à soumettre un ou plusieurs acides hydroxycinnamiques tel que l'acide para-coumarique et ses dérivés portant au moins un substituant sur le groupe phénol, ou un extrait végétal contenant lesdits acides, à l'action d'une préparation ou d'un micro-organisme comportant une activité décarboxylase, dans les conditions permettant la formation de vinylphénol et/ou d'un ou plusieurs dérivés du vinylphénol dont le groupe phénol porte au moins un substituant, et à ajouter au milieu de fermentation précédent une ou plusieurs molécules d'anthocyane ou un extrait global de diverses anthocyanes contenues dans un ou plusieurs végétaux ou dans un ou plusieurs sous-produits de transformation desdits végétaux, de façon à faire réagir ledit vinylphénol et/ou son ou ses dérivés au fur et à mesure de leur formation avec les anthocyanes et obtenir dans le milieu de réaction ledit colorant anthocyanique ou ledit mélange de colorants anthocyaniques.

Une seconde forme de réalisation de la réaction de cycloaddition de type [4+2] définie précédemment est caractérisée en ce que le composé possédant une double liaison polarisée et/ou polarisable mis en oeuvre répond à la formule suivante :

O OH

R C il CH _? R ' ^ ^→_ R C ι — CH R' (IV) dans laquelle, R et R' sont choisis parmi ceux définis pour la formule (I) permettant l'énolisation.

Dans cette seconde forme de réalisation, on préfère les composés de formule (IV) choisis parmi : l'acide pyruvique, l'éthanal, l'acétone, l'acide alpha- cétoglutarique, l'acétoïne. Avantageusement le procédé consiste à faire réagir une ou plusieurs molécules d'anthocyane ou un extrait global de divers anthocyanes contenues dans un ou plusieurs végétaux ou dans un ou plusieurs sous-produits de transformation desdits végétaux, avec un excès d'un ou plusieurs composés de formule (IV) , puis à recueillir et éventuellement purifier lesdits colorants anthocyaniques par tout moyen approprié.

Une variante à cette seconde forme de préparation des colorants de l'invention consiste : - à soumettre une ou plusieurs molécules d'anthocyane ou un extrait global de diverses anthocyanes contenues dans un ou plusieurs végétaux ou dans un ou plusieurs sous-produits de transformation desdits végétaux, à l'action d'une préparation de levure oenologique ou de levure équivalente, puis

- à laisser s'effectuer la fermentation alcoolique et en ce que l'on recueille et éventuellement purifie lesdits colorants anthocyaniques par tout moyen approprié. Les composés obtenus par les deux variantes de ce second mode de préparation présentent une hydrophilie analogue à celle des anthocyanes de départ. Cette propriété peut être mise à profit pour leur purification par chromatographie.

Avantageusement, les deux mode de préparation décrits ci-dessus sont mis en oeuvre avec une ou plusieurs molécules ^' d' anthocyane ou un extrait global de divers anthocyanes contenu dans un ou plusieurs végétaux ou dans un ou plusieurs sous-produits de transformation desdits végétaux, répondant à la formule (II) définie précédemment.

On préfère alors tout particulièrement dans le procédé précédent, un extrait global d ' anthocyanes contenu dans du raisin ou du vin ou du marc de raisin.

L ' ensemble des propriétés et avantages de colorants anthocyaniques de 1 ' Invention permettent d'envisager leur utilisation pour colorer des compositions cosmétiques , phamaceutiques et alimentaires .

L'Invention a donc aussi pour objet les compositions cosmétiques ou phamaceutiques colorées renfermant au moins un colorant anthocyanique précédent, ou un colorant anthocyanique ou un mélange de colorants anthocyaniques préparés par l'un des procédés précédents.

L'Invention concerne aussi les compositions alimentaires colorées comprenant au moins un aliment de base et au moins un colorant anthocyanique précédent, ou un colorant anthocyanique ou un mélange de colorants anthocyaniques préparés par un 1 ' un des procédés précédents .

L'Invention concerne enfin, l'utilisation d'un colorant anthocyanique ou d'un mélange de colorants anthocyaniques précédent , ou d ' un colorant anthocyanique ou d'un mélange de colorants anthocyanique préparés par l'un des procédés précédents, pour colorer une composition cosmétique, une composition pharmaceutique ou une composition alimentaire.

D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' Invention apparaîtront dans la description qui suit et qui se réfère aux figures an annexe et concerne principalement les propriétés colorantes de certains des nouveaux colorants anthocyaniques de l'Invention.

I - Matériel et méthodes .

Une solution d'un extrait anthocyanique de raisin à 0,97 g/1 (soit une concentration molaire d'environ 1,83 mM, calculée à partir de la masse molaire du 3-glucoside de malvidol, anthocyane prédominante de l'extrait) a été préparée dans un tampon phosphate citrate pH 3.

Les solutions contenant les anthocyanes et les dérivés vinylphénols ont été diluées au cinquième d'une part (modèle boissons) par les solutions à pH3 (HC1 10 ^" 3 M et tampon citrate-phosphate) , d'autre part (modèle autres produits) par le tampon citrate-phosphate à pH 5. Dans ce dernier cas, le pH a été ajusté par addition de soude (10 μl dans 1,5 ml d'échantillon) . Les valeurs des coordonnées tristimlaires et des absorbances ont été mesurées sur ces solutions. Deux échantillons supplémentaires ont été préparés par dilution au cinquième des préparations colorantes à pH3 dans un yaourt nature du commerce afin de tester le comportement (couleur, stabilité de celle-ci, aspect de la solution obtenue, solubilité dans le milieu) des deux types de pigments dans un modèle de type emulsion. Nous avons contrôlé que le pH du yaourt (4,25) n'était pas modifié par 1 'addition des solutions de pigments.

Les tests de stabilité thermique ont été réalisés sur les solutions aqueuses dans un bain marie à 55°C sur des tubes conservés à la lumière ou à l'obscurité.

Des échantillons supplémentaires ont été préparés pour tester la stabilité des préparations colorantes vis-à-vis des sulfites, en ajoutant 20 μl d'une solution de métabisulfite de sodium à 250 gl ^~ l à 1,5 ml de chaque solution. La concentration finale en dioxide de soufre ainsi obtenue est de 2, 5 gl-^.

La couleur des solutions et son évolution au cours des différents tests de stabilité pratiqués a été évaluée par mesure des coordonnées tristimulaires effectuée à l'aide d'un colorimètre commercialisé par la Société Minolta sous la référence CR 200. L'absorbance à 518 nm (maximum d'absorbance de la solution anthocyanique) et à 594 nm

(maximum d'absorbance de la solution des dérivés vinylphénol) a également été mesurée sur chacune des solutions aqueuses. La composition des solutions a été analysée par CLHP en phase inverse au moyen d'un système du type

Waters comprenant un injecteur manuel U6K, un programmateur

de gradient, deux pompes M690 et un détecteur à barettes de diodes M990. La colonne est une colonne de la Société Lichrospher RP-18 (5μm) (250x4mm) protégée par une précolonne remplie de la même phase (Société Merck, Darmstadt, Allemagne) .

Les anthocyanes et leurs adduits vinylphénol ont été élues dans les conditions suivantes :

- solvant A : acide formique/eau (2/98, v) ;

- solvant B : acetonitrile, eau, acide formique (80/18/2, v) ;

- débit : 1 ml par minute;

- température de la colonne 30°C;

- gradient décrit dans la tableau 1 ci-dessous :

Tableau 1

Temps (minutes) % A % B

0 95 5

40 70 30

60 50 50

70 80 20

II - Etude des propriétés colorantes du colorant anthocvaniαue de formule (IV) .

L'étude des propriétés colorantes et de la stabilité a été réalisée sur un mélange de dérivés vinylphénol obtenu par synthèse à partir d'un extrait global d' anthocyanes monoglucosides de raisins et de vinylphénol, dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Ce matériel est une source facilement accessible au niveau industriel.

La composition de l'extrait anthocyanique, contenant exclusivement les formes monoglucosides, est donnée dans le tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2

Anthocyane Concentration relative (%)

3-qlucoside du delphinidol 24,4

3-glucoside du cyanidol 5,7

3-glucoside du petudinol 16,5

3-glucoside du peonidol 12,9

3-glucoside du mavidol 40,1

Toutes les anthocyanes ont été converties en adduits vinylphénol par incubation de cet extrait en présence de vinylphénol 5 mM. Les chromatogramm.es de l'extrait anthocyanique et de la solution contenant les dérivés vinylphénols sont donnés dans la Figure 3. Le vinylphénol résiduel a ensuite été éliminé par entraînement à l'argon afin d'éviter les éventuelles réactions de copigmentation entre les pigments et le vinylphénol, susceptibles de modifier la couleur.

La figure 3 représente les profils chromatographiques en (A) de l'extrait anthocyanique et en (B) de la solution de nouveaux pigments, à 510 nm. Les pics 1, 2, 3, 4 et 5 représentent respectivement le 3-glucoside du delphinidol, le 3-glucoside du cyanidol, le 3-glucoside du petudinol, le 3-glucoside du peonidol et le 3-glucoside du mavidol, et les pics l' ,2' ,3' ,4' et 5' représentent respectivement les adduits vinylphénol correspondants.

1) Evaluation de la couleur et comparaison avec celles de anthocyanes en solutions aqueuses à pH 3 et PH 5.

La couleur peut être évaluée par mesure des coordonnées tristimulaires L*a*b*, définies officiellement (2) . Ces coordonnées sont obtenues par mesure de la réflectance d'un échantillon opaque ou de la transmittance à travers un échantillon transparent à l'aide d'un colorimètre. La coordonnée L* (luminence) est notée de 0 à 100 du sombre au clair., les coordonnées a* et b*, représentant respectivement les composantes rouge (verte pour les valeurs négatives) et jaune (bleue pour les valeurs négatives) de la couleur, peuvent être utilisées directement ou converties en angle de teinte, noté thêta (θ = arctg b*/a*) (6) . La mesure

de la saturation qui rend compte de l'intensité de la coloration est calculée selon la formule (a2+β2)l/2

La couleur de la solution de dérivés vinylphénol qui se présente comme un colorant orangé a été comparée avec celle d'une solution anthocyanique.

Les coordonnées tristimulaires mesurées pour chacune des solutions à pH 3 et à pH 5 sont présentées dans la Figure 4, ainsi que les valeurs calculées pour l'angle de teinte (θ) . A pH 3 (modèle boisson) , les solution d' anthocyanes et de dérivé vinylphénol présentent des coordonnées tristimulaires voisines, à l'exception de la valeur b* , supérieure dans la solution des dérivés, ce qui traduit une teinte plus orangée (angle de teinte de 42° contre 28° pour la solution anthocyanique. Lorsque l'on ajuste le pH à 5 (modèle produits laitiers, carnés) , la solution anthocyanique devient plus claire (augmentation de L*) . Les valeurs a* et b* diminuent dans les deux solutions, ce qui traduit une dégradation de la couleur rouge ou orangée. Notons que cette dégradation est beaucoup plus prononcée dans la solution anthocyanique, qui évolue vers une nuance plus violacée, comme en témoigne la valeur de l'angle de teinte, proche du zéro. Cette coloration est celle de la forme base quinonique des anthocyanes, qui devient prédominante lorsque le pH augmente (4) . La figure 4 représente les coordonnées tristimulaires L*a*b* et angle de teinte (θ) des solutions d'anthocyanes et d'adduits vinylphénol en solutions aqueuses à pH 3 et pH 5.

2) Résistance à la décoloration par les sulfites.

L'addition de sulfites conduit à une décoloration instantanée des solutions anthocyaniques à pH 3 et pH 5 (satutation proche de 0) alors que les solutions de dérivés vinylphenols restent colorées malgré ce traitement

(saturation 60) . Les valeurs de la saturation mesurées après sulfitage évoluent peu au cours du temps.

La figure 5 représente l'évolution de l'intensité colorante (saturation) des solutions d' anthocyanes (An) et de leurs dérivés vinylphenols (Vi) après sulfitage. Ce maintient de l'intensité colorante est d'autant plus appréciable qu'il est réalisé sans modification de la nuance de la solution comme montré à la figure 6 qui représente l'influence du sulfitage sur la couleur (angle de teinte) des solutions. Ce phénomène est certainenemt dû à la protection de la position 4 du noyau flavylium par l'addition du groupe vinylphénol dans les nouveaux composés décrits . Ceci apparaît d'autant plus intéressant que les traitements par les sulfites représentent un procédé fréquent dans l'industrie des fruits, l'utilisation de colorants naturels résistant à ce traitement permettrait de conserver la couleur.

3 ) Stabilité thermique en solution aqueuse. La stabilité thermique a été testée en parallèle sur les solutions d ' anthocyanes et les solutions de pigments formés par réaction avec le vinylphénol, à pH 3 et pH 5. Les incubations ont été réalisées à 55°C, en présence d'air et de lumière, conditions connues pour favoriser la dégradation des anthocyanes.

a) A pH 3 (modèle boisson) .

La dégradation thermique des solutions à pH 3 a été étudiée en parallèle dans l'acide chlorhydrique 10-3 M et dans un tampon citrate, connu pour améliorer la stabilité des colorants anthocyaniques (1) .

Le dosage de chacun des constituants par CLHP confirme la meilleure stabilité de tous les adduits vinylphenols par rapport aux anthocyanes correspondantes. Au bout de 7 jours d'incubation, la solution anthocyanique ne contient plus que 2% de la concentration de glucoside de

malvidol initiale alors que la solution des dérivés vinylphenols renferme encore 72% du dérivé vinylphénol du glucoside de malvidol (39% dans le tampon citrate) initialement présent comme montré à la figure 7, qui représente la cinétique de dégradation du 3-glucoside de malvidol et de son adduit vinylphénol dans des solutions à pH 3 maintenues à 55°C. Le dérivé vinylphénol du delphinidol, bien que beaucoup plus fragile, est également plus stable que son précurseur (47% de la concentration initiale au bout de 7 jours à 55°C contre seulement 0,3% pour le glucoside du delphinidol dans l'acide chlorhydrique) . Les pertes en dérivés vinylphénol légèrement supérieures dans le tampon citrate sont imputables à leur insolubilisation progressive dans ce milieu. L'évolution de 1 'absorbance dans le visible de chacune des solutions à pH 3 montrée à la figure 8 ci- après confirme la stabilité des adduits vinylphenols bien supérieure à celle des anthocyanes. En effet, après sept jours d'incubation dans l'acide chlorhydrique 10-3M, la solution des nouveaux pigments conserve près de 50% de son absorbance initiale au λ max de l'échantillon tandis que la solution anthocyanique a perdu 97% de son absorbance dans le visible. La couleur de chacune des solutions est plus intense dans le tampon citrate qui exerce un effet protecteur sur la couleur, bien que les molécules soient fortement dégradées.

La figure 8 représente l'évolution de 1 ' absorbance des solutions d'anthocyanes (518 nm) et de dérivés vinylphénol (494 nm) maintenues à 55°C.

Les différences de nuances entre la solution d' anthocyanes et celle de dérivés vinylphénol à pH 3 sont conservées au cours du temps comme indiqué à la figure 9 qui représente l'évolution de l'angle de teinte des solutions d'anthocyanes et de dérivés vinylphénol maintenues à 55°C.

Les valeurs des angles de teinte obtenues montrent que la solution d'anthocyanes subit une décoloration dans le rouge, tendant ainsi vers une couleur dont la composant jaune devient prépondérante. La solution de dérivés

vinylphénol conserve, au contraire, une teinte orange identique à celle observée avant le chauffage, confirmant ainsi que ces composés s'avèrent stables tant en milieu tamponné qu'en milieu acide non tamponné.

b) A H 5 (modèle autres produits) . Les dosages des composés par CLHP dans les solutions à pH 5 placées à 55°C représentés à la figure 10 montrent que la solution d'anthocyanes est fortement dégradée (2% restant dès le deuxième jour) alors que la solution de dérivés vinylphenols est nettement plus stable. La perte des composés observée au 2ème jour est imputable à leur précipitation en milieu aqueux pH 5. Ce phénomène amoindrit la différence de stabilité entre les deux solutions examinées et tend à diminuer l'intensité de la coloration.

La figure 10 représente la cinétique de dégradation du 3-glucoside de malvidol et de son adduit vinylphénol dans les solutions à pH 5 maintenues à 55°C.

Au cours du temps, la nuance de la solution anthocyanes est fortement modifiée avec une augmentation de la composante jaune et une diminution de la composante rouge au cours du temps, en revanche les dérivés vinylphénol présentent une nuance proche de celle observée initialement comme montré à la figure 11, laquelle représente l'évolution de l'angle de teinte des solutions d'anthocyanes et de dérivés vinylphénol maintenues à 55°C.

4) Solubilité en milieu de type emulsion (yaourt) . Les phénomènes de précipitation observés dans les milieux aqueux et plus particulièrement à pH 5, s'avèrent inexistants dans les milieux mixtes comprenant une "fraction lipidique"; cette observation permet d'envisager leur utilisation dans divers produits alimentaires et cosmétiques ou pharmaceutiques présentant cette composition comme par exemple les produits laitiers.

Les milieux lactés de type yaourt, utilisés dans l'expérimentation, ont un pH d'environ 4,25 correspondant au pH de la majorité des produits disponibles sur le marché. L'addition d'anthocyanes (dilution identique à celle utilisée pour les milieux aqueux) au yaourt conduit à une coloration dont la nuance présente une tendance rosée- bleue alors que, comme prévu, les dérivés vinylphénol produisent une coloration orangée comme montré à la figure 12 qui représente l'évolution de l'angle de teinte des yaourts+anthocyanes et des yaourts+dérivés vinylphénol . Les intensités de coloration montrées à la figure 13 s'avèrent totalement différentes, démontrant le pouvoir colorant nettement supérieur de la solution de vinylphénol. De plus, cette coloration se maintient au cours du temps, une diminution étant observée pour les anthocyanes malgré la conservation à 4°C des échantillons (conditions réglementaires de conservation de ces produits) .

La figure 13 représente l'évolution de l'intensité de coloration des yaourts + anthocyanes (An) et des yaourts + dérivés vinylphénol (Vi) .

Références

1) Aubert S., Amiot M.J. , Bartholin G., Tachini M., Nicolas J., 1992 : Compte rendu des Journées Internationales d'Etudes du groupe Polyphenols, 16 (2) , 52- 55.

2) Bakker J. , Bridle P. et Timberlake CF., 1986 : Tristimulus measurements (CIELAB 76) of port wine color. Vitis, 25, 68. 3) Brouillard R. , 1982 : Chemical structures of anthocyanins as food colors.

4) Brouillard D. , Dubois J. E. 1977 :

Mechanism of structural transformations of anthocyanins in acidic média. J. Med. Chem. Soc. 99 (5) 1359-1364. 5) Francis F.J., 1989 : Food colorants : anthocyanins, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 28 (4), 273.

6) Francis F.J., 1975 : The origin of tan-1 b/a, J. Food Sci.40, 412.

7) Iacobucci G.A. et Sweeney J.G. , 1983 : The chemistry of anthocyanins, anthocyanidins and related salts.

Tetrahedron Lett., 39, 3005.

8) Pierpoint W.S., 1986 : in Plant flavonoids in biology and médecine (eds. Cody V., Middleton E. et Harborne J.B.) Alan Liss, New York, 125-140. 9) Shenoy V.R. , 1992 : Anthocyanins-

Prospective Food Colours. Current Sci. 64 (8), 575.

10) Timberlake CF. et Bridle P. , 1967 : Flavylium salts, anthocyanidins and anthocyanins. I. Structural transformations in acid solutions. J. Sci. Food Agric. 18, 479.

26) ulf L W, Nagel C 1978 High-pressure liquid chromatographic séparation of anthocyanins of Vitis vinifera . Am J Enol Vitic 29 42-49.