La présente invention a pour objet de nouvelles souches bactériennes ayant un intérêt en tant que probiotique dans l'alimentation animale et plus particulièrement pour l'alimentation des poulets.

Certaines souches bactériennes ont la capacité de libérer des substances ayant un effet bactériostatique ou bactéricide sur leurs compétiteurs. Ces substances antimicrobiennes peuvent être de nature organique, par exemple acides organiques ou peroxyde d'hydrogène (Ross et al., Int. J. Food Microbiol. 79, 3-16, 2002), ou de nature peptidique. On distingue, en outre, les peptides antimicrobiens synthétisés par voie enzymatique qui appartiennent à la classe des antibiotiques (Mootz et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 543-551, 1997; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598-606, 1999), et les peptides produits par la voie ribosomique qui forment la classe des bactériocines (Jacob et al., Ann. Inst. Pasteur (Paris) 84, 222-224, 1953).

Les bactériocines suscitent un intérêt grandissant dans le monde de la recherche et de l'industrie; elles pourraient fournir des solutions alternatives à l'utilisation d'antibiotiques, notamment dans l'élevage (Luchansky, Antonie Van Leeuwenhoek 76, 335, 1999 ; O'Sullivan et al., Biochimie 84, 593-604, 2002).

De nombreux systèmes d'expression hétérologues de ces bactériocines se sont développés depuis quelques années. Notamment, Morisset et al. (Morisset et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 4672-4680, 2004) ont produit des varia nts de la mésentricine Y105, bactériocine de classe lia produite par Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y105, chez Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM20484. De même, Flynn et al. (Microbiol., 148, 973-984, 2002) ont réalisé l'expression du gène de ABP-118, bactériocine de classe Mb produite à l'origine par Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118, chez les hôtes Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis et Bacillus cereus.

En outre, plusieurs essais ont été menés pour exprimer les gènes des bactériocines chez la bactérie Escherichia coli (McCormick et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 4757-4766, 1998; Garneau et al., Appl. Environ. Microbiol., 69, 1352- 1358, 2003; Biet et al., Microbiol., 144, 2845-2854, 1998 ; Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 14-20, 1998; Richa rd et al., J. Bacteriol., 186, 4276-4284, 2004; Kloche et al., Appl. M icrobiol. Biotechnol., 67:532-538, 2005), la levure Saccharomyces cerevisiae (Schoeman et al., Yeast, 15, 647-656, 1999; Van Reenen et al., Int. J. Food Microbiol., 81, 29-40, 2003) et chez des bactéries lactiques (Rodriguez et al., Int. J. Food Microbiol., 80, 101-116, 2003).

De nombreux travaux sont donc menés en vue de l'identification de nouvelles bactériocines et de nouvelles souches bactériennes pour produire des bactériocines.

L'écosystème digestif est constitué par un microbiote abondant et très complexe regroupant des bactéries, des levures et des Archaea. Ce microbiote est essentiellement anaérobie et l'on retrouve principalement des bactéries des genres Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Bifidobacterium et Fusobacterium (Suau et al., Appl. Environ. Microbiol. 65, 4799-4807, 1999). Le microbiote a un impact important sur la santé de l'hôte. Il est notamment impliquée dans la toxification et la détoxication de composés métaboliques issus de l'alimentation (Hughes and Rowland, Microbial Ecology Health Disease 2, 179-185, 2000). Il est également capable de moduler l'expression de fonctions entérocytaires (Bry et al., Science 273,1380-1383, 1996 ; Hooper et al., Science 291, 881-884, 2001). Enfin, Il joue un rôle primordial dans la protection de l'hôte contre l'envahissement par des bactéries exogènes potentiellement pathogènes (Ducluzeau et al., Microbial Ecology and I ntestinal Infections, 1988 ; Fons et al., Microbial Ecology in Health and Disease 2, 240-246, 2000).

Parmi les pathogènes intestinaux connus, on trouve Clostridium perfringens, bactérie à Gram positif, anaérobie stricte, capable de sporuler et très répandue dans l'environnement. Ce pathogène peut provenir de l'alimentation, mais peut aussi être présent à faible concentration dans l'intestin et se mettre à proliférer et sécréter des toxines sous l'effet d'un stress. Les souches de Clostridium perfringens sont classées en 5 toxinotypes en fonction des toxines qu'elles produisent (Petit et al., Trends Microbiol. 7, 104-110, 1999). Les souches de C. perfringens de type A sont responsables de maladies gastro-intestinales chez l'Homme. En 1997, plus de 245000 cas d'infections à C. perfringens ont été recensés aux Etats-Unis. Ceci a conduit à l'hospitalisation de 41 personnes dont 7 n'ont pas survécu (Mead et al., Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625, 1999). Les souches de C. perfringens de type A et C peuvent être respectivement à l'origine d'entérite nécrotique chez les volailles et les porcs. Chez les volailles, l'entérite nécrotique est une pathologie aiguë, d'évolution rapide dont la mortalité peut atteindre 1 à 2% par jour. En plus de son incidence sur le bien-être des animaux, cette pathologie peut donc avoir une influence économique non négligeable. Jusqu'en 1999, cette maladie était bien contrôlée par l'usage d'antibiotiques comme facteurs de croissance. Mais, en 1999 l'Union européenne a interdit partiellement leur emploi, puis complètement en 2006 dans l'alimentation animale par crainte de sélectionner les bactéries résistantes et donc de voir diminuer l'efficacité des antibiotiques chez l'Homme. Depuis cette interdiction, l'entérite nécrotique provoquée par Clostridium perfringens chez la volaille et le porc, n'est plus contrôlée en Europe. Le nombre de cas déclarés au Réseau National d'Observations Epidémiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan) a considérablement augmenté en 1999 et 2000 (Valancony, Bulletin des G TV 12, 9-12, 2001).

Dabard et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001) ont montré que la souche Ruminococcus gnavus El, isolée à partir de la flore dominante de l'Homme, est capable de produire une substance antimicrobienne, appelée ruminococcine A ou RumA, qui s'accumule dans le surnageant de culture. Il s'agit d'une bactériocine appartenant à la famille des lantibiotiques, active contre différentes souches de Clostridium sp. pathogènes. Ruminococcus gnavus est une bactérie anaérobie stricte appartenant à la famille des Lachnospiraceae, dans l'ordre des Clostridiales.

La demande de brevet WO 2008/152252 a pour objet une souche bactérienne de Ruminococcus gnavus (déposée à la CNCM sous le numéro 1-3705 ainsi que les petides RumCl, RumC2 et RumC3 présentant une activité antibactérienne contre Clostridium perfringens, ainsi que les gènes codant pour ces peptides.

A ce jour, la recherche de solutions alternatives pour contrôler et traiter les maladies associées à la prolifération de Clostridium perfringens est donc de première importance. La présente invention a permis d'identifier de façon tout à fait surprenante de nouvelles souches d' Arthrobacter gandavensis synthétisant des peptides ayant une activité antibactérienne (en tant que bactériocine) à rencontre de Clostridium perfringens. Description de l'invention

La présente invention a pour objet une souche d'Arthrobacter gandavensis, ayant une activité contre Clostridium perfringens choisie parmi Arthrobacter gandavensis API déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28444, Arthrobacter gandavensis AP2 déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28445, Arthrobacter gandavensis AP3 déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28446, ou Arthrobacter gandavensis AP4 déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28447.

Dans le cadre de la présente invention l'activité contre Clostridium perfringens peut être définie comme la capacité à inhiber la croissance ou le développement de bactéries cibles ou la capacité à tuer des bactéries cible. Les techniques de mesure de l'activité antimicrobienne sont connues de l'homme du métier. L'activité contre Clostridium perfringens peut être définie par un test d'activité tel que décrit au point 4.3 de l'exemple 4 ci-dessous ou dans la demande de brevet WO2008/152252 (et plus particulièrement à la page 23 & 24 : « 2. Test d'activité antimicrobienne à partir d'un échantillon liquide » ou page 24 : « 3. Test d'activité antimicrobienne à partir de colonies se développant en milieu gélosé » : L'activité antimicrobienne est dans ce cas mise en évidence dans la présente invention par un test d'inhibition de la souche Clostridium perfringens CpA mise en culture sur milieu gélosé. L'échantillon contenant l'un des peptides de l'invention est déposé dans des puits formés dans le milieu gélosé. L'activité antimicrobienne est mise en évidence lorsqu'est formé un halo d'inhibition autour du puit.

L'invention a également pour objet un composé ayant une activité contre C. perfringens isolé à partir d'une souche batérienne choisie parmi Arthrobacter gandavensis API déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28444, Arthrobacter gandavensis AP2 déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28445, Arthrobacter gandavensis AP3 déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28446, ou Arthrobacter gandavensis AP4 déposée le 19 février 2014 auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28447.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide a une séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 16.

L'invention se rapporte également à des fragments biologiquement actifs de ces peptides ayant une activité antimicrobienne. Le terme "fragment biologiquement actifs " d'un peptide désigne un peptide comprenant une partie mais pas la totalité du peptide dont il est dérivé et qui a conservé Γ activité antimicrobienne du polypeptide dont il est dérivé.

Les méthodes de préparation des peptides de séquences SEQ ID No. 1 à SEQ I D No. 16 sont connues de l'homme du métier. Les séquences de ces peptides présentent de fortes identités avec les peptides RumC de la souche Ruminococcus gnavus déposée auprès de la CNCM sous le numéro 1-3705. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre polypeptides sont connues de l'homme du métier. L'alignement des séquences est par exemple réalisé au moyen de Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) ou en utilisant l'outil CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Les peptides de l'invention sont sécrétés (ou relargués) par les bactéries dans l'environnement extracellulaire. Il est possible que l'un quelconque des peptides de séquences SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 16 comprenne un peptide signal d'un nombre déterminé d'acides aminés. Dans ce cas, l'invention concerne également le peptide mature obtenu après clivage du peptide signal.

Dans un autre mode de réalisation, le peptide signal potentiel du peptide SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 16 peut être remplacé par un peptide signal hétérologue pour réaliser l'expression et la sécrétion de ce peptide par un organisme hôte hétérologue.

Les peptides selon l'invention peuvent être isolés ou purifiés de leur environnement naturel. Ils peuvent notamment être isolés à partir de microbiotes caecaux et iléaux d'animaux et notamment de porcs hébergeant la souche Arthrobacter gandavensis. Les peptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des bactéries exprimant naturellement ces peptides, la production de peptides recom binants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ainsi, les peptides des séquences SEQ ID No. 1 à 16 de la présente invention peuvent être isolés à pa rtir d'une des souches d' Arthrobacter gandavensis API déposée auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28444, Arthrobacter gandavensis AP2 déposée auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28445, Arthrobacter gandavensis AP3 déposée auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28446, ou Arthrobacter gandavensis AP4 déposée auprès de DSMZ sous le numéro DSM 28447.

Dans un autre mode de réalisation, les peptides de la présente invention sont isolés à partir d'organisme hôtes recombinants exprimant un composé selon l'invention ou un fragment d'un composé présentant une activité antimicrobienne. L'invention a également pour objet des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant les peptides selon l'invention.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide est adapté à une utilisation en nutrition ou en pharmacie, par exemple une utilisation en nutrition animale.

On entend par "peptide adapté à l'utilisation dans la nutrition ou la pharmacie", un peptide dont les caractéristiques sont telles qu'il convient pour la nutrition ou la pharmacie. Les caractéristiques essentielles à une utilisation en nutrition ou en pharmacie sont notamment le pH auquel le peptide peut résister, la résistance aux enzymes gastriques et la conservation de leur activité à des températures physiologiques. En effet, une partie du système digestif des animaux et de l'homme est acide et il est donc essentiel que le peptide soit résistant à ce pH. Une autre caractéristique essentielle à une utilisation en nutrition est la température à laquelle la substance antimicrobienne est active. En effet, la mise en forme de substance antimicrobienne dans un médicament, un additif nutritionnel ou un aliment pour animaux, par exemple, implique des traitements et une température supérieure à la température ambiante. L'activité des antimicrobiens utilisés doit donc être stable dans les conditions des procédés, notamment les conditions de températures. Les antimicrobiens utilisés doivent également être actifs à des températures physiologiques (37-41°C).

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide, ou un mélange de peptides selon l'invention, présente une activité antimicrobienne à pH neutre et conserve son activité antimicrobienne à un pH acide, par exemple inférieur à 7, de préférence inférieur à 4,4 et notamment à pH2.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide, ou un mélange de peptides selon l'invention, présente une activité antimicrobienne à 37°C et conserve cette activité à des températures inférieures et supérieures à la température ambiante, par exemple supérieure à 50°C.

La présente invention a également pour objet un polynucléotide codant pour un peptide ayant une activité contre Clostridium perfringens choisi parmi les polynucléotides dont la séquence est définie par SEQ ID No. 17 à SEQ ID No. 32, les polynucléotides qui s'hybrident au polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 17 à SEQ ID No. 32, ou les polynucléotides codant pour un peptide tels que définis ci-dessus. Selon la présente invention, on entend pa r "polyn ucléotide" une chaîne nucléotidique sim ple brin ou son complémenta ire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouva nt être de type ADN complémentaire ou génomique. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notam ment ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés.

Les polynucléotides de la présente invention peuvent être isolés ou purifiés de leu r environnement naturel. Les polynucléotides de la présente invention peuvent également être préparés par synthèse chimique ou pa r des techniques classiques de biologie moléculai re tel les que décrites par Sam brook, Fristsch et Ma niatis, dans leur ouvrage intitu lé "Molecular cloning: a laboratory man ual", édition : Cold Spring Harbor Laboratory P ress, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

L'invention concerne aussi des polynucléotides capables de s'hybride r de manière sélective avec le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 17 à SEQ I D No. 32

Dans le cadre de la présente invention, une hybridation sélective est effectuée dans des conditions de moyenne stringence et préférentiellement da ns des conditions de forte stringence. Par "séquence capable de s'hybrider de ma nière sélective", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré pa r l'interaction entre la séquence capa ble de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont connues de l'homme du métier. En généra l, la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'a u moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/m \ sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence da ns un tampon 2X SSC, 0,1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01% SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a la boratory manual", édition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Dans le cas présent, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective avec le polynucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No. 17 à SEQ ID No. 32. codent pour une activité anti-microbienne.

L'invention se rapporte de manière générale aux polynucléotides codant pour les peptides selon l'invention. En raison de la dégénérescence du code génétique, différents polynucléotides peuvent coder pour un même polypeptide.

La présente invention concerne également une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide tel que ci-dessus défini et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte.

La présente invention concerne encore un vecteur comprenant un polynucléotide tel que ci-dessus défini et/ou une cassette d'expression telle que ci- dessus définie.

La présente invention concerne également des vecteurs de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins un polynucléotide ou une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment correspondre à un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte afin d'induire notamment l'expression d'un polynucléotide ou d'un peptide peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés en fonction de l'organisme hôte à transformer, et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre.

Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur et/ou de l'expression d'un peptide selon l'invention dans l'organisme hôte.

L'invention concerne aussi une méthode pour préparer un peptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes: - on transforme un organisme hôte avec un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon l'invention et/ou avec un polynucléotide selon l'invention,

- on isole les peptides produits par l'organisme hôte.

La présente invention concerne aussi un organisme hôte transformé avec un polynucléotide tel que ci-dessus défini, une cassette d'expression telle que ci- dessus définie et/ou un vecteur tel que ci-dessus défini. La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide, d'au moins une cassette d'expression ou d'au moins un vecteur selon l'invention. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont connus de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature.

Par "organisme hôte", on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures et les champignons. En particulier, par "organisme hôte", on entend un organisme non humain. De manière avantageuse, les levures sont choisies parmi par exemple Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae, Yarrowia lipolytica et Schwanniomyces occidentalis. Les champignons sont par exemple choisis parmi les Aspergillus, les Trichoderma et les Pénicilliums, préférentiellement parmi Pénicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii et Trichoderma koningii. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'organisme hôte est une souche de Pénicillium funiculosum dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide selon l'invention. Dans un autre mode de réalisation, l'organisme hôte est une souche de Debaryomyces castellii dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide selon l'invention. Dans un autre mode encore de réalisation, l'organisme hôte est une souche d'Entérobactérie ou Corynébactérie et plus particulièrement Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide selon l'invention.

Les techniques de construction de vecteurs, de transformation d'organismes hôtes et d'expression de protéines hétérologues dans ces organismes sont largement décrites dans la littérature notamment par Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans l'ouvrage intitulé "Molecula r cloning: a laboratory manua l", édition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ou par Ausubel et al., dans l'ouvrage intitulé "Current Protocols in Molecular Biology", édition : Greene Publishing Associates, Inc., and John Wiley and Sons, NY, 1992. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un peptide présentant une activité antimicrobienne selon l'invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

mise en culture d'une souche de Arthrobacter gandavensis ou d'un organisme hôte transformé selon l'invention dans des conditions d'induction de l'expression du peptide, et

récupération du surnageant de culture (ou moût de fermentation) comprenant le peptide.

La séparation du peptide à partir du surnageant de culture peut être réalisée pa r la charge, la taille et/ou le caractère hydrophobe. L'homme du métier connaît les différentes techniques permettant la séparation en fonction de la charge, de la taille et/ou du caractère hydrophobe des différents constituants d'un milieu.

Ce surnageant de culture ou moût de fermentation peut ensuite être concentré ou lyophilisé pour la formulation d'un additif alimentaire ou d'un aliment pour animaux. Le procédé peut comprendre des étapes supplémentaires de purification de la substance antimicrobienne à partir du surnageant de culture.

Si l'organisme hôte ne secrète pas la substance antimicrobienne dans le milieu de culture, une étape supplémentaire de casse des cellules et de purification de l'extrait cellulaire peut être nécessaire.

La présente invention concerne également une composition comprenant un peptide tel que ci-dessus défini, un organisme hôte tel que ci-dessus défini, une souche telle que ci-dessus définie, un moût de fermentation d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini ou un moût de fermentation d'une souche telle que ci-dessus définie. Selon un mode de réalisation de la présente invention, la composition se présente sous forme liquide ou sous forme de poudre.

Ces compositions comprennent différents ingrédients. Sous forme liquide, elles peuvent comprendre par exemple un autre agent antimicrobien, par exemple de l'acide sorbique ou un sel d'acide sorbique, de l'acide benzoïque ou un sel d'acide benzoïque, de l'acide fumarique ou un sel d'acide fumarique. Les compositions de l'invention peuvent en outre comprendre du sorbitol. Le sorbitol est un agent de stabilisation et de formulation. Les compositions de l'invention peuvent également comprendre des agents anticongelants, par exemple l'éthylène glycol, le glycérol, le propylène glycol et le propane-l,2-diol.

Les compositions de la présente invention comprennent au moins un peptide selon l'invention mais elles peuvent également comprendre d'autres substances comme des vitamines, des principes actifs autres, des acides aminés ou des sels minéraux.

Les compositions sous forme de poudre comprennent un support. Ce support peut être choisi parmi la farine de blé, l'amidon, la maltodextrine, le gypsum et les rafles de maïs.

Les compositions selon l'invention présentent une activité antimicrobienne. Elles fournissent des solutions alternatives à l'utilisation d'antibiotiques. Elles peuvent par exemple être utilisées dans l'élevage des animaux ou comme médicament pour l'homme.

La présente invention concerne également un additif nutritionnel comprenant un peptide tel que ci-dessus défini, un organisme hôte tel que ci-dessus défini, une souche telle que ci-dessus définie, un moût de fermentation d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini ou un moût de fermentation tel que ci-dessus défini. Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'additif se présente sous forme liquide ou sous forme de poudre.

La présente invention concerne aussi un aliment pour animaux caractérisé en ce qu'il comprend une base nutritionnelle pour animaux et un additif nutritionnel tel que ci-dessus défini.

Ces aliments se présentent habituellement sous la forme de farines ou de granulés dans lesquels sont incorporées les compositions présentant une activité antimicrobienne.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par "aliment" tout ce qui peut servir à la nourriture des animaux. Par "base nutritionnelle", on entend tout ce qui constitue l'essentiel de la ration alimentaire de l'animal, constituée à titre d'exemple par un mélange de céréales, de protéines et de matières grasses d'origine animale et/ou végétale. Habituellement, ces bases nutritionnelles comprennent par exemple du maïs, du blé, et du soja. Ces bases nutritionnelles sont adaptées aux besoins des différentes espèces animales auxquelles elles sont destinées. Il peut par exemple s'agir de volailles (poules pondeuses, poulets de chair, dindes et canards) ou de porcs (porcs croissance et finition, porcelets, truies). L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un peptide tel que ci- dessus défini, au moins un mout de fermentation d'une souche et/ou au moins un mout de fermentation d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini, et/ou au moins d'une souche ou d'un organisme hôte tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un additif nutritionnel, d'un aliment ou d'un médicament.

Le peptide selon l'invention, le mout de fermentation d'une souche ou d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini, la souche ou l'organisme hôte tel que décrit ci-dessus peuvent être utilisés comme médicament.

Le peptide selon l'invention, le mout de fermentation d'une souche ou d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini, la souche ou l'organisme hôte tel que décrit ci-dessus peuvent être utilisés prévenir ou traiter les maladies gastrointestinales chez l'homme

De façon particulière, le peptide selon l'invention, le mout de fermentation d'une souche ou d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini, la souche ou l'organisme hôte tel que décrit ci-dessus peuvent être utilisés pour la prévention et/ou le traitement de dysbactérioses intestinales, notamment l'entérite nécrotique chez les animaux monogastriques, et plus particulièrement les volailles et les porcs

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide tel que ci-dessus défini, au moins un mout de fermentation d'une souche ou d'un organisme hôte tel que ci-dessus défini, et/ou au moins d'une souche ou d'un organisme hôte, d'un additif nutritionnel selon ou d'un aliment tel que décrit ci- dessus pour améliorer les performances de croissance des animaux, notamment du poulet. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide tel que ci-dessus défini, au moins un mout de fermentation d'une souche selon l'invention et/ou ou un mout de fermentation d'un organisme hôte tel que ci- dessus défini, et/ou au moins d'une souche selon l'invention et/ou d'un organisme hôte, et/ou d'un additif nutritionnel selon et/ou d'un aliment tel que décrit ci-dessus pour améliorer les performances zootechniques des animaux d'élevage.

Dans le cadre de la présente invention l'amélioration des performances zootechniques des animaux d'élevage comprend de façon non exhaustive l'augmentation du gain de poids des anima ux, la diminution de l'indice de consommation, la diminution de la mortalité et morbidité, l'homogénéité des animaux, l'amélioration rendement carcasse/rendement viande, l'amélioration de la digestibilité des nutriments, l'amélioration du statut immunitaire de l'animal, la réduction des effets négatifs d'une infection à pathogène {Clostridium perfingens, Clostridium difficile, E. coli, Salmonella sp., Campylobacter sp.), ou encore l'amélioration de l'utilisation des nutriments et donc réduction de l'excrétion de rejets.

Description des figures

Figure 1 : Détection du gène rumCl par PCR

Figure 2 : Profil chromosomique par électrophorèse en champ puisé des souches API, AP2, AP3 et AP4.

Figure 3 : Pourcentage de survie dans la nourriture des souches API, AP2, AP3 et AP4

Figure 4 : dosage des interleukines IL8 par ELISA dans le surnageant de culture des cellules Caco-2 après contact avec les bactéries en présence ou en absence d'ILl

Figure 5 : Les tests d'activité avec les surnageants de culture bactérien contre la souche Clostridium perfringens

Figure 6 : une activité anti-C. perfringens après une première étape de pré-purification a été réalisée : purification des surnageants sur colonne Sep-Pak avec une élution à 40% d'acétonitrile (ACN, cf. WO2008/152252)

La présente invention sera illustrée par les exemples suivants

Exemple 1 : Isolement de souches bactériennes rumC+

La recherche de souches cultivables hébergeant les gènes rumC-like a été entreprise à partir des microbiotes caecaux et iléaux de porcs.

Dans un premier temps les bactéries sont mises en culture dans les milieux suivants :

M17 : favorisant les lactocoques

LB : permettant la croissance des Bacillus sp. et entérocoques

BEA : milieu contre-sélectionnant le groupe Bacteroides Les clones sont ensuite sélectionnés pour leur capacité à inhiber la croissance de Clostridium perfringens. La présence des gènes rumC est alors mise en évidence par PCR (Figure 1).

Tableau 1 : Liste des amorces utilisées pour amplifier les différents fragments d'ADN cibles

Quatre souches ont été retenues : API, AP2 AP3 et AP4.

Exemple 2 : Identification des souches retenues

2.1 ADNr 16S

Un fragment (environ 1550 pb) du gène codant l'ARNr 16S (correspondant aux positions 8-1541 dans le système de numérotation d'Escherichia coli) a été amplifié par PCR en utilisant des amorces conservées (16F8 : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3' (SEQ ID No.39) et 16R1541 : 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3') (SEQ ID No.40) puis séquencé.

Les séquences obtenues ont été soumises à une comparaison dans les banques de données à l'aide d'un programme de recherche d'homologie de séquence de type « BLAST »

Souche API (SEQ ID No.) => 99,45% d'identité avec Arthrobacter gandavensis R 5812

Souche AP2 (SEQ ID No.) => 99,37% d'identité avec Arthrobacter gandavensis R 5812 Souche AP3 (SEQ ID No.) => 99,44% d'identité avec Arthrobacter gandavensis R 5812

Souche AP4 (SEQ ID No.) => 99,31% d'identité avec Arthrobacter gandavensis R 5812

2.2. Identification PFGE

Les souches API, AP2 AP3 et AP4 appartenant au genre Arthrobacter doivent pouvoir être différenciées sur le plan génétique. La technique de référence pour identifier au niveau intra-spécifique des souches bactériennes consiste à établir leur profil chromosomique par électrophorèse en champ puisé (Figure 2) (Rapport d'analyse N°: LR251012 - Biocéa ne).

Les souches AP3 et AP4 semblent identiques. Cependant, le séquençage des gènes rumC, ainsi que leurs séquences peptidiques réduites, semble quant à lui indiquer que AP3 et AP4 sont deux souches distinctes (cf. Exemple 4, pointl 4.2).

Exemple 3 : Caractérisation des souches

3.1 Résistance au pH et aux sels biliaires

Les souches sont soumises à deux traitements pour déterminer leur résistance à l'acidité et aux sels biliaires.

- Acidité : tampon NaCI 0.85%, pH2, contenant de la pepsine (lmg/mL)

- Sels Biliaire tampon isotonique (K ₂ HP0 ₄ 1.24%, H ₂ P0 ₄ 0.76%, citrate trisodique 0.1%, [NH ₄ ] ₂ S0 ₄ 0.6%, pH6.7) contenant 0.2% de sels biliaire (50% cholate de sodium, 50% desoxycholate de sodium)

Tableau 2 : Pourcentage de survie des différentes souches

API AP2 AP3 AP4

Acidité 0% 15% 12% 90%

SB 0% 10% 8% ND

Sels biliaires ; ND : Non déterminé La souche AP4 résiste le mieux aux conditions mimant le milieu gastrique. De façon générale, toutes les souches sont plus sensibles aux sels biliaires mais la survie est cependant suffisante, excepté pour la souche API.

3.2 Paramètres fermentaires

L'analyse de leurs paramètres fermentaires a été réalisée sur un surnageant de culture obtenue après croissance en BHI-YH en semi-anaérobiose (analyse © In vivo Labs).

Tableau 3 : Dosage des paramètres fermentaires

Comme attendu, il est difficile d'évaluer les paramètres fermentaires pour les souches d'Arthrobacter. Les conditions de culture ne permettent pas de mettre en évidence la production d'un quelconque métabolite issu de la fermentation. II a également été recherché la présence d'acide propionique, d'acide isobutyrique, d'acide butyrique, d'acide isovalérique et d'acide valérique. Cependant aucunes des quatre souches ne semblent être productrice dans nos conditions de culture. 3.3 Tests de survie à la température

Les souches sont sensibles aux températures élevées. En effet, aucune ne survit au-delà de 70°C.

Selon ces résultats, il est difficilement envisageable de prévoir un ajout de ces souches lors de la granulation.

3.4 Tests de survie dans l'eau et les aliments

La souche Arthrobacter sp. AP4 survit très bien dans l'eau (Tableau 4 ci- dessous). Il semblerait même qu'elle soit capable de se développer dans ces conditions. En effet, après 7 jours dans l'eau, la population bactérienne aurait doublé.

Tableau 4 : Pourcentage de survie dans l'eau

Dans l'aliment la population reste relativement stable même après 21 jours (Figure 3). Selon ces résultats, l'addition des souches aussi bien dans l'eau de boisson que dans l'aliment est envisageable.

3.5 Potentiel anti-inflammatoire

La modulation du profil inflammatoire est estimé par dosage des interleukines IL8 par ELISA dans le surnageant de culture des cellules Caco-2 (lignée cellulaire intestinale) après contact avec les bactéries en présence ou en absence d'ILl (molécule d'induction de l'inflammation).

Ces résultats ont été obtenus sur les surnageants de cellules cultivées en puits. Les bactéries ne présente pas d'activité pro-inflammatoire (sécrétion d'IL8 faible en absence d'ILl) ni d'activité anti-inflammatoire (quantité d'I L8 en présence d'ILl identique au control).

L'expérience a été répétée avec la souche AP4 mais avec des cellules Caco-2 cultivées sur filtre. Dans ce cas cette souche présente une activité proinflammatoire. 3.6 Profils enzymatiques

Le système API ZYM est une méthode semi quantitative de recherche d'activités enzymatiques. Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension bactérienne dense.

Tableau 5 : Résultats des lectures des galeries Api Zym

I : premier essai ; Il : second essai Certaines activités sont retrouvées indiscutablement quelle que soit la souche utilisée. C'est le cas de l'estérase, de l'estérase lipase, de la leucine arylamidase, de la valine arylamidase et de la phosphatase acide. Certaines activités ne semblent pas très stables, comme pour la cystine arylamidase.

La souche API présente un profil différent des a utres Arthrobacter dans l'uti lisation du maltose et du fucose pa r exemple.

3.7 Résista nce aux antibiotiques

Un premier essai a été réalisé a u laboratoire. Les antibiogram mes ont été réalisés en utilisant des disques de diffusion antibiotiq ue (BBL™ Sensi-Disc™ Susceptibility Test Dises).

Les antibiotiques testés ont été utilisés aux quantités suivantes : Bacitracine lC^g, érythromycine l^g, pénicilline G lC^g, ampicilline lC^g, vancomycine 3C^g, streptomycine 30C^g, chlora mphénicol 3C^g, ciprofloxacine 5μg, fosfomycine 20C^g, rifampicine 25μg et triméthoprime / sulfaméthoxazole l,25μg / 23,75μg. Les résultats de l'antibiogramme sont soumis à un abaque de lecture afin de déterminer le niveau de sensibilité de la souche par rapport au diamètre d'inhibition mesuré.

Les 4 souches d' Arthrobacter sont sensibles à tous les antibiotiques testés.

Tableau 6 : sensibilité aux antibiotiques

API AP2 AP3 AP4

Ampicilline S S S S

Erythromycine S S S S

Gentamicine S s s s

Kanamycine s s s s

Streptomycine R R R R

Tetracycline R S S S

Chloramphenicol R/S R/S s s

Vancomycine S S s s

Ciprofloxacine ND* ND* ND* ND*

Linezolid ND* ND* ND* ND* Clindamycine R S S S

Tylosine ND* ND* ND* ND*

ND* : non déterminé car absence de break-point

D'après ces tests toutes les souches sont résistantes à la Streptomycine. La souche API est celle qui présente le plus de résistances.

3.8 Tests d'adhésion

L'adhésion bactérienne est estimée sur des cellules Caco-2 (lignée cellulaire épithéliale).

Tableau 7 : Numération bactérienne et taux d'adhésion

CFUi : dénombrement initial CFU _A : dénombrement après adhésion

Bien que faible, toutes nos souches présentent une capacité d'adhésion aux cellules intestinales. Les souches AP3 et AP4 semblent adhérer plus efficacement.

Exemple 4 : Validation du concept

4.1 I nnocuité des souches

Dans un premier temps les bactéries ont été observées en microscopie électronique afin de vérifier l'absence de caractère morphologique associé à la pathogénicité.

La morphologie des cellules est variable (bâtonnets à coccoïdes), ce qui est en accord avec la caractérisation du genre Arthrobacter. Les cellules sont dépourvues de flagelles et de pili. Da ns un second temps un test in vivo a été mis en place. 10 ⁷ bactéries ont été administrées en intra-gastrique à des souris axéniques (3 animaux par souche). Chaque jour et pendant 5 jours un prélèvement de fèces est effectué. U ne ana lyse de ces selles par microscopie optique a permis de confirme r la présence des bactéries pendant au moins 4 jou rs, mettant en évidence leur survie dans le tube digestif. I l est à noter une absence de mortalité, de lésions intestina les et de signes cliniques (prostration, dia rrhées...). Ces résultats appuient l'expérimentation sur la lignée cellulaire Caco-2 (Absence de lyse ou de décollement des cellules). 4.2 Séquençage des gènes rumC

Les séquences des différents gènes rumC-\ ke présents chez nos souches ont été compa rées aux séquences de la souche R. gnavus El (Cf Annexes).

Tableau 8 : Pourcentage d'identité des gènes rumC-Wke par rapport aux gènes de R. gnavus El (les identifiants de séquences figurant dans le tableau ci- dessous correspondent aux séquences identifiées dans les souches API à AP4).

API AP2 AP3 AP4

rumCl 78,12 99,48 93,23 98,44

(SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

No 17) No 22) No 27) No 30)

rumC2 97,92 55,73 86,46 84,9

(SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

No 18) No 23) No 28) No 31)

mmC3 100 44,79 89,06 89,06

(SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

No 19) No 24) No 29) No 32)

rumC4 60,98 75,14 / /

(SEQ ID (SEQ ID

No 20) No 25)

rumC5 52,2 66,88 / /

(SEQ ID (SEQ ID

No 21) No 26) La conservation des gènes est différente en fonction des souches. Le gène rumCl est celui qui est le plus conservé. De façon général les gènes rumC4 et rumC5 sont très divergents, voire trop divergents, pour être séquencés pour les souches AP3 et AP4.

La même analyse a été effectuée en comparant les séquences peptidiques déduites (Cf. annexes).

Tableau 9 : Pourcentage d'identité des séquences peptidiques déduites par rapport à R. gnavus El (les identifiants de séquences figurant dans le tableau ci- dessous correspondent aux séquences identifiées dans les souches API à AP4).

Globalement les mêmes conclusions peuvent être tirées. Les identités des séquences déduites sont inférieures aux identités des gènes. Dans certains cas, les séquences peptidiques sont trop éloignées (ou tronquées ; Cf annexes) pour prétendre à une activité (RumC2_AP3 et RumC4_ API par exemple).

4.3 Test d'activité

Les tests d'activité sont réalisés avec les surnageants de culture bactérien contre la souche Clostridium perfringens.

Les quatre souches possèdent bien une activité anti-C. perfringens (Figure 5). Afin de limiter l'action d'un acide organique les surnageants sont neutralisés avant le test. Deux tests ont été réalisés afin de conforter l'idée que l'inhibition de C. perfringens est bien due à une activité « RumC-like ». Dans un premier temps les surnageants ont été chauffés 10 min à 95°C avant le test. L'activité est bien conservée comme c'est le cas pour RumC. Dans un second temps la première étape de pré-purification a été réalisée (cf. WO 2008/152252): purification des surnageants sur colonne Sep-Pak avec une élution à 40% d'acétonitrile (ACN, Figure 6). Dans ce cas l'activité est également retrouvée.

4.4 Evaluation des propriétés probiotiques des souches d'Arthrobacter in vivo

L'évaluation de l'effet des souches AP3 et AP4 sur les performances de croissance du poulet de chair (gain de poids, consommation et indice de consommation) a été réalisée dans des conditions dites de "régime challengeant". Ce régime consiste en un régime à base de maïs avec une teneur standard en protéines (23%) durant 14 jours suivi d'un régime à base de blé et d'orge, donc riche en fibres, hyperprotéiné (26% de protéines) de 14 à 35 jours. Ce régime challengent correspond au « régime « contrôle du tableau 10).

Les souches AP3 et AP4 ont été pulvérisées sur l'aliment à une concentration permettant l'ingestion de 10 ⁸ CFU par jour et par animal, dès le premier jour, et ce, pendant toute la durée de l'essai, à savoir 35 jours. Ces régimes correspondent respectivement aux mentions « AP3 » et « AP4 » dans le tableau 10.

Le régime « Lincomycine (8,8%) » correspond à un régime challengeant auquel est ajouté de la lycomycine à hauteur de 8,8% (i.e. 5,25g par tonne d'aliment).

Ces quatre traitement ont été effectués sur des lots de 15 poulets et ont été répétés 12 fois (soit 720 poulets au total).

Tableau 10 : résultats in vivo. ET : Ecart-Type; IC : I ndice de consommation (consommation d'aliment nécessaire à l'augmentation du gain de poids de 1kg, IC = Consommation/Gain de Poids) ; % : pourcentage d'amélioration par rapport au contrôle; Consommation : consommation d'aliment par les animaux sur la totalité de l'essai

Les deux souches testées, AP3 et AP4, ont des effets similaires et positifs sur les performances de croissance des poulets de chai r. Elles permettent une diminution de l'indice de consommation de 7 à 8% due à la fois à une augmentation du gain de poids et à une diminution de la consommation